[LT] Išradimas apibrėžia naujojo Salmonella bakterijų nustatymo būdo sukūrimą, pasižymi tuo, kad testuojamos bakterijos panaudojamos PCR, taikant zondus@5'-GTAAATCCGGTTCACTTTAACAC-3' ir@5'-GAGTAAATCACTTCACCTACGTG-3',@komplementarius S.typhimurium 23S rRNR genui, amplifikacijos produktai analizuojami elektroforetiškai, o apie nustatymo specifiškumą sprendžiama iš amplifikacijos produktų restrikcinės analizės, panaudojant restrikcinę endonukleazę Eco 130 l. Empiriškai nustatyta, kad oligonukleotidiniai zondai yra universalūs ir specifiškai tik Salmonella genties bakterijoms. Detekcijos jautrumo riba- 50 bakterijų 10 µl mėginio.
[EN]
[0001] Išradimas apibrėžia naujo Salmonella bakterijų nustatymo būdą bei oligonukleotidinius zondus ir gali būti pritaikytas medicinoje, maisto pramonėje, veterinarijoje.
[0002] Seniausias mikrobiologinėse laboratorijose naudojamas Salmonella bakterijų testavimo metodas, įskaitant bakterijų auginimą selektyviose terpėse, o vėliau gautų kolonijų morfologinių ir biocheminių charakteristikų apibūdinimą, vidutiniškai trunka 4 dienas. Šis metodas naudojamas ir Lietuvos mikrobiologinėse laboratorijose (MeTOflHHecKHe yxa3aHHH no MHKp06H0J10rHqeCK0H flHarHOCTHKe 3a6oJieBaHHH, BbI3BaHHbIX 3HTepo6aKTepHHMH, MocKBa, 1984 r.).
[0003] Nukleino rūgščių hibridizacijos technologijos panaudojimas - kokybinis šuolis patogeninių mikroorganizmų diagnostikos srityje. Ši metodologija remiasi savybe, jog unikali testuojamo mikroorganizmo polinukleotidinė seka hibridinasi su specifiškai pažymėtu nukleino rūgšties zondu. Šių testų neigiama savybė - nepakankamas jautrumas (W0 89/05359, C12Q 1/68, 1989; EP 0383509, C12Q 1/68, 1990; WO 90/11370, C12Q 1/68, 1990).
[0004] Artimiausias siūlomam techniniam sprendimui yra patentas (WO 90/11370, C12Q 1/68, 1990), kuriame Salmonella bakterijų nustatymui panaudoti 32p.žymėti DNR zondai, komplementarūs Salmonella tvphimurium išorinės membranos Omp A genui. Testuojamos bakterijos auginamos iki optinio tankio OD=0,7, 100 jj.1 bakterijų suspensijos filtruojama per nitroceliuliozinį filtrą, DNR imobilizuojama švitinant filtrus 4 minutes UV lempa. Filtrai prehibridinami 45 minutes, o, pridėjus 32p.žymėto zondo, hibridinami dar 1,5 valandos. Filtrai atplaunami ir 3 dienas atliekama radioautografija.
[0005] Metodo trukumas - nepakankamas jautrumas, ilga trukmė.
[0006] Pastaruoju metu molekulinėje biologijoje pradėtas taikyti polimerazės ciklinės reakcijos metodas (Saiki R.K. et al., Science 239, 487-491 (1988). Tai būdas gauti mikrograminius kiekius norimos DNR nuo labai mažo kiekio DNR matricos, tačiau dar nebuvo tiesiogiai panaudotas Salmonella bakterijų detekcijai.
[0007] Išradimo tikslas - sukurti metodą, leidžiantį greitai ir specifiškai nustatyti Salmonella bakterijas. Šis tikslas pasiekiamas, pritaikant Salmonella bakterijų detekcijai polimerazės ciklinę reakciją (PCR), t.y. panaudojus oligonukleotidinius DNR zondus, komplementarius Salmonella tvphimurium 23S rRNR genui bei termostabilią DNR polimerazę, kaitaliojant įvairių temperatūrų ciklus nuo denatūracijos iki polimerizaci-jos temperatūrų, nuo panaudotos DNR matricos enzimatiš-kai reprodukuojamas - amplifikuojamas nustatyto dydžio Salmonella-specifinis DNR fragmentas, identifikuojamas restrikcijos būdu, o, reakcijoje panaudojus įvairių ne- Salmonella bakterijų DNR, amplifikacijos nėra.
[0008] Išradime pateiktų oligonukleotidinių zondų charakteristika:
[0009]
[0010] Zondai susintetinti Biotechnologijos Instituto "Fermentas" Nukleino rūgščių chemijos sektoriuje cianoetilfosforamiditiniu metodu. 2. Empiriškai buvo nustatyta, jog šie zondai universalūs Salmonella genties bakterijoms, t.y. zondų panaudojimas polimerazės ciklinėje reakcijoje leidžia mėginyje detektuoti 13 Salmonella rūšių (1 lentelė): S. brandenburg. S. choleraesuis. S. enberitidis. S. haifa. S. infantis, S. isangi, S. i ava, S. newport, S. ngor, S. stanlev. S. thompson, S. typhimurium, S. tshiongwe. 3. Empiriškai nustatyta, kad zondai specifiški tik Salmonella genties bakterijoms, t.y., panaudojus zondus mėginiuose, turinčiuose Acinetobacter. Citrobacter, Citrobacter freundii, Escherichia coli, Enterobacter, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Hafnia, Yersinia enterocolitica, Klebsiella, Proteus, Proteus vulgaris. Providencia rettgeri, Pseudomonas, Pseudomonas aeruginosa, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Serratia bakterijas, polimerazės ciklinė reakcija nevyksta (2 lentelė).Fig.l. Elektroforetinė PCR produktų, gautų su įvairiais S. typhimurium bakterijų kiekiais, analizė. PCR panaudoti bakterijų kiekiai: 1-5x10^, 2-5x10^, 3-5x10^, 4-5x10^, 5-5x10^, 6-5x10, 7-5 bakterijos mėginyje, 8-pBR-Alu I fragmentų dydžiai bazių poromis. Fig.2. Elektroforetinė PCR produktų analizė po inkubavimo su restriktaze Ecol30 I. 9 - S. typhimurium PCR produktas, 10- S. typhimurium PCR produktas-Ecol30 I, 11-S. enteritidis PCR produktas-Ecol30 I, 12 - S. typhimurium PCR produktas-Eco64 I, 13-pBR-Alu I fragmentų dydžiai bazių poromis. Fig.3. Elektroforetinė PCR produktų, gautų su įvairiomis bakterijomis, analizė. 14,28-pBR-Alu I fragmentų dydžiai bazių poromis. PCR panaudotos bakterijos: 15, 16, 17 - S. enteritidis; 18 - S. tshiongwe: 19,20,21- S. infantis; 22.23- S. brandenburg; 24,25,27-S. typhimurium; 26- Y. enterocolitica.
[0011] 1 Pavyzdys. Polimerazės ciklinės reakcijos, naudojamos Salmonella genties bakterijų nustatymui jautrumo įvertinimas.
[0012] Visi bakterijų kamienai (1,2 lentelės), panaudoti šiame darbe, gauti Vilniaus Higienos centro mikrobiologinėje laboratorijoje.
[0013] Reakcija atliekama 100 jai mišinio, savo sudėtyje turinčio 67 mM Tris-HCl (pH 8,4), 2 mM MgCl2, 16,6 mM (NH4)2SC>4, 10 mM merkaptoetanolio, 1,25 mM dATP, 1,25 mM dTTP, 1,25 mM dGTP, 1,25 mM dCTP, 0,001 mM praimerius, 20 jag jaučio serumo albumino, 2 vienetus Taq polimerazės. Testuojamos bakterijos auginamos per naktį 4 ml LB terpės 37°C temperatūroje. 100 įj.1 ląstelių suspensijos centrifuguojama mikrocentrifugoje 11000 aps./min. 5 minutes, nuosėdos suspenduojamos 100 įil sterilaus H2O ir virinama 10 min. 100°C. 10 įiI tokios suspensijos naudojama polimerazės ciklinėje reakcijoje. Empiriškai parinktos polimerazės ciklinės reakcijos sąlygos, t.y. optimalu, kai PCR atliekama 25 ciklus, kurių kiekvienas trunka: 95°C - 1 min., 58°C - 1 min., 70°C - 1 min. Pasibaigus PCR reakcijos mišinį 2 kartus ekstrahuojame chloroformu, o 10 (.ii vandeninės fazės analizuojame elektroforetiškai 1,5% agarozės gelyje. PCR rezultate matomas 250 bazių porų dydžio fragmentas (Fig.l).
[0014] PCR jautrumo įvertinimui S. tvphimurium kultūra buvo auginama per naktį 4 ml LB terpės, ištitruojama fiziologiniame tirpale ir mėginiai po 100 įil išsėjami ant agarizuotos LB terpės gyvybingų ląstelių titrui paskaičiuoti. Su įvairiais bakterijų kiekiais atliekama PCR. Iš Fig.l pateiktų rezultatų matome, jog testo jautrumo riba - 50 Salmonella bakterijų 10 įj.1 mėginio. 2 Pavyzdys. Oligonukleotidinių zondų, panaudojamų PCR, tyrimas.
[0015] Amplifikacijos produktai identifikuojami restrikcijos būdu empiriškai iš daugelio panaudotų restriktazių pasirinkus Ecol30 I. Salmonella-PCR produktas - 10 įj.1 buvo inkubuojamas l vai. 37°C 20 [il reakcijos mišinio, turinčio 50 mM Tris-HCl(pH 7,5), 10 mM MgCl2/ 100 mM NaCl ir restrikcinę endonukleazę Ecol30 I. Restrikcijos produktai analizuojami elektroforetiškai 2% agarozės gelyje. Fig.2 iliustruoja S. tvphimurium- ir S. enteritidis-PCR produktų, restriktuotų Ecol30 I, elektroforetinį vaizdą. Absoliučiai identiški vaizdai, pateiktiems Fig.2, gaunami po PCR produktų, PCR reakcijai panaudojus S. brandenburg, S. choleraesuis, S. haifa, S. infantis, S. isangi, S. i ava, S. newport, S. ngor, S. stanlev, S. thompson, S. tshiongwe bakterijas, inkubacijos su Ecol30 I.
[0016] Salmonella bakterijų nustatymui buvo naudojami zondai
[0017]
[0018] Fig.3, 1,2 lentelėse pateikti rezultatai patvirtina, jog, panaudojus oligonukleotidinius praimerius, komplementarius Salmonella typhimurium 23S rRNR genui, vyksta labai specifinė polimerazės ciklinė reakcija, t.y. amplifikacija vyksta tik nuo Salmonella bakterijų DNR, tuo tarpu nuo įvairių kitų bakterijų DNR amplifikacijos nėra. Akivaizdu, kad panaudoti zondai : pakankamai universalūs Salmonella genties bakterijoms, nes jų panaudojimas įgalina nustatyti 13 skirtingų Salmonella rūšių.
[0019] 1. Padidintas Salmonella bakterijų nustatymo jautrumas, t.y. tam, kad vyktų polimerazės ciklinė reakcija, užtenka 50 bakterijų mėginyje. 2. Salmonella bakterijų detekcijos laikas sutrumpėja iki vienos dienos. 3. Amplifikuoto produkto identifikavimui naudojama restrikcija. Empiriškai pasirinkta restriktazė Ecol30 I (Fig.2) .
1. Oligonukleotidiniai zondai - praimeriai, komplemen-tarūs Salmonella tvphimurium 23S rRNR genui, turintys seką:5'-GAG-TAA-ATC-ACT-TCA-CCT-ACG-TG- 3' ir5'-GTA-AAT-CCG-GTT-CAC-TTT-AAC-AC-3' ,skirti Salmonella bakterijų nustatymui.
5'-GAG-TAA-ATC-ACT-TCA-CCT-ACG-TG- 3' ir5'-GTA-AAT-CCG-GTT-CAC-TTT-AAC-AC-3' ,skirti Salmonella bakterijų nustatymui.2. Salmonella bakterijų nustatymo būdas, kuriame bakterijos testuojamos zondų pagalba, besiskiriantis tuo, kad bakterijas panaudoja polimerazės ciklinėje reakcijoje, taikant zondus pagal 1 punktą, amplifikacijos produktus analizuoja elektroforetiškai ir apie nustatymo specifiškumą sprendžia iš amplifikacijos produktų restrikcinės analizės.
3. Būdas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad atlieka ne mažiau, nei 25 polimerazės ciklinės reakcijos ciklų, kurių kiekvienas trunka 1 min. - 95° ± 1°C, 1 min. - 58° ± 1°C, 1 min. - 70° ± 1°C.
4. Būdas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad amplifikacijos produktus identifikuoja, panaudojant restrikcinę endonukleazę Ecol30 I.