[LT] Yra aprašytas preparatas, pasižymintis fermentiniu aktyvumu ir sugebantis delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65 °C temperatūroje ir esant pH mažiausiai 9. Šis preparatas yra gaunamas iš Bacillusstearothermophilus kamieno, parinkto iš deponuotų kamienų NCIMB 40221 ir NCIMB 40222 bei jų mutantų ir variantų, aerobine fermentacija. Į išradimą taip pat įeina deponuoti kamienai NCIMB 40221 ir NCIMB 40222. Dar yra atskleistas minėto preparato gamybos būdas ir procesas, apimantis medienos masės apdorojimą šiuo preparatu. Be to, šis išradimas apima minėto preparato panaudojimą gaunant medienos masę, dulkių masę, popierių ir lentas, apdorotas šiuo preparatu.
[EN]
[0001] Išradimas skirtas preparatui, pasižyminčiam fermentiniu aktyvumu, sugebančiam delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje, kai pH yra mažiausiai 9. Dar šis išradimas skirtas minėto preparato gamybos būdui, aerobiškai fermentuojant pasirinktą Bacillus stearothermophi/ us kamieną. Be to, šis išradimas skirtas dviems išskirtiems Bacillus stearothermophilus kamienams ir jų mutantams bei variantams. Išradimas taip pat skirtas išradimo preparato panaudojimams, būtent, procesui, apimančiam medienos masės apdorojimą preparatu pagal šį išradimą, medienos bei susmulkintos celiuliozės, apdorotai preparatu pagal šį išradimą, taip pat popieriui, lentoms ir dulkėms, pagamintoms iš medienos masės, apdorotos preparatu pagal šį išradimą.
[0002] Medienos ir popieriaus pramonėje yra dedamos didelės pastangos, kad būtų sumažintas chemikalų panaudojimas delignifikacijos ir balinimo procesuose, kadangi tokie chemikalai, ir ypač chloro junginiai, ištekėję iš balinimo įrenginių, padidina aplinkos užteršimą.
[0003] Vienas kelias sumažinti chemikalų panaudojimą masės sudaryme ir balinime yra susijęs su ligniną suskaldančių mikroorganizmų panaudojimu. Taip pat buvo pasiūlyti ligniną skaldantys ir ligniną modifikuojantys fermentai. Lignino suskaldymo išsami apžvalga buvo publikuota „Critical Revievvs in Biotechnology, vol. 6, Issue 1, 1987, pp. 1-60, Ed. Stevvart, G.G." ir „Russell, I., CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida".
[0004] Kitas kelias buvo susijęs su lignino išskyrimu, panaudojant hemiceliuliazes hemiceliuliozės jungčių nutraukimui. Apžvalginis straipsnis apie hemiceliuliazes - „Their Occurence, Purification, Properties and Mode of Activity by Dekker, R.F.H. and Richars, G.N." buvo publikuotas žurnale Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, vol. 32, 1976, pp. 277-352.
[0005] Tarp hemiceliuliazių panaudojimo biominkštinimui ir biobalinimui didžiausio dėmesio susilaukė ksilanazės. FR 2 557 894-A1 atskleidžia popieriaus masės apdorojimą fermentiniu tirpalu, kuris nepasižymi jokiu celiuliaziniu aktyvumu ir kuriame yra ksilanazės. Šis apdorojimas atliekamas 20-60°C, ypač 40°C temperatūroje, ir 6 pavyzdys parodo, kad pH turėtų būti 5. Tačiau popieriaus ir medienos pramonėje būtų geriau apdoroti medienos masę aukštesnėje temperatūroje ir esant didesniam pH dėl ekonominių priežasčių ir patogumo, kadangi kai kurie įprasti balinimo procesai atliekami temperatūroje, viršijančioje 65°C, esant pH didesniam už 9.
[0006] Kiek mums žinoma, niekas nepaskelbė apie medienos masės apdorojimą preparatu, pasižyminčiu fermentiniu aktyvumu ir sugebėjimu delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje, kai pH yra mažiausiai 9. Šis išradimas pateikia preparatą, pasižymintį fermentiniu aktyvumu ir sugebantį delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje, kai pH yra mažiausiai 9.
[0007] Šiame aprašyme ir pridėtoje apibrėžtyje posakis „medienos masė" turi būti interpretuojamas plačiai, ir tuo būdu juo norima apimti visas lignoceliuliozinių medžiagų rūšis.
[0008] Vienas šio išradimo aspektų yra skirtas preparatui, pasižyminčiam fermentiniu aktyvumu, kuris gaunamas aerobinės fermentacijos būdu tinkamoje terpėje iš BacH/ us stearothermophi/ us kamieno, parinkto iš deponuotų NCIMB 40221 ir NCIMB 40222 kamienų ir jų mutantų bei variantų, sugebančių praktiškai taip pat gaminti minėtą preparatą kaip ir minėti NCIMB 40221 ir NCIMB 40222 kamienai, ir kuris sugeba delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje, kai pH yra mažiausiai 9.
[0009] Viename iš šio išradimo aspekto įgyvendinimų preparatas yra gaunamas aerobine fermentacija tinkamoje terpėje, kurioje yra gliukozės kaip anglies šaltinio, iš Bacillus stearothermophi/ us kamieno NCIMB 40222 mutantinio kamieno. Kitame šio išradimo įgyvendinime šio išradimo preparatas susideda iš fermento, sudaryto iš aminorūgščių sekos
[0010] Kitas šio išradimo aspektas yra skirtas preparato, pasižyminčio fermentiniu aktyvumu, gamybos būdui, kur Bacillus stearothermophilus kamienas, parinktas iš kamienų NCIMB 40221 ir NCIMB 40222 ir jų mutantų bei variantų, iš esmės sugebančių gaminti minėtą preparatą, kaip ir minėti kamienai NCIMB 40221 ir NCIMB 40222, yra nukreipiamas aerobinei fermentacijai tinkamoje terpėje, minėtam preparatui sugebant delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje, kai pH yra mažiausiai 9. Atskirame šio išradimo įgyvendinime mutantinis Bacillus stearothermophi/ us NCIMB 40222 kamienas yra nukreipiamas aerobinei fermentacijai tinkamoje terpėje, kurioje yra gliukozės kaip anglies šaltinio. Kitame šio išradimo aspekto įgyvendinime fermentacijos buljonas yra nuskaidrinamas paprastai centrifugavimo būdu. Dar viename įgyvendinime nuskaidrintas fermentacijos buljonas yra nukreipiamas amonio sulfato nusodinimui ir paprastai resuspensijai skystoje terpėje, kad būtų gauta dalinai išgryninta minėto nuskaidrinto kultūros buljono frakcija, pasižyminti fermentiniu aktyvumu medienos masės terpėje mažiausiai 65°C temperatūroje, kai pH yra mažiausiai 9. Tolesniame būdo pagal šį išradimą įgyvendinime nuskaidrintas fermentacijos buljonas yra gryninamas ir koncentruojamas, panaudojant katijonitą, kad būtų gauta labai gryna ksilanazės pavidalo frakcija, pasižyminti fermentiniu aktyvumu medienos masės terpėje mažiausiai 65°C temperatūroje, kai pH yra mažiausiai 9.
[0011] Dar vienas šio išradimo aspektas yra skirtas išskirtiems Bacillus stearothermophi/ us kamienams NCIMB 40221 ir NCIMB 40222 ir jų mutantams bei variantams, minėtiems mutantams bei variantams sugebant praktiškai taip pat gaminti preparatą, pasižymintį fermentiniu aktyvumu, kaip ir minėti kamienai NCIMB 40221 ir NCIMB 40222, minėtam preparatui pasižymint sugebėjimu delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje, kai pH yra mažiausiai 9.
[0012] Dar vienas išradimo aspektas yra skirtas procesui, apimančiam medienos masės apdorojimą, kur medienos masė yra apdorojama preparatu pagal šį išradimą bent vienoje stadijoje. Viename iš šio išradimo aspekto įgyvendinimų medienos masė, kuri turi būti apdorojama, yra sulfato masė. Kitame įgyvendinime sulfato masė, kuri turi būti apdorojama, yra dalinai delignifikuota sulfato masė. Dar viename šio išradimo aspekto įgyvendinime dalinai delignifikuota sulfato masė, kuri turi būti apdorojama, yra deguoniu delignifikuota sulfato masė. Procesas, apimantis medienos masės apdorojimą, yra tinkamai atliekamas mažiausiai 65°C temperatūroje, kai pH yra mažiausiai 9.
[0013] Papildomas šio išradimo aspektas yra skirtas produktams, gautiems iš medienos masės, kuri bent vienoje stadijoje buvo apdorota preparatu pagal šį išradimą. Tuo būdu, šis išradimo aspektas apima medienos masę ir susmulkintą celiuliozę, kurios bent vienoje stadijoje buvo apdorotos preparatu pagal šį išradimą, ir popierių, lentas bei dulkes, kurie buvo pagaminti iš medienos masės, bent vienoje stadijoje apdorotos preparatu pagal šį išradimą.
[0014] Tolesnis šio išradimo aspektas yra skirtas DNR arba RNR prabai, kuri atpažjsta nukleotidų seką, koduojančią aminorūgščių seką
[0015]
[0016] Pastarieji du išradimo aspektai yra naudingi fermentų, sugebančių delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje ir esant pH mažiausiai 9, suradimui.
[0017] Termostabilių fermentų, gaminančių organizmus, išskyrimas
[0018] Organizmų šaltinis buvo vandens ir purvo pavyzdžiai, paimti iš vandens valymo baseinų Korsnas medienos ir popieriaus fabrike (Gavle, Švedija). Praturtinimo terpėje (XM) buvo 0.01% mielių ekstrakto, 0.04% triptono ir 0,2% ksilano, esant pH 7.0. Toje pačioje terpėje, esant pH 8.1 ir 9.6, buvo papildomai Na2CC>3. Vandens ir purvo pavyzdžiai buvo įdėti į XM terpę ir aerobiškai kultivuoti 65°C temperatūroje. Kultūrų pavyzdžiai buvo perkeliami į šviežią terpę kas 2-3 dienos. Po 4 perkėlimų, kultūrų pavyzdžiai buvo praskiesti ir paskirstyti ant XM agaro lėkštelių (XM turi 2% agaro).
[0019] Po trijų nepriklausomų praturtinimo procedūrų, buvo išskirta 30 kamienų, kurie galėjo augti ant MX agaro lėkštelių 65°C temperatūroje. Nė vienas kamienas nebuvo išskirtas iš XM terpės, esant pH 9.6. 10 iš 30 išskirtų kamienų aplink koloniją gamino ryškias zonas, leidžiančias manyti, kad jie gamina neląstelinę ksilanazę. Du iš šios dešimties išskirtų kamienų
[0020] Du kamienai, pavadinti BaciHus sp T- 2 ir Bacillus sp. T- 6 buvo deponuoti pagal Budapešto sutartį National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Ltd (NCIMB), Aberdeen, 1989 m. lapkričio 3 d. kamienams T-2 ir T-6 buvo priskirti registracijos numeriai, atitinkamai NCIMB 40221 ir NCIMB 40222.
[0021] Kamienai T2 ir T6 yra aerobinės, gramteigiamos, sporas sudarančios lazdelės, galinčios augti 65°C temperatūroje. Šie kamienai NCIMB laikomi skirtingais Bacillus stearothermophilus kamienais, remiantis tokiais bandymo rezultatais:
[0022] Bacillus- antros stadijos tyrimai
[0023] Termofiliniai ksilanazės teigiami izoliatai T2 ir T6 buvo nusiųsti į Microbial ID, INC. Nevvark, DE, JAV - riebiųjų rūgščių sudėties nustatymui. Buvo gauti tokie rezultatai:
[0024]
[0025] Kamienų 12 ir T6 augimo charakteristikos ir koncentruotų nevalytų supernatantų paruošimas iš sukultūrintų kamienų
[0026] bevitamininės kazamino rūgštys, 4; mielių ekstraktas, 0.2; MgS04, 0.01; (NH4)2S04, 2; K2HP04, 0.46; KH2P04, 0.1; ksilozė, 5; MOPS (3-[N-morfolino] propano sulforūgštis), 10.4; ir kitų elementų pėdsakai. Terpės pH buvo 7.0.
[0027] Ksilanazės aktyvumas buvo nustatytas, inkubuojant šviežią ksilano tirpalą su neląsteliniu supernatantiniu skysčiu ir tiriant padidėjimą redukciniame cukruje ferocianido metodu (Spiro, R.G. 1966, Methods of Enzymology 8: 7-9). Bandymo buferis buvo 50 mM Tris. Cl, pH 7.0 ir 0.5% ksilano (avižos speltos, Sigma). Ksilanazės aktyvumo vienetai yra (jmol redukcinio cukraus, generuojamo per minutę 65°C temperatūroje.
[0028] Terpės ląstelės drumstumas pateiktas Klett vienetais. IKV=0.004 g sausos ląstelės masės (SLM)/litre. Jei kultūra pasiekia savo maksimalų tankį, ji yra linkusi lizuotis, ką parodė ryškus kultūros drumstumo sumažėjimas.
[0029] Kamienai T2 ir T6 buvo auginami XMP terpėje 24 valandas New Brunsvvick Microferm 7.5 litrų fermentatoriuje. Auginimas buvo atliekamas 4 litrų darbo tūryje 60°C temperatūroje, esant maišymo greičiui 600 aps/min. ir vėdinimo greičiui 7 l/min. Putojimas buvo reguliuojamas automatiškai, pridedant silicio priemonės prieš putojimą (5%, Fluka), o darbinis tūris buvo išlaikomas, pridedant sterilaus vandens. Pradinis pasėlių drumstumas buvo 10 KV (0.04g SLM/I). Per pirmąsias 8 fermentacijos valandas ląstelių drumstumas kamienams T2 ir T6 išaugo atitinkamai iki 540 ir 700 KV. Po 24 valandų drumstumas išnyko.
[0030] Kultūros skystis buvo atšaldytas iki kambario temperatūros ir centrifuguotas (8000 g, 10 min., 20°C), kad būtų pašalintos ląstelės. Beląsteliniame supernatante buvo 1.0-1.4 ir 2.0-2.4 ksilanazės vienetų ml atitinkamai kamienams T2 ir T6 bei apie 0.02 mg baltymo abiems kamienams. Baltymas buvo sukoncentruotas, pridedant prie supernatanto kieto amonio sulfato iki 80% prisotinimo 4°C temperatūroje ir centrifuguojant (9000 g, 15 min.) mišinį 12 valandų 4°C temperatūroje. Nuosėdos buvo ištirpintos bendrame 100 ml 10mM fosfato buferio su pH 7.0 tūryje ir triskart dializuotos prieš 5 litrus to paties buferio 4°C temperatūroje.Dializuotame tirpale (120 ml) buvo maždaug 7 mg/ml baltymo ir 15-20 bei 35-40 ksilanazės vienetų atitinkamai kamienams T2 ir T6.
[0031]
[0032] Reikėtų pastebėti, kad kamienų T2 ir T6 ksilanazės aktyvumas fermentacijos pabaigoje nesumažėjo.
[0033] Fermentas, pasižymintis fermentiniu aktvumu pagal šj išradimą
[0034] Beląsteliniai supernatantai nuo T2 ir T6 kamienų augimo XMP terpėje turi mažiausiai vieną ksilanazę, kadangi buvo parodyta, kad jie pasižymi ksilanazės aktyvumu. Minėti supernatantai (taip pat vadinami nevalytais fermentiniais preparatais) ir dalinai išgrynintos frakcijos buvo panaudotos, apdorojant nebalintą ir deguoniu pusiau išbalintą minkštos medienos sulfato masę.
[0035] Masės pavyzdžiai buvo minkštos medienos sulfato masės pavyzdžiai, paimti iš Korsnas fabriko.
[0036] Nebalintos medienos pavyzdys buvo pavyzdys, paimtas po šarminio apdorojimo Kamyr autoklave, laboratoriškai persijotas ir perpalutas, ir šis pavyzdys buvo per naktį džiovinamas 50°C temperatūroje. Pusiau sausas pavyzdys buvo panaudotas eksperimentuose ir buvo pažymėtas K8. Ši medžiaga buvo džiovinama 105°C temperatūroje iki pastovaus svorio, atiduodanti 6.35% vandens turinio.
[0037] Deguoniu pusiau išbalintos masės pavyzdys buvo pavyzdys, apdorotas Korsnas pluošto 3 linijoje, ir buvo paimtas po antro apdorojimo deguonimi, laboratoriškai persijotas ir perplautas. Bendras medienos apdorojimas Korsnas fabrike aprašymas buvo atspausdintas 1989 m. spalio mėn., Paper 26, p. 20 ir Nordisk Cellulose 1989 No. 6, P.8-11. Deguoniu pusiau išbalinta masė buvo pažymėta K11.
[0038] Masių K8 ir K11 lignino kiekis buvo nustatytas pagal „The Svvedish Association of the Pulp and Paper Engineers", Series CCA5. K8 (nebalintos) lignino kiekis buvo 2.8% ir K11 (deguoniu pusiau išbalintos) lignino kiekis buvo 2.0%. Tokiu būdu deguoniu pusiau išbalintos masės K11 pavyzdys turėjo maždaug 25% mažesnį lignino kiekį negu K8.
[0039] Masių K8 ir K11 delignifikavimo eksperimentai, atlikti su nevalytais fermentų preparatais iš Bacillus stearothermophilus kamienų T2 ir T6
[0040] Norint nustatyti, kiek lignino padaryta ekstrahuojamu šio išradimo preparatu, buvo panaudotas jautrus spektrofotometrinis bandymas. Buvo matuoti pavyzdžių supernatantinių skysčių absorbcijos dydžiai, prie 350 nm (A350), ir išmatuoti dydžiai pateikti kaip išskirto lignino %. Eksperimentai ir rezultatai susumuoti 1-5 lentelėse.
[0041] Pagal duomenis, pateiktus 1-5 lentelėse, gali būti padaryta išvada, kad nevalyti fermentų preparatai iš Bacillus stearothermophilus kamienų T2 ir T6 sugeba delignifikuoti ir išbalintą, ir pusiau išbalintą medienos masę, esant pH dydžiams mažiausiai 9, ir mažiausiai 65°C temperatūroje. Dar daugiau, gali būti padaryta išvada, kad išskirto lignino % priklauso tiek nuo laiko, tiek nuo koncentracijos.
[0042]
[0043] Labai išgrynintos frakcijos iš kamieno T6 kulturos preparatas
[0044] Nuskaidrinto buljono iš kamieno T6 kultūros labai išgryninta frakcija (ksilanazės pavidalo) yra gaunama, panaudojant katijonitą vienoje koncentracijos ir gryninimo stadijoje. Tokiu būdu, ksilanazė T6 buvo gryninama ir koncentruojama tiesiog iš beląstėlinio supernatanto adsorbcija j katijonitą CM-52 (Whatman). Tačiau su XMP terpe regeneravimo išeiga buvo tik 21%, matyt, dėl didelės terpės joninio pajėgumo. Kada terpė buvo dializuota prieš mažo joninio pajėgumo buferį arba MOPS buvo išleista iš terpės, regeneravimo išeiga buvo maždaug 50%. Minimalaus CM-52 kiekio, reikalingo efektyviai adsorbcijai iš nuskaidrintos kultūros nustatymui buvo tiriami įvairūs CM-52 kiekiai ksilanazės T-6 gryninimui. Rezultatai pateikti 6 lentelėje.
[0045] Kaip parodyta 6 lentelėje, esant 5% adsorbento, išeiga yra 50%. Kitas komerciškai prieinamas katijonitas yra SE-52 (VVhatman) (neigiamos grupės yra sulfoksietilo, prijungto prie celiuliozės). Žinoma, kad SE-52 yra didesnės adsorbcinės talpos negu CM-52. Kadangi gryninimo stadija yra kartu ir koncentravimo stadija, yra naudinga panaudoti kiek įmanoma mažiau adsorbento. Todėl mes ksilanazės adsorbcijai išbandėme SE-52. Rezultatai pateikti 7 lentelėje.
[0046] Kaip parodyta 7 lentelėje, tik 2% SE-52 buvo sunaudoti ksilanazės T-6 48% regeneravimui.
[0047] Ksilanazės T-6 molekulinė masė nustatyta SDS PAGE ir gelio filtracijos būdas, gauti dydžiai svyruoja tarp 41000 ir 42000 Daltonų. Faktas, kad abu metodai davė panašią MM (molekulinę masę), parodo, kad fermentas sudarytas iš vienos polipeptidinės grandinės (elektroforeze poliakrilamidiniame gelyje su natrio dodecilsulfatu (SDS PAGE) atskiria baltymo subvienetus). Fermento pl (pH, kur bendras baltymo krūvis yra lygus nuliui) buvo 9.0, nustatytas aukšto voltažo izoelektrinio fokusavimo būdu. Palyginti aukštas fermento pl paaiškina teigiamą fermento krūvį, esant neutraliam pH. Fermento optimalus pH buvo apie 7.0; esant pH 9.0, fermentas turėjo maždaug 50% jo pH 7.0 aktyvumo. Ksilanazės T-6 aktyvumo temperatūros profilis pateiktas 8 lentelėje.
[0048] Be to, galima paminėti, kad esant 65°C ir pH 7, per 10 vai. nebuvo aptikta aktyvumo sumažėjimo.
[0049] Norėdami gauti mutantus, mes pasinaudojome tuo faktu, kad daugeliu atvejų ksilanazė ir ksilozidazė yra pavaldžios tai pačiai reguliacinei kontrolei (tas pats represorius). Kamienai, kurie gamino ksilozidazę, gali būti lengvai aptikti ant agaro lėkštelių su chromogeniniu p-nitrofenilo p-D-ksilopiranozido (ONPX) substratu. Tik struktūriniai mutantai ksilozidazei gamins ant agaro lėkštelių geltoną spalvą, kai nėra ksilozės. Norint gauti ksilozidazės struktūrinius mutantus, ląstelės buvo mutagenizuotos MNNC (1-metil-3-nitro-1-nitrozoguanidinu) ir tuomet patalpintos ant agaro lėkštelių su ONPX be ksilozės. Maždaug viena iš penkių šimtų ląstelių gamino kolonijas, kurios ant agaro lėkštelių davė geltoną spalvą. Tokiu būdu buvo išskirti trisdešimt ksilozidazės struktūrinių mutantų ir visi jie buvo ir ksilanazės struktūriniai mutantai. Dviejų iš jų (M-7 ir M-28), augančių esant ksilozei ar gliukozei, augimas ir ksilanazės gaminimas yra pateikti 10 ir 11 lentelėse. Abiejose terpėse (XMP ir GMP) mutantų ir T-6 augimo greičiai buvo panašūs. Tačiau mutantai, palyginus su T-6, gamino žymiai daugiau ksilanazės XMP terpėje. GMP terpėje (gliukozė yra anglies šaltinis) kamienas T-6 negamino nustatomo ksilanazės kiekio tuo tarpu kai mutantai davė ksilanazės aktyvumo lygį. Kamieno M-7 ksilanazė buvo išgryninta ir pasižymėjo ksilanazei T-6 identiškomis savybėmis.
[0050]
[0051] Iš gana ilgos baltymo N-terminalinės aminorūgščių sekos dalies galima visiškai identifikuoti baltymą. Vieno ksilanazės T-6 fragmento seka buvo dukart nustatyta VVeizman institute Izraelyje Taikomuoju biosistemų dujinės fazės mikrosekvenseriu ABI 475 A. Pirmas baltymo pavyzdys buvo pirmiausiai elektra padengtas ant PVDF membranos (Millipore) ir davė 20 aminorūgščių. Antras baltymo pavyzdys buvo pirmiausiai išgrynintas Superose 12 FPLC kolonėlėje (Pharmacia) ir buvo pakankamas 41 aminorūgšties sekos gavimui.
[0052] Gauta tokia seka:
[0053] Tolesnei fermento charakteristikai aminorūgščių tyrimas buvo atliktas su išgryninta ksilanaze T-6. Šio tyrimo rezultatai pateikti 12 lentelėje.
[0054] Masės pavyzdys K14 buvo deguoniu pusiau išbalintos minkštos medienos masė iš Korsnas fabriko. Fermentas buvo išgryninta termofilinė ksilanazė T-6.
[0055] Buvo tirti įvairūs parametrai, veikiantys masės K14 delignifikacijos laipsnį.
[0056]
[0057] Kaip matyti iš 13 lentelės, mažinant pluošto koncentraciją nuo 4.7 iki 2.5 ir iki 1.0% sauso pluošto svorio, procesas stiprėja. Kadangi fermentinis apdorojimas atliekamas be maišymo, panašu, kad buvo per silpnas kontaktas tarp fermento ir netirpaus substrato. Dėl praktinių priežasčių mes pasirenkame dirbti su 2.5% koncentracijos pluoštu.
[0058] pH poveikis pateiktas 14 lentelėje.
[0059]
[0060] Kaip matyti iš 14 lentelės, fermentas yra efektyviausias, esant pH 8.5-9.0, tiek kalio fosfate, tiek natrio sulfate. Ankstesni eksperimentai parodė mažą aktyvumą žemiau pH 8.0 ir aukščiau pH 9.5.
[0061] Na2S04 koncentracijos poveikis yra pateiktas 15 lentelėje.
[0062] Kaip matyti iš 16 lentelės, lignino išskyrimas priklausė nuo koncentracijos iki maždaug 15 V/ml tiek 0.1 M Na2S04, tiek kalio fosfato buferyje. Didesnė fermento koncentracija arba ilgesnis inkubacijos periodas (4 vai.) tik nežymiai padidino išskirtą gryną ligniną. 10 g ir 50 g apdorotos K14 masės pavyzdžių paruošimas tolesniems bandymams 10 g masės K14 pavyzdžių buvo apdoroti 15 V/ml ir 45 V/ml ksilanaze 2 vai. ir 4 vai. kartu su atitinkamais kontroliniais pavyzdžiais. Visi pavyzdžiai turėjo dublikatus. Visos inkubacijos buvo atliekamos, esant pH 9.0 ir 65°C. Lignino išskyrimo spektrometrinė analizė parodyta 17 lentelėje (fosfato buferis) ir 18 lentelėje (0.1 M Na2S04). Išskirto lignino kiekis svyravo nuo 10.3 iki 14.9 % su 45 V/ml fermentu ir 4 vai. inkubacijos periodais, gaunant nežymiai didesnius dydžius negu prie 15 V/ml ir 2 vai. Neseniai 50 g masės pavyzdžių buvo apdorota, naudojant dublikatus, papildomai analizei. Išskirto gryno lignino buvo 10.8% 13 V/ml fermento 2 vai. ir atitinkamai 12.6% prie 15 V/ml 4 vai.
[0063] Ksilanaze apdorotų 10 g pavyzdžių analizė
[0064] Analizės rezultatai yra susumuoti 19-23 lentelėse. Parametrai, pateikti lentelėse, buvo matuoti pagal SCAN bandymų serijas, išskyrus nulinio žingsnio dydžius, kurie buvo matuojami pagal gamintojų (Pulmac Instruments Ltd., Kanada) instrukcijas. 19 lentelėje pateikti duomenys, gauti panaudojant masę, kuri buvo apdorota 2 valandas 65°C temperatūroje, pH 9.0, 0.1 M Na2S04, be fermento (kontrolinis pvz.) ir su 15 V/ml fermento. Kaip galima matyti, buvo puikus atgaminimas su dublikatų pavyzdžiais, paruoštais kas 2 savaičių intervalai. Didžiausias poveikis buvo pentozano kiekiui, kuris sumažėjo 17.4% Buvo nedideli, bet patikimi Kapa skaičių bei tamprumo indeksų sumažėjimai, ir ryškumo, klampumo bei nulinio žingsnio dydžių padidėjimai.
[0065] Aukščiau minėtų savybių dydžiai medienos masei arba lakštams, padarytiems iš masės, nebuvo labai skirtingi, naudojant fermentus 15 V/ml bei 45 V/ml, apdorojant 2 vai. ir 4 vai., ir naudojant 0.01 M kalio fosfatą bei 0.1 M Na2S04 (20 ir 21 lentelės).
[0066] Šių duomenų reikšmingumo analizė, medienos masės ir popieriaus savybės yra pateiktos 22 ir 23 lentelėse kaip procentiniai pasikeitimai, palyginus su atitinkamais kontroliniais pavyzdžiais.
[0067] 1. Pentozanai yra dalinai išskirti (10.4-22.2%); didesni fermento kiekiai išskiria daugiau pentozanų. 2. Yra mažas, bet reikšmingas klampumo padidėjimas; tai gali būti paaiškinta pentozanų išskyrimu (apie 1% K14 sausos masės). Nepastebima celiuliozės skilimo netgi esant didžiausioms fermento koncentracijoms, 4 vai. 65°C temperatūroje, pH 9. 3. Kapa skaičius mažėjo visose aštuoniose tirtose sąlygose (ribos: 5.5-9.1%). Kai šie dydžiai toliau nemažėja prie didesnių fermento koncentracijų (tada, kai pentozanai buvo), didesni fermento kiekiai pasirodė išskiriantys pentozanus, kurie nebuvo prijungti prie lignino. 4. Visose aštuoniose tikrintose sąlygose masės lakštai parodė nedidelį ryškumo ir nulinio žingsnio dydžių padidėjimą ir tamprumo indeksų sumažėjimą.
[0068] Masė K14 su Kapa skaičiumi 18.5 buvo panaudota tirti apdorojimo fermentu poveikį balinimui. Masė K14 buvo apdorota fermentu, kurio koncentracija 15 V/ml ksilanazės, pagamintos iš kamieno T-6. Po fermentinio apdorojimo masė buvo balinama su balinimo seka, naudojama Korsnas fabrike: Chloro dioksidas (DO)- šarminė ekstrakcija, sustiprinta deguoniu (EO)- Chloro dioksidas (D1)- chloro dioksidas (D2).
[0069] Fermentinis apdorojimas sumažino lignino masės kiekį iki Kapa skaičiaus 15.9. Masė, apdorota tuo pačiu būdu, kaip fermentu apdorota masė, t.y. 65°C temperatūroje, pH 9, 100 mM Na2S04 buferyje, bet nepridėjus fermentų, buvo delignifikuojama iki Kapa skaičiaus 17.2. Tikrasis fermentinio apdorojimo poveikis buvo delignifikacija nuo Kapa sk. 17.2 iki 15.9, t.y. 8% delignifikacija.
[0070] Masė, apdorota fermentais sulfato buferio sistemoje, sunaudojo 47 kg chloro dioksido (aktyvaus chloro)/masės tonai, kai buvo balinama iki 83% ryškumo su balinimo seka DO (EO) D1D2. Atitinkamas suvartojimas tiktai buferiu apdorotai masei buvo 59 kg chloro dioksido (Cl)/masės tonai, t.y. fermentu apdorota masė sunaudojo 20% mažiau chloro dioksido.
1. Preparatas, pasižymintis fermentiniu aktyvumu, besiskiriantis tuo, kad jis gaunamas iš Bacillus stearothermophilus kamieno, parinkto iš kamienų NCIMB 40221 ir NCIMB 40222 bei jų mutantų ir variantų, sugebančių iš esmės taip pat gaminti minėtą preparatą, kaip minėti kamienai NCIMB 40221 ir NCIMB 40222, aerobine fermentacija tinkamoje terpėje ir sugeba delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje ir esant pH mažiausiai 9.
2. Preparatas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas preparatas gaunamas iš mutantinio Bacillus stearothermophilus kamieno NCIMB 40222 aerobine fermentacija tinkamoje terpėje, turinčioje gliukozės kaip anglies šaltinio.
3. Preparatas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas preparatas susideda iš fermento, apimančio aminorūgščių seką- Lys-Asn-Ala-As p-Ser-Ty r-Ala- Lys- Lys- Pro- H i s- lle-Ser-Ala--Leu-Asn-Ala-Pro-GIn-Leu-Asn-GIn-Arg-Tyr-Lys-Asn-Glu-Phe--Thr-lle-Gly-Ala-Ala-Val-Glu-Pro-Tyr-GIn-Leu-GIn-Asn-arba jos homologą, visam fermentui parodant aktyvumą medienos masės terpėje.
- Lys-Asn-Ala-As p-Ser-Ty r-Ala- Lys- Lys- Pro- H i s- lle-Ser-Ala--Leu-Asn-Ala-Pro-GIn-Leu-Asn-GIn-Arg-Tyr-Lys-Asn-Glu-Phe--Thr-lle-Gly-Ala-Ala-Val-Glu-Pro-Tyr-GIn-Leu-GIn-Asn-arba jos homologą, visam fermentui parodant aktyvumą medienos masės terpėje.4. Preparatas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas preparatas yra labai išgryninta kultūros buljono frakcija, gaunama panaudojant katijonitą, minėtai frakcijai esant ksilanazės formoje, parodančiai fermentinį aktyvumą medienos masės terpėje.
5. Preparatas pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta ksilanazė turi apytikslę molekulinę masę tarp 41000 ir 42000 Daltonų, nustatytą elektroforeze poliakrilamidiniame gelyje su natrio dodecilsulfatu (SDS PAGE) bei gelių filtracija, ir tokią apytikslę aminorūgščių sudėtį, nustatytą aminorūgščių analize kaip aminorūgšties liekanos/ molekulei:Asx 58; Thr 12; Ser 10; Glx 44; Pro 24; Gly 20; Ala 30; Cys 1; Vai 28; Met 2; lle 26; Leu 14; Tyr 22; Phe 16; Lys 38; His 6; Arg 12.
Asx 58; Thr 12; Ser 10; Glx 44; Pro 24; Gly 20; Ala 30; Cys 1; Vai 28; Met 2; lle 26; Leu 14; Tyr 22; Phe 16; Lys 38; His 6; Arg 12.6. Preparato, pasižyminčio fermentiniu aktyvumu, gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad BaciHus stearothermophilus kamieną, parinktą iš kamienų NCIMB 40221 ir NCIMB 40222 bei jų mutantų ir variantų, sugebantį iš esmės taip pat gaminti minėtą peparatą, kaip minėti kamienai NCIMB 40221 ir NCIMB 40222, nukreipia aerobinei fermentacijai tinkamoje terpėje, minėtam preparatui sugebant delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje, esant pH mažiausiai 9.
7. Būdas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad BaciHus stearothermophilus kamieno NCIMB 40222 mutantinį kamieną nukreipia aerobinei fermentacijai tinkamoje terpėje, turinčioje gliukozės kaip anglies šaltinio.
8. Išskirti BaciHus stearothermophilus kamienai NCIMB 40221 ir NCIMB 40222 bei jų mutantai ir variantai, minėtiems mutantams ir variantams iš esmės taip pat sugebant gaminti preparatą, pasižymintį fermentiniu aktyvumu, kaip ir minėti kamienai NCIMB 40221 ir NCIMB 40222, o minėtas perparatas sugeba delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje, esant pH mažiausiai 9.
9. Būdas, susidedantis iš medienos masės apdorojimo, besiskiriantis tuo, kad medienos masę bent vienoje stadijoje apdoroja preparatu pagal bet kurj iš 1-5 punktų.
10. Medienos masė, susmulkinta celiuliozė, popierius, lentos bei dulkės, besiskiriantys tuo, kad jie padaryti iš medienos masės, kuri bent vienoje stadijoje apdorota preparatu pagal bet kurį iš 1-5 punktų.