[LT] Išradime aprašomi žmogaus eritropoetino (EPO) klonuoti genai, kurie leidžia gauti labai didelę ekspersiją. Taip pat aprašyta šių genų ekspresija in vitro gaminant aktyvų žmogaus EPO.
[EN]
[0001] Šiame išradime aprašomi klonuoti žmogaus eritropoetino genai, kurių ekspresijos lygis nepaprastai aukštas, minėtų genų ekspresija ir aktyvaus žmogaus eritropoetino in vitro gavimas.
[0002] cirkuliuojantis glikoproteinas, kuris stimuliuoja eritrocitų susidarymą aukštesniuose organizmuose (žr. Carnot et al, Compt. Rend., 143:384 (1906)). Todėl EPO kartais vadinamas eritropoezę stimuliuojančiu faktoriumi.
[0003] Tai reiškia, kad retikulo-endotelio sistema kasdien suardo maždaug 1/120 visų eritrocitų ir lygia greta kasdien santykinai pastovų kiekį pagamina, siekdama nuolat palaikyti eritrocitų balansą (Guyton, Textbook of Medical Physiology,
[0004] Eritrocitai gaminami kaulų čiulpuose bręstant ir diferencijuojantis eritroblastams, o EPO yra faktorius,
[0005] kuris veikia mažiau diferencijuotas ląsteles ir indukuoja jų diferenciaciją į eritrocitus (Guyton, supra).
[0006] &fu yra perspeKtyvus terapinis agentas klinikiniam anemijos, ypač inkstų anemijos gydymui. Deja, praktinėje terapijoje EPO plačiai dar netaikomas, nes yra sunkiai prieinamas.
[0007] Norint EPO naudoti kaip terapinį agentą, reikia įvertinti galimas problemas, susijusias su antigeniškumu. Todėl geriau EPO gaminti iš žmogaus tiekiamų žaliavų. Pavyzdžiui, galima panaudoti donorų kraują arba sergančių aplastine anemija ir panašiomis ligomis (tuomet išsiskiria didelis EPO kiekis) šlapimą. Deja, šių žaliavų kiekis yra ribotas. Žr., pavyzdžiui, White et al., Rec. Progr. Horm. Res., 16:219
[0008] (1960); Espada et al., Biochem. Med. 3:475 (1970); Fisher, Pharmacol. Rev., 24:459 (1972) ir Gordon, Vitam. Horm. ( N. Y.), 31:105 (1973), kurių aprašymai įtraukiami į šį išradimą.
[0009] Paprastai EPO gaminamas koncentruojant ir gryninant pacientų šlapimą, kuriame yra didelė EPO koncentracija, pavyzdžiui, pacientų, sergančių aplastine anemija ir kitomis panašiomis ligomis. Žr., pavyzdžiui, JAV patentus Nr. 4,397,840; 4,303,650 ir 3,865,801, kurie yra šio išradimo dalis. Riboti tokio šlapimo ištekliai trukdo naudoti EPO praktikoje, todėl būtų pageidautina EPO gaminti iš sveikų individų šlapimo. Sveikų žmonių šlapimo panaudojimas yra problemiškas, nes jame yra žymiai mažiau EPO, negu anemija sergančių individų šlapime. Be to, sveikų individų šlapime yra kai kurių inhibuoj ančių faktorių, kurie, esant pakankamai aukštai koncentracijai, slopina eritropoezę, todėl patenkinamas terapinis efektas gali būti gautas tik vartojant labai gerai išgrynintą EPO.
[0010] EPO taip pat galima gaminti iš avių kraujo plazmos. Iš tokio kraujo plazmos išskirto EPO buvo pagaminti patenkinamo aktyvumo, stabilūs ir tirpūs vandenyje preparatai. Žr. Goldwasser, Control Cellular Dif. Develop., Part A; pp. 487-494, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1981) (šis straipsnis įtraukiamas į šio išradimo aprašymą). Tačiau, galima teigti, kad avies EPO turėtų pasižymėti a r: t i genis kurnu žmogaus organi zme.
[0011] Taigi nors EPO yra labai pageidaujamas terapinis agentas, standartinės išskyrimo ir gryninimo metodikos, naudojamos dirbant su natūralios žaliavos šaltiniais, neatitinka šio junginio masinės produkcijos poreikio.
[0012] Sugimoto et al. JAV patente Nr. 4,377,513 aprašo EPO pramoninės gamybos būdą, kurio sudėtyje yra žmogaus limfoblastoidų ląstelių - jų tarpe Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 ir JBL - multiplikavimas įn vivo.
[0013] Komercinėje literatūroje pranešama apie EPO, pagamintą genų inžineriniais būdais, tačiau nėra paskelbta nei šių būdų aprašymai, nei produkto cheminė sudėtis. Ši paraiška atskleidžia baltymų, pasižyminčių biologinėmis žmogaus EPO savybėmis, pramoninio gaminimo būdą. Šiuo būdu taip pat įmanoma gaminti baltymus, kurių cheminė sudėtis skiriasi nuo autentiško EPO, tačiau pasižymi panašiomis (o kai kuriais atvejais ir pagerintomis) savybėmis. Patogumo dėlei visus baltymus, pasižyminčius žmogaus EPO biologinėmis savybėmis galima vadinti EPO, nesvarbu, ar šie junginiai yra chemiškai identiški EPO.
[0014] Šiame išradime aprašomas geno, kuris ekspresuoja nepaprastai didelius žmogaus EPO kiekius, klonavimas, EPO ekspresija ir aktyvaus žmogaus EPO pramoninė gamyba in vitro. Taip pat aprašyti ekspresijos vektoriai, tinkami EPO gaminimui, ekspresijos ląstelės, gryninimo schemos ir kiti procesai. EPO buvo gautas nepilnai išgrynintas, po to išgrynintas iki homogeniškumo ir tripsinu suskaldytas į specifinius fragmentus (šių operacijų detalės pateiktos toliau). Šie fragmentai buvo išgryninti ir sekvenuoti. Remiantis šiomis sekomis buvo sukonstruoti ir susintetinti EPO oligonukleotidai. Šie oligai buvo panaudoti žmogaus genomo bibliotekos skryningui, siekiant išskirti EPO geną.
[0015] EPO genas buvo patikrintas, remiantis jo DNR seka, kuri atitiko daugumą sekvenuotų triptinių fragmentų. Genommio klono dalis buvo panaudota hibridizacijos testu siekiant pademonstruoti, kad EPO mRNR galima aptikti žmogaus gemalo (20 savaičių) mRNR. Buvo paruošta žmogaus gemalo kepenų kDNR biblioteka ir atliktas jos skryningas. Buvo gauti trys EPO kDNR klonai (patikrinus daugiau kaip 750 000 rekombinantų). Nustatyta, kad du iš šių klonų yra maksimalaus ilgio, sprendžiant pagal visą koduojančią seką ir pagrindinę 5' ir 3' netransliuojamą seką. Šios kDNR buvo ekspresuotos ir beždžionių ląstelėse, transformuotose SV-40 virusu (COS-1 ląstelių linija; Gluzman, Cell 23:175-182 (1981)), ir kiniškojo žiurkėno kiaušidžių ląstelėse (CHO ląstelių linija; Urlaub, G. ir Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci USA 77:4216-4280 (1980)). EPO, pagamintas COS ląstelėse, yra biologiškai aktyvus tiek in vitro, tiek in vivo. EPO, pagamintas CHO ląstelėse, taip pat aktyvus tiek in vitro, tiek in vivo.
[0016] EPO kDNR klonas turi įdomų atvirą skaitymo rėmelį, sudarytą iš 14-15 amino rūgščių (ar), su iniciatoriumi ir terminatoriumi iš 20-30 nukleotidų (nt), esančių virš koduojančio regiono. Charakteringas E_;_ coli, transfekuotos klonuotu EPO genu, pavyzdys deponuotas Amerikos tipinių kultūrų kolekcijoje (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, No. ATCC 40153).
[0017] Lentelėje 1 pateikta žmogaus EPO geno 87 bazių porų egzono bazinė seka;
[0018] Fig.l iliustruoja EPO mRNR nustatymą žmogaus gemalo kepenų mRNR;
[0019] Lentelėje 2 pateikta EPO baltymo amino rūgščių seka, nustatyta pagal X,-HEPO"FL13. nukleotidų seką;
[0020] Lentelėje 3 pateikta EPO kDNR nukleotidų seka X-HEPOFL13 (schematiškai pateikta Fig.2 ) ir pagal šią seką nustatyta amino rūgščių seka;
[0021] Fig. 3 parodytos keturių nepriklausomų žmogaus EPO genomo klonų DNR intarpų santykinės padėtys; Fig. 4 parodytas žmogaus EPO geno intronų ir ekzonų spėjama struktūra; Lentelėje 4 parodyta EPO' geno, pateikto Fig. 4B, DNR seka; Fig. 5A, 5B ir 5C parodyta vektoriaus 91023 (B) struktūra; Fig. 6 pateikta EPO, pagaminto COS-1- ląstelėse ir natyvaus EPO palyginamoji analizė NDS poliakrilamido gelyje; Lentelėje 5 pateikta EPO klono X.-HEP0FL6 nukleotidų ir amino rūgščių seka; Lentelėje 6 pateikta EPO klono X-HEPOFL8 nukleotidų ir amino rūgščių seka; Lentelėje 7 pateikta EPO klono X-HEP0FL136 nukleotidų ir amino rūgščių seka; Fig. 7 pateikta plazraidės pRKl-4 schema; Fig. 8 pateikta plazmidės pdBPV-MMTneo(342-12) schema.
[0022] Šiame išradime aprašomas EPO genų klonavimas ir EPO gaminimas ekspresuojant šiuos genus in vitro.
[0023] Patentinėje ir mokslinėje literatūroje aprašyta daugybė rekombinantinių produktų gaminimo būdų. Dažniausiai šios metodikos apima reikiamos genų sekos išskyrimą arba sintezę bei šios sekos ekspresavimą prokariotinėje arba eukariotinėje ląstelėje, naudojant specialistams žinomus metodus. Jeigu genas išskirtas, išgrynintas ir įterptas į perkėlimo vektorių (klonuotas), tuomet pakankamas jo kiekis užtikrintas. Vektorius su klonuotu genu perkeliamas į tinkamą mikroorganizmą arba ląstelių liniją, sakykim, bakteriją, mieles, žinduolių ląsteles, pavyzdžiui, COS-1 (beždžionės inkstų), CHO (kiniškojo žiurkėno kiaušidžių), vabzdžių ląstelių linijas ir panašiai. Vektorius replikuojasi tuomet, kai mikroorganizmas arba ląstelių linija prolįferuoja ir'.jis gali būti išskirtas, naudojant standartinius metodus. Taigi taip atsiranda nuolat atsinaujinantis geno šaltinis tolesnėms manipuliacijoms, modifikacijoms ir perkėlimams į kitus vektorius ar į kitus to paties vektoriaus lokusus.
[0024] Dažnai ekspresija gaunama perkeliant tinkamai orientuotą ir tinkamame rėmelyje esanti klonuotą geną į atitinkamą perkėlimo vektoriaus saitą taip, kad transliacinis perskaitymas iš prokariotinio arba eukariotinio geno susintetina baltymo pirmtaką, apimantį amino'rūgščių seką, kurią koduoja klonuotas genas, kartu su Met arba N-galo seka iš prokariotinio arba eukariotinio geno. Kitais atvejais transkripcijos ir transliacijos pradžios signalus gali pateikti tinkami klonuoto geno fragmentai. Susintetintas baltymo pirmtakas gali būti skaldomas naudojant įvairius specifinio baltymų skaldymo pageidaujamoje vietoje būdus - taip gaunama pageidaujama amino rūgščių seka, kuri vėliau išgryninama standartiniais metodais. Kartais baltymą, turintį pageidaujamą amino rūgščių seką, pavyksta pagaminti nenaudojant specifinio skaldymo metodų, arba išskirti jį į ekstraląstelinę augimo terpę.
[0025] Žmogaus EPO buvo išgrynintas (kaip tai aprašyta žemiau) iki homogeniško baltymo iš pacientų, sergančių aplastine anemija, šlapimo. Išgrynintas EPO buvo visiškai suskaldytas tripsinu, gauti fragmentai atskirti HPLC atvirkštinės fazės būčių, išskirti iš surinktų gradientinių frakcijų bei" nustatyta jų seka. Triptinių fragmentų sekos pabrauktos Lentelėse 2 ir 3 ir toliau aptartos detaliau. Dvi amino rūgščių sekos, Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys ir Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg buvo atrinktos oligonukleotidinių zondų sukūrimui (vienoje grupėje - 17 nt ilgio oligonukleotidai, išsigimę 32 kartus, kitoje - 18 nt ilgio oligonukleotidai, išsigimę 128 kartus, priklausantys pirmajam triptiniam fragmentui bei dvi grupės, kuriose yra 14 nt oligonukleotidai, išsigimę kiekvienas 128 kartus, priklausantys antrajam peptidiniam fragmentui). Grupė,
[0026] kurioje yra 17-mera;L, išsigimę 32 kartus, buvo naudojama žmogaus genomo DNR bibliotekos skryningui Ch4A vektoriuje (22) pagal Woo or O'Malley amplifikacijos in situ procedūros modifikaciją ( Proc. Nat' l. Acad. Sci. U. S. A. 75:3688, 1978), siekiant pagaminti skryningo filtrus.
[0027] Fagai, kurie hibridizuojasi su 17-meru, surenkami, padalinami į kelias grupes ir bandomi hibridizuoti su 14-merų ir 18-merų grupėmis. Fagai, kurie hibridizuojasi su 17-merų, 18-merų ir 14-merų grupėmis, buvo išgryninti pagal ližės dėmių morfologiją ir fragmentai subklonuoti į M13 vektorius, siekiant sekvenuoti didezoksi grandinės terminavimo būdu (Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A.R., Proc. Nat' l. Acad. Sci.. U. S. A. 74:5463, 1977).
[0028]
[0029] Lentelėje 1 parodyta regiono, kuris hibridizuojasi su 32 kartus degeneruotu 17-meru viename iš klonų, seka. Šios DNR sekos atvirame skaitymo rėmelyje yra nukleotidai, kurie gali tiksliai koduoti triptinį fragmentą, kuris buvo naudojamas 17-merų grupės struktūros konstravimui. Be to, DNR sekos analizė parodė, kad regionas, su kuriuo hibridizavo 17-meras, yra 87 bp egzone, kuri, supa potencialus splaisingo akceptorius ir donoro saitai.
[0030] Papildomas patvirtinimas, kad šie du klonai (čia žymimi X - HEP01 ir X-HEP02) yra EPO genominiai.klonai, buvo gautas sekvenuojant papildomus egzonus, kuriuose yra kita triptinius fragmentus koduojanti informacija.
[0031] Žmogaus gemalo (20 savaičių) Northern Blot analizė
[0032] (Derman, E., et al., Cell 23:731, 1981) buvo atlikta naudojant 95 nt viengrandį mėginį, paruoštą iš M13
[0033] klono, kuriame yra dalis 87 bp egzono, aprašyto Lentelėje 1. Kaip parodyta Fig. i, gemalo kepenų mRNR gali būti aptiktas stiprus signalas. Šią juostelę pavyko patikimai . identifikuoti kaip mRNR EPO naudojant tą patį gemalo kepenų mRNR mėginį bakteripfago X kDNR bibliotekos skryningui (Toole, J. J., et al., Natūra i n 1984).
[0034] Kelių hibridizuojančįų klonų ir patikrintų rekombinantų santykis buvo 1:250 000. Visa nukleotidų seka ir numatyta amino rūgščių seka šiems klonams (A.-HEPOFL13 ir X-HEPOFL8) parodyta lentelėse 5 ir 6. EPO koduojanti informacija yra kDNR 5' gale, 594 nt regione, kuriame yra labai hidrofobinis lyderis, sudarytas iš 27 amino rūgščių, ir brandus baltymas, sudarytas iš 166 amino rūgščių.
[0035] Brandaus baltymo N galas buvo identifikuotas remiantis N galine seka baltymo, kuris sekretuojamas į individų, sergančių aplastine anemija, šlapimą (lentelė 1), kaip tai aprašė Goldv/asser (Blood SuppI.. 1, 58, xlii (abstr), 1981) , Sue ir Sytkowski ( Proc. Nat' l. Acari. Sci. U. S. A. 80:3651-3655,1983) ir Yanagava ( J. Biol. chem. 259:9707-s?7i n iqq/ m ir yra tikrasis cirkuliuojančio organizme EPO N galas, ar inkstuose arba šlapime įvyksta skilimas.
[0036] Lentelėse 2 ir 3 pabrauktos amino rūgščių sekos yra tie N galo arba jo dalies triptiniai fragmentai, kurių baltymų seka ir buvo gauta. Numatyta amino rūgščių seka visiškai sutampa su triptiniais fragmentais, kurie buvo sekvenuoti - tuo patvirtinama, kad- išskirtas genas koduoja žmogaus EPO.
[0037] Fig. 3 parodytos keturių nepriklausomų žmogaus EPO genominių klonų DNR intarpų santykinės pozicijos. Šių klonuotų DNR hibridizacinė analizė su oligonukleotidų mėginiais ir kitais mėginiais, paruoštais iš EPO kDNR dviejų klasių klonų, leidžia lokalizuoti EPO geną 3. 3 kb regione, kuris parodytas Fig. 3 pastorinta linija. Visa šio regiono sekos analizė
[0038] ( žr. Pvz. 4) ir palyginimas su kDNR klonais leidžia sudaryti EPO geno introno ir egzono struktūros žemėlapį, parodytą
[0039] Fig. 4. EPO genas yra padalintas į penkis egzonus. Dalis egzono I, egzonai II, III, IV bei dalis egzono V turi baltymą koduojančią informaciją. Egzono I ir V liekanos koduoja atitinkamai 5' ir 3' netransliuojamas sekas.
[0040] Siekiant- pademonstruoti kad biologiškai aktyvų EPO galima ekspresuoti ląstelių kultūros sistemoje in vitro , buvo tiriama COS ląstelių ekspresijos sistema ( Hewick, R. M., et al.
[0041] J. Biol. Chem. 256:7990- 7997, 1981)
[0042] ( B), aprašytas Pvz. 5. Šiame vektoriuje yra adenoviruso ' pagrindinis vėlyvasis. promotorius, SV40 poliadenilinimo seka, SV40 replika, SV. 40 sustiprintojas ir adenoviruso VA genas. kDNR intarpas " iš a.- HEPOFL13 ( žr. Lentelę 6) buvo įterptas į p91023 ( B) vektorių, žemiau adenoviruso pagrindinio vėlyvojo promotoriaus. Šis naujasis vektorius žvmimas nPTFT. l " 3
[0043] Praėjus Z4 valanadoms po sios Konstrukcijos transieKcijos a, COS-1 ląstelių M6 kamieną (Horowitz et al, J. Mol. Appl.
[0044] Genet. 2:147-149 (1983))/ ląstelės plaunamos, talpinamos i, 5 terpę be serumo ir surenkamos po 48 valandų. EPO sekrecijos į terpę lygis matuojamas kiekybiniu RIA metodu, pritaikytu EPO. Kaip parodyta Lentelėje 8, (Pvz. 6) ekspresuojamas imunologiškai aktyvus EPO. Taip pat buvo ištirtas EPO,
[0045] 0 atliktas atskiras eksperimentas, kurio metu vektorius, EPO
[0046] kDNR iš X-HEP0FL13 buvo transfekuotas į COS-1 ląsteles ir terpė surinkta kaip tai apršyta aukščiau. EPO kiekis terpėje buvo nustatytas vienu iš dviejų in vitro biotestų: 3H-trimidino ir CFU-E (Krystal, G. Exp. Hematol. 11:649-660, 5 1983; Bersch, N. and Golde, D. W., In vitro Aspects of Ervfchropoiesis, M. J. Murphy (Ed.) New York: Springer-Verlag, 1978), bei vienu iš dviejų in vivo testų; su hipoksinėmis pelėmis ir badavusiomis žiurkėmis (Cotes, P.
[0047] 3 E. and Gross, M. Methods in Enzvmol. 37:109-121, 1975) (žr. Lentelę 9, Pvz. 7). Šie rezultatai
[0048] demonstruoja, kad COS-1 ląstelės gamina biologiškai aktyvų EPO. Western bloto .duomenimis, analizės su poliklonaliniais
[0049] 5 ląstelėse, NDS- poliakrilamidiniame gelyje pasižymi tokiu pačiu judrumu, kaip ir natyvus EPO, pagamintas iš šlapimo (Pvz. 8). Todėl galima padaryti išvadą, kad COS-1 pagamintas EPO gali būti panašiai glikozilintas kaip ir natyvus EPO.
[0050] ) Kiti vektoriai, turintys įvairius promotorius, taip pat gali būti panaudoti COS ląstelėse araba kitose žinduolių arba eukariotų ląstelėse. Tokių promotorių pavyzdžiai, naudingi šio išradime? praktikoje, yra SV40 ankstyvasis ir vėlyvasis
[0051] į promotorius, randamas paukščių arba žinduolių
[0052] retrovirusuose, bakuloviruso poliedrono geno promotoriųj e ir kt. Kitų, šio išradimo praktikoje naudingų ląstelių pavyzdžiu gali būti E_ coli, mielių, žinduolių ląstelės, pavyzdžiui, CHO (kiniškojo žiurkėno kiaušidžių), C127 (beždžionės epitelio), 3T3 (pelės fibroblastų) CV-l
[0053] metanogaster. Šie alternatyvūs promotoriai ir/arba ląstelių tipai gali turėti įtakos EPO ekspresijos lygiui ir laiko reguliavimui, gaminant ląstelių specifišką EPO tipą, arba auginant didelius EPO gaminančių ląstelių kiekius pigiau ir esant lengviau kontroliuojamoms sąlygoms.
[0054] Ekspresijos sistema, kurioje išlieka ekspresijos žinduolių ląstelėse pranašumai, tačiau mažiau laiko sugaištama kuriant labai produktyvią ląstelių liniją, yra sudaryta iš vabzdžių ląstelių linijos ir DNR viruso, kuris dauginasi šioje ląstelių linijoje. Toks virusas vadinamas branduolio poliedrozės virusas. Jis sudarytas iš dvigrandės žiedinės ' DNR genomo, kurio dydis yra 128 kb. Branduolio kapsida yra pailgos formos ir būna dviejose formose: neokliuduota forma, kai virusas apvilktas membrana ir okliuduota forma, kai virusas yra užkrėstos ląstelės branduolio baltymo kristale. Šiuos virusus galima standartiniu būdu kultivuoti in vitro vabzdžių ląstelių kultūroje ir su jais galima dirbti naudojant visus standartinius gyvūnų virologinius metodus. Ląstelių kultūros terpė yra standartinis maitinantis druskų tirpalas, kuriame yra 10% fetalinio veršelių serumo.
[0055] Virusų auginimas iri vitro prasideda, kai neokliuduotas virusas (NOV) patenka į ląstelę ir skverbiasi \ branduolį, kuriame replikuojasi. Tai - branduolinė replikacija. Pradinėje viruso pridėjimo fazėje (8-18 valandų po užkrėtimo) branduolio kapsidos susigrupuoja branduolyje ir po to pasklinda per plazmos membraną kaip NOV, tuo būdu išplatindamos infekciją visoje ląstelių kultūroje. Be to, kai kurios branduolio kapsidos po to (praėjus 18 ir daugiau valandų po infekcijos) lieka branduolyje ir įstringa baltyminėje medžiagoje - tai yra vadinami poliedriniai įterpimo kūnai (PĮB) (polyhedral inclusion bodies). Ši forma neužkrečia ląstelių kultūros. Matrica sudaryta iš baltymo, vadinamo poliedrinu, kurio molekulinė masė yra 33 kd. Kiekvienas PĮB yra maždaug 1 mm skersmens, o viename branduolyje gali būti iki 100 PĮB. Vėlyvajame infekcijos etape pagaminama labai daug poliedrino - iki 25%, skaičiuojant nuo visų ląstelės baltymų.
[0056] Kadangi PįB neturi jokios įtakos in vitro replikacijos ciklui, poliedrino genas gali būti išmestas iš viruso chromosomos, nepadarant jokios žalos viruso gyvybingumui in vitro. Naudodami virusą kaip ekspresijos- vektorių, mes pakeitėme poliedrino geno koduojanti, regioną svetima DNR,; kurią siekėme ekspresuoti, kontroliuojant poliedrino. promotoriui. Gaunamas viruso fenotipas, nesudarantis PĮB.
[0057] Šią sistemą panaudojo keli tyrinėtojai, jų tarpe pažymėtinas Pennock et al ir Smith et al. Pennock et al. (Gregory D. Pennock, Charles Shoeraaker ir Lois K. Miller, Molecular and Cell Biology 3:84, p. 399-406) aprašė bakterinio baltymo, galaktozidazės aukšto lygio ekspresiją, kai procesas kontroliuojamas poliedrino promotoriumi.
[0058] Kitą ekspresijos vektorių, sukonstruotą iš branduolinės poliedrozės viruso, pasiūlė Smith et al. (Gale E. Smith, Max D. Summers and M.J. Fraser, Molecular and Cell Biology, May 16, 1983, pp.2156-2165) . Autoriai pademonstravo siūlomo vektoriaus efektyvumą ekspresuodami (5-interferoną. Kaip ir buvo laukta, susintetintas produktas buvo glikozilintas ir sekretuojamas iš vabzdžių ląstelių. Pavyzdyje 14 aprašytos plazmidės, turinčios Autographa californica branduolinės-poliedrozės viruso (AcNPV) poliedrono geną, modifikacijos, kurių dėka galima nesunkiai įterpti EPO geną į plazmidę taip, kad jį transkripciniu būdu kontroliuotų poliedrino promotorius. Gauta DNR transfekuojama kartu su laukinio tipo AcNPV nepažeista DNR chromosoma į vabzdžių ląsteles. Dėl genų rekombinacijos AcNPV poliedrino geno regionas pakeičiamas DNR iš plazmidės. Gautą rekombinantinį virusą galima aptikti tolesnėse virusų kartose pagal jų DNR esantį EPO geną. Tikimasi, kad užkrėtus šiuo virusu vabzdžių ląsteles, jos gamins EPO.
[0059] Pavyzdžiais 10 ir 11 (CHO), 13 (C127 ir 3T3) ir 14 (vabzdžių ląstelės) iliustruojama EPO ekspresija CHO, C127, 3T3 ląstelėse ir vabzdžių ląstelėse.
[0060] Rekombinantinis EPO, gaminamas CHO ląstelėse, kaip tai parodyta Pavyzdyje 11, buvo išgrynintas, naudojant žinomus chromatografijos kolonose metodus. Santykini-ai karbohidratų kiekiai glikoproteine buvo nustatyti dviem nepriklausomais būdais [ (i) Reinhold, Methods in Enzymol. 50:244-249 (Metanolizė) ir (ii) Takemoto, H. et al., Anai. Biochem. 145:245 (1985) (piridilamininimas, kartu - nepriklausomas sialo rūgšties nustatymas)] . Rezultatai, gauti abiem metodais, labai gerai sutapo. Buvo atliktos kelios analizės, gautos vidutinės reikšmės lyginamos su N-acetilgliukozaminu, kurio kiekis laikomas lygiu 1.
[0061] Verta pažymėti, kad nemažas kiekis fukozės ir N-acetilgalaktozamino buvo pakartotinai aptinkamas naudojant nepriklausomus karbohidratų analizės metodus. N-acetilgalaktozamino buvimas rodo, kad baltymas yra 0-glikozilinimo tipo. O-glikozilinimą taip pat patvirtina glikoproteino, suskaldyto įvairiomis glikozidinių fermentų kombinacijomis, SDS-PAGE (elektroforezė poliakrilamidiniame gelyje esant natrio dodecilsulfatui) analizė. Kalbant konkrečiau, po to, kai fermentiniu būdu pašalinti visi N-prijungti prie baltymo karbohidratai, naudojant fermentą - endo F N-glikozidazę, baltymo molekulinis svoris sumažėja SDS-PAGE analizės duomenimis, veikiant jį neuraminidaze.
[0062] Išgryninto rekombinantinio EPO biologinis aktyvumas iri vitro buvo matuojamas pagal G. Krystal, Exp. Hematol. 11:649
[0063] (1983) (blužnies ląstelių proliferacijos testas), o baltymo kiekis nustatytas analizuojant amino rūgščių sudėtį. Daugkartinės analizės parodė, kad išgryninto rekombinantinio EPO apskaičiuotas specifinis aktyvumas in vitro yra didesnis nei 200 000 VV/mg baltymo. Vidutinė reikšmė buvo nuo. 275000 iki 300000 VV/mg baltymo. Be to, buvo gaunamos ir reikšmės, didesnės nei 300000. Aktyvumų santykis in vivo (policiteminis testas su pelėmis, Kazal ir Erslev, Am. Clinical Lab. Sci., Vol. B, p. 91 (1975))/iri vitro buvo nuo 0.7 iki 1.3.
[0064] Įdomu palyginti glikoproteino charakteristiką, pateiktą aukščiau, su rekombinantinio CHO ląstelėse pagaminto EPO charakteristikomis, kuris aprašytas anksčiau tarptautinėje paraiškoje IPA Publication No. WO85/02610 (publikuota 1985 metų birželio 20). Atitinkama palyginamoji karbohidratų analizė, aprašyta šios paraiškos 65-ame puslapyje), pateikia nulines reikšmes fukozei ir N-acetilgalaktozaminui bei heksozės:N-acetilgalaktozamino santykį, lygų 15.09:1. Tai, kad nėra N-galaktozamino, rodo, kad aprašytasis glikoproteinas nėra O-glikozilintas. Priešingai, šio išradimo rekombinantinis EPO, pagamintas CHO ląstelėse ir apibūdintas aukščiau, turi savo sudėtyje nemažus, daug kartų matuojant atsikartojančius kiekius fukozės ir N-acetilgalaktozamino bei mažiau nei vieną dešimtadalį santykinio heksozės kiekio ir yra O-glikozilintas. Be to, didelis aukščiau aprašyto CHO ląstelėse pagaminto rekombinantinio EPO specifinis aktyvumas gali būti tiesiogiai susijęs su charakteringu baltymo glikozilinimu.
[0065] Biologiškai aktyvus EPO, pagamintas prokariotų arba eukariotų organizmuose, naudojant šio išradimo klonuotus EPO genus, gali būti medikų ir veterinarų naudojamas in vivo, gydant žinduolius. Veikliosios medžiagos kiekis, žinoma, priklausys nuo gydomos ligos sunkumo, vartojimo būdo, aktyvaus EPO specifinio aktyvumo, tačiau galutinai tai nuspręs gydantis medikas arba veterinaras. Toks aktyvaus EPO kiekis, kuri, nustato gydantis gydytojas, vadinamas „EPO efektyviu terapiniu" kiekiu. Pavyzdžiui, gydant indukuotą hipoproliferatyvinę avių anemiją, asocijuotą su chronišku inkstų nepakankamumu, efektyvus kasdienis EPO kiekis buvo 10 VV/kg nuo 15 iki 40 dienų. Žr. Eschbach et al., J. Clin. Invest., 74:434 (1984).
[0066] Aktyvus EPO gali būti skiriamas bet kuriuo tinkamu gydymui būdu. Labiau tinka leisti EPO į kraują gydomiems žinduoliams. Specialistams suprantama, kad tinkamiausias būdas gali keistis priklausomai nuo gydomos ligos.
[0067] Nors galima vartoti EPO kaip gryną arba iš esmės gryną junginį, labiau tinka vartoti EPO kaip farmacinę receptūrą arba preparatą.
[0068] Šio išradimo kompozicijos, skirtos tiek medicinai, tiek veterinarijai, turi savo sudėtyje aktyvų EPO baltymą, aprašytą aukščiau, kartu su vienu ar keliais farmaciniu požiūriu priimtinais nešėjais ir - kartais - kitais terapiniais ingredientais. Nešėjai turi būti „priimtini" tuo požūriu, kad jie suderinami su kitais kompozicijos ingredientais ir nekenksmingi pacientui. Pageidautina, kad kompozicijoje nebūtų oksiduojančių agentų ir kitų medžiagų, apie kurias žinoma, kad jos nesuderinamos su peptidais. Kompozicijos gali būti patogiai pateiktos dozės vienetais ir pagamintos bet kuriais farmacijoje žinomais būdais. Visų metodų sudėtyje yra stadija, kurios metu veiklioji medžiaga sujungiama su nešėju, kuriame yra vienas arba keli pagalbiniai komponentai. Aplamai, vaistinė forma gaminama sumaišant veikliąją medžiagą su skystu nešėju arba
[0069] 4
[0070] susmulkintu kietu nešėju, arba su abiem šiais nešėjais, ir, jei to reikia, suteikiant produktui reikiamą formą.
[0071] Vaistinės formos, tinkamos parenteraliam vartojimui, tai paprastai sterilūs vandeniniai veikliosios medžiagos tirpalai, kurie dažniausiai yra izotoniški paciento kraujo atžvilgiu. Šios vaistinės formos gali būti lengvai pagamintos ištirpinus vandenyje kietą veikliąją medžiagą, ir sterilizavus gautą tirpalą pateikti ji, kaip toki, arba išfasuoti į multidozinius konteinerius, pvz., užlydytas ampules arba flakonus.
[0072] Čia minimas EPO/kDNR žymi brandų EPO/kDNR geną, esantį priešais ATG kodoną ir EPO/kDNR, koduojantį EPO baltymo alelinius variantus. Viena iš alelių parodyta Lentelėse 2 ir 3. EPO baltymas apima 1-metionino darinį (Met-EPO) ir EPO baltymo alelinius variantus. Brandus EPO baltymas, kurio seka pateikta Lentelėje 2, prasideda tokia seka: Ala-Pro-Pro-Arg-.... Sekos pradžia žymima skaičiumi „1". Met-EPO prasideda tokia seka: Met-Ala-Pro-Pro-Arg-....
[0073] Toliau pateikiami pavyzdžiai, kurie padeda suprasti šio išradimo esmę. Visa išradimo apimtis yra pateikta išradimo apibrėžtyje. Suprantama, kad pateikiamose metodikose gali būti modifikacijų, tačiau jos neiškraipo išradimo esmės. Visos temperatūros pateiktos Celsijaus laipsniais ir yra netaisytos. Sąvokos „mikronas" arba „mikro" žymimos (I, pavyzdžiui, mikrolitras, mikromolis ir pan. yra „Įil", „|J.m" ir pan.
[0074] EPO buvo išskirtas iš pacientų, sergančių aplastine anemija, šlapimo pagal anksčiau aprašytą metodiką (Miyake, et al., J. Biol. Chem., 252:5558 (1977)), išskyrus tai, kad vietoj apdorojimo fenoliu preparatas laikomas 80°C 5 minutes, siekiant inaktyvuoti neuraminidazę. Galutinė gryninimo stadija - frakcionavimas per Vydac HPLC kolonėlę (Separation Group), naudojant acetonitrilo su 0.1% trifluoracto rūgštimi gradientą nuo 0 iki 95% per 100 minučių. EPO ištekėjimo vieta gradiente buvo nustatyta analizuojant pagrindinus pikus elektroforeze gelyje ir nustatant N galo seką
[0075] EPO išteka esant maždaug 53% acetonitrilo ir sudaro maždaug 40% nuo visų baltymų, leistų i, atvirkštinės fazės chromatografiją. Frakcijos, kuriose yra EPO, sukoncentruotos iki 100 Įll, pH koreguotas iki 7.0, pridedant amonio bikarbonatą, ir preparatas suskaldomas, veikiant 2% tripsinu, apdorotu TPCK, (Worthington) 18 valandų esant 37°C. Triptinių peptidų mišinys buvo frakcionuojamas atvirkštinės fazės HPLC, kaip tai aprašyta aukščiau. Registruojamas optinis tankis prie 280 ir 214 nm. Gerai atsiskyrę pikai surenkami, išdžiovinami iki sausumo ir analizuojama N galo seka, naudojant Applied Biosystems Model 480 A dujų fazės sekvenatorių. Lentelėse 2 ir 3 nustatytos sekos pabrauktos. Kaip tai aprašyta aukščiau, du tokie triptiniai fragmentai buvo atrinkti oligonukleotidų zondų gamybai.
[0076] Remiantis seka Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys (amino rūgštys nuo 46 iki 52 Lentelėse 2 ir 3), buvo susintetintas 17-meras, išsigimęs 32 kartus,
[0077] Remiantis seka Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg (amino rūgštys nuo 144 iki 150 Lentelėse 2 ir 3), buvo susintetintos dvi grupės 14-merų,- kiekviena iš jų išsigimusi 32 kartus
[0078] kurios skiriasi pirma leucino kodono padėtimi. Oligonukleotidai buvo pažymėti 5' gale 32P, naudojant polinukleotidkinazę (New England Biolabs) ir y 32P-ATP (New England Nuclear).Oligonukleotidų specifinis aktyvumas buvo nuo 1000 iki 3000 Ci/mmol oligonukleotidui. Buvo atliktas žmogaus genomo DNR bibliotekos X bakteriofage (Lawn et al., Cell. 15:1157, 1978) skryningas, naudojant in situ amplifikacijos metodiką, kurią pirmą kartą aprašė Woo et al., ( Proc. Nat' l. Acad. Sci. U. S. A. 75:3688, 1978). Maždaug 3.5 x 10^ fagų talpinama į Petri lėkšteles (po 6000 fagų į 150 mm skersmens lėkštelę), su NZCYM terpe ir inkubuojama esant
[0079] 37°C tol, kol atsiranda mažos, bet pastebimos dėmės (maždaug 0.5 mm skersmens). Atvėsinama iki 4°C ir išlaikoma 1 valandą šioje temperatūroje. Dvigubos dėmių replikos perkeliamos ant nailono membranų (New England Nuclear)ir inkubuojamos per
[0080] naktį esant 37°C lėkštelėse su šviežia NZCYM terpe. Filtrai denatūruojami ir neutralizuojami išlaikant kiekvieną 10 minučių ploname sluoksnyje tirpalo, sudaryto iš atitinkamai 0.5 N NaOH - 1 M NaCI ir 0.5 M Tris (pH 8) - 1M NaCI. Filtrai kaitinami 2 valandas esant 80°C, plaunami 5 kartus SSC tirpalu, 0.5% NDS 1 valandą. Ląstelių liekanos pašalinamos švelniai braukiant drėgnu audiniu. Toks braukymas sumažina zondo foninį sukibimą su filtru. Po to filtrai perplaunami vandeniuir prehibriaizuojami nuo 3 iki 4 valandų esant 48°C 3M tetrametilamonio chloride, 10 mM NaPC>4 (pH 6.8) tirpale, 5-kartiniame Denhardt'o tirpale, 0.5% NDS ir 10 mM EDTA tirpale. Po to pridedamas 32P žymėtas 17-meras (koncentracija 0.1 pmol/ml) ir hibridizacija tęsiama 72 valandas esant 48°C. Po hibridizacijos filtrai ilgai plaunami dukartiniame SSC (0.3 M NaCI - 0.03 M Na citratas, pH 7) esant kambario temperatūrai ir 1 valandą 3M TMAC1 - 10 mM NaPC>4 (pH 6.8) esant kambario temperatūrai ir nuo 5 iki 15 minučių'esant hibridizacijos temperatūrai. Maždaug 120 stiprių dvigubų signalų buvo aptikta po 2 dienas trukusios autoradiografijos, naudojant intensyvinantį ekraną. Teigiami signalai buvo surinkti, sugrupuoti po 8, užnešti ir
[0081] pakartotinai atliktas skryningas .su trimis pakartojimais, naudojant pusę 14-merų grupės ant kiekvieno iš dviejų filtrų ir 127=merą ant trečiojo filtro. 17-mero užnešimo ir hibridizacijos metodika buvo tokia pati, kaip aprašyta aukščiau, išskyrus tai, .kad 14-mero hibridizacija vyko esant 37°C. Po autoradiografijos zondas pašalinamas iš filtro su 17-meru, laikant jį 50% formamide 20 rainučių kambario
[0082] temperatūroje ir filtras rehibridizuojamas esant 52°C su 18-mero zondu. Du nepriklausomi fagai hibridizuojami su visais trim zondais. Vieno, iš šių fagų DNR (čia žymima X HEP01) visiškai suskaldyta veikiant Sau3A ir subklonuota į M13, siekiant panaudoti ją DNR sekos analizei dideoksi grandinės užbaigimui pagal Sanger ir Coulson ( Proc. Nat' l. Acad. Sci., U. S. A. 74:5463, 1977). Čia taip pat aprašyta atviro skaitymo rėmelio, koduojančio EPO triptinį fragmentą
[0083] (pabrauktas regionas), nukleotidų seka ir pagal ją numatyta amino rūgščių seka. Introno sekos žymimos mažomis raidėmis, egzono sekos (87 nt) - didžiosiomis raidėmis. Sekos, kurios atitinka konsensuso splaisingo akceptoriaus (a) ir donoro (b) saitus, yra pabrauktos (žr. Lentelę 4) .
[0084] Pavyzdys 2: Žmogaus gemalo kepenų mRNR Nothern bloto analizė
[0085] Agarozės (0.8%) formaldehido gelyje atliekama elektroforezė su 5 fig žmogaus gemalo kepenų mRNR (paruoštų iš 20 savaičių gemalo kepenų) ir suaugusio žmogaus kepenų mRNR ir perkeliama ant nitroceliuliozinio filtro, naudojant Derman et al., metodą ( Cell, 23:731 (1981)). Paruošiamas viengrandis zondas iš M13 pavyzdžio, kuriame yra intarpas, pateiktas Lentelėje 1. Praimeriu pasirinktas 20-meras pagal tą pati, triptini, fragmentą, kaip ir originalus 17-mero zondas. Zondas paruošiamas pagal Anderson et al. , ( Proc. Nat' l. Acad. Sci., U. S. A. 80:6836-6842,1983), išskyrus tai, kad po skaldymo, veikiant Smal (kurio metu susidaro reikiamas 95 nt ilgio .zondas, turintis 74 nt koduojančią seką), mažasis fragmentas atskiriamas nuo M13 pavyzdžio chromą tografuo j ant per Sepharose C14B koloną su 0.1N NaOH-0.2M NaCl. Filtras hibridizuojamas kol zotido aktyvumas pasiekia maždaug 5 x 105 impulsų per minutę.
[0086] (cpm)(12 valandų esant 68°C), perplaunamas dukartiniame SSC esant 68°C ir eksponuojamas 6 dienas su intensyvinančiu ekranu. Šalia esančioje juostoje leidžiamas mRNR vienos dėmės (1200 nt) markeris, pažymėtas rodykle (Fig. 1).
[0087] Paruošiamas zondas, identiškas aprašytam Pav. 2, ir 3U0 atliekamas skryningas gemalo kepenų kDNR bibliotekos, paruoštos vektoriuje X,-Ch21A (Toole et al., Nature in Press,
[0088] (1984), naudojant standartines ližės dėmių skryningo (Benton Davis, Science 196:180-182,1977) procedūras. Atlikus skryningą su 1 x 10^ ližės dėmių, išskirti trys nepriklausomi teigiami klonai (žymimi X-HEPOFL6 (135 bp), A.-HEP0FL8 (700 bp) ir X-HEPOFL13 (1400 bp) . Visas X-HEPOFL13 ir A.-HEPOFL6 intarpas buvo nusekvenuotas, atlikus subklonavimą i, M13 (Lentelės 7ir 5, atitinkamai) . Intarpo A.-HEP0FL8 buvo nusekvenuoti tik atskiri fragmentai - buvo nuspręsta, kad liekana yra identiška kitiems dviems klonams (Lentelė 6). 5' ir 3' netransliuojamos sekos žymimos mažomis raidėmis. Koduojantis regionas žymimas didžiosiomis raidėmis.
[0089] Pagal Lenteles 2 ir 3, numatoma amino rūgščių seka yra pateikta po nukleotidų seka ir sunumeruota, pradedant nuo pirmos brandaus baltymo amino rūgšties. Spėjamas lyderinis peptidas amino rūgščių sekoje pažymėtas didžiosiomis raidėmis. Cisteino liekanos brandaus baltymo sekoje papildomai pažymėtos SH, o N glikozilinimo vietos - žvaigždute. Pabrauktos amino rūgštys žymi liekanas, kurios nustatytos sekvenuojant baltymo N galą arba sekvenuojant EPO triptinius fragmentus, kaip tai aprašyta Pavyzdyje 1. Pabraukimai punktyru žymi tas liekanas triptiniuose fragmentuose, kurios negali būti nustatytos
[0090] vienareikšmiškai. kDNR klonai X-HEPOFL6, X-HEPOFL8 ir \-HEPOFL13 deponuoti Amerikos tipų kultūrų kolekcijoje (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland);
[0091]
[0092] depozito numeriai (accession numbers) ATCC 40156, ATCC 40152 ir ATCC 40156, atitinkamai.
[0093] Keturių nepriklausomų genominių klonų (A.-HEP01, 2, 3 ir 6) santykiniai dydžiai ir lokalizacija HAelII/AluI bibliotekoje parodyta persiklojančiomis linijomis Fig. 3. Pastorinta linija žymi EPO geno lokalizaciją. Parodytas mastelis (Kb) ir žinomų restrikcijos endonukleazių skaldymo vietų padėtys. Abi regiono, kuriame yra EPO genas, grandys buvo visiškai sekvenuotos, naudojant ekzonukleazės III generuotas delecijų serijas šiame regione. Penkių ekzonų, koduojančių EPO mRNR, išsidėstymo schema pateikta Fig. 4. Tiksli ekzono I 5' riba šiuo metu nežinoma. Ekzono dalis, koduojanti'baltymą, užštrichuota. Visa regiono nukleotidų seka pateikta Lentelėje 4. Kiekvieno ekzono žinomos ribos pažymėtos vertikaliais brūkšniais. Genominiai klonai ^.-HEPOFLl, HEP0FL2, ^.-HEPOFL3 ir 7.-HEPOFL6 deponuoti Amerikos tipų kultūrų kolekcijoje (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland); depozito numeriai (accession numbers) ATCC 40154, ATCC 40155, ATCC 40150 ir ATCC 40151, atitinkamai.
[0094] Pavyzdys 5: Vektoriaus p91023 ( b) konstrukcija
[0095] Transformacijos vektoriumi buvo naudojamas pAdD26SVpA(3) , kurį aprašė Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 2;1304 (1982). Šio vektoriaus struktūra pateikta Fig. 5A. Trumpai kalbant, šioje plazmidėje yra pelės dihidrofolatreduktazės (DFHR) kDNR genas, kurio transkripciją kontroliuoja adenoviruso 2 (Ad2) pagrindinis vėlyvasis promotorius. 5' splaisingo vieta pažymėta adenoviruso DNR, o 3' splaisingo vieta, numatyta pagal imunoglobulino geną, yra tarp Ad2 pagrindinio vėlyvojo promotoriaus ir DFHR koduojančios sekos. Ankstyvasis SV40 poliadenilinimo saitas yra žemiau DHFR koduojančios sekos. pAdD26SVpA(3) prokariotinė dalis yra iš pSVOd (Mellon et
[0096]
[0097] al., Cell, 27:279 (1981)). Jos sudėtyje nėra pBR322 sekų, kurios, kaip žinia, inhibuoja replikaciją žinduolių ląstelėse (Lusky et al., Nature, 293:79 (1981)).
[0098] pAdD26SVpA(3) buvo konvertuota į plazmidę pCVSVL2, kaip tai parodyta Fig. 5A. pAdD26SVpA (3) konvertuota į plazmidę pAdD26SVpA(3) (d), deletuojant vieną iš dviejų Pstl saitų plazraidėje pAdD26SVpA (3) . Tai padaryta nepilnai suskaldant plazmidę restriktaze Pstl, pasinaudojus šio fermento deficitu. Taip gaunama linijinių plazmidžių subpopuliacija, kai tik vienas Pstl saitas suskaldytas. Po to veikiama Klenow fragmentu, liguojama, siekiant gauti žiedines plazmides. Pstl saito delecijos skryningas leidžia jį lokalizuoti tarp 3' ir SV40 poliadenilinimo sekų.
[0099] Adenoviruso lyderio, sudaryto iš trijų dalių, ir viruso asocijuoti genai (VA genai) įterpti į pAdD26SVpA(3) (d), kaip tai parodyta Fig. 5A. Iš pradžių pAdD26SVpA (3) (d) skaldoma su PvuII, siekiant perkirsti ją 3' regione, kuriame yra trys elementai, sudarantys trijų dalių lyderį. Po to pJAW 43 (Zain et al., Cell, 16:851 (1979)) skaldomas su Xhol, veikiamas Klenow fragmentu, skaldomas PvuII, ir 140 bp fragmentas, turintis trečiojo lyderio antrąją dalį išskiriamas elektroforezės akrilamido gelyje būdu (6% Tris borato buferyje; Maniatis et al.., supra) . Po to 140 bp fragmnetas liguojamas su pAdD26SVpA(3) (d), suskaldytu PvuII. Ligavimo produktas panaudojamas transformuoti E. coli į atsparų tetraciklinui kloną. Atliekamas kolonijų skryningas pagal Grunstein-Hogness metodiką, naudojant 32p žymėtą zondą, kuris hibridizuojasi su 140 bp fragmentu. DNR, pagamintas iš teigiamai hibridizuojančių kolonijų, buvo analizuojamas, siekiant nustatyti, ar rekonstruotas PvuII saitas iš 140 bp DNR yra 5' ar 3' adenoviruso antrojo ir trečiojo vėlyvojo lyderio atžvilgiu. Plazmidė yra žymima tTPL ir parodyta Fig. 5A.
[0100] SV40 AvalID fragmentas, turintis SV40 sustiprinančią seką, gaunamas skaldant SV40 DNR su AvalI, sulyginant galus su Poli Klenow fragmentu, liguojant Xhol linkerius su fragmentais, skaldant su Xhol ir taip atidarant Xhol saitą ir išskiriant ketvirtą didžiausią (D) fragmentą elektroforezės būdu. Šis fragmentas po liguojamas su pTPL, suskaldytu Xhol, ir gaunama plazmidė pCVSVL2-TPL. SV40 D fragmento orientacija plazmidėje pCVSVL2-TPL yra tokia, kad SV40 vėlyvasis promotorius yra taip pat orientuotas kaip ir adenoviruso pagrindinis vėlyvasis promotorius.
[0101] Siekiant įterpti genus, asocijuotus su adenovirusu (VA), į pCVSVL2-TPL, iš pradžių buvo sukonstruota plazmidė pBR322, kurios sudėtyje yra 2-o tipo adenoviruso Hind III Bjfragmentas. 2-o tipo adenoviruso DNR skaldoma su HindlII ir B fragmentas išskiriamas elektroforezės gelyje būdu. Šis fragmentas įterpiamas į pBR322, kuri prieš tai suskaldoma HindlII. E. coli transformuojama į ampicilinui atsparų kamieną. Atliekamas rekombinantų skryningas, siekiant nustatyti, ar įterptas HindlII B fragmentas, o jo orientacija nustatyta skaldant restrikcijos endonukleazėmis. Plazmidės pBR322 - Ad HindlII B sudėtyje yra 2-o tipo adenoviruso HindlII B fragmentas, kurio orientacija pateikta
[0102] Kaip parodyta Fig. 5B, VA genus patogu gauti iš plazmidės pBR322 - Ad HindlII B, skaldant ją Hpa I, pridedant EcoRl linkerius ir skaldant su EcoRl, o po to išskiriant 1.4 kb fragmentą. Fragmentasjd, turintis EcoRl lipnius galus, po to liguojamas į PTL EcoRl saitą, kuris prieš tai suskaldomas EcoRl. E. coli HB101 transformuojama ir atrenkaraaos atsparios tetraciklinui kolonijos, su kuriomis atliekamas filtrinės hibridizacijos skryningas, siekiant nustatyti DNR, specifines VA genams. DNR buvo susintetintos iš teigiamai hibridizuojnačių klonų ir apibūdintos, skaldant restrikcijos endonukleazėmis. Gauta plazmidė žymima p91023.
[0103] Abu EcoRl saitai p91023, kaip parodyta Fig. 5C, buvo' pašalinti visiškai suskaldant p91023 su EcoRl. Gaunami du DNR fragmentai: vienas maždaug 7 kb ir kitas maždaug 1.3 kb. Pastarajame fragmente yra VA genai. Abiejų fragmentų galai buvo sulyginti naudojant Poli Klenow fragmentą ir jie liguojami vienas su kitu. Gaunama plazmidė p911023 (A), turinti yra VA genus, kuri panaši i p91023, išskyrus tai, kad joje nėra abiejų EcoRl saitų. Ši plazmidė' identifikuojama naudojantis Grunstein-Hogness skryningo metodu su Va geno fragmentu ir standartine restrikcijos saitų analize.
[0104] Vienas Pstl saitas, esantis plazmidėje p91023(A) pašalinamas ir pakeičiamas EcoRl saitu. p91023(A) visiškai suskaldoma Pstl ir veikiama Poli Klenow fragmentu, siekiant gauti
[0105] lygius galus. EcoRl linkeriai liguojami su p (1023(A) bukuoju Pstl saitu. Tiesinė p91023 (A) su prijungtais prie buko Pstl-saito EcoRl linkeriais buvo atskirta nuo neliguotų linkerių , visiškai suskaldyta EcoRl ir vėl liguota. Gaunama plazmidė p91023 (B), parodyta Fig. 5C, kurios struktūra panaši į
[0106] p91023(A), tačiau vietoje EcoRl saito yra anksčiau buvęs Pstl saitas. Plazmidė p91023(B) deponuota ir ją galima gauti Amerikos kultūrų tipų kolekcijoje (ATCC), Rockville, Maryland, depozito Nr. ATCC 39754.
[0107] Į plazmiaę p91023(B) įterpiami kDNR klonai (X-EP0FL6 ir X - EPOFL13; Fig. 3) ir susidaro atitinkamos plazmidės pPTFLG ir pPTFL13. 8 (ag kiekvienos išgrynintos DNR buvo panaudota COS ląstelių (5 x 10^) transfekcijai, naudojant DEAE-dekstrano
[0108] metodą (žr. žemiau). Po 12 valandų ląstelės perplaunamos ir 'veikiamos 2 valandas Chlorochinu (0.1 mM), vėl perplaunamos ir paliekamos 24 valandoms terpėje (10 ml), kurioje yra 10% veršelio fetalinio serumo. Po to terpė keičiama neserumine teroe M ml) ir išlaikoma 48 valančias.
[0109] Imunologiškai aktyvaus EPO gaminamas kiekis išmatuojamas kiekybiškai RIA metodu, kuris aprašytas Sherwood ir Goldwasser ( Blood 54:8885- 893, 1979). Antikūniai gauti iš Dr. Judith Sherwood. Jodo preparatas pagamintas iš homogeninio EPO, aprašyto Pav. 1. Šio testo jautrumas yra maždaug 1 ng/ ml. Rezultatai pateikti žemiau Lentelėje 8.
[0110] Plazmidė pPTFL13 deponuota ir ją galima gauti Amerikos kultūrų tipų kolekcijoje ( ATCC), Rockville, Maryland, depozito Nr. ATCC 39990.
[0111] EPO kDNR ( X- HEPOFL13) įterpiama į p91023(B) vektorių ir transfekuojama į COS- 1 ląsteles. Kultivavimo sąlygos tokios pačios, kaip aprašyta Pav. 6, išskyrus tai, kad praleidžiama chlorochino stadija.
[0112] EPO biologinis aktyvumas i_ n vitro buvo matuojamas naudojant kolonijų formavimo testą su pelės gemalo kepenų ląstelėmis kaip CFU- E šaltiniu arba ^ H- timidino įsisavinimo testą, naudojant pelių,. kurioms suleista fenilhidrazino, blužnies ląsteles. Šių testų jautrumas yra maždaug 25 milivienetai/ ml.
[0113] EPO biologinis aktyvumas in vivo buvo matuojamas naudojant hipoksinių pelių arba - badaujančių žiurkių metodą. Šių testų jautrumas yra maždaug 100 milivienetai/ ml. Kontrolinėje terpėje nerasta jokio aktyvumo. Matavimų rezultatai, gauti EPO, kuris ekspresuotas klone EPOFL13, pateikti žemiau Lentelėje 9. Čia pateikti aktyvumai išreikšti vienetais/ml, naudojant kaip standartą komercini, apibrėžtos sudėties EPO (Toyobo, Inc.).
[0114] Pavyzdys 8: EPO iš COS ląstelių analizė NDS poliakrilamidiniame gelyje
[0115] 180 ng EPO, kurį sekretuoja i terpę COS ląstelės, transfekuotos EPO (X-HEP0FL13) kDNR i, vektorių 91023 (B)
[0116] (aprašytas aukščiau) analizuojama elektroforezės būdu 10% NDS Laemlli poliakrilamidiniame gelyje ir perkeliama elektriniu būdu ant nitroceliuliozės popieriaus (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350 (1979)). Filtras testuojamas su anti-EPO antikūnais kaip aprašyta Lentelėje 8, perplaunamas ir vėl testuojamas su 125 į-stafilokoko A baltymu. Filtras autoradiografuojamas 2 dienas. Natyvus homogeninis EPO, aprašytas Pvz. 1, analizuojamas elektroforezės būdu prieš jodavimą (takelis B) arba po 'jodavimo (takelis C) (žr. Fig. 6). Naudojami markeriai - ^^S metioninas, serumo albuminas (68 000d) ir ovalbuminas (45 000 d).
[0117] Iš plazmidės PSV2DHFR (Subraraani et al., Mol. Cell. Bio. 1:854-864 (1981)) buvo išskirtas Bam HI-PvuII fragmentas, turintis SV40 ankstyvąjį regiono promotorių, esantį šalia pelės dihidrofolatreduktazės (DHFR) geno, SV40 stiprintuvą, mažą t antigeno introną ir SV40 poliadenilinimo seką
[0118] (fragmentas A) . Kiti fragmentai gauti iš vektoriaus p91023(A) (žr. aukščiau) taip: p91023(A) skaldoma PstI ties vieninteliu PstI saitu, esančiu šalia adenoviruso promotoriaus, siekiant linearizuoti plazmiaę, o po to liguoti su sintetiniu PstI - EcoRI konverteriu ir vėl uždaryti žiedą (taip sukuriami saitai PstI - EcoRI - PstI originalaus PstI saito vietoje; 91023(B1)) arba ši plazmidė veikiama dideliu DNR polimerazės I fragmentu, siekiant suardyti PstI saitus, ir liguojama su sintetiniu EcoRI linkeriu ir uždaromas žiedas (taip sukuriamas EcoRI saitas vietoj originalaus PstI saito; 91023 (B)) . Kiekviena gauta plazmidė - 91023 (B1) ir 91023 (B) - skaldoma Xba ir EcoRI, siekiant gauti du fragmentus (F ir G) . Sujungiant fragmentą F iš 91023(B) su fragmentu G iš 91023(B') ir fragmentą G iš 91023 (B) su fragmentu F iš 91023(B1), sukuriamos dvi naujos plazmidės, kuriose yra EcoRI - PstI saitas arba Pst -EcoRI saitas vietoj originalaus PstI saito. Plazmidė, kurioje PstI - EcoRI saite PstI saitas yra arčiausiai vėlyvojo pagrindinio adenoviruso promotoriaus, žymima p91023 (C) .
[0119] Vektorius p91023 (C) pilnai suskaldomas restriktaze XhoI ir gautos linearizuotos DNR, kurių lipnūs galai sulyginti, naudojant didelį DNR polimerazės I iš E. coli fragmentą. Su tokia DNR liguojamas 340 bp HindlII - EcoRI fragmentas, turintis SV40 stiprintuvą, susintetintą taip: HindlII - PvuII fragmentas iš SV40, turintis SV40 originalą arba jo kopiją, įterpiamas į plazmidę c lac (Little et al., Mol. Biol. Med. 1:473-488 (1983)). Vektorius c lac buvo susintetintas skaldant DNR su BamHI, sulyginant lipnius galus, naudojant didelį DNR polimerazės I fragmentą ir skaldant DNR su HindlII. Gauta plazmidė (c SVHPlac) vėl turi BamHI saitą, liguojant su bukuoju PvuII galu. EcoRI - HindlII fragmentas susintetintas iš c SVHPlac ir liguojamas su EcoRI - HindlII fragmentu iš PSVOd (Mellon et al., žr. aukščiau), kuriame yra originali plazmidė arba jos kopija. Pasirenkama gauta plazmidė pSVHPOd. Sintetinamas EcoRI - HindlII 340 bp fragmentas, kuriame yra SV40 originalas arba stiprintuvas, abu galai sulyginami, naudojant didelį DNR polimerazės I fragmentą, ir liguojami su aukščiau aprašytu, Xhol suskaldytu, sulygintais galais vektoriumi p91023(c).
[0120] Gauta plazmidė (p91023(C)/Xho/buki galai +
[0121] EcoRI/HindIII/SV40 su bukais galais + stiprintuvas), kurioje HindlII - EcoRI fragmentas buvo toks, kad BamHI saitas jame artimiausias VA genui, žymima pES105. Plazmidė pES105 skaldoma su BamHI ir PvuII ir tik su PvuII, po to išskiriamas BamHI - PvuII fragmentas, kuriame yra adenoviruso pagrindinis vėlyvasis promotorius (fragmentas B), PvuII fragmentas, turintis atsparumo tetraciklinui geną ir kitos sekos (fragmentas C). Fragmentai A, B ir C liguojami ir gauta plazmidė, parodyta Fig. 7, išskirta ir pažymėta RK1-4. Plazmidė RK1-4 deponuota Amerikos kultūrų tipų kolekcijoje (ATCC), Rockville, Maryland, depozito Nr. ATCC 39940.
[0122] DNR (20 (ag) iš plazmidės pPTFL13, kuri aprašyta aukščiau (Pvz. 6), skaldoma su restrikcijos endonukleaze Clal, siekiant linearizuoti plazmidę ir liguojama su plazmidės pAdD26SVp(A) 1 (2 flg) DNR, kuri suskaldyta su Clal, ir kurioje yra nepažeistas dihidrofolatreduktazės (DHFR) genas, 'kontroliuojamas adenoviruso pagrindinio vėlyvojo promotoriaus (Kaufman ir Sharp, Mol. and Cell Biol. 2:1304-1319 (1982)). Taip liguota DNR-buvo panaudota DHFR neigiamoms CHO ląstelėms transfekuoti (DUKX-BII, Chasin L.A. ir Urlaub G. (1980) PNAS 77 4216-4220), ir - praėjus dviems dienoms nuo auginimo pradžios - ląstelės, turinčios bent vieną DHFR geno kopiją buvo atrinktos a-terpėje be nukleotidų, papildytoje 10% dializuotu fetaliniu jaučio serumu. Praėjus dviems savaitėms nuo auginimo pradžios, selektyvioje terpėje, kolonijos išimamos iš pradinių lėkštelių, sugrupuojamos po 10-100 kolonijų, persėjamos ir auginamos iki susiliejimo a-terpėje be nukleotidų. Terpių supernatantai prieš selekciją metotreksatu testuojami RIA metodu ieškant EPO. Grupės, kuriose rastas EPO, auginamos terpėje su metotreksatu (0.02 jiM) , po to subklonuojamos ir pakartotinai analizuojamos. EPO Cla 4 4.02-7 pasirodė esanti vienintelė subklonuota iš EPO Cla 4 4.02 grupė, kuri atpalaiduoja 460 ng/ml EPO į terpę, turinčią 0.02 fiM MTX (Lentelė 10). EPO Cla 4 4.02-7 yra pati geriausia ląstelių linija EPO gamybai; ji deponuota Amerikos kultūrų tipų kolekcijoje (ATCC), Rockville, Maryland, depozito Nr. ATCC CRL8695. Šiuo metu atliekama šio klono laipsniška selekcija, didinant MTX koncentraciją - tai, kaip tikimasi, leis gauti ląsteles, pasižyminčias dar didesne EPO ekspresija. Grupėse, kurios yra neigiamos RIA duomenimis, atrenkamos metotreksatui atsparios kolonijos iš atitinkamų kultūrų, kurios auginamos terpėje su metotreksatu (0.02 uK) . Šiose kolonijose vėl nustatomas EPO RIA metodu. Neigiamos kultūros subklonuojamos ir toliau auginamos, didinant metotreksato koncentraciją.
[0123] Laipsniška selekcija pagal metotreksatą (MTX) buvo pasiekta kartojant ląstelių kultivavimo terpėse su didėjančia metotreksato koncentracija ir likusių gyvų ląstelių selekcijos ciklus. Kiekviename cikle buvo matuojamas EPO kiekis kultūros supernatante RIA metodu ir biologinis aktyvumas in vitro. Metotreksato kiekiai, naudojami kiekvienoje amplifikacijos stadijoje buvo 0.02 įiM, 0.1 ĮlM ir 0.5 (iM. Kaip parodyta Lentelėje 10, po 1 selekcijos ciklo terpėje su 0.02 fiM metotreksato į terpę sekretuojami žymūs kiekiai EPO.
[0124] EPO kiekiai, sekretuojaroi j terpę
[0125]
[0126] Pavyzdys 11: EPO ekspresija CHO ląstelėse - Il- as metodas
[0127] DNR iš klono X-HEPOFL13 skaldoma su EcoRI ir mažas RI fragmentas, turintis EPO geną, subklonuojamas į plazmidės RK1-4 EcoRI saitą (žr. Pvz. 10). Ši DNR (RKFL13) naudojama tiesioginei (be skaldymo) DHFR-neigiamų CHO ląstelių transfekcijai. Selekcija ir amplifikacija atliekama kaip aprašyta aukščiau pateiktame Pvz. 10.
[0128] RKFL13 DNR į CHO ląsteles buvo įterpta ir kitais būdais - protoplastų sulydymu ir mikroinjekcij a. Plazmidė RKFL13 deponuota Amerikos kultūrų tipų kolekcijoje (ATCC),' Rockville, Maryland, depozito Nr. ATCC 39989.
[0129] Geriausias atskiros kolonijos klonas buvo deponuotas Amerikos kultūrų tipų kolekcijoje (ATCC), Rockville, Maryland, depozito Nr. ATCC CRL8595.
[0130] Pavyzdys 12: EPO genominio klono ekspresija COS- 1 ląstelėse
[0131] EPO genominio klono ekspresijai naudojamas vektorius pSVOd (Mellon et al., supra) . DNR iš pSVOd pilnai suskaldoma su HindlII, jos galai sulyginami naudojant didij į DNR polimerazės I fragmentą. EPO genominis klonas 7.HEP03 pilnai skaldomas su EcoRI ir HindlII , išskiriamas 4.0 kb fragmentas, turintis EPO geną, ir sulyginami jo galai, kaip aprašyta aukščiau. Šio fragmneto nukleotidų seka nuo HindlII saito iki regiono virš poliadenilinimo signalo parodyta Fig. 4 Lentelėje 4. EPO geno fragmentas buvo įterptas į pSVOd plazmidės fragmentą ir taisyklingai sukonstruoti abiejų orientacijų rekombinantai buvo išskirti ir patikrinti. Plazmidėje CZ2-1 EPO genas yra „a" orientacijos (t.y. EPO 5'galas yra arčiausiai SV40 originalo), o plazmidėje CZ1-3 - priešingos orientacijos (orientacija „b").
[0132] Plazmidės CZ1-3 ir CZ2-1 transfekuojartios į COS-1 ląsteles, kaip tai aprašyta Pvz. 7, terpė surenkama ir jooje nustatomas imunologiškai aktyvus EPO. CZ2-1 kultūros supernatante EPO rasta maždaug 31 ng/ml, CZ1-3 - 16-31 ng/ml.
[0133] Panašiu būdu į COS ląsteles gali būti įterpti genominiai klonai HEP01, HEPO2 ir HEPO6.
[0134] Pavyzdys 13: Ekspresija C127 ir 3T3 ląstelių pBPVEPO konstrukcijoj e
[0135] Konstruojama plazmidė, turinti EPO kDNR seką, kurią kontroliuoja pelės metalotioneino promotorius, ir sujungta su pilna jaučio papilomos viruso DNR.
[0136] Plazmidė SP6/5 gauta iš Promega Biotec. ši plazmidė pilnai suskaldyta su EcoRI ir 1340 bp EcoRI fragmentas iš X - HEPOFL13 įterpiamas naudojant DNR ligazę. Gauta plazmidė, kurios EPO geno 5' galas yra arčiausiai SP6 promotoriaus (pagal skaldymą su BglI ir HindlII), žymima pEP049F. Šioje orientacijoje BamHI saitas PSP6/5 polilinkeris yra tiesiogiai prijungtas prie EPO geno 5' galo.
[0137] Plazmidė pdBPV-MMTneo (342-12) (Law et el., Mol. and Cell Biol. 3:2110-2115 (1983)), parodyta Fig. 8, pilnai suskaldoma su BamHI ir gauanmi du fragmentai - didelis maždaug 8 kb fragmentas, kuriame yra BPV genomas, ir mažesnis, maždaug 6,5 kb fragmentas, kuriame yra pML2 replikacijos originalas ir atsparumo ampicilinui genas, metalotioneino promotorius, atsparumo neomicinui genas ir SV40 poliadenilinimo signalas. Suskaldyta DNR sujungiama į žiedą veikiant ją DNR ligaze ir, skaldant su EcoRI ir BamHI restrikcijos endonukleazėmis, identifikuojamos plazmidės, turinčios tik 6.8 kb fragmentą. Viena šių plazmidžių pažymėta pMMTneo BPV.
[0138] pMiMTneo BPV pilnai suskaldoma su BglII. pEP049f pilnai suskaldoma su BamHI bei BglII ir maždaug 700 bp fragmentas, kuriame yra visas EPO koduojantis regionas, išskiriamas gelyje. pMMTneo BPV , suskaldytas BglII ir 700 bp BamHI/BglII EPO fragmentas liguojami ir gautos palzmidės, turinčios EPO kDNR, identifikuojamos hibridizuojant kolonijas su oligonukleotido d(GGTCATCTGTCCCCTGTCC) zondu, kuris yra specifiškas EPO genui. Tarp teigiamai hibridizavusių plazmidžių skaldant su EcoRI ir KpnI identifikuota viena plazmidė (pEP015a), kurioje EPO kDNR taip orientuotas, kad EPO kDNR 5' galas yra arčiausiai metalotioneino promotoriaus.
[0139] Plazmidė pEP015A linearizuojama pilnai suskaldant ją su BamHI. Taip pat pilnai suskaldoma pdBPV-MMTneo-(342-12) plazmidė, veikiant ją BamHI, ir gaunami du fragmentai - 6.5 kb ir 8 kb. 8 kb fragmentas, kuriame yra visas jaučio papilomos viruso genomas, išskiriamas gelyje. pEP015a/BamHI ir 8 kb BamHI fragmentas liguojami vienas su kitu ir kolonijų hibridizavimo metodu, naudojant specifinį BPV genomui oligonukleotido d(P-CCACACCCGGTACACAC-OH) zondą, identifikuojama plazmidė (pBPV-EPO), kurioje yra BPV fragmentas. pBPV-EPO DNR skaldymas su HindlII parodė, kad BPV genomo transkripcijos kryptis yra tokia pati, kaip ir metalotioneino promotoriaus transkripcijos kryptis (taip pat yra ir pdBPV-MMTneo (342-12), žr. Pav. 8). Plazmidę pdBPV-MMTneo(342-12) galima gauti Amerikos kultūrų tipų kolekcijoje (ATCC), Rockville, Maryland, depozito Nr. ATCC 37224 .
[0140] EPO ekspresijai buvo naudojami žemiau aprašyti metodai.
[0141] Susintetinta pBPV-EPO DNR ir maždaug 25 jJ.g panaudojama -1 x 106 C127 (Lowy et al. , J. of Virol. 26:291-98 (1978)) CHO ląstelių transfekcijai, naudojant standartinę kalcio fosfato nusodinimo metodiką (Grahm et al., Virology, 52:456-67
[0142] (1973)) . Praėjus 5 valandoms po transfekcijos, pašalinama transfekcijos terpė, atliekamas glicerino šokas, ląstelės perplaunamos ir pridedama šviežia oc-terpė, \ kurią pridėta 10 % fetalinio jaučio serumo. Po 48 valandų ląstelės tripsinizuojamos, disperguojamos santykiu 1:10 DME terpėje, kurioje yra 500 jlg/ml G418 (Southern et al., Mol . Appl. Genet. 1:327-41 (1982)) ir inkubuojamos dvi tris savaites. Kolonijos, atsparios G418, išskiriamos individualiai, patalpinamos į. mikrotitravimo šulinėlius ir auginamos iki susiliejimo esant G418. Po to ląstelės perplaunamos, pridedama šviežia terpė, kurioje yra 10% fetalinio jaučio serumo ir po 48 valandų terpė surenkama. Apdorota terpė analizuojama ir RIA metodu bei iri vitro biologiniu testu parodyta, kad ji yra teigiama EPO atžvilgiu.
[0143] C127 arba 3T3 ląstelės kotransf ekuo j amos su 25 ja. g pBPV-EPO ir 2 |ig pSV2neo (Southern et al. , supra) kaip tai aprašyta Metode I. Naudojamas maždaug 10-kartinis molinis pBPV-EPO perteklius. Po transfekcijos taikoma ta pati procedūra, kaip aprašyta Metode I.
[0144] C127 ląstelės transfekuojamos su 30 ĮJ.g pBPV-EPO, kaip aprašyta Metode I. Po transfekcijos ir padalinimo (1:10) terpė keičiama kas trys dienos. Maždaug po 2 savaičių pasirodo BPV transformuotų ląstelių dėmės. Individualios dėmės surenkamos atskirai į 1 cm mikrotitravimo lėkštelės šulinėlius, auginamos iki susiliejančio monosluoksnio ir apdorotoje terpėje tikrinamas jų EPO aktyvumas arba antigeniškumas.
[0145] Pavyzdys 14: Ekspresija vabzdžių ląstelėse. pIVEV EP0FL13 konstrukcij a
[0146] Plazmidės vektorius pIVEV deponuotas Amerikos kultūrų tipų kolekcijoje (ATCC), Rockville, Maryland, depozito Nr. ATCC 39991. Vektorius modifikuotas taip:
[0147] pIVEV skaldomas su EcoRI, siekiant linearizuoti plazmidę, galai sulyginami, naudojant didijį DNR polimerazės I fragmentą ir vienas NotI linkeris
[0148]
[0149] įterptas liguojant bukąjį galą. Gauta plazmidė žymima
[0150] pIVEV skaldomas su SmaI, siekiant linearizuoti plazmidę, ir vienas Sfil linkeris
[0151]
[0152] įterptas liguojant bukąjį galą. Gauta plazraidė žymima
[0153] Plazmidė pIVEVSI skaldoma su KpnI, siekiant ją linearizuoti, ir maždaug 0-100 bp pašalinama iš kiekvieno galo skaldant su dvigrande ekzonukleaze Bal31. Gauti galai sulyginami, naudojant didij į DNR polimerazės I fragmentą, ir, liguojant bukąjį galą, įterpiamas polilinkeris
[0154]
[0155] Gaunamos abi polilinkerio orientacijos. Plazmidė, kurioje polilinkeris orientuotas taip, kad BglII saitas, esantis polilinkeryje, yra arčiausiai poliedrono geno promotoriaus, žymima pIVEVSIBgKp. Plazmidė, kurioje KpnI saitas, esantis polilinkeryje, yra arčiausiai poliedrono geno promotoriaus, žymima pIVEVSIKpBg. Bazių porų skaičius, kurios pašalintos iš regiono tarp originalaus KpnI saito pIVEVSI ir poliedrono promotoriaus, nebuvo nustatytas. pIVEVSIBgKp deponuota Amerikos kultūrų tipų kolekcijoje (ATCC), Rockville, Maryland, depozito Nr. ATCC 39998.
[0156] pIVEVNI pilnai suskaldoma su KpnI ir PstI - gaunami du fragmentai. Didesnysis fragmentas, kuriame yra plazmidės originalo replikacija ir 3'galas, išskiriamas gelyje (fragmentas A) . pIVEVSIBgKp pilnai suskaldoma su Pst.I ir KpnI - gaunami du fragmentai. Mažesnysis fragmentas, kuriame yra poliedrono geno promotorius ir polilinkeris, išskiriamas
[0157] gelyje (fragmentas B). Fragmentai A ir B sujungiami, naudojant DNR ligazę, ir susidaro nauja plazmidė pIVEVSIBgKpNl, kurioje yra iš dalies deletuotas poliedrono genas, į kurį įterptas polilinkeris, bei NotI saitas (vietoj suardyto EcoRI saito) ir Sfil saitas, kurie supa poliedrono geno regioną.
[0158] pIVEVSI BGKpNI pilnai suskaldomas su EcoRI, siekiant linearizuoti plazmidę ir įterpiamas 1340 bp EcoRI fragmentas iš X-HEPOFL13. Plazmidės, kuriose EPO genas yra taip orientuotas, kad EPO geno 5'galas yra arčiausiai poliedrono promotoriaus, o poliedrono geno 3' galas identifikuojamas skaldant su BglII. Viena šių plazmidžių, pasižyminti aukščiau minėta orientacija, žymima pIVEPO.
[0159] Transformuojant E. coli kamieną JMlOl-tgl, pagaminamas didelis kiekis pIVEPO plazmidės. DNR plazmidė išskirta naudojant skaidraus lizato metodiką (Maniatis ir Fritsch, Cold Spring Harbor Manual) ir po to valoma centrifuguoj ant CsCl gradiente. Poliedrozės viruso (AcNPV) Autographa californica laukinio tipo kamieno L-l DNR gaminama ekstrahuojant fenoliu viruso daleles ir po to gryninant virusinę DNR CsCl gradiente.
[0160] Šios dvi DNR kotransfekuojamos į Spodoptera frugiperda ląsteles IPLB-SF-21 (Vaughn et al., In Vitro Vol. B, pp. 213-17 (1977)), naudojant kalcio fosfato transfekcijos procedūrą (Potter ir Miller, 1977) . Kiekvienai lėkštelei ko-transfekuoj amų ląstelių buvo naudojama kilpelė laukinio tipo AcNPV DNR ir 10|ag pIVEPO. Lėkštelės inkubuojamos 5 dienas esant 27°C. Surenkamas supernatantas ir EPO ekspresijos lygis jame nustatomas RIA metodu in vitro biologiniu testu.
[0161] COS ląstelių terpė (12 1), kurioje EPO koncentracija yra iki 200 |J.g/l, koncentruojama iki 600 ml, naudojant 10 000 D ultrafiltracijos membranas, pavyzdžiui, Millipore Pellicon aparatą su 5 kvadratinių pėdų membrana. Testuojama RIA metodu pagal metodiką, aprašytą Pvz. 6. Ultrafiltracijos retentatas diafiltruojamas prieš 4 ml 10 mM natrio fosfato buferio, pH 7.0. Sukoncentruotoje ir diafiltruotoje terpėje rasta 2.5 mg EPO (bendras baltymas - 380 mg). Po to EPO tirpalas koncentruojamas iki 186 ml ir krentantys į nuosėdas baltymai pašalinami centrifuguoj ant 30 minučių
[0162] Supernatanto, kuriame yra EPO (2.0 mg), pH koreguojamas iki 5.5 pridedant 50% acto rūgštį, maišomas 30 minučių esant 4°C ir nuosėdos pašalinamos centrifuguoj ant 30 minučių esant 13 000 g.
[0163] Supernatantas po centrifugavimo (20 ml) , kuriame yra 200 (ig EPO (bendras baltymas - 24 mg) užnešamas ant kolonėlės, užpildytos CM-Sepharose (20 ml). Kolonėlė nulygsvarinama lOmM natrio acetato tirpalu (pH 5.5), perplaunama 40 ml to paties buferio. EPO eliuojamas nuo CM-Sepharose su 100 ml NaU(O-l) gradiento 10 mM natrio fosfato tirpalo, pH 5.5. Surenkamos frakcijos, kuriose yra EPO (50 jag dviejuose mg bendro baltymo), gautas tirpalas koncentruojamas iki. 2 ml naudojant Amicon YM10 ultrafiltracijos membraną.
[0164] Sukoncentruotos frakcijos po CM-Sepharose, turinčios- EPO, toliau gryninamas atvirkštinės fazės HPLC, naudojant Vydac C-4 kolonėlę. EPO užnešamas ant kolonėlės, nulygsvarintos 10% eliuentu B ( Eliuentas A - 0.1% CF3CO2H vandenyje; eliuentas B - 0.1% CF3CO2H acetonitrile), srovės greitis 1 ml/min. Kolonėlė 10 minučių plaunama 10%-iniu B. EPO eliuojamas B tiesiniu gradientu (10-70% per 60 minučių). Surenkamos frakcijos, kuriose yra EPO (-40 fig EPO, bendras baltymas - 120 |-lg) , ir liof ilizuojama. Liof ilizuotas EPO ištirpinamas 0.1 M Tris-HCl su 0.15 M NaCl esant pH 7.5 dar kartą gryninamas atvirkštinės fazės HPLC. Frakcijos, kuriose yra EPO, surenkamos ir analizuojamos NDS poliakrilamido gelyje (10%) elektroforezės būdu (Laemmli, U.K., Nature). Surinktose frakcijose yra 15.5 [ig EPO, visas baltymas -
[0165] Šio išradimo aprašymas pateiktas su detalėmis, pateikti labiau tinkami pavyzdžiai. Autoriai būtų dėkingi, jei specialistai, įvesdami patobulinimus ir modifikacijas, atsižvelgdami čia pateiktas specifikacijas ir piešinius, nenukryptų nuo šio išradimo idėjos ir neišeitų už jo rėmų, kurie pateikti pridedamoje išradimo apibrėžtyje.
1. Žmogaus kDNR klono, ekspresuojančio biologiškai aktyvų eritropoetiną, gamybos būdas, besiskiriantis tuo, kad susideda iš tokių stadijų:(a) išgrynintą eritropoetiną skaldo tripsinu;(b) sudaro oligonukleotidų zondų rinkinį, remiantis triptinių fragmentų, gautų stadijoje (a) , amino rūgščių seka;(c) atlieka žmogaus genomines DNR bibliotekos skryningą su oligonukleotidų zondais iš stadijos (b);(d) atrenka klonus, kurie hibridizuojasi su zondais, ir nustato šių klonų seką, siekiant nustatyti, ar jie yra eritropoetino klonai;(e) identifikuoja eritropoetino kloną iš stadijos (d);(f) kloną iš stadijos (e) panaudoja kDNR bibliotekos, paruoštos iš žmogaus gemalo kepenų, skryningui;(g) atrenka eritropoetino klono iš gemalo kepenų kDNR bibliotekos stadijoje (f).
(a) išgrynintą eritropoetiną skaldo tripsinu;(b) sudaro oligonukleotidų zondų rinkinį, remiantis triptinių fragmentų, gautų stadijoje (a) , amino rūgščių seka;(c) atlieka žmogaus genomines DNR bibliotekos skryningą su oligonukleotidų zondais iš stadijos (b);(d) atrenka klonus, kurie hibridizuojasi su zondais, ir nustato šių klonų seką, siekiant nustatyti, ar jie yra eritropoetino klonai;(e) identifikuoja eritropoetino kloną iš stadijos (d);(f) kloną iš stadijos (e) panaudoja kDNR bibliotekos, paruoštos iš žmogaus gemalo kepenų, skryningui;(g) atrenka eritropoetino klono iš gemalo kepenų kDNR bibliotekos stadijoje (f).2. Eritropoetino gamybos būdas, besiskiriantis tuo, kad jį sudaro auginimas tinkamoje terpėje šeimininko ląstelių, turinčių iš esmės tokią pačią DNR seką, kaip parodyta 3 lentelėje, operatyviai sujungtą su ekspresiją kontroliuojančia seka; ir taip pagamintą eritropoetiną atskiria nuo ląstelių ir terpės, o 3 lentelė įeina į šio apibrėžties punkto apimtį.
3. Eritropoetino gamybos būdas, besiskiriantis tuo, kad jį sudaro auginimas tinkamoje terpėje eukariotinių šeimininko ląstelių, turinčių iš esmės tokią pačią DNR seką, kaip parodyta 4 lentelėje, operatyviai sujungtą su ekspresiją kontroliuojančia seka; ir taip pagamintą eritropoetiną atskiria nuo ląstelių ir terpės, o 4 lentelė įeina į šio apibrėžties punkto apimtį.
4. Būdas pagal 2 arba 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad šeimininko ląstelės yra žinduolių ląstelės.
5. Būdas pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad žinduolių ląstelės yra 3T3 ląstelės.
6. Būdas pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad žinduolių ląstelės yra kiniškojo žiurkėno kiaušidžių (CHO) ląstelės.
7. Būdas pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR seka yra vektoriuje, kuri be to dar turi jaučio papilomos viruso DNR.
8. Farmacinė kompozicija su farmaciniu požiūriu tinkamu užpildu, besiskirianti tuo, kad į jos s-udėtį įeina terapiškai efektyvus eritropoetino kiekis, pagamintas pagal būdą, išdėstytą 2-7 punktuose.
9. Rekombinantinis DNR plazmidės vektorius, turintis kDNR kloną, X.- HEP0FLI3.
10. Mikroorganizmas arba ląstelių linija, transformuoti vektoriumi, aprašytu 9 punkte.
11. Mikroorganizmas arba ląstelių linija pagal 10 punktą, besiskiriantys tuo, kad pasirinkti iš E. coli, mielių, žinduolių arba vabzdžių ląstelių.
12. Mikroorganizmas arba ląstelių linija pagal 11 punktą, besiskiriantys tuo, kad minėtos ląstelės yra 3T3, C127 arba CHO ląstelės.
13. Biologiškai aktyvus žmogaus eritropoetinas, besiskiriantis tuo, kad pagamintas auginant kontroliuojamose sąlygose in vitro mikroorganizmus arba ląstelių liniją pagal 11 punktą.
14. Rekombinantinis DNR vektorius, į kurio sudėtį įeina genominis DNR klonas, besiskiriantis tuo, kad turi nukleotidų seką, kuri pateikta 4 lentelėje, o 4 lentelė įeina į šio apibrėžties punkto apimtį.
15. Žinduolių ląstelių linija, transformuota vektoriumi pagal 14 punktą.
16. Ląstelių linija pagal 15 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtos žinduolių ląstelės yra CHO ląstelės.
17. Biologiškai aktyvus žmogaus eritropoetinas, besiskiriantis tuo, kad pagamintas auginant kontroliuojamose sąlygose in vitro ląstelių liniją pagal 15 punktą.
18. kDNR seka, kurios sudėtyje yra DNR seka, apimanti seką nuo 1 iki 166 amino rūgšties, kaip parodyta 3 lentelėje, o 3 lentelė įeina į šio apibrėžties punkto apimtį.
19. kDNR seka pagal 18 punktą, besiskirianti tuo, kad jos sudėtyje yra DNR seka, koduojanti lyderinę amino rūgščių seką Met Gly Leu Gly, parodytą 3 lentelėje, o 3 lentelė įeina į šio apibrėžties punkto apimtį.
20. Rekombinantinis DNR vektorius, kurio sudėtyje yra heterologinis promotorius ir kDNR seka pagal 18 arba 19 punktą.
21. Mikroorganizmas arba ląstelių linija, transformuoti vektoriumi pagal 20 punktą.
22. Mikroorganizmas arba ląstelių linija pagal 21 punktą, besiskiriantys tuo, kad pasirinkti iš E. coli, mielių, žinduolių arba vabzdžių ląstelių.
23. Mikroorganizmas arba ląstelių linija pagal 22 punktą, besiskiriantys tuo, kad minėtos ląstelės yra 3T3, C127 arba CHO ląstelės.
24. Žinduolių ląstelė, kurios sudėtyje yra jaučio papilomos viruso DNR ir DNR seka, koduojanti eritropoetiną (EPO).
25. Ląstelė pagal 24 punktą, besiskirianti tuo, kad minėta ląstelė yra C127 arba 3T3 ląstelė.
26. Ląstelė pagal 25 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtą eritropoetiną (EPO) DNR per transkripciją kontroliuoja pelės metalotioneino promotorius.
27. Ląstelė pagal 25 punktą, besiskirianti tuo, kad turi savo sudėtyje DNR iš pdBPV-MMTneo (342-12).
28. Eritropoetinas, gaminamas pagal būdą, nurodytą 3 arba 4 punkte, besiskiriantis tuo, kad jo specifinis aktyvumas yra didesnis nei maždaug 200 000 VV/mg baltymo.
29. Eritropoetinas, pagal 28 punktą, besiskiriantis tuo, kad jo specifinis aktyvumas yra didesnis nei maždaug 275 000 VV/mg baltymo.
30. Eritropoetinas, gaminamas pagal būdą, nurodytą 3 arba 4 punkte, besiskiriantis tuo, kad jo specifinis aktyvumas yra maždaug 275 000 - 300 000 VV/mg baltymo.
31. Eritropoetinas, pagal 28, 29 arba 30 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra O-glikozilintas.
32. Būdas pagal 2 arba 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad kultūrinėje terpėje yra fetalinio serumo.
33. Būdas pagal 32 punktą, besiskiriantis tuo, kad šeimininko ląstelės yra žinduolių ląstelės.
34. Būdas pagal 33 punktą, besiskiriantis tuo, kad žinduolių šeimininko ląstelės yra COS, CHO, C127 arba 3T3 ląstelės.
35. Biologiškai aktyvus eritropoetinas, besiskiriantis tuo, kad jis gaminamas pagal 32-34 punktus.