[LT] Fermentų imobilizavimo metodas, formuojant fermentų kristalus ir, bendresniu atvėju, sudarant gautuose kristaluose skersinius susiuvimus, bifunkcinių reagentų pagalba; susiūti, imobilizuoti fermentų kristalai (CLEC), padaryti pagal šį metodą; liofilizuoti, susiūti, imobilizuoti fermentų kristalai (CLEC) ir reikalingų produktų gamybos metodas, panaudojant CLEC ar CLEC katalizuojamas reakcijas.
[EN]
[0001] Šis išradimas yra apie fermento imobilizavimo būdą, pagal kuri, suformuojami kristalai ir, bendru atveju kristalas susiuvamas (sudaromi skersiniai ryšiai tarp kristalą sudarančių baltymo molekulių (šiam procesui pažymėti čia naudojamas terminas skersinis susiuvimas arba tiesiog susiuvimas)), panaudojant bifunkcinį reagentą; susiūtus imobilizuotus fermentų kristalus (toliau trumpintai CLEC arba CLIEC), gautus šiuo būdu; CLEC liofilizaciją, kaip priemonę pagerinančią imobili-zuotų fermentų saugojimo, priežiūros ir panaudojimo savybes ir apie norimo produkto gavimo būdą, panaudojant reakcijas katalizuojamas CLEC ar CLEC rinkiniais.
[0002] Fermentai naudojami kaip katalizatoriai pramoninio bei laboratorinio masto aukštos kokybės ir specializuotų cheminių medžiagų pramoninėje gamyboje (Jonės. J. B., Tetrahedron 42: 3351-3403 (1986)), maisto produktų gamyboje (Zaks ir kt., Trends in Biotechnology 6: 272-275 (1988)), ir kaip įrankis organinių junginių sintetinimui (Wong, C.-H., Science 244: 1145-1152 (1989); CHEMTRACTS-Org. Chem. 3: 91-111 (1990); Klibanov, A.M., Acc. Chem. Res. 23: 114-120 (1990)).
[0003] Gamyba, paremta fermentų panaudojimu, gali žymiai sumažinti aplinkos teršimo naštą, pasireiškiančią plataus masto gamyba kitur nepanaudojamų tarpinių chemikalų, kaip parodyta plataus masto akrilamido gamyboje, panaudojant fermentą nitrilo hidratazę
[0004] (Nagasawa, T. ir Yamada, H., Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)).
[0005] Fermentai taip pat panaudojami kaip biosensoriai, įvairių medžiagų aptikimui klinikiniams, pramoniniams bei kitiems poreikiams (Hali, E., "Biosensors", Open University Press (1990)). Klinikinių tyrimų srityje fermentai gali būti panaudoti ekstrakorporalinėj e terapijoje, pavyzdžiui hemodializėje ir hemofiltra-cijoje, kur fermentai selektyviai pašalina nereikalingas ir toksines medžiagas iš kraujo ( Klein, M., Langer, R., Trends in Biotechnology 4: 179-185 ( 1986)). Fermentai naudojami šiose srityse todėl, kad jie efektyviai katalizuoja daugelio tipų reakcijas prie vidutinių temperatūrų, be to jie yra specifiški substratui ir stereoselektyvūs. Vis dėlto, tirpių fermentinių katalizatorių vartojimas turi trūkumų, kurie riboja fermentų panaudojimą pramoniniuose ir laboratoriniuose cheminiuose procesuose ( Akiyama ir kt., CHEMTECH 627- 634 ( 1988)).
[0006] Fermentai yra brangūs ir santykinai nestabilūs, lyginant su dauguma pramoninių ir laboratorinių katalizatorių, net kai jie naudojami vandeninėje terpėje, kurioje paprastai fermentai funkcionuoja. Daugumas iš ekonomiškai vertingesnių cheminių reakcijų, plačiai vykdomų praktikoje, nesuderinamos su vandenine terpe, kurioje, pvz., dažnai substratai ir produktai yra netirpūs ar nestabilūs ir kurioje hidrolizė gali turėti didelę įtaką. Be to, kad išgauti fermentini, katalizatorių iš produkto ir nesureagavusio substrato, esančio žaliavoje, dažnai reikia panaudoti sudėtingą ir brangią atskyrimo technologiją. Galiausiai, fermentus sunku išsaugoti, išlaikant jų aktyvumą komerciškai priimtinam laikotarpiui ( nuo mėnesių iki metų), be jų užšaldymo ( nuo 4°C iki - 80°C ir iki skysto azoto temperatūros) arba be laikymo vandeniniuose tirpikliuose su atitinkama jonine galia, pH ir t. t.
[0007] Fermentų imobilizacijos būdai, dauguma atvejų, leidžia išvengti šių problemų. Imobilizacij a gali pagerinti fermentinių katalizatorių stabilumą ir apsaugoti jų funkcionalini, integralumą agresyvių tirpiklių aplinkoje bei ekstremaliose temperatūrose, t. y. sąlygose, kurios būdingos pramoniniams ir laboratoriniams cheminiams procesams (Hartmeier, W., Trends in Biotechnology 3: 149-153 (1985)). Nenutrūkstamo srauto procesai gali vykti kolonose su imobilizuoto fermento dalelėmis, pavyzdžiui, kai tirpi žaliava praeina pro tas daleles ir palaipsniui virsta produktu.
[0008] Šiame aprašyme, terminas fermentų imobilizacija reiškia fermentinio katalizatoriaus pervedimą į netirpią būseną, panaudojant prijungimą, inkapsuliaciją arba agregaciją i, makroskopines (10"1 mm) daleles.
[0009] Literatūroje pasirodė eilė vertingų fermentų imobilizacijos būdų apžvalgų (Maugh, T.H., Science 223: 474-47 6 (1984); Tramper, J., Trends in Biotechnology 3: 45-50 (1985)). Maugh aprašė penkis bendrus fermentų imobilizacijos būdus. Tarp jų: adsorbavimas kietuose nešikliuose (tokiuose kaip jonitinės dervos); kovalentinis prijungimas prie nešiklių (tokių kaip jonitinės dervos, poringa keramika arba stiklo rutuliukai); surišimas polimeriniuose geliuose; inkapsuliacija; ir tirpių baltymų nusodinimas, sudarant tarp jų atsitiktinius ir neapibrėžtus skersinius ryšius bifunkcinių reagentų pagalba. Be to, galima imobilizuoti ištisas ląsteles (paprastai negyvas arba padarytas pralaidžiomis), kurios parodė gero lygio aktyvumą (pvz., Nagasawa, T. ir Yamada, H., Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)).
[0010] Kiekviena iš šių imobilizacijos procedūrų turi savo privalumus ir apribojimus ir nei viena iš jų negali būti laikoma optimalia ar dominuojančia. Daugumoje jų, pats fermentinis katalizatorius galiausiai tesudaro tik mažą dali, viso tūrio, kuri, užima medžiaga, esanti cheminiame reaktoriuje. Iš esmės, didžiąją dali, imobilizuotos terpės sudaro inertiška, tačiau dažnai brangi nešiklio medžiaga. Visuose būduose imobilizuo-jančios sąveikos tarp fermentinio katalizatoriaus molekulių ir/arba jų sąveika su nešiklio medžiaga turi polinki, i, atsitiktinumą ir neapibrėžtumą. To pasekoje, nors šios sąveikos ir padidina tam tikru laipsniu fermentinio katalizatoriaus molekulių stabilumą, dėl santykinio jų nespecifiškumo ir netaisyklingumo gauta stabilizacija yra suboptimali ir netolygi. Daugumoje atvejų, pablogėja priėjimas prie fermentinio katalizatoriaus aktyvaus centro. Be to, aprašytieji imobilizacijos būdai neišsprendžia saugojimo ir šaldymo problemų. Kaip taisyklė, tradiciniais būdais imobilizuotais fermentais negalima laisvai manipuliuoti, pavyzdžiui, pakeisti vieną tirpikli, i, kitą, be rizikos suardyti struktūrini, ir funkcini, fermento integralumą. Praktiškai, išskyrus tą atveji,, kai prie nešiklio dalelių prijungiama rišančioj i grupė, tradiciškai imobilizuoti fermentai labai panašūs i, tirpius fermentus ir, kad pastarieji, turi polinki, denatūruotis bei praranda funkcines savybes agresyviose aplinkose. Bendru atveju, imobilizacijos būdai sumažina fermento katalizuojamos reakcijos greitį, lyginant su gaunamu tirpikliuose. Tai apsprendžia apribojimai, susiję su substrato difuzija i, imobilizuoto fermento daleles ir produkto difuzija iš jų (Quiocho, F.A., ir Richards F.M., Biochemistry 5: 4062-4076 (1967)). Neišvengiamas inertinio nešiklio buvimas dalelėse su imobilizuotu fermentu prailgina vidutinį laisvą kelią tarp imobilizuoto fermento dalelių išorės su tirpikliu ir fermentinio katalizatoriaus aktyvaus centro ir, tuo būdu, pasunkina šias difuzijos problemas. Imobilizuotu ląstelių atveju, difuzijos problemos ypač sunkios, net jei ląstelių sienelės ir membranos tuo ar kitu būdu padarytos pralaidžiomis substratui ir produktui. Be to, reikia įvertinti daugybę pašalinių fermentinių aktyvumų, esančius ląstelėje metabolitus ir toksinus, o taip pat, ląstelės stabilumą darbinėje aplinkoje su agresyviais tirpikliais ir ekstremaliomis tempera-tūromis. Patobulinta imobilizacijos metodika, kuri išvengia apribojimų, būdingų šiuo metu egzistuojantiems būdams, būtų naudinga skatinant fermentų, kaip pramoninių katalizatorių, vartoj imą, ■ ypač, jei būtų parodytas jos naudingumas plataus masto gamyboje (Daniels, M.J., Methods in Enzymology 136: 371-379 (1987)).
[0011] Šio išradimo būde, nedideli (10"1 mm) baltymo kristalai iš vandeninių tirpalų arba vandeninių tirpalų su organiniais tirpikliais, kuriuose fermentinis katalizatorius išlieka struktūriškai ir funkciškai stabilus. Labiau priimtiname išpildyme, kristalai yra susiuvami su bifunkciniu reagentu, tokiu kaip glutaraldehidas. Šis susiuvimas stabilizuoja kristalinės gardelės kontaktus tarp atskirų fermento molekulių, sudarančių ši, kristalą. Šios papildomos stabilizacijos dėka, susiūti imobilizuotų fermentų kristalai gali funkcionuoti pakeltose temperatūrose, ekstremaliuose pH ir agresyviose vandeninėse, organinėse ar beveik bevandenėse terpėse, tame tarpe ir jų mišiniuose. Tuo būdu, šio išradimo CLEC gali veikti aplinkose, kuriose nekristalizuoti, nesusiūti, natyvūs fermentai ar tradiciniais būdais imobilizuoti fermentiniai katalizatoriai negali išlaikyti savo funkcinio integralumo.
[0012] Be to, su CLEC, gautais šiuo būdu, galima atlikti liofilizaciją ir gauti liofilizuotus CLEC, kurie tokioje liofilizuotoje būsenoje gali būti laikomi ilgesni, laikotarpį nešaltoje (kambario) temperatūroje ir kurie gali lengvai atsistatyti pasirinktame vandeniniame, organiniame ar maišytame vandeniniame-organiniame tirpiklyje, be amforinės suspensijos suformavimo ir su minimalia denatūracijos rizika.
[0013] Šis išradimas taip pat susijęs su CLEC, gautais aprašytu būdu ir jų panaudojimu laboratorinėje bei
[0014] plataus masto pramoninėje gamyboje pasirinktų medžiagų, tokių kaip chiralinės organinės molekulės, peptidai, angliavandeniai, lipidai ar kiti cheminiai junginiai. Šiuo metu, tos medžiagos paprastai gaunamos tradiciniais cheminiais būdais, kurie reikalauja agresyvių sąlygų (pvz.: vandeninių, organinių ar beveik bevandenių tirpiklių, mišrių vandens-organinių tirpiklių arba aukštų temperatūrų), nesuderinamų su nekristalizuotų, nesusiūtų, natyvių fermentinių katalizatorių funkciniu integra-lumu. Kitos makromolekulės, turinčios katalitini, aktyvumą, taip pat gali būti įtrauktos i, pasiūlytą CLEC technologiją. Tai gali būti kristalizuojantys antikūniai (Lerner, R.A., Benkovic, S.J., ir Schultz, P.G., Science 252: 659-667 (1991)) ir katalizuoj antys polinukleotidai (Cech T.R., Cell 64: 667-669 (1991); Celander, D.W., and Cech, T.R., Science, 251: 401-407 (1991)).
[0015] Šis išradimas taip pat susijęs su pasirinktų produktų gamybos būdu, panaudojant reakcijas, kurias katalizuoj a šio išradimo CLEC.
[0016] Praktiniame šio išradimo būdo pavyzdyje dipeptidilinio dirbtinio saldintojo, aspartamo, chiralinio pirmtako sintezei buvo panaudotas fermentas termolizinas, cinko metaloproteazė. Termolizinas buvo kristalizuotas iš vandeninio 45% dimetilsulfoksido ir 55% 1.4M kalcio acetato, 0,05M natrio kakodilato, prie pH 6,5. Iš gautų kristalų buvo suformuoti termolizino CLEC, susiuvant su glutaraldehidu. Po to termolizino CLEC buvo perkeltas iš vandeninio kristalizacijos tirpalo, kuriame jis buvo pagamintas, i, etilacetato tirpalą, turinti, substratus, N-(benziloksikarbonil)-L-asparagino rūgšti, (Z-L-Asp) ir L-fenilalanino metilo esteri, (L-Phe-OMe) . Termolizino CLEC panaudotas katalizuoti šių dviejų substratų kondensacijos reakciją susintetinti N-(benziloksi-karbonil )-L-aspartil-L-fenilalanino metilo esteri (Z-L-Asp-L-Phe-OMe), kuris yra dirbtinio saldintojo aspartamo dipeptidilinis pirmtakas. Naudojant bet kuri, iš daugelio žinomų būdų (žr. pvz., Lindeberg, G., J. Chem. Ed. 64: 1062-1064 (1987)), galima nuimti apsaugą nuo L-asparagino rūgšties, esančios susintetintame dipeptidiliniame pirmtake, pašalinant benziloksi-karbonilo (Z-) grupę ir tokiu būdu gauti aspartamą.
[0017] Antrame praktiniame šio išradimo būdo pavyzdyje fermentas termolizinas buvo panaudotas termolizino CLEC gavimui. Gautų CLEC aktyvumas ir stabilumas buvo palyginti su tomis pačiomis tirpaus termolizino charakteristikomis prie optimalių sąlygų, o taip pat prie sąlygų su ekstremaliomis pH ir temperatūra, po inkubavimo organiniuose tirpikliuose ir po inkubavimo tirpale su su egzogenine proteaze.
[0018] Fermentas termolizinas buvo kristalizuotas iš 1,2M kalcio acetato ir 30% dimetilsulfoksido tirpalo, prie pH 8,0. Iš gautų kristalų buvo suformuoti termolizino CLEC, susiuvant su 12,5% glutaraldehidu. Po to termolizino CLEC buvo liofilizuotas, naudojant standartinę procedūrą (Cooper, T.G., The Tools of Biochemistry, pp. 379-380 (John Wiley and Sons, NY
[0019] (1977)), ir buvo gautas liofilizuotas termolizino CLEC. Po to šis liofilizuotas CLEC buvo tiesiogiai perkeltas i įvairius pasirinktus vandeninius, organinius ar maišytus vandens-organinius tirpiklius, be tarpinės tirpiklių keitimo procedūros, be amorfinių suspensijų formavimo ir su minimalia denatūracijos rizika. Tarp šių tirpiklių buvo acetonitrilas, dioksanas, acetonas ir tetrahidrofuranas, bet galima panaudoti ir kitus. Po inkubacijos, aktyvumas buvo tiriamas spektrofoto-metriniu būdu, skaidant dipeptidinį substratą FAGLA (furilakriloil-glicil-L-leucino amidą). Trečiame praktiniame šio išradimo būdo pavyzdyje fermentas elastazė (iš kiaulės kasos) buvo kristalizuotas iš 5,5 mg/ml baltymo, 0,1M natrio acetato vandeninio tirpalo, prie pH 5,0 ir kambario temperatūroje (Sawyer, L. ir kt., J. Mol. Biol. 118: 137-208). Iš gautų kristalų buvo suformuoti elastazės CLEC, susiuvant su 5% glutaraldehidu. Elastazės CLEC buvo liofilizuotas kaip aprašyta 2 pavyzdyje.
[0020] Ketvirtame praktiniame šio išradimo būdo pavyzdyje, kaip čia atskleista, fermentas esterazė (iš kiaulės kepenų) buvo kristalizuotas iš 15 mg/ml baltymo ir 0,25M kalcio acetato vandeninio tirpalo, prie pH 5,6 ir kambario temperatūroje. Iš gautų kristalų buvo suformuoti esterazės CLEC, susiuvant su 12,5% glutaraldehidu. Esterazės CLEC buvo liofilizuotas kaip aprašyta 2 pavyzdyje.
[0021] Penktame praktiniame šio išradimo būdo pavyzdyje, kaip čia parodyta, fermentas lipazė ( Geotrichum candidum) buvo kristalizuotas iš 20 mg/ml baltymo, 0,50M Tris vandeninio tirpalo, prie pH 7 ir kambario tempera-tūroje. Iš gautų kristalų buvo suformuoti lipazės CLEC, susiuvant su 12,5% glutaraldehidu. Lipazės CLEC buvo liofilizuotas kaip aprašyta 2 pavyzdyje.
[0022] Šeštame praktiniame šio išradimo būdo pavyzdyje fermentas lizocimas (iš vištos kiaušinio baltymo) buvo kristalizuotas iš 40 mg/ml baltymo, 40 mM natrio acetato buferio, turinčio 5% natrio chlorido, vandeninio tirpalo, prie pH 7,4 ir kambario tempera-tūros (Blake, C.C.F. ir kt., Nature, 196: 1173 (1962)). Iš gautų kristalų buvo suformuoti lizocimo CLEC, susiuvant su 20% glutaraldehidu. Lizocimo CLEC buvo liofilizuotas kaip aprašyta 2 pavyzdyje.
[0023] Septintame praktiniame šio išradimo būdo pavyzdyje fermentas asparaginazė ( Escherichia coli) buvo kristalizuotas iš 25 mg/ml baltymo, 50 mM natrio acetato ir 33% etanolio vandeninio tirpalo, prie pH 5,0 ir ir 4°C. Kristalizacijai panaudota modifikuota procedūra, aprašyta Grabner ir kt. [U.S. Patent 3664926 (1972)] . Iš gautų kristalų buvo suformuoti asparaginazės CLEC, susiuvant su 7,5% glutaraldehidu. Asparaginazės CLEC buvo liofilizuotas kaip aprašyta 2 pavyzdyje.
[0024] Panašiai gali būti imobilizuotos ir panaudotos atitinkamų reakcijų katalizei liuciferazė ir ureazė. Kiti fermentai, tokie kaip nurodyti 1-5 lentelėse, taip pat gali būti kristalizuoti ir susiūti pagal ši, būdą, o gauti CLEC gali būti panaudoti kristalizavimui reakcijų, kurių pagalba gaunamas pasirinktas produktas, arba reakcijų, kurios yra tarpinis žingsnis (t.y. viena iš eilės reakcijų) pasirinkto produkto gamyboje. Kaip žinoma, nors skersinis susiuvimas padeda stabilizuoti daugumą kristalų, jis nėra būtinas ar pageidautinas visais atvejais. Kai kurie kristaliniai fermentai išlaiko funkcini, ir struktūrini, integralumą agresyviose aplinkose, net jei neatliktas susiuvimas. Nors labiau priimtiname išpildyme kristalai yra susiuvami, skersinių jungčių sudarymas ne visada būtinas, kad pagamintume naudingą fermentini, kristalą pagal ši, būdą.
[0025] Fermentiniai CLEC turi keletą svarbių charakteristikų, kurios jiems suteikia reikšmingą pranašumą lyginant su šiuo metu vartojamais tradiciniais fermentų imobilizavimo būdais. Fermentiniams CLEC nereikia atskiros inertinės nešančiosios struktūros. Be inertinio nešiklio pagerėja substrato ir produkto difuzija CLEC viduje ir galima kristale gauti fermento koncentraciją, artimą teorinei tokio dydžio molekulių supakavimo ribai. Aukštos fermento koncentracijos gali duoti žymią gamybinę ekonomiją, dėka efektyvinio aktyvumo išaugimo duotame katalizatoriaus tūryje, substrato ir fermento kontaktavimo laiko sutrumpėjimo ir bendro gamyklos dydžio bei kapitalinių įdėjimų sumažėjimo (Daniels, M.J., Methods in Enzymol. 136: 371-379 (1987)). Tolygus pasiskirstymas kristalo tūryje ir padidintas CLEC sudarančių fermentų stabilumas sukuria naujas galimybes fermentinės katalizės panaudojimui agresyviose aplinkose, tokiose kaip aukštos temperatūros, vandeniniai, organiniai ar beveik bevandeniai tirpikliai, o taip pat jų mišiniai. Be to, apribotas tirpiklio priėjimas ir taisyklinga baltymų aplinka, kuri būdinga kristalinei gardelei, leidžia fermentiniams CLEC geriau išlaikyti metalo jonus ir kofaktorius, palyginus su tradicinėmis fermentų imobilizavimo sistemomis.
[0026] Fig. 1 grafiškai pavaizduoti tirpaus termolizino ir
[0027] termolizino CLEC aktyvumų įvertinimo rezultatai.
[0028] Fig. 2 grafiškai pavaizduotas termolizino CLEC ir tirpaus termolizino priklausomybių nuo pH palyginimas. Fig. 3 grafiškai pavaizduoti tirpaus ir kristalinio termolizino aktyvumo matavimai po inkubacijos prie 65°C. Fig. 4 grafiškai pavaizduoti tirpaus termolizino ir termolizino CLEC atsparumo egzogeninei proteolitinei degradacijai įvertinimo rezultatai. Fig. 5 grafiškai pavaizduoti tirpios elastazės ir atitinkamo elastazės CLEC fermentinių aktyvumų įvertinimo rezultatai. Fig. 6 grafiškai pavaizduoti tirpios elastazės ir atitinkamo elastazės CLEC atsparumai egzogeninei proteolitinei degradacijai. Fig. 7 grafiškai pavaizduoti tirpios esterazės ir atitinkamo esterazės CLEC fermentinių aktyvumų įvertinimo rezultatai. Fig. 8 grafiškai pavaizduoti tirpios esterazės ir atitinkamo esterazės CLEC atsparumai egzogeninei proteolitinei degradacijai. Fig. 9 grafiškai pavaizduoti tirpios lipazės ir atitinkamo lipazės CLEC fermentinių aktyvumų įvertinimo rezultatai. Fig. 10 grafiškai pavaizduoti tirpaus lizocimo ir atitinkamo lizocimo CLEC fermentinių aktyvumų įvertinimo rezultatai. Fig. 11 grafiškai pavaizduoti tirpios asparaginazės ir atitinkamo asparaginazės CLEC fermentinių aktyvumų įvertinimo rezultatai.
[0029] Būtų labai naudinga, turėti paprastą ir bendrą būdą, užtikrinantį duoto fermento ar jų rinkinio stabilumą ir funkcionavimą prie sąlygų, kurios domina chemiką, užsiimantį sinteze, ir kurios yra perdaug agresyvios, kad galėtų būti panaudoti šiuo metu žinomi fermentiniai būdai. Susiūti imobilizuoti fermentų kristalai (toliau sutrumpintai CLEC arba CLIFC), kaip čia aprašyta, gali būti panaudoti šiam tikslui. Kristalinės gardelės bei sudarančių kristalą fermentinių katalizatorių stabili-zavimas, panaudojant skersinio susiuvimo reakciją, leidžia vartoti CLEC tokiose aplinkose, kaip vandeniniai, organiniai ar beveik bevandeniai tirpikliai, šių tirpiklių mišiniai, kraštutinės pH reikšmės ir aukštos temperatūros, kurios nesuderinamos su fermentų funkcionavimu, naudojantis šiuo metu esamais būdais. Be to, CLEC kristalinės gardelės stabilizacija, leidžia jiems pritaikyti standartinius liofilizacijos būdus. Liofilizuoti CLEC gali būti išsaugomi be užšaldymo komerciškai priimtiną laiko periodą (nuo mėnesių iki metų), o taip pat sudaro galimybę greitai ir paprastai panaudoti CLEC pramoninio ir laboratorinio masto procesuose, tiesiog sumaišant su pasirinktu tirpikliu be jokių tarpinių tirpiklio keitimų. Be to fermentiniai CLEC yra labai atsparūs egzogeninių proteazių poveikiui. Šio išradimo būdas palengvina lanksčių fermentinių katalizatorių panaudojimą pagrindiniuose pramoniniuose cheminiuose procesuose, o taip pat laboratorinėje sintezėje, ieškant naujų junginių.
[0030] Nors susiuvimas pagerina kristalinio fermento stabilumą, ne visais atvejais jis yra būtinas ir pageidautinas. Kai kurie kristaliniai fermentai išlaiko funkcinį ir struktūrinį integralumą agresyviose aplinkose ir be skersinių ryšių. Labiau priimtiname šio būdo išpildyme kristaliniai fermentai yra susiuvami, kaip smulkiai aprašyta tolesniuose skyriuose. Tačiau turi būti suprasta, jog kristalizuoti fermentai, nepraėję tolimesnės skersinio susiuvimo stadijos, gali būti panaudoti kai kuriuose šio išradimo išpildymuose.
[0031] Reguliarios sąveikos tarp CLEC kristalinę gardelę sudarančių fermentų molekulių apsprendžia riboto dydžio poras, vedančias prie fermento molekulių CLEC viduje. Todėl substratai, didesni už porų dydį, negali patekti į CLEC dalelių vidų.
[0032] Dėl riboto porų dydžio, daugelis fermentinių reakcijų, turinčių komercinę ir mokslinę reikšmę, bet susijusių
[0033] su substratais, didesniais nei CLEC porų dydis, turėtų likti už šio išradimo ribų. Tarp jų patektų daugumas reakcijų, susijusių su dideliais polimerais, tokiais kaip baltymai, polinukleotidai, polisacharidai ir kiti organiniai polimerai, kuriuose polimerinių subvienetų skaičius būtų toks, jog polimeras pasidarytų didesnis už CLEC kristalų porų dydį. Tačiau, tokiais atvejais, katalizė, vis dėlto, gali vykti CLEC paviršiuje.
[0034] Šis išradimas yra pasirinkto baltymo tame tarpe fermento imobilizavimo būdas, kristalizuojant ir susiuvant ši, baltymą, to rezultate, gautas susiūtas imobilizuotas fermento kristalas (CLEC), gali būti panaudotas norimų produktų gamybos katalizavimui, tokių, kaip peptidai, angliavandeniai, lipidai ir chiralinės organinės molekulės. Be to šis išradimas susijęs su CLEC ir su pasirinkto produkto gamybos būdu, panaudojant CLEC katalizuojamą reakciją arba CLEC katalizuojamą žingsnį, tokių reakcijų sekoje. Viename iš šio išradimo išpildymų kondensacijos reakcijoje, katalizuojamoje susiūtu imobilizuotu termolizinu, gautu pagal šį būdą, buvo pagamintas dipeptidilinis aspartamo pirmtakas. Kitame šio išradimo išpildyme buvo skaldomas indikatorinis substratas, FAGLA, ir gauti kolorimetri-niai produktai, kurių atsiradimas parodo termolizino CLEC fermentinį aktyvumą. FAGLA - hidrolizė buvo panaudota kaip modelinė reakcija, kad parodyti termolizino CLEC atsparumą visai eilei aplinkų, kurios paprastai būtų nesuderinamos su šio fermento aktyvumu.
[0035] Kituose šio išradimo išpildymuose fermentai elastazė, lipazė, asparaginazė ir lizocimas buvo panaudoti įvairių indikatorinių medžiagų skaldymui, tokių, kaip p-nitrofenilo acetatas (esterazė ir lipazė), sukcinil-(ala)3-p-nitroanilidas (elastazė), 4-metilumbeliferilo N-acetil-chitriozidas (lizocimas) ir NADH (asparaginazė). Pasinaudodamas šio išradimo būdu, vidutinis šios srities specialistas gali pritaikyti protokolą reikalingo produkto gamybai, panaudojant reakciją, katalizuojamą imobilizuotu fermentu. Po to, kai dominantis fermentas yra iškristalizuotas iš atitinkamo tirpalo, jis gali būti susiūtas su glutaraldehidu ar su kitu tinkamu bifunkciniu reagentu kristalizacijos tirpale, kad būtų gautas šio fermento CLEC. Vėliau, pasirinkto fermento CLEC gali būti liofilizuotas, kaip aprašyta 2 pavyzdyje.
[0036] CLEC naudojimas turi keletą privalumų, lyginant su šiuo metu egzistuojančiais fermentinės katalizės būdais. Pavyzdžiui, susiūta kristalinė matrica yra pačio CLEC nešiklis, todėl fermentinio katalizatoriaus surišimui nereikalingi brangūs nešikliai, rutuliukų, stiklo, gelių ar plėvelių pavidalo, kaip šiuo metu egzistuojančiuose fermentinės katalizės būduose. Todėl fermentų koncentracija fermentiniame CLEC yra artima teorinei supakavimo ribai, kurią galima pasiekti tokio dydžio molekulėms, ir žymiai viršija tankį pasiekiamą net koncentruotuose tirpaluose. Visas CLEC sudarytas tik iš aktyvaus fermento (nėra neaktyvaus nešiklio), todėl turėtų būti minimizuotas, susietas su difuzija fermentinės reakcijos greičio sumažėjimas, kuris paprastai stebimas tradiciškai imobilizuotuose fermentuose, lyginant su fermentais tirpale, kadangi CLEC atveju žymiai sutrumpėja (lyginant su tradiciškai imobilizuotu fermentų nešiklio dalelėmis) vidutinis laisvas kelias, kuri, turi nueiti substratas ir produktas tarp išorinio laisvo tirpiklio ir aktyvaus fermento. Šie dideli baltymų tankiai gali būti ypatingai naudingi biosensoriniuose, analitiniuose ar kituose pritaikymuose, kurie reikalauja didelių baltymų kiekių mažuose tūriuose. Didesnis CLEC našumas ir kompaktiškumas pramoniniuose procesuose gali duoti reikšmingą gamybos ekonomiją, dėl padidinto katalizatoriaus efektyvinio aktyvumo duotame tūryje;' kas leidžia sumažinti gamyklos dydi,, o taip pat kapitali-nius įdėjimus ( Daniels, M- J., Methods in Enzymol. 136: 371- 379 ( 1987)). CLEC yra santykinai monodispersipis ir
[0037] t
[0038] jo makroskopinis dydis bei forma atspindi atskiro fermentinio katalizatoriaus natūralaus kristalo augimo charakteristikas. Egzistuojančių terpių su fermentais, imobilizuotais nešikliuose, pakeitimas fermentiniais CLEC, turėtų būti nesudėtingas, kadangi abi siistemos yra panašaus dydžio ir formos ir abi gali būti panašiai išgautos iš žaliavos, panaudojant eilę paprastų' būdų, tame tarpe panaudojant pagrindines ekonomiškas procedūras tokias kaip filtravimą, centrifugavimą, tirpiklių dekantavimą ir kitas.
[0039] Be to, naudojant liofilizuotus CLEC supaprastėja kasdienis elgesys su jais ir šių medžiagų saugojimas prieš jų pavartojimą ( sausas saugojimas ilgesnį laikotarpį kambario temperatūroje be šaldymo). Liofilizuotus CLEC paprasta vartoti, nes prie jų galima tiesiogiai pridėti norimą tirpiklį ir substratą be ilgų tirpiklio keitimo procesų ir amorfinės suspensijos formavimo. Liofilizuota CLEC forma praplečia bendrą fermentų kaip katalizatorių panaudojimą, leisdama panaudoti platesnį fermentų bei jų funkcionavimo sąlygų spektrą.
[0040] Antras CLEC privalumas yra tas, kad kristalizuoto fermento susiuvimas stabilizuoja ir sustiprina kristalinę gardelę ir ją sudarančias fermentų molekules tiek mechaniškai, tiek ir chemiškai. Todėl CLEC gali būti vienintelė priemonė pasiekti dideles aktyvaus fermentinio katalizatoriaus koncentracijas agresyviuose vandeniniuose, organiniuose, beveik bevandeniuose tirpikliuose ar vandens- organinių tirpiklių mišiniuose. Fermentinių katalizatorių panaudojimą organinėje sintezėje stabdė jų polinkis denatūruotis nevandeninių tirpiklių aplinkoje, ypač vandeniniu ir nevandeninių tirpiklių mišiniuose ( Klibanov, A. M., Trends in Biochemical Sciences, 14: 141- 144 ( 1989)). Fermentiniuose CLEC stabilumą apsprendžiantys konformacinio mobilumo apribojimai yra sąlygoti tarpmolekulinių kontaktų ir skersinių ryšių tarp kristalų gardelę sudarančių fermento molekulių, o ne beveik visiško vandens nebuvimo terpėje. Todėl, fermentai CLEC formoje gali toleruoti tarpines vandens koncentracijas, kas anksčiau buvo neįmanoma ( žr. 12 lentelę). Komerciniuose taikymuose vandens- organinių tirpiklių mišiniai leidžia valdyti produktų formavimą, pasinaudojant produktų ir substratų santykiniu tirpumu. Cheminio reaktoriaus viduje net vandeninėje terpėje imobilizuoti ar tirpūs fermentiniai katalizatoriai yra veikiami mechaniškai, todėl jie gali denatūruotis arba gali sutrumpėti jų gyvenimo pusperiodis. Cheminiai skersiniai ryšiai CLEC viduje suteikia būtiną mechanini, stiprumą ( Quiocho ir Richards, Proc. Natl. Acad. Sci. ( USA) 52: 833-839 ( 1964)), kurio dėka pailgėja fermentinių katali-zatorių išgyvenimas reaktoriuje.
[0041] Trečias CLEC privalumas yra sąlygotas jų kristalinės kilmės, dėl kurios galima pasiekti tolygumą visame susiūto kristalo tūryje. Kaip čia aprašyta, kristaliniai fermentai yra auginami ir susiuvami vandeninėje aplinkoje ir todėl molekulių išsidėstymas kristalinėje gardelėje išlieka tolygus ir taisyklingas. Šis tolygumas yra palaikomas tarpmolekulinių kontaktų ir cheminių skersinių ryšių tarp kristalinę gardelę sudarančių fermento molekulių ir išlieka perkėlus i kitą vandeninę, organinę ar beveik bevandenę terpę ar maišytus vandens- organinius tirpiklius. Visuose šiuose tirpikliuose fermento molekulės išlaiko pastovų tarpusavio atstumą, suformuodamos gerai apibrėžtas stabilias poras CLEC viduje, kurios palengvina substrato priėjimą prie fermentinio katalizatoriaus, o taip pat produkto pašalinimą. Fermento aktyvumo tolygumas yra labai svarbus pramoniniuose, medicininiuose ir analitiniuose taikymuose, kuriuose pasikarto-jamumas ir stabilumas turi pirmaeilę svarbą.
[0042] Ketvirtas CLEC privalumas yra tas, kad kristalinėje formoje fermentai gali turėti ilgesni, darbo ir saugojimo pusperiodi,. Kaip žinoma, gardelės sąveikos, net ir be skersinių jungčių, stabilizuoja baltymus, dalinai dėl to, kad apriboja konformacinius laisvės laipsnius, reikalingus baltymo denatūracij ai. CLEC gardelinės sąveikos, fiksuotos cheminiais skersiniais ryšiais, ypatingai reikšmingos denatūracijos apribojimui, ypač, vandeninių ir nevandeninių tirpiklių mišiniuose ( Klibanov, A. M., Trends in Biochemical Sciences, 14: 141- 144 ( 1989)). Fermentai, kurie išbuvo kristalinėje būsenoje mėnesius ar metus, paprastai išlaiko dideli, procentą savo katalitinio aktyvumo. Susiūti imobilizuotų fermentų kristalai saugoti bevandeniuose tirpikliuose būtų dar labiau apginti nuo mikrobinio užterštumo ir pažeidimo, kas sudaro rimtą problemą saugant didelius kiekius baltymų turtingoje maistinėmis medžiagomis vandeninėje terpėje. Liofilizuotų CLEC atveju, imobilizuoti fermentai saugomi be tirpiklio. Tai ir susiuvimo pagalba pasiekta stabilizacija, leidžia ilgalaiki, CLEC saugojimą be šaldymo.
[0043] Penktas CLEC privalumas yra tas, kad dėl kristalinės gardelės stabilizavimo skersinėmis jungtimis jie gali turėti padidintą temperatūrini, atsparumą. Reakcijos vykdymas aukštesnėje temperatūroje negu tradiciniuose būduose gali padidinti dominančių reakcijų greiti, tiek termodinamiškai, tiek ir pagerinant difuzijos greiti, i, ir iš CLEC kristalinės gardelės. Šių efektų visuma įneštų pagrindini, indėlį į reakcijos efektyvumo padidinimą, kadangi jie maksimizuotų produktyvumą duotam fermentinio katalizatoriaus kiekiui, kuris bendru atveju yra brangiausia reakcijos proceso sudedamoji dalis (Daniels, M.J., Methods in Enzymol. 136: 371-379 (1987)). CLEC temperatūrinis stabilumas yra išskirtinis, kadangi daugumas fermentinių sistemų reikalauja švelnių reakcijos sąlygų. CLEC taip pat turėtų būti atsparūs denatūracijai, sąlygotai laikino temperatūros pakilimo saugojimo metu.
[0044] Paskutinis CLEC privalumas susijęs su taisyklingos formos ir dydžio poromis tarp fermento molekulių jo kristalinėje gardelėje. Šis tirpiklio priėjimo apribo-jimas stipriai pagerina metalo jonų ir kofaktorių išlaikymą CLEC kristaluose, lyginant su tradiciškai imobilizuotais fermentais ir fermentais tirpaluose. Ši CLEC savybė duotų galimybę panaudoti ekonomiškai labiau apsimokančius nenutrūkstančio srauto procesus tose situacijose (žr. pvz., Oyama ir kt. Methods in Enzymol. 136: 503-516 (1987)), kuriuose, kitu atveju, fermentai būtų inaktyvuoti dėl metalo jonų arba kofaktorių išplovimo. Pavyzdžiui, kaip žinoma dipeptidilinio aspartamo pirmtako Z-L-Asp-L-Phe-OMe sintezėjee, dalyvaujant termolizinui, tradiciniais būdais imobilizuotas fermentas praranda savo katalitinį aktyvumą nenutrūkstamo srauto procesuose, iš dalies dėl kalcio jonų, svarbių termolizino aktyvumui, išplovimo. Praktiškai kalcio jonų išplovimas verčia naudoti mažiau efektyvius ciklinius procesus (Nakanishi ir t., Biotechnology 3: 459-464 (1985)). Išplovimas įvyksta kada susiformuoja kalcio jonų kompleksai su substratu Z-L-Asp, konkuruojantys su natūraliais kalcio surišimo saitais fermento paviršiuje, dėl ko ir prarandamas katalitinis aktyvumas. Didelis fermentų tankis ir atitinkamai ribotas tūris prieinamas tirpikliui CLEC tarpsluoksniuose, trukdo susidaryti kontroliuojantiems L-Asp-Ca+^ kompleksams, kurie atsakingi už metalo jonų išplovimą.
[0045] Šio išradimo būde susiūtas imobilizuotas fermento kristalas (arba CLEC) gaunamas sekančiai: Fermentiniai kristalai auginami kontroliuojant fermento nusodinimą iš vandeninio tirpalo arba vandeninio tirpalo su organiniais tirpikliais. Tarp sąlygų, kurios turi būti kontroliuojamos, yra, pavyzdžiui, tirpiklio išgarinimo greitis, pridėjimas i, tirpalą atitinkamų ištirpusių medžiagų ir buferių ir pH bei temperatūra. Išsami įvairių faktorių, veikiančių baltymų kristalizaciją, apžvalga buvo išspausdinta McPherson (Methods Enzymol. 114: 112 (1985)). Be to, tiek McPherson tiek ir Gilliland (J. Crystal Growth 90: 51-59 (1988)) suformavo išsamų sąrašą visų baltymų bei nukleotidinių rūgščių, kurios buvo kristalizuotos, taip pat sąlygas, prie kurių vyko jų kristalizacija. Kristalų bei kristalizacijos receptų rinkinys, o taip pat duomenų saugykla apie tirpių baltymų ir nukleotidinių rūgščių kristalų struktūras yra palaikomi Baltymų Duomenų Banke (Protein Data Bank) (Bernstein ir kt. J. Mol. Biol. 112: 535-542 (1977)) nacionalinėje Brookhaven laboratorijoje. Šie šaltiniai gali būti panaudoti nustatymui būtinų kristalizacijos sąlygų tiems baltymams ir fermentams, kurie anksčiau buvo kristalizuoti, prieš pradedant formuoti atitinkamus CLEC arba jais galima vadovautis, formuojant kristalizacijos strategiją tiems baltymams, kurie prieš tai nebuvo kristalizuoti. Kita galimybė, tai intelektuali bandymų ir klaidų paieškos strategija (žiūr. pvz., Carter, C.W. Jr. and Carter, C.W., J. Biol. Chem. 254: 12219-12223 (1979)), kuri daugeliu atvejų duoda priimtinas kristalizacijos sąlygas daugumai baltymų, tame tarpe, bet ne tik jiems, kurie buvo aptarti aukščiau, jeigu gali būti pasiektas
[0046] priimtinas šių baltymų švarumo lygis. Reikalingas švarumo lygis nuo baltymo prie baltymo gali kisti plačiose ribose. Pavyzdžiui, lizocimo atveju fermentas buvo kristalizuotas iš jo nevalyto šaltinio - vištos kiaušinio baltymo ( Gilliland, G. L., J. Crystal Growth 90: 51- 59 ( 1988)).
[0047] Kad galėtų būti panaudoti kaip CLEC pagal šio išradimo būdą, fermentiniai kristalai neturi būti tokie dideli, kaip naudojami rentgeninėje difrakcinėje analizėje ir faktiškai tokie kristalai yra nepageidautini dėl difuzinių problemų, surištų su jų dydžiu. Mikro-kristalinė medžiaga ( t. y. kristalai lCf^ nm dydžio/ skersinio pjūvio) gali būti naudojama kaip CLEC ir dažnai aptinkama, nors retai aprašoma rentgeninės kristalografijos literatūroje. Mikrokristalai labai naudingi šio išradimo būde, nes leidžia sumažinti iki minimumo problemas, susijusias su difuzija ( žr. pvz., Quiocho, F. A., and Richards, F. M., Biochemistry 5: 4062- 4076 ( 1967)).
[0048] Aplamai, kristalai gaunami maišant baltymus, kurie turi būti kristalizuoti, su atitinkamu vandeniniu tirpikliu arba vandeniniu tirpikliu, turinčiu reikalingą nusodinimo agentą, tokį kaip druskos ar organinės medžiagos. Tirpiklis sumaišomas su baltymu prie eksperimentiškai nustatomos temperatūros, kuri tinka kristalizacijos indukavimui bei leidžia baltymams išlaikyti jų stabilumą ir aktyvumą. Esant reikalui, tirpiklis gali turėti papildomų tirpių medžiagų, tokių kaip dvivalenčiai katijonai, kofaktoriai ar chaotropai, o taip pat buferines medžiagas pH kontrolei. Ar reikia papildomų ištirpusių medžiagų ir turi būti jų koncentracijos tam kad pagerintų kristalizaciją, nustato eksperimentiškai. Plataus masto pramoniniuose procesuose, kristalizaciją per kontroliuojamą nusodinimą geriausia atlikti paprasčiausiai maišant baltymus, nusodintoją, papildomas ištirpintas medžiagas ir, esant būtinybei, buferius cikliniame procese. Taip pat galima pritaikyti alternatyvius laboratorinius kristalizacijos būdus, tokius kaip dializė ar garų difuzija. McPherson ( Methods Enzymol. 114: 112 ( 1985)) ir Gilliland ( J. Crystal Growth 90: 51- 59 ( 1988)) savo kristalizacijos literatūros apžvalgose yra įtraukę išsamų tinkamų sąlygų sąrašą. Retkarčiais nesuderinamumas tarp susiuvančio reagento ir kristalizacijos terpės gali pareikalauti perkelti kristalus į labiau tinkamą tirpikli,.
[0049] Daugumas baltymų, kurių kristalizacijos sąlygos jau aprašytos literatūroje, jau sukaupę žymų potencialą kaip praktiniai fermentiniai katalizatoriai pramoniniuose ir laboratoriniuose cheminiuose procesuose, ir iš jų tiesiogiai galima suformuoti CLEC pagal šio išradimo būdą. 1 lentelėje pateikti fermentų pavyzdžiai, kurie buvo kristalizuoti anksčiau. Reikia pažymėti, kad sąlygos, pateiktos šiose nuorodose, buvo optimizuotos didelių difrakcinės kokybės kristalų auginimui, dažnai pridedant milžiniškas pastangas. Mažesniems kristalams, naudojamiems CLEC sudaryme, kai kuriais atvejais gali tekti šiek tiek paderinti kristalizacijos sąlygas.
[0050]
[0051] Po to, kai kristalai išauginti tinkamoje terpėje, juos galima susiūti. Skersinis susiuvimas stabilizuoja kristalinę gardelę, įvesdamas kovalentines jungtis tarp kristalą sudarančių fermento molekulių. Tai sudaro galimybes perkelti fermentą i, kitą reakcinę terpę, kuri kitaip gali būti nesuderinama su kristalinės gardelės ar net su intaktinio nedenatūruoto baltymo egzistavimu. Susiuvimą galima atlikti įvairiausių bifunkcinių reagentų pagalba, nors praktiškai dažniausiai vartojamas pigus ir paprastas glutaraldehidas. (Kitų galimų susiuvimo reagentų sąrašą galima rasti, pavyzdžiui, 1990 m. Pierce Chemocal Company kataloge).
[0052] Skersinis susiuvimas su glutaraldehidu suformuoja stiprius kovalentinius ryšius pirmiausia tarp lizino amino rūgšties liekanų pačioje fermento molekulėje ir tarp fermento molekulių, sudarančių kristalą. Susiuvimo sąryšiai neleidžia kristalą sudarančioms fermento molekulėms grįžti į tirpalą, efektyviai padaro netirpiomis arba imobilizuoja fermento molekules į mikrokristalines (idealiu atveju 10"1 mm) daleles. Po to makroskopiniai, imobilizuoti, netirpūs kristalai gali būti lengvai atskiriami nuo produkto ir nesureagavusio substrato, esančių žaliavoje, paprastų procedūrų, tokių kaip filtravimas, dekantavimas ir kt., pagalba. Juos taip pat galima panaudoti nenutrūkstančio srauto procesų kolonose, užpildomose fermentiniu CLEC, kuriose jis pasižymi geresniu kofaktorių ir metalo jonų išlaikymu.
[0053] Pagal šio išradimo būdą fermentiniai CLEC daromi kaip fermentiniai katalizatoriai, kurie gali veikti egzistuojančiose ir naujose aplinkose. Padidintas CLEC stabilumas, kurį nulemia skersinio susiuvimo reakcija, leidžia juos perkelti į tirpiklius (pvz., vandeninius, organinius ar beveik bevandenius tirpiklius arba jų mišinius), su kuriais, kitu atveju, fermentinis CLEC būtų nesuderinamas, ir leidžia vykdyti operacijas cheminiuose reaktoriuose su pakelta temperatūra ir ekstremaliais pH. Makroskopinėmis katalizuojančiomis CLEC dalelėmis lengva manipuliuoti, nes jas galima išgauti iš žaliavos tokiais paprastais būdais, kaip filtravimas, centrifugavimas arba dekantavimas iš tirpiklio. Be to, jas galima naudoti nenutrūkstamo srauto procesų kolonose.
[0054] Vienas tūris susiūtų termolizino kristalų suspensijos buvo liofilizuojamas per naktį dešimtyje tūrių demineralizuoto vandens, esant pH 7,0, panaudojant liofilizatorių VirTis Modelis #24. Liofilizuoti kristalai buvo atstatomi pridedant dešimt tūrių pasirinkto tirpiklio tiesiai prie kristalų, kurie prieš tai buvo laikomi kambario arba 4°C temperatūroje. FAGLA skaldymo eksperimentams, rehidratuoti kristalai buvo atstatomi 10 mM kalcio acetato buferyje, prie pH 7. Atstatyti liofilizuoti CLEC paprastai buvo saugomi kambario temperatūroje. Palyginimui, kad tirpus fermentas išlaikytų specifini, aktyvumą ilgiau nei savaitę, j j, reikia laikyti prie -70°C. Tokia saugojimo ir apdorojimo tvarka buvo pritaikyta fermentams, aprašytiems čia pateiktuose pavyzdžiuose.
[0055] Šio išradimo būdas, pagal kuri, gaminami susiūti kristaliniai fermentai, aprašytas žemiau ir pailius-truotas gamyba termolizino susiūtų imobilizuotų fermen-tinių kristalų, naudojamų aspartamo dipeptidilinio pirmtako gavimui etilo acetate, kuris yra beveik bevandenis organinis tirpiklis. Termolizinas jau buvo
[0056] kristalizuotas ir jo struktūra išaiškinta iki 1, 6A skiriamosios gebos (Holmes and Matthews, J. Mol. Biol. 160: 623-639 (1982)), ir yra vienas iš fermentų, kuri, galima naudoti kaip CLEC pagal ši, būdą. Termolizinas naudojamas dirbtinio saldintojo aspartamo gamyboje (Isowa ir kt. U.S. Patent #4436925 (1984); Lindeberg, J. Chem. Ed. 64: 1062-1064 (1987); Nakanishi ir kt., Biotechnology 3: 459-464 (1985); Oyama, ir kt., Methods in Enzymol. 136: 503-516 (1987)). Pasirodo, didžioji dalis aspartamo šiuo metu gaminama tradiciniais sintetinės chemijos būdais, nors tradiciškai imobilizuoto termolizino panaudojimas beveik benvandenėje terpėje davė skatinančius rezultatus (Oyama ir kt., J. Org. Chem. 46: 5242-5244 (1981); Nakanishi ir kt., Biotechnology 3: 459-464 (1985)). Pagerintas, panaudojant šio išradimo būdą, aspartamo fermentinis gamybos būdas galėtų konkuruoti su šiuo metu naudojamais gamybos būdais tiek patogumo, tiek ir kainos požiūriu (Oyama, ir kt., Methods in Enzymol. 136: 503-516 (1987)).
[0057] Šio išradimo būdas buvo panaudotas termolizino CLEC gamyboje, ir buvo įvertinti gautų termolizino CLEC stabilumas ir priklausomybė nuo pH, stabilumas prie pakeltų temperatūrų, atsparumas egzogeninei proteolizei ir stabilumas organiniuose tirpikliuose. Termolizino CLEC palyginimas su tirpiu termolizinu smulkiau aprašytas 2 pavyzdyje ir 1-4 pav. Įvertinimo rezultatai parodė:
[0058] 1. Kas dėl priklausomybės ir stabilumo nuo pH, tai abi formos rodė maksimalų aktyvumą prie pH 7 ir turėjo panašų aktyvumą rūgštiniame diapazone. Šarminiame diapazone termolizino CLEC išlaikė maksimalų aktyvumą iki pH 10; tirpus termolizinas prie pH 8,5 turėjo 75% aktyvumo, prie pH 9 - 25% aktyvumo ir prie pH 9,5 buvo visiškai neaktyvus. 2. Papildomas stabilumas, gaunamas fermentiniuose CLEC, leidžia jiems išlaikyti fermentini, aktyvumą prie aukštesnių temperatūrų, nei tai įmanoma tirpaus termolizino atveju. Padidintas termolizino CLEC stabilumas prie žemesnių temperatūrų supaprastina jų saugojimą, lyginant su tirpiu fermentu. Termolizino CLEC, taip pat, parodė terminį stabilumą ir atsparumą autolizei, nes išlaikė maksimalų aktyvumą po 5 dienų inkubacijos prie 65°C. Priešingai, tirpus termolizinas prarado 50% savo pradinio aktyvumo po 2 valandų inkubacijos ir parodė vos pastebimą aktyvumą po 24 valandų inkubacijos prie 65°C. 3. Fermentinis termolizino CLEC aktyvumas nepakito po 4 dienų inkubacijos galingos streptokokinės proteazės, Pronase®, aplinkoje. Priešingai, tirpus termolizinas greitai degradavo ir prarado visą aktyvumą po 90 minučių inkubacijos. 4. Kaip matosi iš 12 lentelės, termolizino CLEC ir tirpaus termolizino stabilumas organinių tirpiklių aplinkoje stipriai skyrėsi. Termolizino CLEC išlaikė daugiau kaip 95% maksimalaus aktyvumo po inkubacijos visuose tirtuose organiniuose tirpikliuose.
[0059] Dėl šių savybių, termolizino ir kitų fermentų CLEC yra ypač naudingi, kadangi juos lengviau saugoti, jie yra stabilesni ir sunkiau inaktyvuojasi ar degraduoja nei atitinkami tirpūs fermentai.
[0060] Šio išradimo būdas taip pat buvo panaudotas elastazės CLEC gamybai, buvo įvertintas gautų elastazės CLEC aktyvumas ir atsparumas egzogeninei proteolizei. Elastazės CLEC palyginimas su tirpia elastaze smulkiau aprašytas 3 pavyzdyje ir 5-6 pav. Įvertinimo rezultatai parodė: 1. Elastazės CLEC išlaikė apie 50% aktyvumo, lyginant su tirpiu fermentu. 2. Tirpi elastazė greitai degradavo proteazės poveikyje. Tirpios elastazės aktyvumas sumažėjo iki 50% pradinio aktyvumo po 10 minučių inkubacijos su proteaze. Po 1 vai. inkubacijos tirpus fermentas prarado daugiau nei 90% savo aktyvumo. Priešingai, elastazės CLEC fermentinis aktyvumas nepakito po inkubacijos proteazės aplinkoje.
[0061] Šio išradimo būdas buvo panaudotas esterazės CLEC gamybai, buvo įvertintas gautų esterazės CLEC aktyvumas bei atsparumas egzogeninei proteolizei. Esterazės CLEC palyginimas su tirpia esteraze smulkiau aprašytas 4 pavyzdyje ir 7-8 pav. Įvertinimo rezultatai parodė: 1. Esterazės CLEC išlaikė apie 50% aktyvumo, lyginant su tirpiu fermentu. 2. Tirpi esterazė buvo labai jautri proteolitinei degradacijai. Tirpios esterazės aktyvumas sumažėjo iki 50% pradinio aktyvumo po 10 minučių inkubacijos proteazės aplinkoje. Po 1 vai. inkubacijos tirpus fermentas prarado daugiau nei
[0062] 90% savo aktyvumo. Priešingai, esterazės CLEC fermentinis aktyvumas nepakito po inkubacijos proteazės aplinkoje.
[0063] Šio išradimo būdas buvo panaudotas lipazės CLEC gamybai, ir buvo įvertintas gautų lipazės CLEC aktyvumas. Lipazės CLEC palyginimas su tirpia lipaze smulkiau aprašytas 5 pavyzdyje ir 9 pav. Įvertinimo rezultatai parodė, kad lipazės CLEC išlaiko apie 90% aktyvumo lyginant su tirpiu fermentu.
[0064] Šio išradimo būdas buvo panaudotas lizocimo CLEC gamybai ir buvo įvertintas gautų lizocimo CLEC aktyvumas ir atsparumas egzogeninei proteolizei. Lizocimo CLEC palyginimas su tirpiu lizocimu smulkiau aprašytas 6 pavyzdyje ir 10 pav. Įvertinimo rezultatai parodė, kad lizocimo CLEC išlaiko apie 50% aktyvumo lyginant su tirpiu fermentu.
[0065] Šio išradimo būdas buvo panaudotas asparaginazės CLEC gamybai ir buvo įvertintas gautų asparaginazės CLEC aktyvumas. Asparaginazės CLEC palyginimas su tirpia asparaginaze smulkiau aprašytas 7 pavyzdyje ir 11 pav. Įvertinimo rezultatai parodė, kad asparaginazės CLEC išlaiko apie 77% aktyvumo lyginant su tirpiu fermentu.
[0066] Kaip čia atskleista, CLEC atstovauja naujai technologijai, kuri gali būti plačiai taikoma daugelyje sričių, tame tarpe, bet ne tik jose, pramoninio masto sintezėje, laboratorinėse metodikose, biosensoriuose, medicininiuose pritaikymuose. 2- 5 lentelėse pateikti pavyzdžiai įvairių sistemų, kurios savo veikloje naudojo tradiciniais būdais imobilizuotus fermentus. Šios srities specialistas sugebėtų pritaikyti šias ir panašias sistemas prie CLEC technologijos, atskleistos šioje paraiškoje. Tam, kad tai pailiustruoti, konkretūs pavyzdžiai iš kiekvienos pateiktos kategorijos bus aptarti smulkiau.
[0067] 2 lentelėje pateikti pavyzdžiai pramoninių procesų, kuriuose naudojami tradiciniais būdais imobilizuoti fermentai ir kuriuos lengvai galima adaptuoti čia aprašytai CLEC technologijai.
[0068] Akrilamido gamyba, panaudojant CLEC technologiją
[0069] Žemiau aprašytas venas iš šio išradimo būdo panaudo-jimų: pritaikymas akrilamido gamybos, naudojančios imobilizuotas ląsteles, kurios duoda fermento nitrilo hidratazės perprodukciją (Nagasawa, T. and Yamada, H., Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)), prie anksčiau šiame aprašyme atskleistos CLEC technologijos.
[0070] Akrilamido, svarbaus ir plačiai vartojamo chemikalo, pramoninio masto gamybą aprašė Yamada ir bendradarbiai ( Nagasawa, T. and Yamada, H., Trends in Biotechnology 7: 153- 158 ( 1989)). Cheminiuose reaktoriuose, užpildo-muose imobilizuotomis ląstelėmis, kurios parinktos kaip fermento nitrilo hidratazės perproduktoriai, per metus pagaminama tūkstančiai tonų akrilamido. Nitrilo hidratazė, kaip skelbta literatūroje, buvo išvalyta ir kristalizuota iš dviejų šaltinių, Brevibacterium R312 ( Nagasawa et. al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 139: 1305- 1312 ( 1986) ir P. chlororaphis B23 ( Nagasawa et. al., Eur. J. Biochem. 162: 691- 698 ( 1987)). Kaip čia atskleista, šie kristaliniai fermentai gali būti imobilizuoti, panaudojant susiuvimą su glutaraldehidu ar kitu tinkamu susiuvimui reagentu ir gauti jų CLEC. Po to, nitrilo hidratazės CLEC galima naudoti tradiciniuose reaktoriuose vietoj šiuo metu naudojamų imobilizuotų ląstelių. Šio proceso pritaikymas prie CLEC technologijos duoda tiesioginius privalumus. Tarp jų, sumažėjusi, gamyklos dydi, ir geresnę išeigą, dėka padidėjusio aktyvumo tūrio vienete, dėl didesnės fermento koncentracijos CLEC viduje ir pagerinto substrato ir produkto difuzijos greičio; nepageidautino užteršimo ir šalutinių reakcijų sumažėjimą, dėl didesnio CLEC grynumo; ir mažesni, jautrumą mikrobiniam užteršimui, kadangi nėra ląstelių. Be to, yra ir kitų, tik fermentiniais CLEC pagrįstam būdui būdingų, privalumų. Tarp jų, aukštesnė darbo temperatūra, padidinanti reakcijos greiti, ; galimybės dirbti vandeniniuose, organiniuose ir beveik bevandeniuose tirpikliuose, kas leidžia optimizuoti akrilamido gamybos reakciją; ir ilgesnis darbo ir saugojimo pusperiodis, išplaukiantis iš didesnio cheminio ir mechaninio CLEC stabilumo, ypač netradiciniuose tirpikliuose.
[0071] CLEC technologijos pritaikymai medicinoje - ekstrakorporalinis gydymas
[0072] Šio išradimo būdas ir atitinkamai parinktas CLEC ar jų rinkinys taip pat gali būti panaudotas medicininiuose taikymuose. Pavyzdžiui, CLEC arba CLEC rinkinys gali būti panaudotas komponento pašalinimui iš skysčio, tokio kaip kraujas, paprastai ji, pakeičiant, tuo pačiu paverčiant ji, i, medžiagą, nežalingą pacientui, arba medžiagą, kurią gali pašalinti normalūs organizmo procesai (pvz., per detoksikacją ar suskaidymą kepenyse ar išskyrimą per inkstus). Šiame pritaikyme, sudaromas kontaktas tarp atitinkamai parinkto fermentinio CLEC ar jų rinkinio ir audinių skysčio, turinčio komponentą, kuri, reikia pakeisti, arba reakcijos, kurioje dalyvauja komponentas, reaktantą (produktų ar substratą) , kuri, veikia CLEC fermentas. To pasekoje, fermentas gali paveikti komponentą, kuri, reikia pakeisti, arba kitą medžiagą, esančią reakcijos, kurioje dalyvauja toks komponentas, produktu. Fermento aktyvumo dėka tiesiogiai pakeičiamas pats šalinamasis komponentas arba reakcijos, kurioje dalyvauja komponentas, produktas (tuo būdu sustabdomas tolimesnis reakcijos vyks-mas) . Tai galima padaryti panaudojant ekstrakorporalini, (išorini, kūno atžvilgiu) prietaisą, kuriame yra specialiai parinktas CLEC ar jų rinkinys ir turinti, priemones jų išlaikymui, kurios arba padarytos iš akytos medžiagos, išlaikančios CLEC, arba yra vamzdis, kuriame laikomi CLEC, ir kuris pasirūpina kontaktu tarp pačio norimo pakeisti komponento ar medžiagos, esančios reakcijos, kurioje toks komponentas dalyvauja, produktu.
[0073] Taip pat, tai galima atlikti, įvedant parinktą CLEC i, tinkamą kūno ertmę, tokią kaip pilvaplėvę ar limfini, mazgą, kurioje CLEC gali susisiekti su audinių skysčiu. Ši, įvedimą galima atlikti chirurginiu būdu arba atliekant CLEC suspensijos injekciją. Tiesioginė CLEC injekcija j, kraują nepriimtina dėl didžiulės embolijos ( kraujagyslių užsikimšimo) rizikos.
[0074] Atitinkamų CLEC panaudojimas šioje srityje gali pakeisti genetinius būdus, naudojamus fermentų pakeitimo terapijoje, koreguojant įgimtus nepakankamumus, tokius kaip fenilketonurija.
[0075] 3 lentelėje pateiktos kai kurios medicininės sitys, kuriose gali būti panaudoti CLEC. Daugumoje šių atvejų ekstrakorporalinis gydymas yra tiktai tyrimo stadijoje, bet pranašumai būdingi fermentiniams CLEC gali pateikti naujus gydymo būdus tokiose srityse, kuriose anksčiau nebuvo alternatyvaus gydymo.
[0076] Žemiau aprašytas konkretus šio būdo pritaikymas heparino liazės sistemoje, skirtoje heparino paša-linimui iš kraujo (Bernstein ir kt., Methods in Enzymology 137: 515-529 (1987)).
[0077] Kad išvengti kraujo sukrešėjimo, naudojant ekstra-korporalinius prietaisus per kuriuos teka kraujas, tokius kaip inkstų dializės, nepertraukiamo veikimo kraujo filtravimo prietaisai arba ekstrakorporaliniai mechaniniai membraniniai oksigenatoriai, būtinas heparino įvedimas pacientui. Tačiau, paciento hepari-nizacija sukelia hemoraginių komplikacijų ir sudaro pavojų žmogaus sveikatai. Šios problemos išauga ilgėjant perfuzijos laikui, pavyzdžiui membraninių oksigenatorių atveju, ir gali įvykti rimtas nukrau-javimas. Po ekstrakorporalinės terapijos, hepariną galima pašalinti iš kraujo prietaisu, įtaisytu prie ekstrakorporalinio prietaiso išėjimo ir turinčiu heparinazės, kuris pašalina visą hepariną iš pacientui grąžinamo kraujo ir tuo būdu išvengiama šiuo metu esančių heparinizacijos problemų.
[0078] Publikuotose tyrimuose (Langer ir kt., Science 217: 261-263 (1982); Bernstein ir kiti., Methods in Enzymology 137: 515-529 (1987)), smulkiai aprašytos problemos kylančios panaudojant tradiciniais būdais imobilizuotus fermentus ekstrakorporaliniuose įrenginiuose. Pagrindinė problema susijusi su blogu fermentinio aktyvumo tūrio vienetui išlaikymu naudojant tradicinius imobilizacijos būdus, dėl ko, tam, kad atlikti būtiną heparinizaciją, reikalingas didelis imobilizuoto fermento tūris. Šis tūris yra per daug didelis, kad jį galima būtų naudoti praktiniame žmonių gydyme. Tačiau, didelis aktyvumas tūrio vienete, kuris išlaikomas fermentiniuose CLEC, neturinčiuose inertinio nešiklio, apeina šią problemą ir pasiūlo praktinį žmogaus heparinizacijos problemos sprendimą. Padidintas CLEC stabilumas sumažins fermentų disociaciją susiūtame kristale. Tuo jie yra pranašesni už mažiau stabilius tradiciniais būdais imobilizuotus fermentus, nes bus sumažintas imuninis atsakas, sukeltas fermentų nuotėkio. Dėka CLEC temperatūrinio stabilumo neįvyksta fermentų denatūracija saugojimo metu dėl laikinos aukštos temperatūros, galima tikėtis, jog CLEC išlaikys aukštą aktyvumą saugant net prie kambario temperatūros. Be to CLEC bus pigiau ir patogiau naudoti, nei analogiškus fermentus, imobilizuotus tradiciniais būdais, kadangi jie turi ilgesnį darbo ir saugojimo laiką.
[0079] Papildomi CLEC technologijos pritaikymai: biosensoriai
[0080] CLEC arba jų rinkinys gali būti vartojami kaip dalis sensoriaus, čia vadinamu biosensoriu, kuris gali būti panaudotas aptikimui ir/arba kiekybiniam dominančios medžiagos (analito) įvertinimui įvairiuose tokiose terpėse (fluiduose) , tokiose kaip organizmo skysčiai (pvz.: kraujas, šlapimas), chemijos pramonės ir laboratorinės reakcinės terpės, organinės terpės, vanduo, terpės, kuriose auginamos kultūros, ir gėrimai. Kai kuriais atvejais, dominančia takia terpe gali būti dujos, kaip pavyzdžiui iškvepiamo alkoholio analizatoriuje (Barzana, E., Klibanov, A., and Karell, M., NASA Tech Briefs 13: 104 (1989)). Šiame pritaikyme sudaromas kontaktas tarp atitinkamai parinkto CLEC ar jų rinkinio ir analizuojamos takios terpės, turinčios dominantį analitą. Ši medžiaga gali būti išmatuota tiesiogiai (pavyzdžiui, gliukozės kiekis kraujyje) arba netiesiogiai (pvz., aptinkant arba išmatuojant kiekybiškai junginį, kuris yra reaktantas (produktas arba substratas) reakcijoje, vykstančioje dalyvaujant dominančiam analitui). Bet kuriuo atveju CLEC gali paveikti analitą ar junginį, esantį reaktantu reakcijoje, kurioje taip pat dalyvauja analitas. Veikiant fermentui gaunami pastebimi pokyčiai (pvz., pH pakitimai, šviesos arba šilumos išspinduliavimas, elektrinio potencialo pakitimai), kurie aptinkami ir/arba išmatuojami kiekybiškai atitinkamais matavimo prietaisais (pvz., pH elektrodu, prietaisu jautriu šviesai ar šilumai, priemonėmis matuojančiomis elektrinio potencialo pokyčius) (Janata, J., et al., Anai. Chem. 62: 33R-44R (1990)). Gali būti panaudoti bet kokie prietaisai, sugebantys aptikti pakitimus, sukeltus fermentine katalize paremtu būdu. Šio išradimo biosensoriai sudaryti iš CLEC ar jų rinkinio ir priemonių, skirtų CLEC sulaikymui ir leidžiančių susidaryti kontaktui tarp CLEC ir dominančio analito arba junginio, esančio reaktantu reakcijoje, kurioje dalyvauja dominantis analitas.
[0081]
[0082] Šio išradimo būde, kai jis naudojamas pavyzdžių analizėje kaip biosensorius, ypatingai svarbu gauti didžiausią signalą, kur j, galima detektuoti, naudojant kaip galima mažesni, kieki, substrato ir katalizatoriaus. Šiuo požiūriu, čia atskleista CLEC technologija ypatingai patraukli, kadangi ji pasiekia maksimaliai galimą fermentinio katalizatoriaus koncentraciją duotame tūryje.
[0083] Dažnai dedamos didžiulės pastangos tam, kad sujungti, tiesiogiai ar per tinkamą tarpininką, dominančią galutinę fermentinę reakciją su fermentų, tokių kaip liuciferazė, šviesos išspinduliavimu (Kurkijarvi ir kt., Methods in Enzymology 137: 171-181 (1988)). Tai daroma tam, kad pasinaudoti neparaleliu jautrumu ir efektyvumu prietaisų, skaičiuojančių fotonus, kurie prie atitinkamų sąlygų leidžia aptikti femtomolines fermentinės reakcijos produkto koncentracijas. Pagal ši, principą buvo sukurtos biosensorinės sistemos, naudojančios tradiciniais būdais imobilizuotus fermentus ir skirtos aptikimui įvairių substratų, i,domių klinikiniuose ir kituose taikymuose. Šviesą išspinduliuojančios reakcijos buvo sujungtos su mėginių reakcijomis, aptikimui tokių substratų kaip D-gliukozė, L-laktatas, L-glutamatas ir etanolis, bei eilės kitų, prie ypatingai žemų substrato koncentracijų.
[0084] Kas dėl šio taikymo, tai fermentas liuciferazė iš Vibrio harveyii, kaip aprašyta, buvo kristalizuotas (Swanson ir kt., J. Biol. Chem. 260: 1287-1289 (1985)). Šios liuciferazės kristalai gali būti susiūti, naudojant glutaraldehidą ar kitą tinkamą reagentą, tam, kad suformuoti liuciferazės CLEC. Biosensoriniams ir analitiniams pritaikymams, liuciferazės CLEC turi daug pranašumų, lyginant su tradiciniais būdais imobilizuotais fermentais. CLEC atveju, visas liuciferazės CLEC tūris sudarytas iš šviesą spinduliuojančių fermentų. Tuo tarpu sistemoje su tradiciniais būdais imobilizuotu fermentu net 95% viso tūrio užima "inertinė" nešiklio medžiaga, kuri greičiau veikia kaip fermentų išspinduliuotos šviesos absorbuotojas. Be to, padidintas CLEC stabilumas turėtų supaprastinti saugojimą kambario temperatūroje ir, taip pat, įgalinti naujus sensorinius pritaikymus agresyviose aplinkose ir pakeltose temperatūrose.
[0085] Papildomi CLEC technologijos pritaikymai - laboratorinės reakcijos
[0086] CLEC galima naudoti kaip laboratorinius reagentus mažose kolonose arba cikliniuose procesuose, vartojamuose laboratorinių reakcijų vykdyme. Kai kurios iš platesnių, reakcijų kategorijų pateiktos 5 lentelėje.
[0087]
[0088] Reakcijų, katalizuojamų CLEC pagalba, naudojimo laboratorijoje pranašumas yra trigubas. Pirma, CLEC išlaiko dideli, aktyvumą agresyviose aplinkose (pvz., vandeniniuose, organiniuose, beveik bevandeniuose tirpikliuose ir jų mišiniuose bei aukštoje temperatūroje), kurios yra būdingos cheminės sintezės laboratoriniams bandymams. Antra, CLEC yra labai stabilus darbo ir saugojimo metu, o tai svarbu nuolat pertraukiamiems laboratoriniams bandymams. Trečia, didelis CLEC aktyvumas tūrio vienetui leidžia sutrumpinti reakcijos laiką ir sumažinti būtiną fermento kieki, (aktyvumo vienetui). Taigi, pranašumai, kuriuos turi CLEC-fermentai, lyginant su laisvais arba imobilizuotais fermentais, duoda chemikams-organikams alternatyvų, labai selektyvų, sintetinimo instrumentą.
[0089] Visuose minėtuose pavyzdžiuose, ir ne tik juose, šitos srities specialistas gali pritaikyti šio išradimo būdą tam, kad panaudoti atitinkamą CLEC fermentą procese, kuriame buvo naudojamas fermentinis katalizatorius, imobilizuotas tradiciniu būdu. CLEC ne tik gali pakeisti fermentus, imobilizuotus tradiciniais būdais, bet taip pat gali būti panaudojami transformacijose, kurios buvo vykdomos ląstelių pagalba. Toliau šis išradimas bus iliustruojamas žemiau pateiktais pavyzdžiais, kuriais jokiu būdu nesiekiama susiaurinti išradimo apimti,.
[0090] Termolizino kristaližavimas ir skersinis susiuvimas aspartamo pirmtako, Z- Asp- Phe- OMe, sintezei.
[0091] 250 mg termolizino Bacillus thermoproteolyticus, pirkto iš Boehringer-Mannheim GmbH kompanijos, ištirpinta 4ml 45% dimetilsulfoksido (DMSO) ir 55% 1,40M kalcio acetato, 0,50M natrio kakodilato, esant pH 6,5. Šios pradinės sąlygos analogiškos aprašytoms Matthews ir kt. stambiųjų termolizino kristalų (difrakcinės kokybės) gamybai, (žr., pvz. Holmes ir Matthews, J. Mol. Biol. 160: 623-639 (1982)). Po to baltymų tirpalas koncentruojamas iki 1 ml mikrokoncentratoriuj e " Cen-
[0092] tricon-10". Gera mikrokristalų išeiga buvo gauta staigios kristalizacijos būdu, pavaizduotu Siame aprašyme, pagal kurį lml vandens arba 1,40M kalcio acetato, 0,50M natrio kakodilato, esant pH 6,5, greitai įvesdavo į tą ar kitą DMSO - termolizino tirpalą, aprašytą anksčiau. Šiuo būdu gaunama daugybė maždaug vienodo dydžio (apie 10-1 mm ilgio) heksagonalinių mikrokristalų.
[0093] Termolizino mikrokristalų susiuvimas
[0094] Procedūros, atliktos šiame konkrečiame pavyzdyje pagal išradimą, yra pritaikymas protokolo, aprašyto Nakanishi ir kt. (Biotechnology 3: 459-464 (1985)), pagal kurį termolizinas pradžioje adsorbuotas ant granuliuoto nešiklio, sudaryto iš jonitinės dervos Amberlite XAD-7, o po to imobilizuotas susiuvant jį glutaraldehidu (Quicho ir Richards, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 52: 833-839 (1964). Šiame pavyzdyje gautieji termolizino mikrokristalai centrifūguojami ir nusodinami, o supernatantas išpilamas. Po to prie mikrokristalų pridedama 5 ml 17,5% techninio glutaraldehido 2,5% DMSO, 0,05M kalcio acetato ir 0,025M natrio kakodilato, esant pH 6,5. Mišinys inkubuotas 4 valandas 37°C temperatūroje lengvai maišant. Skersinio susiuvimo reakcija nutraukiama pakartotinai praplaunant kristalus 10 ml vandens mėginiais glutaraldehido tirpalo pašalinimui. Praplauti susiūti termolizino kristalai ir sudaro tą termolizino CLEC, kuris toliau naudojamas kaip katalizatorius.
[0095] 5ml termolizino CLEC suspensijos pridedama į ciklinį reaktorių su nuolatiniu maišymu, inkubuojama 37°C temperatūroje. Centrifūgavus ir dekantavus superna-tantą, prie CLEC pridedamas vandeninis reakcinis
[0096] mišinys. Šis tirpalas gaunamas sumaišant 80 mg Z- L- Asp ir 80 mg L- Phe- OMe- HCl 1 ml vandens; kad būtų pH 7, 0 pridedama acto rūgšties. Pavyzdžiai analizuoti HPLC pagalba. 6 lentelėje pateikti substrato Z- L- Asp- HPLC pikų aukščiai po nurodyto reakcijos laiko, normalizuoti iki 1, esant laikui t=0. Kadangi Z- L- Asp apriboja šios reakcijos greitį, tai šios medžiagos kiekio sumažėjimo matavimas yra ekvivalentiškas matavimui atsiradusio produkto Z- L- Asp- L- Phe- OMe ( Nakanishi et al. Biotechnology 3: 459- 464 ( 1985)). Be dar nesureagavusio ribojančio substrato Z- L- Asp normalizuotų HPLC pikų aukščių, 6 lentelėje taip pat pateiktas reakcijos užbaigtumo lygio įvertinimas. Aišku, kad reakcija pasiekia 20% užbaigtumo lygį per pirmąsias 30 sekundžių ir išeina į plato, šie rezultatai atitinka Nakanishi ir kt. stebėjimams ( Biotechnology 3: 459- 464 ( 1985)), gautiems panaudojus termoliziną, imobilizuotą tradiciniais būdais, vandenėje reakcinėje terpėje, analogiškoje aukščiau minėtai, ir gali būti paaiškinti blogu produkto Z- L- Asp- L- Phe- OMe tirpumu vandenyje.
[0097] 5 ml termolizino CLEC suspensijos pridedama į periodinį reaktorių su nuolatiniu maišymu, inkubuojant 37°C. Po centrifugavimo ir supernatanto dekantavimo, prie CLEC pridedama beveik bevandenės organinės reakcinės terpės. Šis tirpalas gaminamas sumaišant 80 mg Z- L- Asp ir 240 mg L- Phe- OMe 1 ml 99% etilacetato su 1% vandens. Pavyzdžiai analizuoti HPLC pagalba. 7 lentelėje pateikti substrato Z- L- Asp HPLC pikų aukščiai po nurodyto reakcijos laiko, normalizuoti iki 1, esant laikui t=0. Kadangi Z- L- Asp apriboja šios reakcijos greitį, tai šios medžiagos kiekio sumažėjimo matavimas yra ekvivalentiškas matavimui atsiradusio produkto Z- L-Asp- L- Phe- OMe ( Nakanishi ir kt. Biotechnology 3: 459-464 ( 1985)). Be normalizuotų HPLC pikų aukščių, dar nesureagavusio ribojančio substrato Z- L- Asp, 7 lentelėje taip pat pateiktas reakcijos užbaigtumo lygio įvertinimas. Šiuo atveju, reakcija pasiekia 70% užbaigtumo lygį per pirmąsias 30 sekundžių ir išeina į plato. Šie rezultatai taip pat atitinka Nakanishi ir kt. stebėjimams ( Biotechnology 3: 459- 464 ( 1985)), gautiems panaudojus termoliziną, imobilizuotą tradiciniais būdais, beveik bevandenėje reakcinėje terpėje, ir yra aiškinami produkto sukeltu fermento inhibavimu.
[0098] Termolizino kristalizavimaa, skersinis susiuvimas ir liofilizacija ir gautojo produkto charakteristikų įvertinimas
[0099] Termolizinas (Diawa Kasei K.K., Japonija) ištirpinamas lOmM kalcio acetato (Sigma), esant pH 10, iki 10% koncentracijos (svoris/tūris) . Tirpalo pH palaikomas 10,0 lygyje titruojant jį 2 M NaOH. Po pilno ištirpimo, baltymo tirpalas titruojamas 2M HC1 iki pH 8,0. Pridedama sauso kalcio acetato iki 1,2M. Po to iki 30% pridedama dimetilo sulfoksido (Sigma) . Baltymas koncentruojamas iki 100 mg/ml ultrafiltracijos būdu Amikon maišomoje kameroje (membrana 10000 MWCO). Po to koncentruotas fermentas buvo išdalintas į mėginius ir laikomas -70°C temperatūroje. Termolizinas kristali-zuojamas pridedant 9 tūrius demineralizuoto vandens i, 1 tūri, koncentruoto (100 mg/ml) baltyminio tirpalo. Tirpalas trumpai maišomas ir paliekamas per naktį kambario temperatūroje. Kristalai praplaunami su 10 tūrių 10 mM kalcio acetato pH 7,0 ir išskiriami centrifūguojant nedideliu greičiu (10 min. prie 1500 x G, Beckman GPR centrifūga).
[0100] Greitas vandens įpylimas į koncentruotą (100 mg/ml) termolizino tirpalą sukelia susidarymą kristalų, kurie tampa matomi po 10 min. mažu padidinimu. Šiuo būdu gaunamų kristalų dydis pasikartojančiai priklauso nuo galutinės baltymo koncentracijos. Esant 3 tūriams vandens ir vienam tūriui termolizino koncentrato (100 mg/ml) susidaro 0,5 mm ilgio heksagonalinės rentgenografinės kokybės kristalinės lazdelės, kurios atitinka kristalus, anksčiau aprašytus Colman ir kt.
[0101] (Colman, P.M., Jansonius, J.N. ir Matthews, B.W., J.
[0102] Mol. Biol. 70: 701-724 (1972)), ką mes patvirtinome difrakcinės analizės pagalba. Įpylus 10 tūrių vandens į vieną koncentruoto baltymo tūrį, gaunamų kristalų ilgis sumažėja iki 0,05 mm. Šie mikrokristalai yra pranašesni naudojant CLEC, kadangi sumažėja difuzinės problemos, susijusios su kristalų dydžiu (žr. pvz. Quiocho, F.A. ir Richards, F.M. Biochemistry 5: 4062-4076 (1967)). Vienoje konkrečioje baltymų partijoje kristalų dydis išlaikomas pastovus. (Šiame tyrinėjime naudoti 0,05-0,10 mm ilgio kristalai, siekiant palengvinti tikslų kristalų suspensijos matavimą pipete). Densitometrinis SDS-PAGE skanavimai parodė šešiakartį fermento išvalymą kristalizuojant, o tai žymiai padidina specifini CLEC aktyvumą. Kristalizacija sąlygojo 20% sumažėjimą bendro CLEC baltymo aktyvumo, palyginus su tirpiuoju termolizinu, ką parodė žemiau aprašyti spektrofotometriniai tyrimai skaldant dipeptidinį substratą furilakriloil-glicil-L-leucino amidą (FAGLA).
[0103] Termolizino kristalų susiuvimas buvo atliekamas 3 vai. kambario temperatūroje 12,5% glutaraldehido (Sigma), 5% DMSO ir 50 mM Tris tirpale, esant pH 6,5. Susiūti kristalai tris kartus praplaunami demineralizuotu vandeniu ir išskiriami centrifūguoj ant nedideliu greičiu, kaip aprašyta termolizino kristalizavimo poskyryje. Fermento kristalų cheminis skersinis susiuvimas pakankamai stabilizuoja kristalinę gardelę ir kristalą sudarančias fermento molekules, kad CLEC būtų galima praktiškai naudoti terpėse, kurios kitaip nesuderinamos su fermento funkcionavimu. Tyrinėjant spektrofotometriškai (aprašyta žemiau) dipeptidinio substrato FAGLA skaldymą, nebuvo pastebėta skirtumų tarp susiūtų ir nesusiūtų kristalų fermentinių aktyvumų. Be to, susiuvimas stabilizuoja CLEC iki tokio lygio, kad jie gali būti liofilizuoti, išsaugant pilną fermentinį aktyvumą po jų atstatymo vandeniniuose, organiniuose ir mišriuose vandens-organiniuose tirpikliuose, kaip parodyta 1 pav. ir 8 lentelėje. Nors kristalizacija sąlygojo CLEC baltymų specifinio aktyvumo sumažėjimą 30%, lyginant su tirpiu termolizinu, CLEC susiuvimas ir liofilizacij a vėliau nemažino jo specifinio aktyvumo.
[0104]
[0105] Tirpaus termolizino ir jo CLEC fermentinis aktyvumas
[0106] Tirpiojo ir CLEC termolizino katalitinis aktyvumas buvo vertinamas (Feder, J. ir Schuck, J.M., Biochemistry 9: 2784-2791 (1970)) blokuoto dipeptidinio substrato furilakriloil-glicil-L-leucino amido (FAGLA) (Schweizerhall) hidrolizės pagalba. Amidinių ryšių nutraukimas matuotas registruojant spektrofotometriškai absorbavimo sumažėjimą 345 nm bangos ilgiui. Pradinė fermento koncentracija buvo 10~7 M pagal Bradford baltymų matavimo metodą ir densitometrini, dažytų Coomassie SDS-PAGE gelių skanavimą (Pharmacia LKB UltroScan XL). CLEC fermentai tai atstatyti liofilizuoti susiūti termolizino kristalai. Tirpus fermentas tai termolizinas koncentruotas iki 100 mg/ml. Fermento pridėta prie 5 ml reakcinės terpės, turinčios substratą. Nurodytu laiku buvo imami vienodo dydžio reakcinio mišinio mėginiai ir matuojama jų absorbcija prie 345 nm. Prieš matuojant absorbciją, termolizino CLEC buvo atskiriamas nuo reakcinio mišinio trumpai centrifūguojant ( Beckman, mikrocentrifūga E) . Absorbcija buvo aproksimuota pseudo pirmos eilės greičio lygties pagalba ir santykis kcat/ Km buvo skaičiuojamas dalinant aproksimuotą reikšmę iš fermento koncentracijos ( Multifit 2. 0 Curve Fitting for tha Apple Macintosh Computer, Day Computing P. O. Box 327, Milton, Cambridge CB4 6WL, U. K. ( 1990)).
[0107] Tirpaus termolizino ir jo CLEC optimalus pH ir stabilumas lygintas skaldant dipeptidini, substratą FAGLA. Rezultatai parodyti 2 pav. ir 9 lentelėje. Tiek tirpaus tiek ir kristalinio fermento maksimalus aktyvumas buvo prie pH 7. CLEC ir tirpus termolizinas, taip pat, turėjo panašų aktyvumą rūgštiniame diapazone ir varpo formos pH profilis gautas tirpaus fermento atveju puikiai sutapo su publikuotais duomenimis ( Feder, J. ir Schuck, J. M., Biochemistry 9: 2784-2791 ( 1970)). Tačiau, šarminiame pH diapazone kristalinis fermentas išlaikė maksimalų aktyvumą iki pH 10, tuo tarpu tirpus fermentas turėjo 75% aktyvumo prie pH 8, 5, ir tik 25% aktyvumo prie pH 9. Esant pH 9, 6, tirpus fermentas buvo visiškai neaktyvus.
[0108] Stabilumas prie pakeltų temperatūrų
[0109] Vykdant cheminius procesus prie aukštesnės tempera-tūros, galima pasiekti didesni, reakcijos greitį ir mažesnį substrato ir produkto difuzijos laiką, kuriuos paprastai apriboja substrato ir produkto temperatūrinis stabilumas. Tačiau, naudojant fermentinę katalizę, praktinę ribą temperatūros, prie kurios gali vykti procesas, dažniausiai nustato fermentinio aktyvumo netekimas. Dėl padidinto stabilumo, CLEC išlaiko fermentinį aktyvumą prie daug aukštesnių temperatūrų nei tirpūs fermentai.
[0110] CLEC katalizatorių padidintas stabilumas žemoms temperatūroms supaprastina kasdienį ilgalaikį jų saugojimą. Pavyzdžiui, koncentruotus (>50mg/ml) tirpaus termolizino tirpalus reikėdavo laikyti prie -80°C, kad išsilaikytų jų maksimalus specifinis aktyvumas. Kambario temperatūroje aktyvumas paprastai buvo prarandamas per vieną dieną. Palyginimui, dehidratuotas termolizino CLEC paprastai gali būti laikomas ištisus mėnesius kambario temperatūroje be pastebimo aktyvumo pakitimo. Neatstatyti liofilizuoti termolizino CLEC atrodo išlieka gyvybingi neapibrėžtą laiką.
[0111] Termostabilumas ir atsparumas autolizei buvo pademonstruotas penkias dienas inkubuojant termolizino CLEC prie 65°C ( 3 pav. ir 10 lentelė). Termolizino CLEC išlaikė maksimalų aktyvumą po penkių dienų inkubacijos prie pakeltos temperatūros. Palyginimui, tirpus termolizinas prarado 50% savo pradinio aktyvumo tik po dviejų valandų inkubacijos, o po 24 valandų inkubacijos 65°C temperatūroje rodė vos pastebimą aktyvumą.
[0112] Tirpaus termolizino ir jo CLEC aktyvumas buvo matuojamas po inkubacijos prie 65°C. Tirpus termolizinas buvo inkubuojamas 10 mM kalcio acetate, 50 mM Tris, esant pH 7, 65°C vandens vonioje. Reakcinės terpės tūris užėmė 500 ( ll. Galutinė fermento koncentracija buvo 10 mg/ ml. Vienodi mėginiai buvo imami po O, 1, 2, 6, 10 ir 18 valandų. Pavyzdžiai buvo tiriami naudojant SDS-PAGE ir FAGLA skaldymą prie kambario temperatūros, kaip aprašyta aukščiau. Termolizino CLEC atveju, 250 nl kristalų suspensijos 10 mM kalcio acetate ir 50 mM Tris buvo inkubuojami 65°C vandens vonioje. Aktyvumas buvo tiriamas po 0, 1, 6, 24, 48, 72, 96 ir 120 valandų FAGLA skaldymo būdu.
[0113] Taip pat, buvo įvertintas termolizino CLEC atsparumas egzogeninių proteazių poveikiui. SDS-PAGE (elektro-forezė natrio dodecilsulfato poliacrilamido gelyje) analizė rodo, kad komerciniai fermentai gali turėti žymų procentą priemaišų, kai kurios iš jų gali turėti proteolitini, aktyvumą pagrindinių fermentų rūšių atžvilgiu. Supakavus fermento molekules d, kristalinę gardelę, galima tikėtis jog CLEC viduje fermento molekulės bus apsaugotos nuo proteolizės. Tam kad tai patikrinti, termolizino CLEC ir tirpaus termolizino preparatai buvo inkubuojami terpėje su streptokoko proteaze Pronaze®, nespecifine proteaze, galinčia suardyti daugumą baltymų iki laisvų amino rūgščių
[0114] Tirpus termolizinas ir jo CLEC buvo inkubuojami 50 mM Tris su proteaze Pronaze® (Calbiochem), esant pH 7,5 prie 45°C. Pronazės® ir termolizino santykis buvo 1/40. Kad prislopinti termolizino autolizę ir išvengti pronazės suardymo dėl proteolitinio termolizino poveikio, prie tirpių fermentų reakcinės terpės buvo pridėtas EDTA su galutine 100 mM koncentracija (EDTA inhibuoja termolizino aktyvumą, bet nekeičia Pronaze® aktyvumo). Nurodytu laiku buvo imami reakcinio mišinio mėginiai ir spektrofotometriškai tiriamas jų aktyvumas, skaldant dipeptidini, substratą FAGLA. Kad pašalinti termolizino inhibavimą dėl EDTA, tirpių fermentų aktyvumo spektrofotometriniai tyrimai buvo atliekami 0, 5 M kalcio acetato buferyje, esant pH 7, ir fermento koncentracija buvo padvigubinta. Susiūti kristaliniai fermentai buvo tiriami kaip aprašytai aukščiau.
[0115] Kaip matosi iš 4 pav. ir 11 lentelės, tirpus termolizinas greitai degradavo ir prarado visą aktyvumą po 90 minučių inkubavimo. Palyginimui CLEC aktyvumas nepasikeitė po keturių dienų inkubavimo proteazės aplinkoje. Šis beveik visiškas atsparumas proteolizei ypač domintų diagnostiniuose biosensorių taikymuose, kuriuose atitinkamas CLEC gali būti veikiamas kokteilio iš nežinomų, natūraliai egzistuojančių fermentų su proteolitiniu veikimu.
[0116] Tam, kad fermentai taptų idealiai priimtinais, gyvybingais pramoniniais katalizatoriais, jie turi sugebėti funkcionuoti, nereikalauti per didelio pakeitimo praktiškai nusistovėjusių aplinkų gamy-biniuose procesuose. Konkrečiau, tai apimtų vandeninių, poliarizuotų, vandeninių- organinių tirpiklių bei jų mišinių naudojimą. Komerciniuose taikymuose, vande-ninių- organinių tirpiklių mišiniai leidžia valdyti produkto susidarymą, pasinaudojant produktų ir substratų santykiniu tirpumu.
[0117] Tirpus termolizinas ir jo CLEC organiniuose tirpikliuose turi ryškiai skirtingą stabilumą ( 12 lentelė). Tirpaus fermento koncentracijos, kurias dar galima laikyti organiniame tirpiklyje, apribotos maksimalia 10 mg/ ml koncentracija. Esant koncentracijoms didesnėms už šią reikšmę, termolizinas akimirksniu nusėsdavo, pridėjus organini, tirpiklį. Palyginimui, termolizino CLEC koncentracijos ribojamos tik kristalų užimamu tūriu. Tirpus termolizinas išlaikė didžiausią aktyvumą
[0118] ( 75%) aktyvumą po inkubacijos acetone ir mažiausią
[0119] ( 36%) - tetrahidrofurane. Po 1 vai. inkubacijos acetonitrile ir dioksane tirpus fermentas prarado apie 50% savo pradinio aktyvumo. Termolizino CLEC išlaikė daugiau nei 95% maksimalaus aktyvumo po inkubacijos visuose tirtuose organiniuose tirpikliuose.
[0120]
[0121] Termolizino CLEC arba tirpaus termolizino preparatai buvo inkubuojami 50% (tūris/tūris) nurodytų tirpiklių tirpaluose 100 Įil termolizino CLEC suspensijos (lOmg/ml) su 10 mM Tris, esant pH 7, supiltas 0,5 drachmos talpos stiklinį buteliuką. Prie jo pridėtas toks pat tūris nurodyto organinio tirpiklio ir mišinys trumpai maišomas sukant. Dvidešimt |il tirpaus termolizino (lOOmg/ml) atskiesta 80 jjl 0,015 M Tris buferiu, esant pH 7, kitame 0,5 drachmos talpos stikliniame buteliuke. Po to į fermentinį tirpalą pridėta 100 ^1 organinio tirpiklio ir trumpai maišoma sukant. CLEC ir tirpus fermentas buvo inkubuojami organinio tirpiklio aplinkoje vieną valandą prie 40°C. Po inkubacijos, fermentų aktyvumas buvo tiriamas dipeptidinio substrato FAGLA skaldymu, kaip aprašyta aukščiau.
[0122] Manoma, jog žemos vandens koncentracijos trukdo fermento molekulei išsivyniojant pereiti i, tarpines būsenas, jos denatūracijos metu. Fermentiniuose CLEC šiuos konformacinio judrumo apribojimus greičiau apsprendžia tarpmolekuliniai kontaktai ir skersiniai susiuvimai tarp kristalinę gardelę sudarančių fermento molekulių, nei beveik visiškas vandens nebuvimas terpėje. Todėl, fermentai, jei iš jų suformuoti CLEC, lengvai išlaiko vidutines vandens-organinio tirpiklio koncentracijas, kas anksčiau, dirbant su fermentais, nebuvo pastebėta (žr. 12 lentelė). Šis atradimas atveria fermentinės katalizės pritaikymui ištisas naujas cheminės sintezės sritis.
[0123] Tačiau, net beveik bevandeniuose organiniuose tirpikliuose įprastinis fermentų vartojimas buvo nelengvas dėl jų polinkio sudaryti blogų charakteristikų suspensijas, kurios linkusios granuliuotis, ir kitų agregacijos problemų. Dėl šių savybių plataus masto pramoniniuose procesuose tokie preparatai nepatrauklūs iš prigimties. Palyginimui, CLEC ir jo kristalinę gardelę sudarantys fermentai išlieka monodispersiniais visuose šiuose tirpikliuose.
[0124] Palyginimas su kitais imobilizacijos būdais
[0125] Literatūroje pasirodė keletas naudingų fermentų imobilizacijos būdų apžvalgų ( Maugh, T. H., Science 223: 474- 476 ( 1986) ; Tramper, J., Trends in Biotechnology 3: 45- 50 ( 1985)). Tuose būduose, fermentai visada sudaro mažą dalį viso imobilizuotų dalelių tūrio, kurio pradinę dali, užimą inertinė nešiklio medžiaga. Nešiklis padidina vidutinį laisvą kelią tarp imobilizuotų fermentų dalelių išorės, skalaujamos tirpiklio, ir fermentų aktyvių centrų, tuo apsunkindamas difuzijos ( Quiocho, F. A., ir Richards F. M., Biochemistry 5: 4062-4076 ( 1967)).
[0126] CLECL susiūta kristalinė matrica sudaro nuosavą pagrindą, atmesdama nešiklio būtinumą. Todėl CLEC fermento koncentracija yra artima teorinei tokio dydžio molekulių supakavimo ribai ir žymiai viršija tankius, pasiekiamus net koncentruotuose tirpaluose. Kadangi visas CLEC sudarytas iš aktyvaus fermento, tai minimizuojamas ( žr. 1 pav.) reakcijos greičio sumažėjimas, susietas su difuzija ir stebimas tradiciniais metodais imobilizuotuose fermentuose, lyginant su fermentais, esančiais tirpale, nes CLEC atveju ( lyginant su tradiciniais metodais imobilizuotų fermentų nešiklio dalelėmis) labai sumažėja vidutinis laisvas kelias, kurį reikia nueiti substratui tarp aktyvaus fermento ir laisvo tirpiklio. Ypač svarbu, jog CLEC sudarantis fermentas iš prigimties yra monodispersinis ir jį galima atstatyti atliekant su CLEC dalelėmis tokias paprastas operacijas kaip filtravimą, centrifugavimą ir tirpiklio dekantavimą.
[0127] Elastazės kristalizavimas, skersinis susiuvimas ir liofilizacija ir gauto produkto charakteristikų ivertinimas
[0128] Liofilizuota elastazė (Servą) iš kiaulės kasos liaukos kambario temperatūroje ištirpdoma 0,1 M natrio acetate prie pH 5 iki 5 mg/ml (svoris/tūris) koncentracijos. Lazdelių pavidalo elastazės kristalai pasirodo praėjus vienai minutei po pilno baltymo ištirpimo (solvacijos). Kristalizacijos tirpalas perkeliamas i, 4°C temperatūrą ir kristalizacija užbaigiama per naktį. Kristalai išskiriami centrifuguojant, kaip aprašyta anksčiau.
[0129] 200 |il elastazės kristalų pridedama prie 1,3 ml tirpalo, turinčio 5,77% glutaraldehido ir 1,5 M natrio acetato, esant pH 5. Kristalų skersinis susiuvimas vykdomas vieną valandą lengvai maišant (maišoma lėkštėje). Po susiuvimo kristalai tris kartus praplaunami 15 ml tūrio 0,2 M Tris, esant pH 8,0. Elastazės kristalai liofilizuojami kaip aprašyta 2 pavyzdyje.
[0130] Tirpios elastazės ir jos CLEC fermentinis aktyvumas
[0131] Tirpios ir CLEC elastazės katalitinis aktyvumas buvo tiriamas spektrofotometriškai matuojant substrato sukcinil-(Ala) 3 p-nitroanilido (Bachem) hidrolizę
[0132] ( 13 lentelė, 5 pav.). Skaldymas stebimas registruojant absorbavimo padidėjimą 400 nm bangos ilgiui. Pradinė substrato koncentracija buvo 2x1O" 4. Fermento koncentracija buvo 2, 8x10 7 M. CLEC ir tirpus fermentai pridedami prie 5 ml reakcinio tūrio su substratu ir 0, 2 M Tris, esant pH 8, 0. Kaip aprašyta anksčiau, CLEC fermentas buvo pašalinamas iš reakcinio mišinio, prieš matuojant absorbciją.
[0133] Elastazės CLEC atsparumas proteazių poveikiui matuotas tokiose pat sąlygose kaip ir termolizimo ( 2 pavyzdys). Po inkubacijos su proteaze, tirpaus ir CLEC fermento aktyvumas įvertintas hidrolizuojant nitroanilido substratą, kaip aprašyta aukščiau ( 14 lentelė ir 6 pav.).
[0134] Esterazės kristaiizavimas, skersinis susiuvimas ir liofilizacija ir gauto produkto charakteristikų įvertinimas
[0135] Kaip čia parodyta, 30 mg/ml esterazės (Fluka) iš kiaulės kepenų amonio sulfato suspensijos kambario temperatūroje ištirpdoma 0,25 M kalcio acetato tirpalo prie pH 5,6. Esterazės kristalai pasirodo po kelių minučių, pridėjus kalcio acetato tirpalo. Kristalizacijos tirpalas paliekamas kambario temperatūroje ir kristalizacija užbaigiama per naktį. Kristalai išskiriami centrifūguoj ant, kaip aprašyta 2 pavyzdyje.
[0136] Kaip čia parodyta, 300 [ii esterazės kristalų pridedama i, 5 ml tirpalo, turinčio 12,5% glutaraldehido ir 0,5 M natrio acetato, esant pH 5,5. Kristalų skersinis susiuvimas vykdomas vieną valandą lengvai maišant
[0137] ( maišoma lėkštėje). Po susiuvimo kristalai tris kartus praplaunami 15 ml tūrio 0, 5 M kalcio acetatu, esant pH 6, 3. Esterazės kristalai liofilizuojami kaip aprašyta aukščiau 2 pavyzdyje.
[0138] Tirpios esterazės ir jos CLEC fermentinis aktyvumas
[0139] Tirpios ir CLEC esterazės katalitinis aktyvumas buvo tiriamas spektrofotometriškai matuojant substrato p-nitrofenilo acetato ( FLUKA) hidrolizę ( 15 lentelė ir 7 pav.). Skaldymas stebimas registruojant absorbavimo padidėjimą 400 nm bangos ilgiui. Pradinė substrato koncentracija buvo 0, 001%. Pradinė fermento koncentracija buvo lxlO~ 0 M. CLEC ir tirpūs fermentai pridedami prie 5 ml reakcinio trio su substratu 0, 25 M kalcio acetatu, esant pH 6, 3. Kaip aprašyta anksčiau 2 pavyzdyje, esterazės CLEC centrifuguojant pašalinamas iš reakcinio mišinio, prieš matuojant absorbciją.
[0140] Esterazės CLEC atsparumas proteazių poveikiui taip pat matuotas tokiose pat sąlygose kaip ir termolizino
[0141] (2 pavyzdys). Po inkubacijos su proteaze, tirpaus ir CLEC fermento aktyvumas įvertintas skaidant substratą, p-nitrofenilo acetatą, kaip aprašyta aukščiau (16 lentelė ir 8 pav.).
[0142] Lipazės kristalizavimas, skersinis susiuvimas ir liofilizacija ir gauto produkto charakteristikų įvertinimas
[0143] Kaip čia atskleista, fermentas lipazė (Geotrichum candidum) kristalizuotas, difunduojant garams iš vandeninio 20 mg/ml baltymo tirpalo su 50 mM Tris prie pH 5,6, turinčio 8% amonio sulfato. Bipiramidiniai kristalai pasirodo po 20-30 dienų inkubacijos kambario temperatūroje. Kristalai išskiriami centrifuguoj ant, kaip anksčiau aprašyta 2 pavyzdyje.
[0144] Kaip čia atskleista kristalai įdedami į 12, 5% glutaraldehido ir 50 mM Tris tirpalą, esant pH 5, 6. Kristalų skersinis susiuvimas vykdomas vieną valandą. Po susiuvimo kristalai tris kartus praplaunami 15 ml tūrio 50 mM Tris, esant pH 7, 0. Lipazės CLEC liofilizuojami kaip aprašyta anksčiau 2 pavyzdyje.
[0145] Tirpios lipazės ir jos CLEC fermentinis aktyvumas
[0146] Tirpios ir CLEC lipazės katalitinis aktyvumas buvo tiriamas spektrofotometriškai matuojant substrato p-nitrofenilo acetato hidrolizę ( 17 lentelė ir 9 pav.). Skaldymas stebimas registruojant absorbavimo padidėjimą 400 nm bangos ilgiui. Pradinė substrato koncentracija buvo 0, 005%. Pradinė fermento koncentracija buvo l, 5xl0~ 8 M. CLEC ir tirpūs fermentai pridedami prie 5 ml reakcinio tūrio su substratu ir 0, 2 M Tris, esant pH 7, kambario temperatūroje. Kaip aprašyta anksčiau 2 pavyzdyje, prieš matuojant absorbciją, CLEC fermentas centrifūguojant pašalinamas iš reakcinio mišinio.
[0147] Lizocimo kristalizavimas, skersinis susiuvimas ir liofilizacija ir gauto produkto charakteristikų įvertinimas
[0148] Pagal BLAKE, C.C.F. ir kt., Nature 196: 1173 (1962) 200 mg liofilizuoto vištos kiaušinio baltymo lizocimo (Boehringer Mannheim) ištirpinta 2,5 ml 0,04 M natrio acetato buferyje kambario temperatūroje, esant pH 4,7. Po baltymo solvatacijos prie lizocimo tirpalo lašinant pridedami 2,5 m; 10% natrio chlorido, nuolat maišant. Kristalizacijos tirpalas paliekamas per naktį kambario temperatūroje ir kristalizacija užbaigiama per 48 valandas. Kristalai išskiriami centrifuguoj ant, kaip anksčiau aprašyta 2 pavyzdyje.
[0149] Kaip čia atskleista, 500 jil lizocimo kristalų pridedama i, 10 ml 24% glutaraldehido ir 50 mM Tris tirpalą, turinti, 20% natrio chlorido, esant pH 5,6. Kristalų skersinis susiuvimas vykdomas 20 minučių švelniai maišant (maišančioje lėkštėje). Po susiuvimo kristalai tris kartus praplaunami 50 ml tūrio 20 mM kalio chloridu, esant pH 5,3. Lizocimo CLEC liofilizuojami kaip aprašyta anksčiau 2 pavyzdyje.
[0150] Tirpaus lizocimo ir jo CLEC fermentinis aktyvumas
[0151] Tirpaus ir CLEC lizocimo katalitinis aktyvumas buvo tiriamas matuojant substrato 4-metilumbeliferilo N-acetil-chitriosido (FLUKA) (Yang, Y. ir Hamaguchi, K., J. Biochem. 8: 1003-1014 (1980)) (18 lentelė ir
[0152] 10 pav.). 4- metilumbeliferono atpalaidavimas buvo sekamas fluorimetru ( Perkin Elmer Model LS- 50). Pradinė substrato koncentracija buvo l, 42xl0~ 3. Fermento koncentracija buvo 3xl0~ 7. CLEC ir tirpus fermentai pridedami prie 2 ml reakcinio tūrio su substratu ir 20 mM kalcio acetatu ir 50 mM kalio chloridu, esant pH 5, 3, prie 42°C. 4- metilumbeliferono kiekis ' buvo registruojamas fluorimetriškai matuojant fluorescencjos intensyvumą prie 450 nm, žadinant prie 360 nin. Plyšio dydis tiek žadinimui tiek ir emisijai buvo 10 nm. Kaip aprašyta anksčiau 2 pavyzdyje, prieš matuojant fluorescenciją, fermentų CLEC buvo pašalinami iš reakcinio mišinio centrifuguojant.
[0153] Asparaginazės kristalizavimas, skersinis susiuvimas ir liofilizacija bei gauto produkto charakteristikų įvertinimas
[0154] Modifikavus procedūrą, aprašytą Grabner ir kt. [U.S.
[0155] Patent 3664926 (1972)] , 25 mg liofilizuotos aspara-ginazės (Worthington) ištirpinama 500 (4.1 50 mM natrio fosfato buferyje, prie pH 7, 2. Tirpalas atšaldomas iki 4°C ir pasiekiamas pH 5, 0 1 M acto rūgšties pagalba. Po to į asparaginazės tirpalą lašinamas šaltas etanolis (- 20°C) ir pasiekiama galutinė 33% koncentracija. Tirpalas inkubuojamas prie 4°C. Kristalizacija užbaigiama per keturiasdešimt aštuonias valandas. Kristalai išskiriami centrifuguoj ant, kaip anksčiau aprašyta.
[0156] Kaip čia atskleista, asparaginazės kristalai susiuvami 7, 5% glutaraldehido ir 50 mM natrio fosfato buferio tirpale, esant pH 5, 6. Po susiuvimo kristalai penkis kartus perplaunami 15 ml tūrio 50 mM Tris, esant pH 7, 0. Asparaginazės CLEC liofilizuojami kaip aprašyta anksčiau 2 pavyzdyje.
[0157] Tirpios asparaginazės ir jos CLEC fermentinis aktyvumas
[0158] Tirpios ir CLEC asparaginazės katalitinis aktyvumas buvo tiriamas spektrofotometriškai matuojant amonio evoliuciją sukabintoje fermentinėje reakcijoje, aprašytoje žemiau ( visi reagentai pirkti Boehringer Mannheim kompanijoje) ( 19 lentelė ir 11 pav.).
[0159] NADH oksidacija buvo registruojama matuojant absorbcijos sumažėjimą 340 nm bangos ilgiui. Pradinė NADH koncentracija buvo 10 3M. Alfa ketoglutarato koncentracija buvo 10 3M. Glutamatdehidrogenazės koncentracija buvo 10" 7M. Asparaginazės koncentracija buvo 2, 3x10~ 8M. Kaip aprašyta anksčiau 2 pavyzdyje, prieš matuojant absorbciją, fermentų CLEC buvo pašalinamas iš reakcinio mišinio centrifuguojant.
1. Skersinio susiuvimo baltymo kristalas, vadinamas kristalu, atsparus egzogeninei proteolizei, besiskiriantis tuo, kad po inkubavimo 3 vai. pronazės tirpale, jis išlaiko mažiausiai 91% savo pradinio aktyvumo, tuo tarpu, kai tirpi baltymo forma, atitinkanti ši, kristalą, tose pačiose sąlygose praranda daugiau negu 90% savo pradinio aktyvumo.
2. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad kristalas yra mikrokristalas.
3. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad baltymas yra fermentas.
4. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad fermentas yra hidrolazė.
5. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrolazė yra parenkama iš termolizino, elastazės, esterazės, lipazės, asparaginazės ir lizocimo.
6. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrolazė yra termolizinas.
7. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrolazė yra asparaginazė.
8. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrolazė yra lizocimas.
9. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrolazė yra esterazė.
10. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrolazė yra elastazė.
11. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 9 punktą, besiskiriantis tuo, kad esterazė yra lipazė.
12. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad proteino:pronazės santykis yra 1:40.
13. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad mikrokristalas turi 10 1 mm skersinio susiuvimo sekcijas.
14. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad mikrokristalas turi skersinio susiuvimo sekcijas mažesnes, negu 10 1 mm.
15. Skersinio susiuvimo hidrolazės mikrokristalas, besiskiriantis tuo, kad turi mažiausiai 35% hidrolazės tirpios formos katalitini, aktyvumą, atitinkanti minimą hidrolazės mikrokristalą.
16. Skersinio susiuvimo hidrolazės mikrokristalas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrolazė yra parenkama iš termolizino, elastazės, esterazės, lipazės, asparaginazės ir lizocimo.
17. Skersinio susiuvimo kristalas, besiskiriantis tuo, kad fermento kristalas turi didesnį, negu 100 kartų, aktyvumo pusperiodi, už tirpios formos fermentą, atitinkanti, fermento kristalą.
18. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo, kad šis kristalas yra mikrokristalas.
19. Skersinio susiuvimo fermento kristalas pagal 16 arba 17 punktą, besiskiriantis tuo, kad fermentas yra hidrolazė.
20. Skersinio susiuvimo fermento kristalas pagal 18 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrolazė parenkama iš termolizino, elastazės, esterazės, lipazės, asparaginazės ir lizocimo.
21. Skersinio susiuvimo kristalas, besiskiriantis tuo, kad fermento kristalas turi toki, stabilumą 50 tūrių % vandens/ organinio tirpiklio mišinyje, kuri, išlaiko mažiausiai 40% nuo inicijuoto aktyvumo inkubuojant minėtame tirpiklyje mažiausiai bent valandą.
22. Skersinio susiuvimo fermento kristalas pagal 20 punktą, besiskiriantis tuo, kad kristalas yra mikrokristalas.
23. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 20 arba 21 punktą, besiskiriantis tuo, kad fermentas yra hidrolazė.
24. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrolazę parenka iš termolizino, elastazės, esterazės, lipazės, asparaginazės ir lizocimo.
25. Skersinio susiuvimo kristalas, besiskiriantis tuo, kad kristalas turi sustiprintą pH aktyvumą palyginus su hidrolazės tirpia forma, kuri atitinka minimą hidrolazės kristalą.
26. Skersinio susiuvimo hidrolazės kristalas pagal 24 punktą, besiskiriantis tuo, kad šis kristalas stabilesnis esant šarminėms pH reikšmėms, negu hidrolazės tirpi forma, atitinkanti hidrolazės kristalą.
27. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 24 arba 25 punktą, besiskiriantis tuo, kad minimas kristalas yra mikrokristalas.
28. Skersinio susiuvimo hidrolazės kristalas pagal 24 arba 25 punktus, besiskiriantis tuo, kad minima hidrolazė parenkama iš termolizino, elastazės, esterazės, lipazės, asparaginazės ir lizocimo.
29. Prietaisas, besiskiriantis tuo, kad turi fermentą su skersinio susiuvimo fermento kristalu pagal 3 arba 4 punktą, priemones, išlaikančias minimą susiūtą fermento kristalą, kurios leidžia susidaryti kontaktui tarp minimo susiūto fermento kristalo ir substrato, kurį veikia fermentas, kai substratas yra tokioje terpėje.
30. Biosensorius, skirtas nustatyti analizuojamą medžiagą terpėje, besiskiriantis tuo, kad jis turi:a) skersinio susiuvimo fermento kristalą pagal 3 arba 4 punktą, kuriame fermentas veikia dominančią analizuojamą medžiagą arba reagentą reakcijoje, kurioje dominanti analizuojama medžiaga dalyvauja; irb) minimo skersinio susiuvimo fermento kristalui išlaikymo priemonių, turinčių medžiagas, leidžiančias susidaryti kontaktui tarp minimo skersinio susiuvimo fermento kristalo ir terpės, turinčios (1) analizuojamą medžiagą, kurią veikia fermentas, kai analizuojama medžiaga yra tokioje terpėje, arba (2) reakcijos, kurioje dalyvauja analizuojama medžiaga, reagentą, kai reagentas yra tokioje terpėje.
a) skersinio susiuvimo fermento kristalą pagal 3 arba 4 punktą, kuriame fermentas veikia dominančią analizuojamą medžiagą arba reagentą reakcijoje, kurioje dominanti analizuojama medžiaga dalyvauja; irb) minimo skersinio susiuvimo fermento kristalui išlaikymo priemonių, turinčių medžiagas, leidžiančias susidaryti kontaktui tarp minimo skersinio susiuvimo fermento kristalo ir terpės, turinčios (1) analizuojamą medžiagą, kurią veikia fermentas, kai analizuojama medžiaga yra tokioje terpėje, arba (2) reakcijos, kurioje dalyvauja analizuojama medžiaga, reagentą, kai reagentas yra tokioje terpėje.31. Biosensorius pagal 29 punktą, besiskiriantis tuo, kad papildomai turi detektavimo priemonių.
32. Biosensorius pagal 29 punktą, besiskiriantis tuo, kad minimas dominanti analizuojama medžiaga yra gliukozė, kreatininas, karbamidas, laktatas, gliukozės-6-fosfatas, sacharozė, ATF, etanolis, acto rūgštis, skruzdžių rūgštis, cholesterolis, karbamido rūgštis, metotreksatas, anglies dioksidas, aminorūgštys, fosfatai, penicilinas, nitratai, nitritai, sulfatai ir sukcinatai.
33. Biosensorius, skirtas nustatyti analizuojamą medžiagą terpėje, besiskiriantis tuo, kad jis turi:a) skersinio susiuvimo liuciferazės kristalą pagal3 punktą, kuriame liuciferazė veikia dominančią analizuojamą medžiagą arba reakcijos, kurioje dominanti medžiaga dalyvauja, produktą; irb) minimo skersinio susiuvimo liuciferazės kristalo išlaikymo priemonių, turinčių medžiagos, leidžian-čios susidaryti kontaktui tarp skersinio susiuvimo liuciferazės kristalo ir terpės, turinčios (1) analizuojamą medžiagą, kurią veikia liuciferazė, arba (2) reakcijos, kurioje dalyvauja analizuojama medžiaga, produktą.
a) skersinio susiuvimo liuciferazės kristalą pagal3 punktą, kuriame liuciferazė veikia dominančią analizuojamą medžiagą arba reakcijos, kurioje dominanti medžiaga dalyvauja, produktą; ir3 punktą, kuriame liuciferazė veikia dominančią analizuojamą medžiagą arba reakcijos, kurioje dominanti medžiaga dalyvauja, produktą; irb) minimo skersinio susiuvimo liuciferazės kristalo išlaikymo priemonių, turinčių medžiagos, leidžian-čios susidaryti kontaktui tarp skersinio susiuvimo liuciferazės kristalo ir terpės, turinčios (1) analizuojamą medžiagą, kurią veikia liuciferazė, arba (2) reakcijos, kurioje dalyvauja analizuojama medžiaga, produktą.34. Ekstrakorporalinis prietaisas terpės komponento pakeitimui, besiskiriantis tuo, kad jis turi:a) skersinio susiuvimo fermento kristalą pagal 3 arba4 punktą, kuriame fermentas veikia komponentą arba reagentą reakcijos, kurioje reagentas dalyvauja; irb) minimo skersinio susiuvimo fermento kristalo išlaikymo priemonių, turinčių medžiagas, leidžian-čias susidaryti kontaktui tarp skersinio susiuvimo fermento kristalo ir (1) komponento, kuri, veikia fermentas, kai komponentas yra tokioje terpėje, arba (2) reakcijos, kurioje dalyvauja komponentas, produkto, kai reagentas yra terpėje.
a) skersinio susiuvimo fermento kristalą pagal 3 arba4 punktą, kuriame fermentas veikia komponentą arba reagentą reakcijos, kurioje reagentas dalyvauja; ir4 punktą, kuriame fermentas veikia komponentą arba reagentą reakcijos, kurioje reagentas dalyvauja; irb) minimo skersinio susiuvimo fermento kristalo išlaikymo priemonių, turinčių medžiagas, leidžian-čias susidaryti kontaktui tarp skersinio susiuvimo fermento kristalo ir (1) komponento, kuri, veikia fermentas, kai komponentas yra tokioje terpėje, arba (2) reakcijos, kurioje dalyvauja komponentas, produkto, kai reagentas yra terpėje.35. Ekstrakorporialinis prietaisas pagal 33 punktą, besiskiriantis tuo, kad komponentas yra asparaginas, heparinas, bilirubinas, metotreksatas, aminorūgštys, karbamidas ir amoniakas.
36. Prietaisas, skirtas panaudoti pasirinkto produkto gamyboje, turintis fermentą skersinio susiuvimo fermento kristalo formoje pagal 3 arba 4 punktą ir skersinio susiuvimo fermento kristalui išlaikymo priemonių.