[LT] Šio biotechnologijos srities išradimo esmė yra vaistinių preparatų gamybai skirto homogeninio auglių nekrozės faktoriaus -a baltymo išgryninimo iš mikrobiologinio producento būdas. Šis valymo būdas gali būti naudojamas medicinos ir biochemijos pramonėje, gaminant auglių faktorių-a, skirtą onkologinių ligų gydymui.@Išradimo tikslas yra padidinti preparato valymo išeigą ir sukurti tokią valymo schemą, kad būtų galima apseiti be aukšto slėgio chromatografijos Phenyl-TSK kolonėlėje.Tai pasiekiama valant auglių nekrozės faktorių-a iš mikrobiologinio producento Escherichia coli SG200 50, turinčio rekombinatinę plazmidę pTNF331 ir naudojant sekančius procesus: ląstelių ardymą ir tolesnį baltymo valymą chromatografijomis ant hidroksilpatito, DE-52 celiuliozės, Red Sepharose CL-6B ir nudruskinimu ant Sephadex G-25.
[EN]
[0001] Tai yra biotechnologijos srities išradimas ir susijęs su medicininės paskirties homogeninio žmogaus auglių nekrozės faktoriaus-a gavimu, panaudojant bakterijų" ląstelės su klonuota plazmide, turinčia žmogaus auglių nekrozės -faktoriaus-a geną. Šis.būdas skirtas žmogaus auglių nekrozės faktoriaus-a baltymo, naudojamo medicinos ir mikrobiologijos pramonėje, gavimui.
[0002] Ribotais kiekiais homogeninis žmogaus auglių nekrozės faktorius-a gaunamas iš žmogaus hematopoetinės kilmės ląstelių (žiūr. Williamson B. D. et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1983-, v. 80, P. 5397-5401; EP 0218868, C12P 21/02,, C12"N 15/00, 1985) .
[0003] Paskutiniaisiais metais žmogaus auglių nekrozės faktorius-a gaunamas iš" mikroorganizmų, sugebančiu sintetinti ši, baltymą dėka rekombinantinių dezoksiribonukleininių rūgščių technologijos (EP 0220966, C07K 3/20, 1985; US 4677063, C12P 21/00, C12N 15/00; EP 0263518, C07K 3/18).
[0004] Mikrobiologinių producentų panaudojimas įgalina išspręsti žmogaus auglių nekrozės faktoriaus-Ua baltymo didelių kiekių gamybos problemą ir patenkinti medicinos poreikius.
[0005] Pats artimiausias -technologiniu požiūriu būdas žmogaus auglių nekrozės faktoriui-a gauti iš Escherichia coli K-12 DG95 "k ląstelių, turinčių rekombina"įtinę plazmidę pAW711, yra sekantis: mikroorganizmų ląstelių suspendavimas 10 mM Tris buferyje (pH 7,0) ir ardymas ultragarsiniu dezintegratoriumi; pirminis valymas, panaudojant DEAE-agarozę joninės jėgos gradientu-* iki 1 M NaCl, 10 mM Tris buferyje (pH 8,2); tolimesnis valymas aukšto slėgio chromatografijos būdu, panaudojant preparatyvinę phenyl - TSK kolonėlę, nu'lygsvarintą 0,1 natrio fosfatiniu buferiu (pH 7,0) esant 1, 8 M amonio salfato ir eliuėrją mažėjančiu linijiniu amonio sulfato gradientu, 0, 1 M fosfatiniame buferyje ( pH 7, 0) ; nudruskinimas, panaudojant GH- 25 ( EP 0220966, C07K 3/ 28, 1985).
[0006] Pateiktuoju būdu vieno ciklo metu gaunama tik 0, 6 mg baltymo ( 6X106 V).. Be to, šis būdas riboja žmogaus auglių nekrozės faktoriaus- a iš bakterinio producento biomasės pramoninę gamybą, kadangi ultragarsu galima ardyti tik nedidelius ląstelių kiekius. Procesas nėra technologiškas ir dėl naudojamos aukšto slėgio chromatografijos.
[0007] Šio išradimo tikslas - padidinti žmogaus auglių nekrozės faktoriaus- a preparato išeigą bei švarumą ir sukurti ekonomiškesnę technologinę valymo schemą.
[0008] Tikslas pasiekiamas naudojant sekančią žmogaus auglių nekrozės faktoriaus- a valymo iš bakterinio • producento Escherichia coli SG200 50, kuriame auglių nekrozės faktoriaus- a genas klonuotas i, plazminę pTNF3HA, gautą žinomu būdu ( žiūr. TSRS autorini, liudijimą Nr. 1445193), schemą: -
[0009] 1. Ląstelių suardymas, esant dideliam slėgiui ( Manton-Gaulin arba analogiškas aparatas), temperatūra 3- 5°C; 2. Nukleino rūgščių pašalinimas, panaudojant DE- 52 celiuliozę (" Whatman", Didžioji Britanija), esant 3- 5°C temperatūrai; 3. Pirminė valymo stadija, panaudojant hidroksilapatitą(" KpaCHblii XHMHK" , NVS) ; 4. Chromatografija, panaudojant DE- 52 celiuliozę (" Whatman", Didžioji Britanija) ; 5. Afininė chromatografija, panaudojant Red- Sepharose' CL- 6B (" Pharmacia", Švedija) ; 6.. NudrUskinimas, panaudojant Sephadex G- 25( Pharmacia", Švedija).
[0010] Visos valymo operacijos, pradedant chromatografija ant hidroksilapatito, atliekamos steriliose sąlygose,
[0011] panaudojant __ apirogeninius sorbentus bei buferinius tirpalus.
[0012] Pateiktas žmogaus auglių nekrozės faktoriaus- a gavimo būdas skiriasi tuo, jog bakterijų ląstelės buvo ardytos, panaudojant didelį slėgi ( Manton- Gaulin aparatas), o tai igalina neribotai maštabuoti procesą. Hidrofobinės aukšto slėgio chromatografijos phenyl- TSK kolonėlėje pakeitimas afinine ( Ręd- Sepharose CL- 6B) įgalina vieno ciklo metu gauti iki 2, 2xl010 V preparat• o veitoj 6xl06 V ( prototipe). Esminiai pakeitimai leidžia
[0013] neribotai maštabuoti procesą, drauge žymiai padidinti išeigą bei švarumą, o tai svarbu pramoninėje gamyboje.
[0014] 1. 1. Štamo producento ląstelių suardymas Manton- Gaulin aparatu
[0015] 120 g Escherichia coli SG200 50 ( pTNF31lA) biomasės, užšaldytos - 70°C temperatūroje, susmulkinama 0, 5- 1 cm3 dydžio gabalėliais, sudedama į indą, užpilama 2400 ml 20 mM Tris, turinčiu 200 mM NaCl, pH 7, 5, maišoma iki
[0016] homogeninės suspensijos 3- 5°C temperatūroje. Gauta suspensija 2- 3 kartus leidžiama per Manton- Gaulin aparatą esant 500- 600 kg/ cm2 , slėgiui. Ekstraktas centrifuguojamas 1 valandą Beckman J2- 21 centrifūga
[0017] 1400 aps/ min. Gaunama 2350 ml baltyminio ekstrakto
[0018] Į gautą baltyminį tirpalą dedama 500 ml DE- 52 celiuliozės, praplautos 20 mM Tris, turinčiu 200 mM NaCl, pH 7, 5, ir maišoma 15- 20 min 3- 5°C temperatūroje. Dekantavimo .. būdu sorbentas atskiriamas nuo baltyminio tirpalo ir pakartotinai praplaunamas 500 ml 20 mM Tris su 200 mM NaCl, pH 7, 5. Abu baltyminiai tirpalai apjungiami. Gaunama 2900 ml baltyminio tirpalo. 1. 3. Chromatografija, panaudojant hidroksilapatitą
[0019] Gautas baltyminis tirpalas skiedžiamas 3 kartus 20 įiM Tris pH 7, 0 ir leidžiamas per koloną K45/ 100 (" Pharmacia", Švedija), užpildytą 1000 ml hidoksilapatito 3- 5°C temperatūroje, prieš tai sorbentas praplaunamas 50 mM Na2HP04, pH 7, 0. Toliau sorbentas praplaunamas tuo pačiu buferiu, kurio tūris lygus 4- 5 sorbento tūriams. Žmogaus auglių nekrozės f akt. orius- a/ nuimamas joninės jėgos linijiniu gradientu iki 220 mM Na2HP04, pH 7, 0. Eliucijos greitis 500 ml/ h. Frakcijos, turinčios žmogaus auglių nekrozės- faktorių- a, surenkamos ( žiūr. lent. 3). Ši ir visos sekančios stadijos atliekamos steriliose sąlygose.
[0020] Apjungtos . frakcijos po hidroksilapatito ultrafiltruojamos " Minitan" aparatu (" Millipore", JAV). Atliekami penki ciklai. Membranų porų dydis 10000 daltonų. Naudojamas 20 mM Tris, pH 7, 5, buferis.. 1. 5. Chromatografija, panaudojant DE- 52 celiuliozę
[0021] Po dializės baltyminis tirpalas leidžiamas per koloną K45/100 ("Pharmacia", Švedija), užpildytą 2000 ml DE-52 celui^ioze, prieš tai sorbentas praplautas 20 mM Tris, pH 7,-5, temperatūra 3-5°C.
[0022] Toliau per sorbentą leidžiamas praplovimo buferis, kol pasiekiama bazinė linija, fiksuojama baltymų deteke?jos kontroline įranga UV-I tipo (Pharmacia", Švedija). Eliucija vykdoma joninės jėgos linijiniu gradientu iki 140 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,5, buferyje. Greitis 2000 ml/h. Frakcijos, turinčios žmogaus auglių nekrozės faktorių-a, apjungiamos. Bendras tūris 3000 ml (žiūr. lent.).
[0023] 1.6. Afininė chromatografija, panaudojant Red-SepharoseCL-6B.
[0024] Sorbenta's praplaunamas 25 mM Na2HP04, pH 7,2 buferiu. Apjungtos frakcijos leidžiamos per koloną K50/40 ("Pharmacia", Švedija), pakrautą 300 ml Red-Sepharose CL-6B sorbentu. Per sorbentą leidžiamas praplovimo buferis iki bazinės linijos. Eliucija vykdoma joninės jėgos gradientu ik 1,5 M NaCl, 25 mM Na2HP04, pH 7,2, . Po to sorbentas toliau plaunamas buferiniu tirpalu, turinčiu 1,5 m NaCl, pH 7,2. Frakcijos, turinčios žmogaus auglių nekrozės faktorių-a apjungiamos. Bendras tūris 1600 ml (žiūr. lent.).
[0025] Apjungtos frakcijos po Red-Sepharose CL-6B ultrafiltruojamos aparatu "Minitan" (Millipore", JAV). Membranų porų dydis 10000 daltonų. Ultraf iltr-ucjama, pasiekiant baltymo koncentraciją ne didesnę kaip 4 mg/ml.
[0026] Naudojama kolona K10D/100 (''Pharmacia", Švedija) užpildyta 7500 ml Sephadex G-25 serbentu, praplautų 100 mM fosfatiniu buferiu turinčiu 200 mM NaCl, pH 7,2. Sukoncentruotas baltyminis tirpalas leidžiamas per so <•rbentą'400 ml/h greičiu. Frakcijqs, turinčios žmogaus auglių nekrozės faktorių-a, apjungiamos. Bendras tūris 800 ml (žiūr. lent.).
[0027] 2.1. Biomasės ląstelių suardymas atliekamas analogiškai 1.1.
[0028] Bakterinio producento ląstelėms suardyti naudojant Manton-Gaulin aparatą, slėgis siekia 700-800 kg/cm2.
[0029] 2.2. Nukleino rūgštys pašalinamos, analogiškai 1.2.
[0030] 2.3. Chromatografija, panaudojant hidroksilapatitą. Žmogaus auglių nekrozės faktoriaus-a eliucij'a atliekama joninės jėgos linijiniu gradientu iki 300 mM Na2HP04, pH 7,0.
[0031] 2.5. Chromatografija, panaudojant DE-52 celiuliozę. Eliucija atliekama joninės jėgos linijiniu gradientu iki 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0.
[0032] 2.6. Afininė chromatografija, panaudojant Red-Sepharose CL-6B.
[0033] Eliucija atliekama joninės jėgos linijiniu gradientu iki 2 M NaCl, 25 mM Na2HP04, pH 7,2.
[0034] 2.8. Nudruskinimas kolonoje Sephadex G-25. Atliekamas analogiškai 1.8.
[0035] 3.1., Biomasės ląstelių suardymas atliekamas analogiškai 1.1. Bakterinio producento ląstelėms suardyti naudojant Manton-Gaulin aparatą, slėgis siekia 300-400 kg/cm2.
[0036] 3.2. Nukleino rūgštys, pašalinamos analogiškai 1.2.
[0037] 3.3. Chromatografija, panaudojant hidroksilapatitą, atliekama analogiškai 1.3.
[0038] 3.5. Chromatografija, panaudojant DE-52 celiuliozę, atliekama analogiškai 1.5.
[0039] 3.6. Afininė chromatografija, panaudojant Red-Sepharose CL-6B, atliekama eliuojant joninės jėgos "-linijiniu gradientu iki 1,5 M NaCl, 25 mM Na2HP04, pH 7,2.
[0040] 3.8. Nudruskinimas kolonoje Sephadex G-25 atliekamas analogiškai 1.-8.
[0041] Gautas preparatas yra apirogeniškas, sterilus, homogeniškas elektroforetini'u bei imunocheminiu požiūriu, biologinis aktyvumas ne mažesnis' kaip. 3xl07 V/mg.
[0042] Gaunamo žmogaus auglių nekrozės faktoriaus-a preparato homogeniškumas patvirtintas elektroforezės poliakri-lamidiniame gelyje, esant natrio dodecilsūlfatui, būdu. Automatizuotas sekvenavimas Edmano metodu modifikuotu Čango parodė, jog gautas auglių nekrozės faktoriaus-a preparatąs turi vieną polipeptidinę grandinę šu Ser-Arį-Th"r-Pro-... amino rūgščių seka N-gale.
[0043] Pastaroji auglių nekrozės faktoriaus-a seka skiriasi nuo natūralaus tipo, jog N-gale neturi keturių amino rūgščių Val-Arg-Ser-Ser-...
[0044] Preparato biologinis aktyvumas, nustatytas -panaudojant pelių fibroblastines ląsteles L929, lygus 3xl07 V/mg baltymo, prototipe - 1x1Op V/mg baltymo.
[0045] Pateiktos technologinės schemos panaudojimas įgalina padidinti žmogaus nekrozės faktoriaus- a išeigą iki32 %, prototipe 30 %, ir vieno ciklo metu gauti 2, 2xl010 V preparato, prototipe 6xl06 V.
[0046] Aukšto slėgio chromatografijos pakeitimas įgalina technologiškesnę, tinkamesnę maštabavimui va' lymo schemą.
[0047] Gautą preparatą galima naudoti kaip biologiškai aktyvią medžiagą ląstelių kultūroms, taip pat vaistinės formos gamybai.
Rekombirfantinio žmogaus auglių nekrozės faktoriaus-gavimo būdas iš Escherichia coli ląstelių, turinčių rekombinantinę plazmidę, chromatografiniuose procesuose naudojant anijonitini, sorbentą bei nudruskinimą, besiskiriantis tuo, kad ardo Escherichia coli ląstelės SG200- 50 su rekombinantine plazmide pTNF311A,veikiant aukštam slėgiui, pirminiam gryninimui.naudoj a hidroksilapatitą ir eliuciją gradientu iki 220-300 mM NajHPO,,, pH 7,0, toliau grynina DE-52 celiulioze,eliucija 20 mM Tris buferiu, turinčiu 140-200 mM NaCl,pH 7,5-8,0, po to naudoja afininę chromatografiją Red-Sepharose CL-6B, eliuciją, naudojant 25 mM Na2HP04, turinti, 1,5-2 M NaCl, pH 7,2, preparato pervedimui i,natrio fosfatini, buferį, pH 7,2, atlieka nudruskinimą Sephadex G-25 kolonoje.
Rekombirfantinio žmogaus auglių nekrozės faktoriaus-gavimo būdas iš Escherichia coli ląstelių, turinčių rekombinantinę plazmidę, chromatografiniuose procesuose naudojant anijonitini, sorbentą bei nudruskinimą, besiskiriantis tuo, kad ardo Escherichia coli ląstelės SG200- 50 su rekombinantine plazmide pTNF311A,veikiant aukštam slėgiui, pirminiam gryninimui.naudoj a hidroksilapatitą ir eliuciją gradientu iki 220-300 mM NajHPO,,, pH 7,0, toliau grynina DE-52 celiulioze,eliucija 20 mM Tris buferiu, turinčiu 140-200 mM NaCl,pH 7,5-8,0, po to naudoja afininę chromatografiją Red-Sepharose CL-6B, eliuciją, naudojant 25 mM Na2HP04, turinti, 1,5-2 M NaCl, pH 7,2, preparato pervedimui i,natrio fosfatini, buferį, pH 7,2, atlieka nudruskinimą Sephadex G-25 kolonoje.