[LT] Šis išradimas yra iš imuninės biotechnologijos srities. Jo esmė - naujos hibridomos sukūrimas ir monokloninių antikūnių prieš insuliną gavimas.@Hibridoma skiriasi nuo anksčiau aprašytų analogų pagal produkuojamų monokloninių antikūnų specifiškumą ir imunizacijos būdą. Monokloniniai antikūniai gali būti pritaikyti insulino biotechnologijoje.
[EN]
[0001] Išradimas yra iš imuninės biotechnologijos srities. Jo esmė - naujos hibridomos sukūrimas ir monokloninių antikūnų (MA) prieš insuliną gavimas.
[0002] Hibridinių ląstelių linija (hibridoma IP-C2) - tai MA prieš insuliną producentas.
[0003] Hibridomos IP-C2 analogais laikomos hibridinių ląstelių linijos, produkuojančios MA prieš žmogaus insuliną (JI-2), kiaulės ir jaučio insuliną (JI-1) (EP 0179576), žmogaus ir kiaulės insuliną (IN—0 4) (CS 240846), žmogaus ir kiaulės insuliną, silpnai reaguojančius su jaučio insulinu (5H-1B-10B) (SU 1595903). Hibridoma, produkuojanti MA prieš antigeninę determinantę, bendrą žmogaus, kiaulės ir jaučio insulinui ir proinsulinui, nėra aprašyta. Be to, minėtos hibridomos buvo gautos, imunizavus peles natyviu insulinu, tuo tarpu kai hibridoma IP-C2-konjuguotu jaučio proinsulinu.
[0004] Šio išradimo tikslas - sukurti hibridomą, kuri produkuoja specifinius antikūnus prieš insuliną, tam tikslui pelės buvo imunizuotos konjuguotu jaučio proinsulinu, po to imunizuotų pelių blužnies limfocitai sukryžminti su pelių mieioma NSO/1 pagal Kiolerio ir Milšteino metodą [ Kohler, Milstein, Eur. J. Immunol., 1976, 6, 511-919] . Atlikus hibridinių ląstelių tikrinimą ir klonavimą, buvo gauta hibridoma IP-C2.
[0005] Hibridoma IP-C2 deponuota Biotechnologijos institute "Fermentas", deponavimo numeris H 0403.
[0006] Morfologiniai požymiai. Hibridinės ląstelės yra sferinės formos, su lygiais kraštais, turi stambų branduolį. Dauginasi suspensijoje, pasižymi silpna adhezija ant stiklo arba plastiko paviršiaus.
[0007] Ląstelių kultūros požymiai. Kultivavimo sąlygos standartinės: terpė DMEM su 10 % embrioninio karvių serumo, 2 mM L-gliutamino, 20 mM HEPES buferio, 200 |ig/ml gentamicino, auginama 37UC temperatūroje, 5 % C02 atmosferoje. Ląstelių auginimui naudojami stiklo arba plastiko indai, persėjama kas 3-4 dienos, peršėjimo dozė - 100 tūkst. ląst./ml.
[0008] Auginimas gyvūnų organizme. Singeninių pelių BALB/ c organizme hibridoma IP-C2 100 % atvejų sukelia ascitą, suleidus i, pilvo ertmę 1-2 mln. ląstelių. Likus 7-10 dienų iki ląstelių injekcijos, pelės sensibilizuojamos 0,5 ml pristano. Ascitas formuojasi, praėjus 8-12 dienų po hibridinių ląstelių injekcijos.
[0009] Kriokonservavimas. Ilgalaikiam saugojimui ląstelės užšaldomos embrioniniame karvių serume su 10 % dimetilsulfoksido. Užšaldymo režimas - luC/min. iki - 70°C, po to ląstelės perkeliamos į skystą azotą. Atšildymas - vandens vonioje 37°C. Ląstelių gyvybin-gumas po atšildymo - 70-80 %.
[0010] Kontaminacija. Bakterijų ir grybų kultūroje nerasta, mikoplazmos testas neigiamas.
[0011] Ląstelių produktyvumas. 3-4 kultivavimo dieną MA sekrecijos lygis terpėje - 15-20 (.ig/ml, ascite - 7-10 mg/ml. MA produkcija išlieka iki 20 pasažų kultūroje ir iki 5 pasažų ascite.
[0012] Produkto charakteristika. Hibridoma IP-C2 produkuoja IgG klasės, IgGl poklasio MA, specifiškus insulinui.
[0013] 1 pavyzdys. Hibridomos gavimas. Linijos BALB/ c pelės imunizuojamos jaučio proinsulinu ("Novo"), konjuguotu su gliutaro aldehidu. Konjugavimas atliekamas 16 vai. 4UC temperatūroje fosfatiniame buferyje (pH 7,5) su 1 % gliutaro aldehido. Pelės imunizuojamos 4 kartus, suleidžiant konjuguotą • proinsuliną i, pilvo ertmę. Pirmos 3 imunizacijos atliekamos kas 14 dienų, suleidžiant kiekvienai pelei po 50 Įil proinsulino, suspenduoto pilname Froindo adjuvante. Paskutinės imunizacijos metu, kuri atliekama, likus 3 dienoms iki hibridizacijos, suleidžiama po 50 (.il proinsulino fiziologiniame tirpale.
[0014] Hibridizacijai naudojama pelių mielomos linija NSO/1 logaritminėje augimo fazėje ir imunizuotos pelės blužnies limfocitai. Hibridizacijos agentas - 50 % polietilenglikolio (PEG-4000) tirpalas DMEM terpėje su 15 % dimetilsulfoksido, mielomos ir blužnies ląstelių santykis hibridizacijos metu - 1:5. Hibridizacija vykdoma 1 min., po to ląstelės atplaunamos nuo PEG beserumine DMEM terpe, centrifuguojamos, suspenduojamos HAT terpėje ir išsėjamos į plokšteles, po 105 ląstelių į šulinėli,. Prieš tai plokštelėse pasodinami makrofagai iš pelės pilvo ertmės Hibridinių ląstelių selekcija atliekama HAT terpėje, kuri 7-tą kultivavimo dieną palaipsniui keičiama HT terpe (hipoksantinas, timidinas) , o po to - normalia kultivavimo terpe su dviguba serumo koncentracija (20 %). Hibridiniai producentai klonuojami didelių praskiedimų metodu, išsėjant po 1 ląstelę j, šulinėli,. Atrinkti klonai padauginami ir toliau auginami pelių BALB/c pilvo ertmėje, kur formuojasi ascitas. 2 pavyzdys. MA specifiškumo tikrinimas. Naudojamas netiesioginės imunofermentinės analizės (IFA) metodas. Plokštelėse sorbuojami antigenai (žmogaus, kiaulės ir jaučio insulinas ir proinsulinas) : i, šulinėlius įpilama po 0,5 (.ig atitinkamo antigeno 100 (al 0,05 M Na-karbonatinio buferio (pH 9,5) ir inkubuojama 16 vai. 4°C temperatūroje. Po to plokštelės šulinėliai blokuojami 1 % albumino tirpalu, atplaunami vandeniu ir užpildomi 100 |il hibridomos IP-C2 auginimo terpės arba atskiesto ascitinio skysčio. Po inkubacijos (1 vai. kambario temperatūroje) ir atplovimo i, šulinėlius įpilama po 100 |.il triušio antikūnų prieš pelės imunoglobulinus, konjuguotų su krienų peroksidaze. Po inkubacijos (30 min. kambario temperatūroje) ir atplovimo išryškinama fermentinė reakcija: i, šulinėlius įpilama po 100 į.i1 o-fenilendiamino tirpalo (0,5 mg/ml) 0,05 M Na-acetatiniame buferyje (pH 5,5) su 0,03 % vandenilio peroksido. Reakcija sustabdoma po 10-15 min., pridedant po 50 (.ii 10 % sieros rūgšties. Optinis tankis matuojamas fotometru Titertek Multiscan ("Flow"), esant bangos ilgiui 492 nm. Šulinėliuose su imobilizuotu insulinu ir proinsulinu optinis tankis viršijo 2 opt. vnt., šulinėliuose su imobilizuotu albuminu ir jaučio C-peptidu - buvo mažesnis nei 0,3 opt. vnt. Analizės rezultatai pateikiami 1 lentelėje.
[0015] Hibridoma IP-C2 skiriasi nuo anksčiau aprašytų analogų
[0016] (ląstelių linijų IN-04, JI-1, JI-2, 5H-1B-10Ū) tuo, kad ji produkuoja kitokio specifiškumo antikūnus - prieš antigeninę determinantę, bendrą žmogaus, kiaulės ir jaučio insulinui, tuo tarpu kai visos minėtos hibridomos - antikūnus su siauru specifiškumu. Todėl antikūnai IP-C2 yra universalus instrumentas šių rūšių insulinams, plačiai naudojamiems medicinoje. Be to, gaunant hibridomą IP-C2 buvo panaudota efektyvesnė imunizacijos schema (konjuguotas proinsulinas), todėl antigenas nesukėlė hipoglikeminio šoko imunizuojamiems gyvūnams.
[0017] Hibridomos IP-C2 produkuojami antikūnai gali būti pritaikyti insulino biotechnologijoje.
Hibridoma, produkuojanti pelės monokloninius antikunus prieš insuliną.