[LT] Biologiškai aktyvi medžiaga (BAM), pasižyminti imunomoduliuojančiomis savybėmis, turinti susmulkinto gyvulio audinio ingredientų vandenyje tirpių organinių junginių hidrolizės produktų; hidrolizės produktų sudėtyje turi termostabilius, žemamolekulinius morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentus (MGLK), modifikuotus embriogenezės ir/arba proliferacijos ir/arba ląstelių diferencijacijos, ir/arba patologijos, lydimas ir/arba jau po įvykusios audinių regeneracijos ir/arba reparacijos, procesuose.@Biologiškai aktyvios medžiagos, turinčios imunomoduliuojančių savybių, gavimo būdas apima plautos žaliavos susmulkinimo, gautų ingredientų hidrolizės, hidrolizės produktų filtracijos ir supernatanto išskyrimo operacijas. Žaliavai naudojami modifikuoti MGLK ir prieš hidrolizę atliekama jos homogenizacija ir valymas nuo nesuirusių audinio elementų. @Preparatas žmonių ir gyvūnų fiziologinei būklei normalizuoti susideda iš BAM ir užpildo. BAM hidrolizės produktų sudėtyje turi termostabilius žemamolekulinius modifikuotus MGLK 0,001-85 %, o likusi dalis - užpildas.@Preparatas panaudojamas žmonių fiziologinei būklei normalizuoti farmaciškai efektyviu kiekiu.
[EN] Biologically active material (BAM) characterized in immunomodulating property comprising thermostable low molecular weight components of morphoplasma and glycocalyx cells (CMGC) which have been modified during the processes of embryogenesis and/or cell proliferation and/or cell differentiation and/or pathology after and/or together with the processes of tissue regeneration and/or reparation. Process for preparing biologically active material comprises steps of crushing pre-washed raw materials, hydrolysis of ingredients obtained, filtration of the hydrolysis products and separation of supernatante. The raw materials are modified CMGC. Homogenization and separation of undisintegrated particles of CMGC takes place before the stage of hydrolysis. The preparation for the human and animals physiological state conditioning consists of 0,001-85 % BAM in the form of thermostable low molecular weight CMGC components and an excipient.
[0001] Išradimas skirtas farmacinės chemijos pramonei, būtent aktyvių medžiagų, turinčių imunomoduliuojančių savybių sukūrimas ir jų panaudojimas medicinoje ir veterinarijoje žmonių ir gyvūnų fiziologinei būklei harmonizuoti, gyvūnų produktyvumui skatinti.
[0002] Biologiškai aktyvi medžiaga pagal šį išradimą priskiriama gyvulinės kilmės medžiagoms, kurių sudėtyje yra organiniai junginiai. Žmogaus ir gyvūnų organizme esantys įvairios kilmės patologiniai sutrikimai sukelia fiziologinės būklės parametrų nukrypimus nuo normos. Šiuo atveju gydymas, tame tarpe ir/arba profilaktika pasireiškia fiziologinės būklės parametrų palaikymu (jeigu jie nukrypę nuo normos), tokiu poveikiu veikiamas į organizmą, kad jie normalizuotųsi.
[0003] Išradimų grupė apima biologiškai aktyvią medžiagą, jos gavimo būdą ir jos preparatą, naudojamą organizmo fiziologinei būklei normalizuoti.
[0004] Normalizuoti žmogaus ir gyvūnų fiziologinę būklę galima dviem kryptim, pirma tiesiogiai veikiant į patologijas, ir antra, betarpiškai veikiant sistemas, organus ir organizmo audinius atsakančius už homeostazės parametrų palaikymą normoje.
[0005] Hormoninių preparatų, mediatorių, augimo stimuliatorių įvedimas, chemoterapija ir panašios priemonės tiesiogiai veikia ląsteles - taikinius recepcijos pagalba.
[0006] Pavyzdžiui, diabeto gydymui skiriamas insulinas atstatantis kasos funkcijas; esant nervų sistemos funkciniam pažeidimui skiriami neuromediatoriai, normalizuojantys neuronų ribinį jautrumą ir atitinkamai gerinantys nervinių impulsų perdavimą; esant organizmo imuninės sistemos funkciniam sutrikimui naudojami imunomediatoriai koreliuojantys imuninius atsakymus.
[0007] Ligų gydymas tarpiniu veikimu į organus pasiekimas vidinių organizmo resursų mobilizacijos dėka.
[0008] Vykstant procesams, susijusiems su organų ir audinių regeneracija, vykstant uždegiminiams procesams stimuliuojama organizmo imuninė sistema.
[0009] su audinių ir organų regeneracija, jų reabilitacija, taip pat esant uždegiminiams ir infekciniams procesams. Dėka to pagerėja imuninė ir bendra organizmo būklė.
[0010] Žinoma biologiškai aktyvi medžiaga, gauta iš gemalinės medžiagos, pasižyminti imunomoduliuoj ančių veikimu, atstatanti organizmo fiziologinę būklę ir reguliuojanti ląstelių pasikeitimą (FR - A - 2413912). Biologiškai aktyvi medžiaga (toliau BAM) gauta iš tokių sudėtinių dalių - susmulkinto ir homogenizuoto gyvulinio audinio, išskirto iš gemalo ir sumaišyta su fiziologiniu serumu.
[0011] Kadangi medžiaga pasižymi palyginti aukštu imunomoduliuoj ančių veikimu, jos panaudojimas normalizuoja fiziologinę būklę, gydo, padidina gyvūnų produktyvumą, palyginus su kontroline grupe 5-15%
[0012] Žinomos BAM efektyvumas yra nepakankamas dėl to, kad kartu su imunomoduliuojančiais faktoriais savo sudėtyje turi imunodepresantų,
[0013] kurie kliudo pilnam imunomoduliuojančiam efektui pasireikšti. Nurodytos medžiagos imunomoduliuoj antis veikimas iš esmės yra rezultatas kartu veikiančių joje imunomoduliuoj ančių faktorių ir depresantų. Tokiu būdu, specifinis žinomos BAM aktyvumas, priklausantis nuo imunomoduliuoj ančių faktorių ir depresantų koncentracijų santykio, palyginti nedidelis dėl žymios depresantų koncentracijos jos sudėtyje.
[0014] Kitas žinomos BAM trūkumas yra padidintas kiekis jo sudėtyje stambiamolekulinių junginių, kurie yra imunogenai, iššaukiantys šalutines imunines reakcijas (alergiją, sulėtinto veikimo hiperjautrumą ir 1.1.)
[0015] Aukščiau parašytos žinomos BAM trūkumai žymia dalimi priklauso nuo medžiagos gavimo būdo, kur technologinis procesas baigiasi žaliavos iš gyvulinio audinio smulkinimo ir homogenizacijos operacija, dėl ko būtinai jos sudėtyje atsiranda didelis kiekis depresantų ir stambiamolekulinių junginių.
[0016] Taip pat žinoma B AM, turinti imunomoduliuoj ančių savybių, normalizuojanti fiziologinę organizmo būklę, gaunama iš susmulkinto ir homogenizuoto audinio, išskirto iš gyvūnų gemalinio audinio ekstrakto pavidale (EP-A-0249563).
[0017] BAM gaunama sekančiais etapais: gyvulinio audinio susmulkinimas ir homogenizacija, netirpių junginių pašalinimas ir ekstrahuotos ištirpintos medžiagos panaudojimas kaip galutinio produkto (EP-A-0249563).
[0018] Medžiagos, gautos aprašytu būdu, specifinis aktyvumas pasireiškiąs kaip rezultatas tų imunostimuliuojančių ir imunoinhibuojančių efektų rezultatas, taip pat yra nepakankamas.
[0019] Gavimo būdas pasižymi tuo, kad ekstrakte yra tik tirpūs baltymai, o struktūriniai baltymai pašalinti, kas žymiai sumažina imunostimuliuoj ančių faktorių kiekį medžiagos sudėtyje.
[0020] Taip pat žinoma BAM, gauta iš susmulkinto ir homogenizuoto gyvulinio audinio, gauto ekstrakto pavidale iš audinio organų, sudarančių imuninę sistemą (užkrūčio liaukos, blužnies ir limfmazgių), termo-stabilių komponentų arba hormonus gaminančių audinių (placenta) organizmo būklei normalizuoti, tame tarpe gyvulių rezistentiškumui ir produktyvumui padidinti (SU-A-1442064).
[0021] Žinoma BAM skirta imuninės T-sistemos reguliavimui ir ją panaudojant praktiškai neiššaukiamos jokios imuninės reakcijos (alergija, lėto veikimo hiperjautrumas ir t.t.). Jos specifinis aktyvumas, palyginus su jau paminėtomis BAM, yra aukštesnis dėl pasireiškiančio kiekio imunostimuliuoj ančių faktorių.
[0022] Panaudojama žaliava, o taip pat prieš hidrolizę operacijų, skirtų jos homogenizacijai ir išvalymui nuo nesuardytų audinio elementų ir iš to sekančiu supernatanto turinčio ingredientų su morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentais, nebuvimas neleidžia gauti galutinio produkto su paminėtų komponentų aukštomis (>30%) koncentracijomis, o taip pat sumažinti imunodepresantų, neutralių ir balastinių junginių kiekį.
[0023] ŽV inomas vaistinis preparatas žmogaus ir gyvuli1 ų fiziologi(nei organizmo būklei normalizuoti iš gyvulio audinio sudėtinių hidrolizės produktų dalių, išreikštų organiniais junginiais, kuris uždedamas ant pakenktų kūno vietų
[0024] (US-A-4455302). Be išvardintų trūkumų vaistinio preparato iš žinomos BAM yra tai, kad organizmo imuninės sistemos stimuliacija galima tiktai lokaline aplikacija ant traumuotų kūno vietų. Todėl tokio preparato aktyvumas yra palyginti nedidelis. Nurodyti trūkumai dalinai pašalinti žinomame preparate, pasižyminčiame imunomoduliuojančių veikimu,
[0025] skirto žmogaus ir gyvūnų organizmo fiziologinės būklės normalizavimui, turinčiam veikiančią medžiagą, kuri yra biologiškai aktyvi medžiaga, sudaryta iš gyvulio audinio sudėtinių dalių hidrolizės produktų ir užpildo,
[0026] kuri įvedama injekcijų pavidale į organizmą per raumenis 0,75-1,0 m/g kūno svorio kas 3 dienos, ir tokiu būdu jos naudojimas nelokalizuotas (SU-A-904707).
[0027] Žinomo gydomojo preparato panaudojimo trūkumas yra tai, kad jis įvedamas į organizmą tik injekcijos būdu, ir taip pat jo panaudojimas, dėl jo sudėtyje esančių imunogenų sukelia šalutinius poveikius (alergiją, sulėtinto veikimo hiperjautrumąir 1.1.).
[0028] Panaudojimas gyvulinio audinio, turinčio palyginti didelį kiekį imunodepresantų, kaip žaliavos ir negalėjimas pagaminimo metu pagerinti BAM, kurios pagrindu pagamintas gydomasis preparatas, sudėties, labai
[0029] jo sudėtyje yra didelis kiekis įvairių biologiškai aktyvių medžiagų, kas sąlygoja iš vienos pusės perdozavimo pavojų, šalutinių efektų atsiradimą,
[0030] Žvinomas žmogaus ir gyvūnų fiziologinės būklės normalizavimo būdas, susirgimų iššauktų patalogiškai pasikeitusių ir/arba svetimų ląstelių, mikroorganizmų ir jų gyvybingumo produktų, atveju, numatantis preparato sudaryto iš gyvulinio audinio sudėtinių dalių hidrolizės produktų, įvedimą į organizmą. (SU-A-904707).
[0031] Žinomas būdas yra mažai efektyvus dėl aukščiau aprašytų preparato trūkumų ir tame tarpe dėl to, kad jį reikia naudoti didelėmis dozėmis (iki 10 mg/kg) dėl ko gali būti perdozuojamas ir iššaukti šalutinius poveikius.
[0032] Aukščiau paminėti trūkumai yra pašalinami pareikštoje biologiškai aktyvioje medžiagoje, turinčioje imunomoduliuojančią savybę, pareikštame šios medžiagos gavimo būde ir šios medžiagos preparate, o taip pat jos panaudojime organizmo fiziologinei būklei normalizuoti.
[0033] Išradimo tikslas yra biologiškai aktyvios medžiagos turinčios imunomoduliuojančią savybių, jos gavimo būdas ir šios medžiagos vaistinio preparato jos pagrindu, kurie būtų aukšto biologinio aktyvumo, be toksiško poveikio ir kitų šalutinių efektų, o taip pat galutinio produkto sukūrimas su iš anksto numatytomis savybėmis.
[0034] Išradimo tikslas pasiekiamas tuo, kad biologiškai aktyvi medžiaga, turinti imunomoduliuojančių savybių, medžiaga sudaryta iš susmulkinto gyvulinio audinio sudėtinių dalių vandenyje tirpių hidrolizės produktų, išreikštų organiniais junginiais, turinčių savo sudėtyje termostabilių žemomolekulinių morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų, ir modifikuotų embriogenezės ir/arba poliferacijos procesų metu, ir/arba ląstelių diferenciacijos ir/arba patalogijos prieš ir/arba lydimos regeneracijos ir audinio reparacijos.
[0035] Reikia turėti omenyje, kad terminas "morfoplazma" čia naudojamas plačiąja prasme ir apima struktūrinę citoplazmos ląstelių dalį, pateikiamą ląstelinėmis organelomis, membranomis, citoskeletais ir panašiomis ląstelinėmis struktūromis (Yasuo Karaba. Biomembranos. M. Vysšąja škola - 1995 13-15), o terminas "glikokaliksas" naudojamas žymėti angliavandenių turinčiam sluoksniui, prisišliejusiam prie išorinės plazminės membranos ląstelės (B. Alberts, D. Brei, Jš Liuis. Molekuliarnaja biologija kletki. "Mir" - 1968 m. 97p.).
[0036] Tikslas pasiekiamas ir todėl, kad pareikštos BAM modifikuotų morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų sudėtyje yra termostabilūs komponentai (esant temperatūrai <= 120°C). Be to termostabilių komponentų kiekio santykis su modifikuotais elementais sudaro 30-100% masės.
[0037] Be to, žinomos BAM modifikuotų morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų sudėtyje yra žemamolekuliniai komponentai su molekuline mase M<=10,0 kDa.
[0038] Be to žemamolekulinių komponentų kiekio santykis su modifikuotais morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentais sudaro 30-100%
[0039] Išradimo tkslas pasiekiamas ir tuo, kad pareikšta medžiaga hidrolizės produktų su modifikuotais morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentais sudėtyje turi organinių junginių, sekančiu masių santykiu,
[0040] masė (%)
[0041]
[0042] Tikslas pasiekiamas ir tuo, kad pareikšta medžiaga hidrolizės produktų su modifikuotais morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentais sudėtyje turi organinių junginių, sekančiu masių santykiu, masė (%)
[0043]
[0044] Tikslas pasiekiamas ir tuo, kad B AM, turinčios imunomoduliuoj ančių savybių, gavimo būde, kur atliekamas praplautos žaliavos iš gyvulinio audinio susmulkinimas, gautų ingredientų hidrolizė, po to hidrolizės produktų atskyrimas, jų filtracija ir supernatanto, kaip galutinio produkto išskyrimas, kaip žaliavą naudoja modifikuotą embriogenezės ir/arba poliferacįjos procesų metu, ir/arba ląstelių diferenciacijos, ir arba patologijos, prieš ir/arba lydimos regeneracijos ir/arba audinio reparacijos, modifikuotą gyvulinį audinį, ir prieš hidrolizę atlieka jos homogenizaciją ir nesuirusių audinių elementų valymą, išskiriant supernatantą su morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentais.
[0045] Žaliavai naudojami audiniai embrioninis audinys, diferencijuotų timocitų užkrūčio liaukos audinys, sėklidžių spermatogonijos ir spermatocitai, placenta, žarnyno epitelinis audinys, kaulų čiulpų ląstelės, regenerauojantis odos audinys, atsistatantis kepenų audinys, varliagyvių galūnių atsistatantis audinys, patologiškai pakitęs audinys, paimtas iki regeneracijos stadijos.
[0046] Be to, po homogenizacijos fiziologiniame ir/arba buferiniame tirpale, atliekamas nesuirusių audinio elementų valymas, filtruojama ir centrifuguojama, greičiu 150-250 g per 10-15 min.
[0047] Be to, žaliavos iš gyvulinio audinio susmulkinimas atliekamas prieš homogenizaciją, vykdomas iki ląstelės suirimo, po to ekstrahuojamas papildomai praplaunant ir filtruojama ir/arba centrifuguojama, greičiu 300-
[0048] 15000 g per 10-20 min. ir išskiriama jau ekstrahuota susmulkinta medžiaga.
[0049] Tikslas pasiekiamas todėl, kad hidrolizuotų ingredientų sudėtyje morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų santykis yra nuo 30-
[0050] 45°C temperatūroje. Be to, hidrolizė gali būti atliekama ir esant konservantui.
[0051] Tikslas pasiekiamas dar ir todėl, kad ingredientų hidrolizės produktus termiškai apdirbama Tn=60-120°C temperatūroje iki pilnos termolabilių junginių denatūracijos ir filtruojama ir/arba centrifuguojama, greičiu 1500
[0052] g per 20-40 min., išskiriamas supernatantas, turintis termostabilių galutinio produkto komponentų.
[0053] pusiau pralaidžią plėvelę ir/arba ultrafiltruoja, ir/arba gelfiltruoja iki išskiriama frakcija, kaip galutinis produktas, turinti žemamolekulinių morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų su molekuline mase M< lOkDa.
[0054] Tikslas pasiekiamas ir todėl, kad žinomas preparatas žmonių ir gyvulių organizmo būklei normalizuoti, turintis biologiškai aktyvią medžiagą gyvulinio audinio ingredientų hidrolizės produktų pagrindu, ir užpildą, ta biologiškai aktyvi medžiaga hidrolizės produktų sudėtyje turi termostabilius, žemamolekulinius morfoplazmos ir gliukokalikso ląstelių komponentus, modifikuotus embriogenezės ir/arba poliferacijos procesų metu, ir/arba ląstelių diferenciacijos, ir/arba patologijos, prieš ir/arba lydimos regeneracijos ir/arba audinio reparacijos, ir jų kiekis preparate sudaro 0,001-85,0 masės (%), o visa kita - užpildas.
[0055] Tikslas pasiekiamas ir tuo, kad pareikštas biologiškai aktyvios medžiagos preparatas hidrolizės produktų su modifikuotais morfoplazmos ir gliukokalikso ląstelių komponentais sudėtyje turi organinių junginių, sekančiu masių santykiu, masė (%)
[0056]
[0057] Tikslas pasiekiamas tuo, kad biologiškai aktyvi medžiaga (vaistas) turi organinių junginių sekančiu masių santykiu:
[0058]
[0059] Preparato užpildu gali būti natrio chlorido fiziologinis tirpalas ir/arba druskos buferio tirpalas, ir/arba angliavandeniniai junginiai, ir/arba mineralinės, gyvulinės, augalinės ir sintetinės kilmės riebalai, ir jų mišiniai.
[0060] Tikslas pasiekiamas ir tuo, kad žmogaus ir gyvulių susirgimų, susijusių su patologiniais pakitimais ir/arba svetimos prigimties ląstelėmis mikroorganizmais ir/arba gyvybingumo palaikymo produktais, fiziologinei būklei normalizuoti naudojamas gyvulinės medžiagos ingredientų hidrolizės produktų preparatas, ir tas preparatas yra biologiškai aktyvios medžiagos, turinčios hidrolizės produktų sudėtyje modifikuotus audinius, paveiktus embriogenezės ir/arba poliferacijos procesuose, ir/arba ląstelių diferencijacijos, ir/arba patologijos paveiktos prieš ir/arba lydimos regeneracijos, ir/arba audinio reparacijos, morfoplazmos ir gikokalikso ląstelių komponentus, kompozicija, 0,001-85,0 masės (%) ir užpildas, 15,0-99,999 masės (%). Preparatas naudojamas injekcijomis į raumenis 0,005-0,5 mg/kg svorio, intervalu 1-7 dienas, ir/arba naudojamas inhaliacijoms 0,012-0,12 mg/kg kas 4-48 valandas, ir/arba sublingvaliai 0,012-0,12 mg/kg kas 4-48 valandas, ir/arba geriamas 0,02-1,0 mg/kg kas 1-10 dienų, ir/arba interaliai piliulėmis 0,02-1,0 mg/kg kas 1-10 dienų,
[0061] ir/arba kompresais, žvakės, tepalai dedami ant pūlinio ar žaizdos kas 1-10 dienų, - iki fiziologinės būklės parametrų normalizacijos.
[0062] Be to, žmonių ir gyvulių fiziologinė būklė normalizuojama stimuliuojant imuninę sistemą, visų pirma aktyvinant retikuloendotelinę sistemą, T-, B-sistemas, neutrofilus ir/arba natūralių kilerių populiaciją.
[0063] Nustatyta, kad pareikštos BAM gautos nurodytu būdu praktiškas efektyvumas pasireiškia aukštu biologiniu aktyvumu, ir visų pirma padidintu imunomoduliuojančių efektu.
[0064] Aktyvinant imuninę sistemą, ir visų pirma makrofagų granulocitų eilės ląsteles, pareikšta BAM ir jos preparatas: 1) veikia ne į konkrečią patologiją, o mobilizuodami vidinius rezervus, normalizuojančius visus homeostazės parametrus, tame tarpe ir patologiją, gerina bendrą organizmo fiziologinę būklę. Be to, koreguoja patalogijų sukeltus nukrypimus nuo normos be šalutinio poveikio. Pareikšta BAM, skirtingai nuo kitų vaistinių preparatų, normalizuodama pakitusius parametrus, nekenkia kitiems organizmo homeostazės parametrams. 2) turi kompleksišką veikimą, kuris leidžia išplėsti BAM panaudojimo sritis eilei susirgimų, kuriuos kontroliuoja imuninė sistema, gydyti 3) turi tokį veikimo aktyvumo laipsnį, nukreiptą homeostazės, kuri koreliuoja nukrypimus nuo normos, parametrų normalizacijai.
[0065] Nurodyti rezultatai pasiekiami dėl įpatingų pareikštos BAM ir jo preparato savybių.
[0066] Nustatyta, kad modifikuotų morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų kiekis padidinamas, panaudojant gyvulinį audinį, paveiktą embriogenezės ir/arba proliferacijos procesuose, ir/arba diferenciacijos, ir/arba patologijos, prieš ir/arba lydimos regeneracijos ir/arba audinio reparacijos.
[0067] - sėklidžių spermatogonijos ir spermatocitai, kaulų čiulpų ląstelės, žarnyno epitelinis audinys
[0068] po dalinės hepatektomijos arba po apsinuodijimo, pavyzdžiui CCI4, regeneruotas odos audinys, o taip pat audinys paveiktas patologijos, pavyzdžiui, paveiktas gangrenos, chemiškai arba termiškai apdorotas.
[0069] Paminėtų audinių, kaip žaliavos panaudojimas, suteikia B AM laukiamas savybes.
[0070] Ši modifikuotų morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų savybė įgalina juos panaudoti pareikštos B AM ir preperato jos pagrindu gamyboje.
[0071] Preparatą įvedus į žmogaus ar gyvulio organizmą stimuliuojama atsakomoji organizmo reakcija į patologiją.
[0072] ir/arba nurodytų audinių nukrypimuose nuo normos yra specialūs komponentai, kurie įeina į morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių struktūrą,
[0073] ir keičiantis ląstelių fiziologiniam statusui pasiduoda modifikacijai. Pareikšta B AM ir jos preparatas turi modifikuotus morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentus, dėl ko juos naudojant stimuliuojama atsakomoji organizmo reakcija.
[0074] Prieš hidrolizę atliekamas susmulkinto audinio nuplovimas nuo audinio ekstrakto komponentų ir kraujo, ir kartu vykdoma homogenizacija, po kurios pašalina nesuardytus audinio elementus, suteikia pareikštos BAM ir jo preparato morfoplazmos ir glikokalikso ląstelėms aukštą koncentraciją
[0075] (30-60%), o taip pat sumažina imunodepresantų, neutralių ir balastinių junginių kiekį. Tai padidina organizmo imuninį atsakymą.
[0076] Organizmo atsakomoji reakcija padidėja, įvedant į organizmą medžiagą, kuri savo sudėtyje turi termostabilius morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių žemamolekulinius su molekuline mase M<=10 kDa komponentus (stabilius TM<120° C kaitinimo temperatūroje).
[0077] Pareikšta BAM naudojama kaip veiklusis pagrindas preparate, o užpildai naudojami priklausomai nuo panaudojimo.
[0078] Vidiniam panaudojimui preparatas naudojamas injekcijomis, o užpildas - fiziologinis natrio chlorido tirpalas arba buferinis druskos tirpalas.
[0079] Išviršiniam panaudojimui, be aukščiau išvardintų tirpalų, užpildui naudojami geliai - augaliniai ar gyvuliniai angliavandenių junginiai, pavyzdžiui, medus, sultys, augalų minkštimas ir panašiai, ir/arba tepalai - gyvulinės, augalinės arba sintetinės kilmės riebalai, arba jų mišiniai. Preparato efektyvumas labai priklauso nuo BAM sudėties. Dėl to galima pasiekti reikiamą efektyvumą žymiai sumažinus preparato veikliojo pagrindo kiekį, dėl ko išvengiama perdozavimo ir šalutinio poveikio, sumažėja preparato kaina.
[0080] Be to, pastebėta, kad aukščiau aprašytos preparato savybės leidžia panaudoti jį fiziologinei organizmo būklei normalizuoti, įvedant į organizmą bet kokias dozes, o būtent nuo 0,001 iki kelių g/lkg svorio.
[0081] Nurodytos savybės iliustruojamos konkrečiuose išradimo panaudojimo pavyzdžiuose: 1,2,4,8,9,12,16,18-25 irkt.
[0082] Susirgimai, sukeliami patologinių pakitimų ir/arba svetimų ląstelių, mikroorganizmų ir/arba jų veiklos produktų, gydomi nauju preparatu, konkrečiomis dozėmis ir konkrečiais būdais iliustruoti konkrečiuose išradimo panaudojimo pavyzdžiuose: 3,4,7,8,11-13,15-17 irkt.
[0083] Biologiškai aktyvi medžiaga, turinti imunomoduliuojančių savybių, gaunama sekančiu būdu.
[0084] Žaliavai naudojamas gyvulinis, embriogenezės ir/arba proliferacijos procesų metu, ir/arba ląstelių diferencijacijos ir/arba patologijos metu prieš ir/arba kartu su audinio regeneracija ir/arba reparizacija, modifikuotas audinys.
[0085] Gyvulinis audinys plaunamas, smulkinamas, po to homogenizuojamas fiziologiniame ir/arba buferiniame tirpale iki visiško ląstelių suirimo, o homogenizuotas mišinys išvalomas nuo nesuirusių medžiagos elementų filtravimo ir/arba centrifugavimo metu, išskiriant morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių turinčius ingredientus, o po to hidrolizuojamas. Hidrolizės produktai po centrifugavimo ir/arba filtracijos naudojami kaip galutinis produktas, organizmo fiziologinei būklei normalizuoti.
[0086] Galutinio produkto efektyvumas priklauso nuo modifikuotų morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų kiekio jame. Kiekis padidinamas, optimaliai pasirenkant žaliavą su intensyviais modifikacijos procesais audinyje, ir optimalaus jo gavimo būdo.
[0087] Žaliava parenkama remiantis ta aplinkybe, kad morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentai reaguodami į fiziologinės būklės ląstelių pakitimus, pakeičia savo struktūrą, ir tas pakitimas iššaukia audinio imuninį pakitimą o tuo pačiu ir organizmo atsakomąsias imunines reakcijas. Nustatyta, kad modifikuotos struktūros imunogeniškumas išlaikomas visų stadijų procesuose (embriogenezė ir pan.).
[0088] Gyvuliniu audiniu naudojamas
[0089] - prieškrūčio liaukos diferencijuoti timocitai (ląstelių diferencijacijos procesas) - sėklidžių spermatogonijos ir spermatocitai, kaulų čiulpų ląstelės, epitelinis žarnyno audinys (ląstelių proliferacijos ir diferenciacijos procesai)embrioninis audinys, placenta (proliferacijos, diferenciacijos, embriogenezės procesai) - varliagyvių galūnių atsistatantis audinys, regeneruotos žiurkių kepenys po dalinės hepatektomijos arba po apsinuodijimo, pavyzdžiui, CCI4, regeneruotas odos audinys, o taip pat audinys paveiktas patologijos, pavyzdžiui, paveiktas gangrenos, chemiškai arba termiškai apdorotas (įvairių procesų kombinacija).
[0090] Nustatyta, kad charakteirngiausia aukščiau aprašytų įvairių audinių savybė
[0091] yra jų morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių struktūrinių komponentų pakitimas, leidžiantis išdiferencijuoti nuo intaktinių arba ramybės organizmo audinio ląstelių.
[0092] Svi modifikuotų morfoplazmos ir gikokalikso ląstelių komponentų savybė nurodytuose audiniuose, leidžia juos panaudoti pareikštoje B AM, kurią
[0093] įvedus į organizmą suteikiama galimybė stimuliuoti atsakomąją organizmo reakciją į patologiją. Pagrindinę rolę vaidina organizmo imuninė sistema.
[0094] Geriausia panaudoti gyvulinį audinį, paimtą modifikacijos proceso inkremento stadijoje. Svi stadija nustatoma empiriškai pagal imuninio pakitimo charakterį. Embrioninio audinio panaudojimo atveju šis periodas atitinka pirmąją embriogenezės pusę. Regeneruotas žiurkių kepenis po dalinės hepatektomijos naudoja po 4-12 valandų, o regeneruotų galūnių panaudojimo atveju - blastemos susidarymo stadijoje.
[0095] Santykinis morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų kiekio padidėjimas pasiekiamas pagrindine sąlyga, t.y. nesuirusių audinio elementų pašalinimu.
[0096] Nesuirusių elementų valymas atliekamas centrifugavimo procese, greičiu 150-250 g per 10-15 min. Esant didesniam centrifugavimo greičiui ir ilgesniam laikui nusodinami morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių elementai, o esant lėtesniam negu 150 g per 10-15 min. - valymas neefektyvus.
[0097] Nesuirusių elementų valymas atliekamas filtravimo procese stambiaporiniu filtru, pavyzdžiui, per kelis marlės sluoksnius, per medvilninį audinį arba kaproninį tinklą.
[0098] Imunomoduliuojanti savybė galutiniame produkte sustiprinama tuo, kad prieš homogenizaciją, audinys susmulkinamas iki ląstelių pažeidimo, po to ekstrahuojamas papildomai praplaunant fiziologiniu tirpalu ir/arba filtruojamas organinės rūgšties tirpalu, ir/arba centrifuguojamas, greičiu 300-15000 g per 10-20 min. ir gautas ektraguotas susmulkintas audinys homogenizuojamas.
[0099] Be to, iš vienos pusės, pašalinama daugiau imunodepresantų, esančių kraujo serume ir audinio ekstrakte, o iš kitos pusės - santykinai padidinamas morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių kiekis.
[0100] Papildomas susmulkinto gyvulinio audinio prieš honogenizaciją praplovimas centrifuguojant, greičiu 300-15000 g per 10-20 min., įgalina kokybiškiau atskirti ekstraguotą audinį iš ekstrakto pramoninėmis sąlygomis.
[0101] Analogiškas efektas pasiekiamas filtruojant stambiaporiu filtru, pavyzdžiui, per kelis marlės sluoksnius, per medvilninį audinį arba per kaproninį filtrą.
[0102] Santykinį morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų audinio ingredientuose, išskirtuose hidrolizės pravedimui, nustato pagal baltymų ir angliavandenių ląstelių struktūrose, išlaisvintose nuo nesuirusio audinio,
[0103] Galutinio produkto efektyvumas žymia dalimi padidėja, naudojant žemamolekulinius morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentus.
[0104] Iš vienos pusės tai padeda išvengti nepageidaujamų reiškinių, o iš kitos pusės - gauti plataus veikimo profilio preparatą. Tuo tikslu audinio ingredientai, turintys modifikuotų morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių, hidrolizuojami suardant morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių stambiamolekulines struktūras į komponentus, turinčius mažesnę molekulinę masę. Hidrolizės produktų efektyvumas priklauso nuo hidrolizės specifikos, kuri priklauso nuo temperatūros - laiko charakteristikų.
[0105] Nustatyta, kad imunomoduliuojanti savybė, būtent dalinai žiurkių peritonealinio eksudato makrofagų aktyvumas ( in vitrol maksimaliai padidėja, kada hidrolizės pravedimo temperatūra T=4-45°C.
[0106] - esant temperatūrai Tp<4 °C žymiai pailgėja hidrolizės procesas, tai mažina ekonominį efektyvumą - esant temperatūrai Tp>45 °C sumažėja fermentų, katalizuojančių žaliavos hidrolizę, aktyvumas, ir pagreitėja aktyvių komponentų suirimo procesas.
[0107] Hidrolizės trukmė nustatoma pagal psiekiamą maksimalų imunomoduliuojantį efektą iš dalies, pagal peritonealinio eskudato makrofagų aktyvumą sutinkamai su NST-testu.
[0108] Santykinis hidrolizės produktuose žemamolekulinių komponentų kiekio padidėjimas atitinkamai stambiamolekulinių termolabilių junginių kiekiui pasiekiamas hidrolizato termišku apdirbimu iki pilnos termolabilių junginių denatūracijos, po to liekana pašalinama, centrifuguojant, greičiu 1500 g per 20-40 min. ir/arba filtracija. Supernatantas, turintis termostabilių morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų panaudojimas kaip galutinis produktas.
[0109] Hidrolizės produktai termiškai apdirbami Tpj>60-120 °C temperatūrų diapazone.
[0110] Esant Tpj<60 °C temperatūrai ne visi baltymai denatūruojami, dėl ko galutiniame produkte padidėja termolabilių junginių. Dėl to sumažėja medžiagos specifinis aktyvumas. Esant Tj^>120 °C temperatūrai, galutinio produkto peptidų ir angliavandenių komponentuose šuoliškai didėja struktūrinių pakitimų greitis, dėl ko blogėja produkto kokybė.
[0111] Po terminio apdorojimo, termostabilius komponentus pašalina centrifuguojant, greičiu ne mažesniu 1500 g per 20-40 min. Esant mažesniam centrifugavimo laikui, sumažėja denatūruotų termolabilių junginių pašalinimo lygis. Centrifugavimo laikas 20-40 min. yra optimaliausias.
[0112] Koaguliuotus denatūruotus termostabilius junginius galima atskirti nuo supernatanto, filtruojant per popierinį filtrą.
[0113] Galutinis produktas, turintis termostabilius marfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentus, pasižymi dideliu specifiniu aktyvumu. Jis gali būti naudojamas ir kaip priemonė injekcijoms tiek veterinarijoje, tiek ir medicinoje.
[0114] Tolimesnis B AM specifinio aktyvumo padidinimas pasiekiamas žemamolekulinių komponentų su molekuline mase M<10,0 kDa. Iš hidrolizės produktų dializės per pusiau persisunkiančią plėvelę ir/arba ultrafiltracijos, ir/arba gelfiltracijos būdu visiškai pašalinami stambiamolekuliniai junginiai, galintys sukelti šalutinius efektus.
[0115] Tokiu būdu pasiekiamas efektyvumas leidžia galutinį produktą naudoti medicinoje.
[0116] Pareikštą B AM, kaip veiklųjį pagrindą naudoja vaistinio preparato gamybai, kur preparato koncentracija priklauso nuo panaudojimo tikslo. Preparatuose, skirtuose gyvulių girdymui ir šėrimui, B AM koncentracija neaukšta, o preparatuose skirtuose injekcijoms, taip pat tepalams, geliams ir milteliams - didesnė.
[0117] Užpildai naudojami priklausomai nuo paskirties. Preparatuose skirtuose injekcijoms, inhaliacijoms, aplikacijoms ir intranazaliai naudojami natrio chlorido ir druskos buferinis tirpalai. Angliavandeniai junginiai užpildu naudojami preparatuose, skirtuose bičių maitinimui (pvz., 10% cukraus tirpalas) arba gelio paruošimui (pvz., medus, sultys ir augalų minkštimas). Tepalams užpildu naudojami mineralinės, gyvulinės, augalinės ir sintetinės
[0118] Žemiau aprašyti konkretūs pareikštų išradimų grupės gavimo ir panaudojimo pavyzdžiai, taip pat pateikti biologiškai aktyvių medžiagų kiekio ir savybių nustatymo metodai.
[0119] Pareikštos BAM gavimui buvo panaudotas embrioninis audinys, paimtas iš
[0120] Iš embriono, po jo dezinfekcijos silpname kalio permanganato tirpale (KMnO^) išpjaunamas raumeninis ir odos audinys, kepenys, blužnis, kasa,
[0121] 10 kg gauto faršo sumaišoma su 30 kg fiziologinio tirpalo ir homogenizuojama su peiliniais blenderiais iki vientisos masės. Mišinio valymui nuo nesuardytų audinio elementų panaudojama dekantacija, o gautas viršnuosėdinis skystis su audinio ingredientais, turinčiais morfoplazmos ir glilcokalikso ląstelių komponentais, autolizuojamos (Th=45 °C temperatūroje, 48 valandų bėgyje). Gautas hidrolizatas, filtruojamas per popierinį filtrą, o filtratas, turintis morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų, panaudojamas kaip galutinis produktas, kurio organinių junginių sudėtis ir specifinis aktyvumas parodyti 1 ir 2 lentelėse.
[0122] - užpildas, sumaišomas su 9 dalimis agurkų-kriaušių minkštimo ir naudojamas kaip gydomasis preparatas - gelio kaukė ant veido kosmetikos reikmėms.
[0123] Ilgam laikymui į gelį pridedama konservantų (nipaginas ir nipazolas masių santykiu 5:1) su galutine masės koncentracija 0,1 mas. %. Gelis dedamas ant veido 2-3 vai. Procedūra pakartojama 1-2 kartus per savaitę. Gydomasis efektas pasiekiamas po 4-10 seansų ir stebimas pagal odos būklę.
[0124] Embriogeninis audinys, gautas taip pat kaip 1 pavyzdyje, susmulkinamas. 10 kg gauto faršo sumaišoma su 30 kg fiziologinio skysčio ir homogenizuojama iki vientisos masės.
[0125] Kad pašalinti nesuirusius audinio elementus, homogenizuota medžiaga centrifiiguojama, greičiu 250 g per 10 min. Po centrifugavimo liekanos pašalinamos, o flotiruoti riebalai pašalinami, supernatantą filtruojant per medvilninę medžiagą (drobę). Į filtruotą homogenatą, turintį ingredientų su morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentais 30% masės, pridedama konservanto (chinozolo) iki galutinės koncentracijos 0,08 % masės. Po sumaišymo, homogenatas 6 savaites hidrolizuojamas Tp=4 °C temperatūroje.
[0126] Gautas hidrolizatas centrifuguojamas, greičiu 15000 g per 20 min. ir išskiriamas supernatantas su morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentais, jau kaip galutinis produktas, kurio organinių junginių sudėtis ir jų specifinis aktyvumas parodyti lentelėje 1 ir 2.
[0127] Gautas galutinis produktas, turintis B AM 1,0% masės, o likusi dalis - užpildas, naudojamas kaip vaistinis preparatas nusilpusių kailinių žvėrelių jauniklių išsaugojimui, o taip pat viščiukų inhaliavimui specialioje kameroje, kur jie laikomi 15-20 min. Kameroje preparatas išpurškiamas - 0,5 ml ant 1 m^ per 1 min. Procedūra kartojama 7 savaites. Efektas kontroliuojamas jauniklių kritimo skaičiaus sumažėjimu. Jauniklių kritimas aumažėja 30-40%.
[0128] faršas užliejamas dvigubu kiekiu fiziologinio skysčio ir sumaišomas. Gauta masė centrifuguojama, greičiu 1500 g per 20 min. Nuosėdos pašalinamos ir vėl sumaišoma su dvigubu kiekiu fiziologinio skysčio, ir vėl taip pat centrifuguojama. Faršo plovimo operacija atliekama 3 kartus. Po to 10 kg išplauto faršo sumaišoma su 30 kg centimoliariniu fosfatiniu druskiniu buferiniu tirpalu (0,01 M PBS) pH 7,2, turinčiu dukart pakeisto natrio fosfato centimoliarinį kiekį ir penkiolika centimolių natrio chlorido (0,01 M Na2HPC>4 ir 0,15 M NaCl), ir homogenizuojama koloidiniu malūnu iki vientisos masės. Nesuirusius audinio elementus nuosėdų pavidalu pašalina centrifuguojant, greičiu 150 g per 15 min.
[0129] Supernatantas, po flotiruojančių riebalų pašalinimo filtravimo būdu, apdorojamas konservantu iki galutinės koncentracijos 0,08% masės.
[0130] Sumaišytas homogenizatas, turintis 60% masės morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų, hidrolizuojamas 6 savaites temperatūroje Tp=4 °C. Gautas hidrolizatas centrifuguojamas, greičiu 1500 g per 40 min. iki išsiskirs supernatantas, turintis morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų, jau kaip galutinis produktas, kurio organinių junginių sudėtis ir jų specifinis aktyvumas parodyti 1 ir 2 lentelėse.
[0131] Galutinis produktas, turintis BAM 1,0 % masės kiekio, o likusi dalis - užpildas, panaudojamas kaip gydomasis preparatas veršeliams, sergantiems paragripu, gydyti injekcijomis atliekamomis į raumenis 0,05 ml/kg masės kas trečią dieną. Gydymo efektas pasireiškia po 1-5 injekcijų. Jis kontroliuojamas pagal temperatūrą ir virusų kiekį kraujyje.
[0132] 2-kart didesniu kiekiu 3% acto rūgšties ir sumaišomas. Mišinys vakuume filtruojamas per medvilninę medžiagą - siurbiamuoju filtru. Nuosėdos pašalinamos, vėl sumaišoma su dvigubu kiekiu fiziologinio tirpalo ir
[0133] centrifuguojama, greičiu 300 g per 20 min. 10 kg plauto faršo sumaišoma su 30 kg centimoliarinio fosfatinio druskinio buferinio tirpalo (0,01 M PBS) pH 7.2. turinčio centimoliarinį dukart pakeisto natrio fosfato ir 15 centimoliarinį natrio chlorido kiekį (0,01 M Na2HPO^ ir 0,15 M NaCl), ir homogenizuota masė filtruojama per medvilinę medžiagą (drobelę). Gautas filtratas papildomas konservantu 0,08 % masės. Sumaišytas homogenatas, turintis 50,0% masės morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų hidrolizuojamas Tp=20 °C temperatūroje 8 dienas. Toliau apdorojama kaip pavyzdyje 3.
[0134] Galutinio produkto organinių junginių sudėtis ir jo specifinio aktyvumo rodikliai parodyti 1 ir 2 lentelėse. Galutinis produktas, turintis B AM 1,0 masės % kiekio, o visa kita - užpildas, naudojamas dermatozėms gydyti.
[0135] Tepalo pavidalo preparatas, paruošiamas sumaišius lanoliną, vazeliną ir galutinį produktą BAM santykiu 1:3:1 masės dalių. Oda tepama tepalu kiekvieną dieną. Gydomasis efektas pasireiškė po 4-12 dienų ir kontroliuojamas pagal odos stovį.
[0136] Santykinis morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų kiekio procentais (pagal masę) su jungiamojo audinio komponentais ir audinio ingredientų ekstraktu, išskirtais hidrolizės pravedimui, nustatomas pagal išlaisvintose nuo nesuirusio audinio dalelių ląstelinėse struktūrose esančio baltymų ir angliavandenių kiekį.
[0137] Tuo tikslu išvalytas nuo nesuirusių audinio elementų kaip ir 1-4 pavyzdžiuose, homogenatas ultracentrifuguojamas, greičiu 100000 g per 60 min.
[0138] Baltymų kiekio visoje liekanoje santykis su kiekiu visame supernatante parodo baltymų morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų santykį su ekstrakto baltymais.
[0139] Baltymų kiekis liekanoje ir supernatante nustatomas po homogenato ultracentrifugavimo. Po supernatanto pašalinimo į 0,1 ml liekanos pridedama 4,9 ml fiziologinio tirpalo ir po suspendavimo, paimama 0,1 ml baltymų kiekiui nustatyti, fotometriškai, pagal tirpalo spalvos intensyvumą SDS-Louri metodu. (U.K. Laemmli. - Nature, - 1970, - V 227, - 5259 - p. 680-685).
[0140] ml fiziologinio tirpalo ir po sumaišymo paimama 0,1 ml baltymų kiekiui nustatyti, pagal SDS-Louri.
[0141] Jungiamojo audinio komponentų kiekis nustatomas aminorūgščių analizės metodu pagal oksiliziną ir oksipiroliną.
[0142] įeinančių į junginį su molekuline mase daugiau 0,8 kDa homogenate kiekį
[0143] reakcija su antronu po glikogeno granulių pašalinimo iš homogenato (S.Seifter, S.Dayton, C.Honiv - Arh. Biochemistry and Biophysical,-1950,- 25,- 1,-p. 191-200).
[0144] Tuo tikslu 20 ml audinio homogenatas sluoksniuojamas centrifugos vamzdeliuose 30 ml ant 5 ml sacharozės (d=l,40 tankumu) ir ultracentrifuguojamas, greičiu 100000 g per 60 min. Glikogenas, nusėdęs vamzdelių dugne, pašalinamas, o morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių
[0145] elementai atrenkami interfazėje ir, po plovimo nuo sacharozės, centrifuguojant fiziologiniame tirpale, ir naudojami tyrimams.
[0146] Angliavandenių kiekis tiriamuose pavyzdžiuose nustatomas pagal bendrą angliavandenių kiekį po hidrolizės ir laisvų angliavandenių - monomerų
[0147] kiekį. Pagal šių duomenų skirtumą matavimuose nustatomas laisvų angliavandenių kiekis įvairių junginių sudėtyje.
[0148] su 1 ml 4,0 N druskos tirpalu. Hidrolizuojama 105 °C temperatūroje 2 valandas, po to hidrolizatas vakuume garinamas eksikatoriuje su NaOH.
[0149] Išgarintas bandinys atskleidžiamas 1,0 ml distiliuoto vandens ir naudojamas tyrimams.
[0150] Laisvų angliavandenių kiekio, esančių BAM arba po rūgštinės hidrolizės nustatomos tokiu būdu: 1 ml bandinio sumaišomas su 1 ml distiliuoto vandens, po to maišant pastovioje -5 °C temperatūroje, pridedama 4 ml 0,2% antronovo reaktyvo, paruošto su 95 % sieros rūgšties (tLjSO^). Gautas mišinys kaitinamas 95 °C temperatūroje 10 min., ir atšaldžius nustatomas optinis tankis ties 620 nm bangos ilgiu. Standartu imamas 20 pg/ml gliukozės koncentrato. Gautos 1 ir 2 pavyzdžiuose B AM baltymų analizė - morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų - 37,6+-7,4%, o BAM gautos 3 ir 4 pavyzdžiuose - 51,8+-8,2%.
[0151] Čia ir toliau tekste, o taip pat lentelėse eksperimentiškai gauti dydžiai išreikšti vidurkiu su vidurkio nukrypimo ribomis, išskaičiuotais pagal Stjudento kriterijų.
[0152] Hidrolizės supernatantas, gautas 3 pavyzdyje, kaitinamas T^=55 °C, Th2=60 °C, Tpj3=95 °C, T^=120 °C ir T^=135 °C temperatūroje kaitinama iki pilnos hidrolizės produktų termolabilių junginių denatūracijos, po to centrifuguojama, greičiu 1500 g per 30 min. iki išsiskiria supernatantas, kaip galutinis produktas, turintis termolabilių marfoplazmos ir glikokalikso ląstelių.
[0153] Gautas galutinis produktas, kiekvienu atveju turi imunomoduliuojantį efektą, kurio reikšmės parodytos 3 lentelėje.
[0154] Švioje lentelėje parodytas BAM specifinio aktyvumo reikšmių pasiskirstymas, priklausomai nuo pasirinkto hidrolizato kaitinimo temperatūros diapazono ir už jo ribų. Optimali kaitinimo temperatūra yra T^=95 °C, kada gautas galutinis produktas turi maksimalų fermentinį ir fagocitarinį aktyvumą, 72,8% ir 64,3%.
[0155] th =55 °C temperatūroje specifinio aktyvumo dydis palyginus su kontroliniu vidutiniškai sudaro 61,1% pagal NST testą ir 52,3% - pagal fagocitus. Tj_j>120 °C temperatūroje vyksta šuoliškas peptidų ir turinčių angliavandenių junginių struktūrinis kitimas, dėl ko kinta galutinio produkto komponentų struktūrinis kitimas, o to pasekoje sumažėja BAM specifinis aktyvumas. T^=135 °C temperatūroje specifinis BAM
[0156] aktyvumas palyginus su kontroliniu vidutiniškai lygus 57,3%, pagal NST testą ir 43,0% - pagal fagocitus. Maksimalus B AM specifinis aktyvumas palyginus su kontroliniu pasiekiamas Tj_p60-120 °C temperatūroje, kurioje žiurkių peritonealinio eskudato makrofagų aktyvumas (įn_vitro) sudaro 72,8% - pagal fermentinį aktyvumą (NST testas), o pagal fagocitinį aktyvumą ( E. Coli) - 64,3%.
[0157] Hidrolizės supernatantas, gautas 3 pavyzdyje, kaitinamas T^=95 °C temperatūroje iki visiškos termolabilių elementų denatūracijos ir po atšaldymo centrifuguojamas, greičiu 1500 g per 40 min.
[0158] Denatūruotų junginių liekana pašalinama, o kaip galutinis produktas naudojamas supernatantas, kuris turi 60% masės termostabilių komponentų pagal peptidus atitinkamai hidrolizės produktams vandenyje tirpių junginių iki termoapdirbimo.
[0159] Organinių junginių kiekis hidrolizės produktuose ir gautos medžiagos aktyvumo rodikliai, gauti eksperimentiškai, parodyti 1 ir 2 lentelėse.
[0160] Galutinis produktas, turintis BAM 0,5% masės kiekio, o kita dalis užpildas, naudojamas karvių mastitams gydyti injekcijomis į raumenis 0,05 ml/kg svorio kas trečią dieną. Gydymo efektas stebimas po 1-4 injekcijų ir kontroliuojamas pagal tešmenį ir pūlingas išskyras.
[0161] 8 pavyzdys
[0162] Hidrolizato supernatantas, gautas 2 pavyzdyje, termiškai apdirbamas iki pilnos termolabilių junginių denatūracijos ir po atšalfymo centrifuguojamas, greičiu 50000 g per 20 min. Nuosėdos pašalinamos, o kaip galutinis produktas naudojamas supernatantas, kuris turi 30% masės termo stabiliųkomponentų pagal peptidus atitinkamai hidrolizės produktams vandenyje tirpių junginių iki terminio apdirbimo. Organinių junginių kiekis hidrolizės produktuose ir medžiagos specifinio aktyvumo rodikliai, gauti eksperimentiškai, nurodyti 1 ir 2 lentelėse.
[0163] Gautas galutinis produktas, turintis 0,5% BAM masės kiekio, o kita dalis - užpildas, naudojamas kaip gydomasis preparatas veršelių, sergančių paragripu gydymui injekcijomis į raumenis 0,05 ml/kg du kartus kas 14 dienų. Preparato panaudojimo efektyvumas registruojamas pagal susirgusių galvijų skaičių per mėnesį neviršijo 10%, o kontrolinis siekė net 22-28%.
[0164] Hidrolizatas, gautas 4 pavyzdyje, termiškai apdirbamas Th=95 °C temperatūroje iki visiškos termolabilių junginių denatūracijos ir po atšaldymo filtruojamas siurbiamuoju filtru per filtruojamą popierių. Filtratas, turintis 45% pagal peptidus termostabilių elementų atitinkamai hidrolizės produktams vandenyje tirpių junginių, naudojamas kaip galutinis produktas.
[0165] Organinių junginių kiekis hidrolizės produktuose ir medžiagos specifinio aktyvumo rodikliai, gauti ekperimentiškai, parodyti 1 ir 2 lentelėse.
[0166] Galutinis produktas, liofiliai išdžiovinamas ir sublingvaliai naudojamas kaip gydomasis perparatas moterų mastitams gydyti. Procedūra atliekama kiekvieną dieną. Gydyno efektas stebimas po 1-4 dienų ir kontroliuojamas pagal krūties stovį (sukietėjimus, pūlingas išskyras) ir kraujo tyrimus.
[0167] Supernatanto hidrolizatas, gautas 3 pavyzdyje, frakcionuojamas ultrafiltravimo įrenginyje "Anicon". Naudojami ultrafiltrai praleidžiantys junginius su molekuline mase mažesne arba lygia: 50,0 kDa, 10,0 kDa, 5,0 kDa, 1,0 kDa, 0,8 kDa, 0,5 kDa.
[0168] Gautų frakcijų, turinčių junginių su molekuline mase: 1) Mj>50,0 kDa, 2) 10,0kDa<M2<50,0 kDa, 3) M3<10,0 kDa, 4) M4<5,0 kDa, 5) M5<1,0 kDa, 6) M^<0,8 kDa, 7) M<y<0,5 kDa biologinis aktyvumas analizuojamas pagal sugebėjimą aktyvinti žiurkių peritonealinio eksudato makrofagus pagal NST-testą. Tyrimų rezultatai parodyti 4 lentelėje.
[0169] 1) specifinio aktyvumo pagal frakcijas pasiskirstymas turi išreikštą maksimumą, masių diapazone nuo 0,8 iki 10,0 kDa 2) specifinio aktyvumo sumažėjimas, esant molekulinei masei M>10,0 kDa susijęs su inhibitorių veikimu galutiniame produkte ir aktyvios substancijos koncentracijos sumažėjimu; 3) specifinio aktyvumo sumažėjimas, esant molekulinei masei M<0,8 kDa susijęs su aktyvios substancijos, oligomerinių junginių pavidale, M>0,8
[0170] Gautas ultrafiltratas, turintis žemamolekulinius morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentus M<=10,0 kDa, naudojamas kaip galutinis produktas, kur žemamolekuliniai komponentai su M<=10,0 kDa sudaro 60% masės pagal peptidus atitinkamai hidrolizės produktams vandenyje tirpių junginių po ultrafiltracijos.
[0171] Organinių junginių hidrolizės produktuose kiekis ir gautaos medžiagos specifinio aktyvumo rodikliai parodyti 1 ir 2 lentelėse.
[0172] Galutinis produktas, turintis BAM 0,1% masės kiekio, o kita dalis užpildas, naudojamas kaip vaistinis preparatas eksperimentams žiurkių hepatitui gydyti injekcijomis į raumenis 0,05 ml/kg kas antrą dieną
[0173] Hidrolizato supernatantas, gautas 2 pavyzdyje, dializuojamas 16-24 vai. per celofaninę plėvelę, fiziologiniu tirpalu, kurio 1 kg turi 0,8 g konservanto. Gautas dializatas naudojamas kaip galutinis produktas, kur žemamolekuliniai komponentai, kur M<10 kDa, sudaro 30% masės pagal peptidus atitinkamai produktams vandenyje tirpių junginių prieš dializę. Organinių junginių hidrolizės produktuose kiekis ir gautos medžiagos specifinio aktyvumo rodikliai parodyti 1 ir 2 lentelėse.
[0174] Galutinis produktas, turintis BAM 0,1% masės kiekio, o kita dalis - užpildas naudojamas kaip gydomasis preparatas injekcijomis veršelių homeostazės parametrams normalizuoti. Veršeliams, su nukrypimais nuo normos leidžiamos injekcijos [raumenis 0,05 ml/kg 1-2 mėnesius. Efektas kontroliuojamas veršelių svėrimu kas mėnesį. Paros prieauglis padidėja 47-70% palyginus su kontroliniu.
[0175] 13 pavyzdys
[0176] Hidrolizato supernatantas, gautas 7 pavyzdyje, gelfiltruojamas sefadekso G-25 d=26 mm diametro ir h=600 mm aukščio kolonėlėje, su decimoliariniu (0,01 M) fosfatiniu buferiniu tirpalu pH 7,2, turinčiu penkiolika centimolių natrio chlorido (0,15 M NaCl).
[0177] Hidralizato supernatanto frakcionavimas pagal molekulines mases atliekamas kolonėlės eliuacija tuo pačiu buferiniu tirpalu, ir eliuato chromatografinis profilis kontroliuojamas spektrometriškai, esant bangos ilgiui 280 nm.
[0178] Hidrolizato žemamolekulinių komponentų frakcija, turinti morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų, eliuuojama kaip galutinis produktas.
[0179] Organinių junginių hidrolizės produktuose kiekis ir gautos BAM specifinio aktyvumo rodiklis, gauti eksperimentiškai, parodyti 1 ir 2 lentelėse.
[0180] Galutinis produktas, turintis BAM 0,1% masės kiekio, o kita dalis - užpildas, naudojamas kaip vaistinis preparatas veršelių, sergančių bronchopneumonija arba aštriu respiratoriniu susirgimu. Preparatas injekcijomis leidžimas į raumenis 0,05 ml/kg kas trečią dieną.
[0181] Gydymo efektas stebimas po 1-7 injekcijų, ir kontroliuojamas pagal kūno temperatūrą.
[0182] Pareikštos BAM efektyvumo priklausomybė nuo modifikuotų morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų kiekio nustatoma žaliavos iš gyvulinio audinio, kuriuose vykdo embriogenezės ir/arba proliferacijos procesuose, ir/arba ląstelių diferencijacijos, ir/arba patologijos, prieš ir/arba lydimos audinių regeneracijos ir/arba reparacijos, panaudojimu.
[0183] Gautos medžiagos apdirbamos taip pat, kaip pavyzdyje 7. Galutinio produkto, gauto panaudojant kiekvienu iš paminėtų modifikuotų ląstelių struktūrų audinį, o būtent morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių, parodyti 5 lentelėje.
[0184] ir jo stiprumas priklauso nuo panaudojamos žaliavos, iš kurios gauti hidrolizės produktai, turintys modifikuotus morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentus.
[0185] Žvaliavai iš gyvulinio audinio paimto ląstelių poliferacijos ir diferenciacijos stadijoje, naudojamus žiurkių sėklidžių spermatogonijos ir spermatocitai,
[0186] kaulų čiulpų ląstelės, žiurkių žarnyno epitelinis audinys. Žaliavai iš gyvulinio audinio, paimto su embriogenezės procesais, naudojamas žiurkių embrioninis audinys.
[0187] Ž valiavai su patologijos ir prieš įvykusios regeneracijos procesais, naudojamas žiurkių kepenys po dalinės hepatektomijos, o žaliavai su patologijos procesais lydimais regeneracijos - regeneruotas varliagyvių
[0188] galūnių audinys, žiurkių kepenys po anglies tetrachlorido (CCI4) poodinio įvedimo.
[0189] Kartu su gautais tyrimų duomenimis, 5 lentelėje parodyti imunomoduliuojančio efekto, gauto panaudojant žiurkių patelių raumenų ir kepenų intaktinį audinį, duomenys. 5 lentelės analizė parodo, kad imunomoduliuojantis efektas pareikštos B AM, gautos panaudojant audinius, paveiktus embriogenezės, proliferacijos procesuose, ir patologijos, prieš ir/arba lydimos regeneracijos ir/arba audinio reparacijos, aukštesnis negu panaudojant audinius nepaveiktus nurodytų procesų.
[0190] Be to, galima padaryti išvadą, kad didžiausias imunomoduliuoj antis efektas pasiekiamas, panaudojant atsistatantį kepenų audinį, embrioninį audinį ir varliagyvių galūnių atsistatantį audinį.
[0191] Žvaliavai naudojamos žiurkių regeneruotos kepenys po 4-12 valandų po hepatektomijos, atliktas žinomu metodu (G.M. Higgins, R.M. Anderson Experimental pathology if the liver. - Areh. Pathology,- 1931- N 12-p.186).
[0192] Kepenys smulkiai nupj austomos ir sumaišomos su trim kiekiais fiziologinio tiepalo, po to centrifuguojama, greičiu 1500 g per min., o gauta liekana sumaišoma su trim kiekiais fiziologinio tirpalo ir vėl centrifuguojama tose pačiose sąlygose. Susmulkinto audinio plovimas atliekamas 3 kartus, o tolimesnės galutinio produkto gavimo stadijos atliekamos taip pat kaip ir 3, 7 ir 11 pavyzdžiuose.
[0193] Gautų galutinio produktų specifinis aktyvumas nustatomas eksperimentiškai pagal žiurkių kepenų, paveiktų CCl^, hepatocitų reparacinių savybių aktyvumą, kur Na, K - AT Fazės aktyvumas atstatomas, atitinkamai 32,7+-3,l%; 43,6+-3,9% ir 85,4+-7,8% palyginus, su gyvulių grupe, kuriai pareikšta medžiaga nebuvo naudota.
[0194] Aminotransferazių kraujyje aktyvumas atstatomas 37,4+-2,8%; 47,2+-3,4% ir 98,3+-1,7%, - o kepenų hepatocitų kalio koncentracija - 22,6+-1,8%; 28,9+-2,5% ir 58,l+-4,7%.
[0195] Galutinis produktas, turintis B AM 0,1% maės kiekio, o likusi dalis - užpildas, naudojamas kaip gydomasis preparatas, veršelių sergančių
[0196] Gydymo efektas stebimas po 7-14 injekcijų ir kontroliuojamas pagal aminotransferazės aktyvumą, bilirubino ir azoto koncentraciją kraujyje.
[0197] Žaliavai naudojamos bulių sėklidžių išspaudos, gautos po lidazių išskyrimo, ekstrahuojant 3% acto rūgštimi audinio homogenatą.
[0198] Gautos sėklidžių išspaudos, lidazės gamybos liekana pakartotinai homogenizuojama trim dalim fiziologinio tirpalo peiliniuose homogenizatoriuose ir centrifuguojama, greičiu 250 g per 15 min., kad pasišalintų nesuirę audinio elementai.
[0199] Natrio šarmo decinormaliniu vandens tirpalu (0,1 N NaOH) terpės rūgštingumas padidinamas iki pH 7,4 ir į homogenatą, turintį morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų, modifikuotų ląstelių diferencijacijos ir poliferacijos procesuose pridedama konservanto 0,8 g/l,
[0200] po to sumaišoma ir hidrolizuojama su tolimesniu apdirbimu, kaip ir 3,7 ir 11 pavyzdžiuose.
[0201] Gautų galutinių produktų specifinis aktyvumas nustatomas eksperimentiškai, pagal žiurkių peritonealinio eksudato makrofagų ir kraujo neutrofilų aktyvumą. Naudojant galutinį produktą, gautą kaip 11 pavyzdyje, fermentinis makrofagų aktyvumas padidėjo 108,3±13,2%, o fagocitarinis, pagal E. Coli aktyvumas - 92,2±10,2%. Kraujo neutrofilams šie rodikliai atitinkamai padidėjo 99,2±14,1% ir 72,4±8,3%.
[0202] Galutinis produktas, turintis B AM 0,1% masės kiekio, o likusi dalis - užpildas, sumaišomas su 50 kiekių vandens ir naudojamas, kaip maistinis preparatas, vištų homeostazės parametrams normalizuoti. Vištos girdomos 5 ml/kg 2-6 savaites.
[0203] Pagal 11 pavyzdį gautą galutinio produkto fermentinis makrofagų aktyvumas padidėja 150,6±17,4%, o fagocitarinis makrofagų aktyvumas padidėja 109,3+12,7%.
[0204] Kraujo neutrofilų atitinkami rodikliai sudaro 137,6±16,8% ir 95,7+11,3%.
[0205] Galutinis produktas, turintis BAM 0,5% masės kiekio, o likusi dalis - užpildas, naudojamas karvėms, sergančioms endometritu gydyti. Injekcijos į raumenis daromos kas 3 dieną po 0,05 ml/kg. Gydymo efektas stebimas po 6-10 injekcijų ir kontroliuojamas pagal uždegimines reakcijas, histologiniu tyrimu ir pūlingų išskyrų rodiklius.
[0206] Žvaliavai naudojama užkrūčio liaukos išspaudos, gautos po netirpių audinio komponentų, kurie yra timozino gamybos atliekos, išskyrimo iš homogenato.
[0207] Užkrūčio liaukos išspaudos apdirbamos taip pat, kaip ir 3, 7 ir 11 pavyzdžiuose ir gaunami galutiniai produktai, kurių specifinis aktyvumas nustatomas eksperimentiškai pagal T-limfocitų blastransformacijos reakcijos stimuliaciją ir kuri padidėja 165,6±13,7%, palyginus su kontroline, kur naudojamas galutinis produktas gautas pagal 11 pavyzdį.
[0208] Galutinis produktas, turintis BAM 0,5% masės kiekio, o kita dalis - užpildas, naudojamas intranazaliai, kaip vaistinis preparatas žmogaus infekcinių susirgimų profilaktikai. Į kiekvieną nosiaryklę įlašinama po 2 lašus ir masažuojama kad šie nutekėtų į gleivinę. Tokia procedūra atliekama 2 kartus per dieną. Efektas kontroliuojamas pagal organizmo būklę ir kūno temperatūrą.
[0209] 13 ir 15-17 pavyzdžiuose, su 0,001% B AM masės jame. Užpildas - 10% sacharozės tirpalas.
[0210] Preparatas naudojamas bitėms maitinti.
[0211] Vienos bičių šeimos vienam maitinimui skirtas 11 preparato, palyginus su kontroliniu, pagerino:
[0212] ir 15-17 pavyzdžiuose, paruošiamas su 85% masės kiekio liofiliškai išdžiovinto BAM. Užpildu naudojamas antiseptikas. Preparatas pabarstų pavidalu paruoštas iš liofiliškai išdžiovintų miltelių naudojamas atvirų
[0213] Preparato naudojimas pagreitina regeneracinius procesus 2-7 kartus, palyginus su kontroliniu.
[0214] Gydomasis preparatas, turintis BAM, gautas taip pat, kaip 1-6, 9-14, 16-21 ir 23-25 pavyzdžiuose, paruošiamas su 1,0% BAM masės.
[0215] Užpildu naudojamas gelis ir augalų minkštimo: agurkų, obuolių, persikų
[0216] piure. Preparatas naudojamas kosmetikoje. Gydomasis efektas stebimas po 4-8 seansų ir kontroliuojamas pagal odos elastingumą.
[0217] Gydomasis preparatas, turintis B AM, gautas taip pat, kaip 1-6, 9-14, 16-21 ir 23-26, pavyzdžiuose, paruošiamas su 1,0% BAM masės.
[0218] Užpildu naudojamas gelis - 15 dalių medaus, 3 dalys ropinio svogūno sulčių, 1 dalis česnako sulčių ir 1 dalis varnalėšų aliejaus.
[0219] Preparatas naudojamas plaukų šaknims stiprinti. Gelis uždedamas ant galvos 2-8 valandoms. Procedūra atliekama 1 kartą per savaitę. Gydymo efektas stebimas po 5-12 seansų ir kontroliuojamas pagal plaukų stovį.
[0220] Gydomasis preparatas, turintis BAM, gautas taip pat, kaip 1-6, 9-14, 16-21 ir 23-2, pavyzdžiuose, paruošiamas su 1,0% BAM masės.
[0221] Užpildu naudojamas lanolino mišinys su spermacetu 1:3. Preparatas naudojamas odos sluoksnio atstatymui po dermatozės. Preparato panaudojimas 2-5 kartus pagreitino atstatymo procesus, palyginus su kontroliniu.
[0222] Gydomasis preparatas, turintis BAM, gautas taip pat, kaip 1-6, 9-14, 16-21 ir 23-26, pavyzdžiuose, paruošiamas su 1,0% BAM masės.
[0223] Užpildu naudojama kakava. Preparatas naudojamas endometritų gydymui žvakutėmis. Gydymo efektas stebimas po 14-21 dienos, ir kontroliuojamas pagal uždegiminės reakcijos, histologinių tyrimų, kraujo analizės rodiklius.
[0224] Užpildu naudojamas lanolino ir vazelino mišinys 1:3. Preparatas naudojamas gleivinės erozijai gydyti. Atstatomieji procesai vyksta 3-5
[0225] B AM, gautos taip pat, kaip ir 1-18 pavyzdžiuose, aminorūgščių analizė atliekama trim kryptimis, kuriomis nustatoma: - bendra aminorūgščių sudėtis; - peptidų ir laisvų aminorūgščių, be rūgštyje netirpių baltymų, aminorūgščių sudėtis;
[0226] 1) B AM, gautos taip pat, kaip 1-18 pavyzdžiuse, bendra aminorūgščių
[0227] analizė atliekama hidrolizės būdu vakuume 6-normalinėje druskos rūgštyje (6 N HC1) 110 °C temperatūroje 24 valandas.
[0228] Po hidrolizės, bandinys garinamas vakuume virš sauso natrio šarmo (NaOH). Sausa liekana atskiedžiama 0,2 N natrio-citrato buferiniu tirpalu pH 2,2 ir analizuojama aminorūgščių analizatoriaus jonų mainų kolonėlėje.
[0229] 2) Rūgštyje netirpiems baltymams pašalinti į 0,5 ml bandinio pridedama 0,5 ml 3% sulfosalicilinės rūgšties, palaikoma 1 vai., periodiškai pamaišant. Denatūruoti baltymai pašalinami centrifugavimu, greičiu 8000
[0230] g per 15-20 min. Gautam supernatantui, atliekama bendra aminorūgščių analizė. 3) B AM, gautos taip pat, kaip 1-18 pavyzdžiuose, laisvų aminorūgščių
[0231] tirpalu pH 2,2 ir po filtracijos per popierinį nukalkintą filtrą, užnešus ant aminorūgščių analizatoriaus jonų mainų kolonėlės.
[0232] Aminorūgščių kolonėlės eliuacija pravedama natrio-citratiniu buferiniu tirpalu pH 3,25; pH 4,25 ir pH 5,28. Frakcionuotos aminorūgštys apdirbamos ninhidridiniu reaktyvu ir nustatomas optinis tankis pratekamu fotometru ties 440 ir 570 nm bangos ilgiu.
[0233] B AM, gautas taip pat, kaip 1-18 pavyzdžiuose, bendras lipidų kiekis nustatomas tokiu būdu. 0,5 ml BAM sumaišoma su 1,5 ml koncentruotos sieros rūgšties (H^SO^) ir kaitinama 95 °C temperatūroje 15 min. Į ataušintą 0,1 ml hidrolizatą pridedama 1,5 ml fosfovanilinio reaktyvo (firmos Chempal.) pagal žinomą bendrą lipidų nustatymo metodą pagal specifinį nudažymą. (J.M. Rnight, S. Anderson, J.M. Rawle. - Clinical Chemistry - 1972, 18, p. 199). Optinis tirpalo tankis nustatomas ties 530 nm bangos ilgiu.
[0234] BAM, gautos taip pat, kaip 1-8 pavyzdžiuose, nukleotidų analizė atliekama tokiu būdu. Purininiai ir pirimidininiai rūgštyje tirpūs nekleotodai ekstrahuojami iš 1,5-5,5 ml 5% atšaldytos chloro perrūgšties (HCIO^) bandinio. Bandiniai po 20 min. ekstrakcijos, šaltyje centrifiiguojami, greičiu 2500 g per 10 min., liekana tris kartus plaunama 5% chloro perrūgštimi, supernatantai sujungiami ir panaudojami rūgštyje tirpių nukleotidų išskyrimui. Rūgštyje tirpi frakcija hidrolizuojama vienamoliarine chloro perrūgštimi (1 M HCIO^) 100 °C temperatūroje 1 vai. iki pirimidininių monofosfatų ir purinų. Tirpalai neutralizuojami kalio šarmu (KOH) ir hidrolizės produktai paskirstomi katijonų mainininke "DAUEKS" 50x4 laiptine eliuacija:
[0235] chloro perrūgštimi - ksantino ir citozino monofosfatui; 0,4 M chloro perrūgštimi - hipoksantinui;
[0236] 1,0 M chloro perrūgštimi - guaninui; 2 M chloro perrūgštimi - adeninui.
[0237] Nukleotidai identifikuojami chromotografiškai pagal judėjimą katijonų mainininke lyginant su standartu, o taip pat pagal absorbcijos spektrus ties 200-300 nm. Nukleotidų kiekis nustatomas, panaudojant moliarinės ekstincijos koeficiento dydį.
[0238] B AM, gautos taip pat, kaip 1-18 pavyzdžiuose, imunomoduliuoj antis aktyvumas nustatomas pagal wister linijos žiurkių peritonealinių makrofagų aktyvumą bandymais in vitro. pagal fermentinio tetrazolio aktyvumo stiprumą nitro-mėlio redukcijoje iki diformazano (NST - testas)
[0239] Į dekapituotų gyvūnų pilvo ertmę švirkštu įvedama 20 ml Chenkso tirpalo, turinčio heparino 20 vnt./ml. Po 2-3 min. pilvo masažo, padaroma įpjova ir tuo pačiu metu švirkštu iš ertmės ištraukiamas įvestas skystis, kuris filtruojamas per neiloninį filtrą ir centrifuguojamas, greičiu 150-200 g per 15 min. Gauta liekana suspenduojama 0,5 kiekio šviežiu Chenkso tirpalu ir vėl centrifuguojama tokiomis pačiomis sąlygomis. Išskirtų ląstelių plovimas atliekamas* 3-4 kartus, po ko ląstelių koncentracija suspensijoje gaunama 80x10^ ląstelių/ml. Visų ląstelių audinio eskudate makrofagų
[0240] Žviurkių peritinealinio eksudato makrofagų fermentinis aktyvumas nustatomas spektrometriškai pagal nitro tetrazolio mėlio redukciją iki diformazano. Žviurkių peritonealinio eksudato ląstelių liekana atskiedžiama bespalviu Chenkso tirpalu iki 80x10^ ląstelių/ml koncentracijos. į 5 [il ląstelių suspensijos pridedama bandinio su pH 7,4 ir 1,0 mg/ml peptidų koncentracija. Mišinys inkubuojamas vandens vonioje pastoviai papurtant 37 °C temperatūroje 30 min., po to pridedama 5 j-il prisotinto 20 °C temperatūroje nitro tetrazolio mėlio "Reanal" firmos ir dar inkubuojama 30
[0241] min. Po to pridedama 3 ml acetono ir centrifuguojama, greičiu 2000 g per 20 min. Nusodinta acetoninė ištrauka fotometruojama ties 515 nm bangos ilgiu.
[0242] Fermentinio aktyvumo palyginimo kontrolei naudojamas bandinys su konservantu fiziologiniame tirpale.
[0243] Žiurkių peritonealinio eksudato ląstelių fagocitarinis aktyvumas nustatomas pagal jų sugebėjimą, užimti E. Coli.
[0244] Į 50 įj.1 ląstelių suspensijos pridedama 50 jil bandinio su pH 7,4 ir peptidų koncentracija 0,05 mg/ml. Mišinys inkubuojamas 37 °C temperatūroje vandens vonioje 30 min. pastoviai pakratant. Po inkubacijos mišinys suspenduojamas 10 ml bespalviu Chenkso tirpalu 4 °C temperatūroje ir centrifuguojamas, greičiu 150-200 g per 15 min. Žiurkių peritonealinio eksudato ląstelių liekana atskiedžiama Chenkso tirpalu iki 2,5x10^ ląstelių/ml koncentracijos. 0,2 ml gautos suspensijos uždedama ant 18x18 mm stiklo ir inkubuojama 37 °C temperatūroje 30 min. 5% angliarūgšties (C02) atmosferoje, kad makrofagai prisitvirtintų prie stiklo. Po inkubacijos prie stiklo neprisiklijavusios ląstelės pašalinamos 3 kart paskalaujant stiklinėje su Chenkso tirpalu. Į likusias ant stiklo ląsteles pridedama 0,2 ml E. Coli suspensijos 20x10^ ląstelių/ml koncentracijos ir inkubuojama tose pat sąlygose 45 min. Po to stiklas vėl 3 kartus stiklinėje paskalaujamas, fiksuojamas metanoliu ir nudažomas Romanovskio-Grimzos metodu.
[0245]
[0246] R - ląstelių skaičius, prarijusių 10 ir daugiau E. Coli ląstelių.
[0247] Makrofagų identifikacija atliekama pagal nespecifinės esterazės spalvą.
[0248] BAM, gautas taip pat kaip 1-18 pavyzdžiuose, imunomoduliuojantis aktyvumas nustatomas pagal wistar linijos žiurkių kraujo neutrofilų aktyvumą bandymuose in vitro, pagal fermentinį aktyvumą pagal nitro tetrazolio mėlio redukcijos iki diformazano (NST - testas) atstatymo ir pagal fagocitarinį aktyvumą, E. Coli atžvilgiu.
[0249] Žiurkių uodegos arterijos kraujas surenkamas į mėgintuvėlius su bespalviu Chenkso-heparino tirpalu ir maišomas. Į gautą mišinį pridedama 6% dekstrano T-500 santykiu 3:1 ir mėgintuvėliai 1 vai. statomi į šaldytuvą.
[0250] ir centrifuguojamas, greičiu 250 g per 15 min. Eritrocitai iš leukocitų
[0251] masės pašalinami hemolizavimu - leukocitų liekana suspenduojama distiliuotame vandenyje, pridedama Chenkso tirpalo ir centrifuguojama. Leukocitų liekana dar suspenduojama šviežiu Chenkso tirpalu ir centrifuguojama tokiose pat sąlygose. Leukocitai plaunami 3 kartus.
[0252] Žviurkių kraujo eritrocitų liekana atskiedžiama bespalviu Chenkso tirpalu iki 80x10^ ląstelių/ml koncentracijos. Į 100 mkl ląstelinės supensijos pridedame 300 ml. BAM, gautos pagal 1-2 pavyzdžius, kurios pH - 7,4 ir peptidų koncentracija - iki 1,0 mg/ml. Mišinys inkubuojamas 30 min. 37
[0253] °C temperatūroje vandens vonioje pastoviai sukrečiant, po to pridedama 400 fj.1 tirpalo firmos Reanal nitro tetrazolio mėlio ir tolimesnės operacijos atliekamos kaip 29 pavyzdyje.
[0254] Žviurkių kraujo fagocitarinis aktyvumas nustatomas pagal jų sugebėjimą
[0255] Į 5 |il leukocitų suspensijos pridedama 50 |^1 BAM, pH 7,4, peptidų koncentracija 0,05 mg/ml. Mišinys inkubuojamas, po to pridedama 10 ml bespalvio Chenkso tirpalo 4 °C temperatūroje ir centrifuguojama, greičiu 150-200 g per 15 min. Leukocitų liekana atskiedžiama 0,3 ml Chenkso tirpale ir pridedama 0,05 ml E. Coli suspensijos 500x10^ ląstelių/ml
[0256] koncentracijos, po to inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje. Po inkubacijos daromi tepinėliai, kuriuose po nudažymo fagocituojančių ląstelių skaičius ir fagocitozės indeksas nustatomas pagal 29 pavyzdį.
[0257] BAM, gautos taip pat kaip 1-18 pavyzdžiuose, imunomoduliuojantis aktyvumas nustatomas bandymais in vivo linijos BALB/C pelėse.
[0258] Gyvūnams daromos dvi poodinės perperato injekcijos dviejų dienų intervalu po 0,5 ml/kg, esant peptidų koncentracijai 1,0 mg/ml. Imunomoduliuoj ančių savybių analizė atliekama praėjus dviem parom po paskutinės injekcijos. Kiekvienam bandymui naudojama ne mažiau 10 gyvūnų. Kontrolei naudojami gyvūnai, apdoroti pagal nurodytą schemą 0,08% konservantu, ištirpintu fiziologiniame tirpale.
[0259] Limfocitų blastransformacijos reakcijai nustatyti, T-ląstelių mitogenu naudojamas fitohemagliutinas, B ląstelių mitogenu lipopolisacharidas E. Coli. Limfocitai, išskirti iš pelių gemalo, inkubuojami su duotais mitogenais 72 vai. 37 °C temperatūroje 5% angliarūgšties atmosferoje. Ląstelių proliferacijos lygis nustatomas radiometriškai, pagal įjungtą H-timidiną. Dėl to, į kultūras pridedama 3 H-timidino (3,7x10 4 Bk/bandiniui) ir inkubuojama 3 vai. Po to bandiniai dedami ant miliporinių filtrų, triskart plaunami 199 terpe, po to 5% trichloracto rūgšties tirpalu ir etanoliu. Filtrai išdžiovinami, dedami į flakonus su scintiliaciniu tirpalu ir skaitikliu "Mark 111" nustatomas bandinių radioaktyvumas.
[0260] BAM, gautas taip pat, kaip 1-18 pavyzdžiuose, imunomoduliuoj antis efektyvumas nustatomas pelių bandymais ir vivo pagal splenocitų natūralaus kilerių aktyvumo stimuliavimą. Gyvūnams dvi dienas daroma po 2 poodines preparato injekcijas 0,05 ml/kg, peptidų koncentracija 1,0 mg/ml.
[0261] Imunomoduliuojančių savybių analizė atliekama praėjus parai po injekcijos. Kiekvienam bandymui naudojama ne mažiau 10 gyvūnų. Kontrolei naudojami gyvūnai, apdirbti pagal nurodytą schemą 0,08 % konservantu, atskiestu fiziologiniame tirpale. Splenocitų natūralus kilerinis aktyvumas nustatomas pelių limfomos ląstelėse, pažymėtose chromo izotopu *^Cr. Inkubacija vykdoma 18 valandų esant ląstelių taikinių ir ląstelių efektorių santykiui 1:25 (1x10^ : 2,5x10 ląstelių).
[0262] Specifinis chromo izotopo išlaisvinimas, atitinkantis efektorinių ląstelių citotoksiniam aktyvumui, skaičiuojamas pagal formulę:
[0263] kur maksimalus išlaisvinimas yra radioaktyvumas, kada visos ląstelės lizuojamos. Kontroliniam natūraliam kilerių aktyvumui nustatyti naudojamas konservantas, ištirpintas fiziologiniame tirpale.
[0264] BAM, gautos taip pat, kaip ir 1-18 pavyzdžiuose, imunomoduliuojantis aktyvumas nustatomas pagal pelių užkrūčio liaukos funkcinį aktyvumą bandymuose in vivo, sąlygose analogiškose 31 pavyzdžiui.
[0265] Bandomųjų pelių kraujo serumas ultrafiltruojamas sistemoje CENTRIFLOCF - 50A. Reakcijoje naudojamas 0,1 ml kondensuotas ir skiestas 199 terpėje serumas. Kontroliuojama 199 terpėje.
[0266] Pelių gemalas paimamas praėjus 10-14 dienų po timektotirovavimo. Iš serumo paimamos ląstelės preparavimo adatomis išpluoštinus audinį
[0267] terpėje 199. Filtruojama per kaproninį tinklą po to 2 kart plaunama terpėje 199, centrifuguojant aplinkoje iki 4x10^ ląstelių/ml koncentracijos, ir
[0268] gauta 0,1 ml suspensija pridedama į mėgintuvėlius su serumu ir 199 terpe. Mėgintuvėlių turinys sumaišomas ir inkubuojamas 37 °C temperatūroje 60 min.
[0269] Po inkubacijos, į visus mėgintuvėlius pridedama po 0,1 ml antitimocitinio serumo ir jūrų kiaulyčių komplemento atskiesto 1:10. Suspensija dar inkubuojama 37 °C temperatūroje 30 min. Po to į mišinį pridedama po 0,1 ml avino eritrocitų suspensijos (12x10^ ląstelių/ml) sumaišoma, centrifuguojama, greičiu 250 g per 5 min. ir inkubuojama 60 min. 4-8 °C temperatūroje. Liekana mėgintuvėliuose suspenduojama 5 min. Lizdai skaičiuojami Goriajavo kameroje. Lizdu laikomas limfocitas, prisijungęs 4 ir daugiau eritrocitus.
[0270] Titru USF laikomas paskutinis serumo praskiedimas, iššaukiantis 50% ląstelių lizdų sudarymo redukciją (LSR) palyginus su kontroliniu. Rezultatai atsispindi titro su 2 pagrindu logaritme, t.y. log A, kur A titro reikšmė.
[0271] B AM, gautos taip pat kaip ir 1-18 pavyzdžiuose, žiurkių kepenų hepatocitų reparacijos stiprėjimo efektyvumas po poodinio įvedimo CC14 nustatomas pagal Na, K - ATF-azės aktyvumo atstatymą tokiu būdu.
[0272] Žiurkių patinams 230-250 g svorio kiekvieną dieną 4 dienas po oda įleidžiama CCI4 mišinyje su augaliniu aliejumi 1:1, 4,0 ml/kg. Praėjus 4 vai. po pirmos CCI4 injekcijos, bandomiems gyvūnams atliekama pirma iš 4 medžiagos -poodinių injekcijų vienos dienos intervale po 0,05 ml/kg. Medžiagos efektyvumas registruojamas sekančią dieną po paskutinės injekcijos.
[0273] Na K-ATF-azės aktyvumas nustatomas, panaudojant hepatocitų ląstelinių membranų frakcijas. 15 g atšaldytų 3 žiurkių kepenų homogenizuojama 150 g 1 m M ^2640-7 tirpale, pH 7,5 su 0,5 mM CaC^ tirpalu, naudojant stiklinį homogenizatorių.
[0274] Homogenizuotas mišinys centrifuguojamas, greičiu 150 g 4 °C temperatūroje 10-12 min. Supernatantas pakartotinai centrifuguojamas greičiu 100000 g per 20 min., gauta liekana plaunama 3 kartus 130 ml buferyje tokiom pat centrifugavimo sąlygomis.
[0275] Po plovimo liekana resuspenduojama buferiniame tirpale, iki baltymo koncentracijos, SDS - Louri metodu, 3,0 mg/ml ir naudojama tyrimams.
[0276] Na, K-ATF-azės hepatocitų membranos plazminis aktyvumas nustatomas standartinėje terpėje iš 66 mM NaCl, 34 mM KC1, 5 mM MgC^ , į kurią
[0277] prieš bandymus pridedama 5 mM ATF.
[0278] I 1,8 ml nurodytos terpės, pridedama 0,2 ml membranos frakcijos suspensijos su baltymų 3,0 mg/ml koncentracija ir inkubuojama 37 °C temperatūroje 15 min., po to reakcija sustabdoma, pridedama 0,6 ml 5% trichloracto rūgšties tirpalo. Mišinys centrifuguojamas, greičiu 300-500 g per 15 min. Į 1,0 ml gauto supernatanto pridedama 4 ml 0,2 M acetato buferinio tirpalo pH=4,0 0,5 ml 1% amonio T molibdato tirpalo, ištirpinto 1% H^SO^ tirpale, 0,5 ml askorbino rūgšties ištirpintos 16% CuSO^
[0279] Na, K-ATF-azės aktyvumas apskaičiuojamas pagal bendros ATF-azės ir Mg-ATF-azės aktyvumų skirtumą. Mg-ATF-azės aktyvumas nustatomas analogiškai, tik vietoje 0,6 ml trichloracto tūgšties į mišinį pridedamas 0,3
[0280] karto, o paveikus pareikšta B AM, pagal 11 pavyzdį, jos aktyvumas padidėja 50%.
[0281] BAM, gautas taip pat kaip 1-18 pavyzdžiuose, žiurkių, po poodinio CCl^ įvedimo, kepenų hepatocitų reparacijos stiprėjimo efektyvumas nustatomas pagal aminotransferazės kraujyje aktyvumo atstatymą ir žiurkių kepenų
[0282] Gyvūnai, apdorojami kaip ir 34 pavyzdyje, aminotransferazės kraujyje aktyvumas patikrinamas test-sistemoje pagal specifinį nudažymą fotometriniu būdu (S.Reitman, S.Franklin. - American Journal of Clinical Pathology,- 1957- 18- 56).
[0283] Į 0,25 ml tirpalą turintį 0,1 M L-aspartato, 0,002 M 2-oksaglutarato ir 0,1 M fosfatinio buferinio tirpalo, pH 7,4, pridedama 0,05 ml žiurkių kraujo serumo ir inkubuojama 37 °C temperatūroje 60 min.
[0284] Po inkubacijos į tirpalą pridedama 0,001 M 2-4-dinitrofenilhidrazino ištirpinto 1 M HC1 ir bandinys 20 min. paliekamas kambario temperatūroje, po to pridedama 2,5 ml 0,4 M NaOH, sumaišoma ir po 10 min. išmatuojamas optinis tankis 520 nm bangos ilgiu prieš kontrolinį tirpalą, kur vietoje 0,05 ml kraujo įvedama 0,05 ml fiziologinio tirpalo.
[0285] Kepenų, toksiškai paveiktų CCI4, pažeidimas yra lydimas hepatocitų suardymu ir aminotransferazės išėjimu, dėl ko jų aktyvumas kraujo serume padidėja 2 kartus.
[0286] Kalio (K+) koncentracija bandomųjų žiurkių kepenų hepatituose nustatoma standartiniu liepsnos fotometrijos metodu, pagal Brikker, liepsnos fotometru.
[0287] Nustatyta, kad kepenų, paveiktų CCI4, Na, K-ATFazės aktyvumas sumažėja 3,5 karto, dėl ko 40% sumažėja K+ koncentracija kepenų hepatituose.
[0288] O panaudojant BAM, gautą pavyzdyje 11, K+ koncentracija atstatoma ne mažiau 43%.
[0289] Išradimas neapsiriboja šiais pavyzdžiais. Įvairūs variantai gali būti naudojami išradimo apibrėžties esmės ir apimties ribose.
[0290] BIOLOGIŠKAI AKTYVIOS MEDŽIAGOS SUDĖTIES IR SAVYBIŲ
[0291] ANALIZĖ
[0292] Identifikuoti pareiškiamą BAM kitų biologiškai aktyvių medžiagų tarpe įmanoma tiesiogiai - atliekant biocheminę sudėties analizę, ir netiesiogiai -
[0293] su kontrole, apsprendžia morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių modifikuoti komponentai, kurių struktūra modifikuota, įeinantys į BAM sudėtį. Tai leidžia identifikuoti BAM pagal tokius rodiklius:
[0294] t.y., pagal makrofagų fermentinio aktyvumo, nustatomo NST-testu,
[0295] padidėjimą ne mažiau kaip 54 % (naudojant eksperimente nitrotetrazolio mėlį - Vengrijos firmos "Reanal" NST testas) ir pagal fagocitarinio aktyvumo E. Colli padidėjimą ne mažiau kaip 39 %;
[0296] b) Pagal žiurkių neutrofilų aktyvacijos kraujyje padidėjimą, t.y., pagal fermentinio aktyvumo, nustatomo NST testu, padidėjimą ne mažiau kaip
[0297] testą) ir pagal fagocitarinio aktyvumo E. Colli padidėjimą ne mažiau kaip 44%;
[0298] c) Pagal T-limfocitų blast-transformaciją - ne mažiau kaip 42 %, ir B-limfocitų - ne mažiau kaip 50 %; d) Pagal užkrūčio liaukos funkcinio aktyvumo padidėjimą, t.y., pagal timininio seruminio faktoriaus kiekio žiurkių kraujyje padidėjimą - ne mažiau kaip 167 %; e) Pagal žiurkių splenocitų natūralaus kilerinio aktyvumo padidėjimą - ne mažiau kaip 66 %; f) Pagal pajėgumą stabilizuoti žiurkių kepenų hepatocitų plazmines membranas po anglies tetrachlorido (CCU) įvedimo: - pagal Na, K-ATF-azės aktyvumo atstatymą - ne mažiau kaip 24 %; - pagal transferazės aktyvumo žiurkių kraujyje atstatymą - ne mažiau kaip 22 %; - pagal kalio (K) ir natrio (Na) santykio žiurkių kepenų
[0299] Palyginimų pagrindu naudojo kontroliniuose bandymuose įvedamą į
[0300] Pateikiama BAM imunomoduliuojančių ir regeneruojančių efektų
[0301] (savybių) sistema leidžia identifikuoti BAM pagal jos biologinį aktyvumą,
[0302] t.y., kaip imunomoduliatorių. BAM ir jos pagrindu pagamintas praparatas turi tendenciją pasireikšti kaip organizmo imuninės sistemos apsauginių
[0303] funkcijų, nukreiptų tiek vidinės patologijos eliminavimui (natūralių kilerių
[0304] aktyvumo stimuliacija), tiek ir bendro organizmo atsparumo infekciniams susirgimams stiprinimui, stimuliatorius, žymiai viršijantis aukščiau išdėstytų žinomų BAM rodiklius.
[0305] Eksperimentiškai nustatytos įvairių biologiškai aktyvių medžiagų
[0306] imunomoduliacinės savybės pagal kompleksą rodiklių, identifikuojančių
[0307] tiriamas medžiagas. Eksperimentų rezultatai pateikti 6 lentelėje, kurioje pateikti kiekybiniai efektų rodikliai žinomų BAM N 1, N 2, N 3, gautų
[0308] pagal technologiją aprašytą atitinkamai EP-A-02499563, SU-A-139404 ir US-A-4455302, ir pareikštos BAM, kurią atstovauja WS, TS ir LM grupės,
[0309] WS - 1-4 pavyzdžių (morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių
[0310] komponentai);
[0311] TS - 7-9 pavyzdžių (termostabilūs morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentai);
[0312] LM - 11-13 pavyzdžių (mažamolekuliniai morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentai, kurių M < 10,0 kDa).
[0313] Kaip kontrolinį objektą tyrė natrio chlorido fiziologinį tirpalą su konservantu. Gauti rezultatai yra 6 lentelėje ir palyginimo būdu charakterizuoja pareiškiamą ir žinomas BAM. Pateikti rezultatai apibūdina pareiškiamos BAM, kuri gaunama kaip nenustatytos struktūros mišinys, charakteristikas ir būtinus BAM identifikacijai efekto, apsprendžiančio jos paskirtį, duomenis.
[0314] Be galimybės identifikuoti pareiškiamą medžiagą, 6 lentelės duomenų
[0315] analizė taip pat leidžia įvertinti konkretų rezultatą, kuris gaunamas BAM
[0316] pagalba ir kuris yra esminis biologinio aktyvumo padidėjimas dėka BAM
[0317] esančių hidrolizės produktų, turinčių savyje modifikuotus morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių su modifikuota struktūra komponentus, kurių įtaka žinomose BAM nenustatyta.
[0318] Pareikštos BAM ir jos pagrindu sudaryto preparato savybės yra glaudžiai susijusios sujos sudėtimi.
[0319] surišti ir laisvi angliavandeniai, lipidai, nukleotidai ir kiti junginiai. 7
[0320] lentelės duomenys atskleidžia organinių junginių pasiskirstymą BAM
[0321] sudėtyje pagal masę, naudojant pradine žaliava stambiųjų raguočių
[0322] embriono audinius. Be to, 7 lentelėje atsispindi pareikštos BAM įvairių
[0323] grupių (WS, TS ir LM) gavimo rezultatai, pagal visus pareikštus būdus. Be būdo, kuriuo gaunama BAM-WS ir kurio įgyvendinime kaip žaliava naudojami gyvulinės kilmės audiniai, esantys morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių modifikavimo proceso stadijoje, įgyvendinimo
[0324] rezultatų, 7 lentelėje taip pat yra pareikštos B AM gavimo termostabilių
[0325] komponentų BAM-ST ir mažamolekulinių komponentų BAM-LM
[0326] 7 lentelės duomenys leidžia atlikti pareikšto ir žinomo BAM gavimo būdų
[0327] palyginamąją analizę, būtent, palyginamąją žinomos ir pareikštos BAM
[0328] analizę, turint mintyje tai, kad iš žinomų BAM geriausios pagal savo charakteristikas yra BAM N 3 (US-A-4455302), BAM N 2 (SU-A-139404) ir BAM N 1 (EP-A-0249563).
[0329] Pareiškiamos ir žinomų BAM specifinio aktyvumo palyginamoji analizė
[0330] rodo (6 ir 7 lentelės), kad jų specifinis aktyvumas priklauso nuo ingredientų sudėties, kurių santykis žymiai įtakoja specifinio aktyvumo dydį.
[0331] Pareiškiamos BAM biocheminės sudėties charakteringa savybė yra buvimas angliavandenius turinčių komponentų, kurių modifikavimas žymia dalimi apsprendžia BAM savybes.
[0332] Angliavandenių kiekis aktyviausiose mažamolekulinių komponentų,
[0333] turinčių molekulinę masę M = 0,8-10,0 kDa (oligonukleotidai,
[0334] glikopeptidai, glikolipidai, nukleotidai) frakcijose (3, 4 ir 5 frakcijos 4
[0335] lentelėje), turi lemiamą reikšmę identifikuojant ir charakterizuojant pareiškiamą BAM.
[0336] Ingredientų specifinio aktyvumo ir sudėties (6 ir 7 lentelės) palyginamoji analizė rodo, kad didesnis pareiškiamo BAM aktyvumas, palyginus su analogais, koreliuoja su didesniu angliavandenių kiekiu komponentų su molekuline mase M = 0,8-10,0 kDa sudėtyje. Pareiškiamai medžiagai šie dydžiai yra: 6,8 ±3,5 %; 7,5 ± 3,5 % ir 8,2 ± 3,3 %, tuo tarpu kai analogams - BAM N 1, N 2 ir N 3 jie yra ne daugiau 0,2%, 2,7 ± 1,1 % ir 3 ± 0,5 %, atitinkamai. Dar geriau ši priklausomybė koreliuoja su angliavandenių santykiniu kiekiu kitų organinių medžiagų kiekio frakcijoje atžvilgiu.
[0337] Šiuo atžvilgiu esminis rodiklis yra angliavandenių ir peptidų kiekio komponentuose, kurių molekulinė masė M = 0,8-10,0 kDa (2 ir 3 lentelės),
[0338]
[0339] kurioje Cy ir Cp - atitinkamai angliavandenių ir peptidų koncentracijos komponentuose, kurių molekulinė masė M = 0,8-10,0 kDa.
[0340] Pareiškiamai BAM šis rodiklis turi reikšmę G3 = 0,25-0,60, tuo tarpu žinomoms BAM jo reikšmė neviršija G? < 0,25.
[0341] Tokiu būdu, rodiklio G reikšmė apibendrintai charakterizuoja hidrolizės produktų savybę ir priklauso nuo naudojamos pareikštame būde žaliavos,
[0342] nuo nurodytos žaliavos apdorojimo operacijų visumos bei hidrolizės procesų įgyvendinimo režimų ir yra vienu iš pareiškiamos BAM
[0343] Pareiškiamos biologiškai aktyvios medžiagos ir bendra idėja susijusio pareiškiamo jos gavimo būdo požymių visuma ir vaistinis preparatas šios medžiagos pagrindu yra priežasties-pasekmės ryšiu susiję su BAM
[0344] Išradimai, susiję su biologiškai aktyvia medžiaga, jos gavimo būdu ir vaistiniu preparatu pareiškiamos BAM pagrindu, pagrįsti pradinės žaliavos parinkimu, BAM ir preparato su garantuotu aukštu specifiniu aktyvumu gavimo proceso sąlygų parinkimu. Parinkta BAM gavimo technologija užtikrina rezultatų atsikartojamumą, t.y., leidžia standartizuoti pareikštos BAM su norimomis savybėmis, būtent su norimu fiksuotu imunomoduliuojančių aktyvumu, apsprendžiančiu farmacinį, terapinį ir bendrą biologinį išradimo naudojimo efektą, gavimą.
[0345] Gaunami galutiniai produktai bendru atveju ir atskirais pareiškiamos BAM
[0346] gavimo būdo įgyvendinimo atvejais yra lygiaverčiai savo biologinio poveikio charakteriu, bet skiriasi savo specifiniu aktyvumu. Todėl vienos ar kitos konkrečios BAM naudojimo tikslingumą apsprendžia objekto,
[0347] kuriam ji skiriama, reikalavimai, t.y., veterinarijos ir/arba medicinos reikalavimai. Ryšium su tuo kiekvienu konkrečiu galutinio produkto panaudojimo atveju vieno ar kito BAM varianto pasirinkimą apsprendžia santykis tarp reikalavimų, keliamų jo imunomoduliaciniam aktyvumui ir bendram efektyvumui ir gavimo kainos (ekonomiškumo). Aukštas efektyvumas priemonės, turinčios savo sudėtyje pareiškiamos BAM-LM
[0348] mažamolekulinių komponentų, kurių molekulinė masė M < 10 kDa, pilnai pasireiškia makrofagų, neutrofilų, limfocitų, natūralių kilerių aktyvumo didinime, kas užtikrina regeneracinių procesų sustiprinimą (6 lentelė).
[0349] Naminiams gyvuliams tokius efektus lydi papildomo priesvorio padidėjimas juos intesyviai penint (8 lentelė). Gydant kvėpavimo takų ir infekcinius susirgimus (para-gripas) toks privalumas ne tiek svarbus, ir šiuo atveju ekonomiškai tikslinga naudoti priemonę, turinčią savo sudėtyje tirpių vandenyje morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų BAM-
[0350] WS. Gydant uždegiminius procesus (mastitas), geriau naudoti priemonę,
[0351] Gaminant preparatą išoriniam naudojimui tepalo, žvakučių , gėlių,
[0352] vietoj BAM-LM ekonomiškai tikslinga naudoti BAM, turinčią savo sudėtyje termostabilių komponentų BAM-ST.
[0353] Siekiant gauti maksimalų efektą, tikslingiau naudoti pareiškiamą medžiagą
[0354] organizmo imuninės sistemos apsauginių funkcijų, nukreiptų tiek vidinės patologijos eliminavimui (natūralių kilerių aktyvumo stimuliavimas), tiek bendro organizmo atsparumo infekciniams susirgimams stiprinimui,
[0355] stimuliacijai, kuri žymiai viršija aukščiau aptartų žinomų BAM
[0356] Pareiškiamos BAM panaudojimas stambiųjų raguočių prieauglio infekciniams susirgimams gydyti (para-gripas, ūmus respiratorinis veršelių
[0357] susirgimas) užtikrina gyvulių išgijimą 82-93 % atvejų. Tuo tarpu panaudojant žinomas BAM tokiomis pačiomis sąlygomis stebimas išgijimas ne daugiau kaip 75 % atvejų, o spontaniškas išgijimas kontrolinėje grupėje yra 55-67 % atvejų ribose.
[0358] Pareiškiamas preparatas davė teigiamus rezultatus įvedant jį į organizmą
[0359] Pareiškiamos BAM panaudojimas profilaktikos tikslais sumažino veršelių
[0360] sergamumą para-gripu iki 10 %, tuo tarpu kai naudojant žinomas priemones gyvulių sergamumas siekė 12-17 %, o kontrolinėje grupėje - 22-28 %.
[0361] Pareiškiamo preparato panaudojimas didino gyvulių atsparumą
[0362] Bendros biologinės naminių gyvulių būklės normalizavimas preparato pagalba pagerino gamybinius rodiklius, tame tarpe gyvosios masės priesvorio padidėjimą nepabloginant mėsos kokybės, priartindamas šiuos rodiklius prie genetiškai užprogramuoto lygio, įmanomo intensyviai penint. Ši savybė palankiai išskiria pareiškiamą B AM ir preparatus jo pagrindu nuo hormoninių ir kitokių augimo stimuliatorių, kurie,, keldami kiekybinius rodiklius, negatyviai veikia homeostazę ir blogina produkcijos kokybę.
[0363] Pareiškiamos BAM ir preparato jos pagrindu įvedimas į organizmą
[0364] gyvūno, kurio homeostazės parametrai nukrypę nuo normos, intensyviai penint užtikrino papildomą priesvorį, lygų vidutiniškai 37-100 %
[0365] priesvorio kontrolinėje grupėje, nepaveiktoje pareiškiama BAM. Tuo tarpu naudojant žinomas BAM - analogus (N 1, N 2 ir N 3), tokiomis pat sąlygomis papildomas priesvoris, lyginant su priesvoriu kontrolinėje grupėje, sudarė vidutiniškai 12-24 %.
[0366] - stambiųjų ir smulkiųjų raguočių pieno primilžį; - naminių paukščių dėslumą; - kailinių žvėrelių kailio kokybę; - priauglio išgyvenimą;
[0367] Pareiškiama BAM yra netoksiška, nesukelia pašalinių reakcijų (alergijos ir pan.).
[0368] Pareiškiamos BAM ir preparato jos pagrindu farmacinio, terapinio ir bendro biologinio efektų palyginamieji duomenys pateikti 8 lentelėje. Šios lentelės duomenų analizė parodo, kad pareikštos BAM biologinis aktyvumas žymiai viršija analogų biologinį aktyvumą.
[0369] Tokiu būdu, pareiškiama BAM ir preparatas jos pagrindu turi platų
[0370] panaudojimo veterinarijoje ir medicinoje spektrą, ir gali būti naudojamas organizmo fiziologinės būklės normalizavimui gydant susirgimus, kurių
[0371] tokiu būdu. Nustato homeostazės parametrus, po to, jei yra nukrypimų nuo normos, stimuliuoja imuninę sistemą, įvesdami BAM, kol nurodyti homeostazės parametrai normalizuojasi.
[0372] Nurodytas imuninės sistemos stimuliavimas atliekamas aktyvuojant retikuloendotelinę sistemą, T- ir B-sistemas, neutrofilus ir/arba natūralių
[0373] organizmo kilerių populiaciją, kas užtikrina peritonealinio eksudato ir kraujo neutrofilų makrofagų aktyvumo padidėjimą in vitro, limfocitų
[0374] blast-transformacijos reakcijos stimuliavimo padidėjimą in vivo, užkrūčio liaukos funkcinio aktyvumo stimuliavimo padidėjimą, splenocitų
[0375] natūralaus kilerių aktyvumo stimuliavimo padidėjimą in vivo, o taip pat kepenų hepatocitų reparacijos sustiprėjimą įvedus nuodingų medžiagų arba po dalinės hepatektomijos ir pan.
[0376] Šiuo tikslu pareiškiamos BAM ir preparato jos pagrindu įvedimo į
[0377] organizmą būdas parenkamas iš eilės, susidedančios iš:
[0378] - injekcijos į raumenis dozėmis 0,005-0,5 ml/kg kūno masės, esant intervalams tarp injekcijų 1-7 dienos; - inhaliacijos dozėmis 0,012-0,12 ml/kg kūno masės, esant intervalams tarp inhaliacijų 4-48 vai.; - sublingvaliai, dozėmis 0,012-0,12 ml/kg kūno masės, esant intervalams tarp dozių 4-48 vai.; - girdymas dozėmis 0,02-1,0 ml/kg kūno masės, esant intervalams tarp girdymų 1-10 dienų; - peroraliai piliulėmis dozėmis 0,02-1,0 ml/kg kūno masės, esant intervalams 1-10 dienų; - intranazaliai paros dozėmis 0,001-0,05 ml/kg kūno masės, esant intervalams tarp lašinimų 2-24 vai.; - aplikacijos ant gleivinės ar žaizdos paviršiaus kompresų, žvakučių,
[0379] pabarstų, tepalų, taip pat gėlių pavidale, arba jų kombinacijų pavidale - iki homeostazės parametrų normalizavimo.
[0380] Duomenys, patvirtinantys pareiškiamos BAM termostabilių komponentų
[0381] BAM-ST pavidale ir preparato jos pagrindu, kuriame užpildu naudojome NaCl fiziologinį tirpalą, pavidale panaudojimo būdo efektyvumą, pateikti 9-12 lentelėse.
[0382] Lentelėse pateikta homeostazės parametrų normalizavimo efekto priklausomybė nuo aukščiau pateiktų dozių ir pareiškiamo preparato vartojimo būdo, kas buvo kontroliuojama sekant veršelių, pradžioje turėjusių nukrypimų nuo homeostazės parametrų normos, priesvorio dydį.
[0383] - įvedant injekcijomis į raumenis kas 3 dienos (9 lentelė); - inhaliuojant kas 24 vai.(10 lentelė).; - girdant kas 7 dienas (11 lentelė);
[0384] Pareiškiamos BAM įvedimas į organizmą pareiškiamo preparato pavidale stimuliuoja:
[0385] - infekcinių ligų gydymą (para-gripas, ūmus respiratorinis susirgimas); - uždegiminių susirgimų gydymą (mastitai, plaučių uždegimas, endometritai); - gyvulių atsparumą infekciniams ir uždegiminiams procesams; - organizmo bendros biologinės būklės gerėjimą; - gyvulių priesvorio augimą; - kepenų audinių funkcinį aktyvumą, esant hepatitui; - kepenų regeneraciją po dalinės hepatektomijos;
[0386] Pašalinių efektų nebuvimas naudojant BAM ir preparatą jos pagrindu ir duomenys apie farmacinį, terapinį ir bendrą poveikį gyvūno organizmui padarė įmanoma BAM ir preparato jos pagrindu klinikinę aprobaciją.
[0387] Tiriant grupę pacientų, nustatytas teigiamas poveikis į organizmo fiziologinę būklę, taip pat praktiškai pilna analogija su eksperimentinių
[0388] Pareiškiamos biologiškai aktyvios medžiagos gavimo būdas gali būti įgyvendintas tiek pramoninėmis, tiek laboratorinėmis sąlygomis.
[0389]
[0390] Skirtumai su kontrole teisingi esant P<0,05.
[0391]
[0392] Skirtumas su kontrole yra teisingas, esant P<0,05
[0393] Skirtumas su kontrole yra teisingas, esant P<0,05
1. Biologiškai aktyvi medžiaga, turinti imunomoduliuojančią susmulkinto gyvulinio audinio ingredientų vandenyje tirpių organinių junginių hidrolizės produktų savybę, besiskirianti tuo, kad hidrolizės produktų sudėtyje turi termostabilius žemamolekulinius morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentus, modifikuotus embriogenezės ir/arba proliferacijos procesuose, ir/arba ląstelių diferencijacijos, ir/arba patalogijos, prieš ir/arba lydimos regeneracijos ir/arba audinių reparacijos, procesuose.
2. Medžiaga pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad modifikuotų morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų sudėtyje turi termostabiliųTpj<120 °C komponentų.
3. Medžiaga pagal 2 punktą, besiskirianti tuo, kad turi termostabilių komponentų 30-100% masės kiekio.
4. Medžiaga pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad modifikuotų morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių žemamolekulinių komponentų masė M<10,0 kDa
5. Medžiagą pagal 4 punktą, besiskirianti tuo, kad turi žemamolekulinių komponentų 30-100% masės kiekio.
6. Medžiaga pagal 1 arba 2, arba 3, arba 4, arba 5 punktus, b e s i s k i r i a n t i tuo, kad savo hidrolizės produktų su modifikuotais morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentais sudėtyje turi organinių junginių masės (%)
7. Medžiaga pagal 6 punktą, besiskirianti tuo, kad organinių junginių sudėtyje turi angliavandenių santykiu, masės (%)- stambiamolekulinių junginių, turinčių molekulinę masę My^>10,0kDa - iki 2,0- žemamolekulinių junginių, turinčių molekulinę masę Myn=0,8-10,0 kDa-2,5-11,5- laisvų monomerų Mym<0,8 kDa - 6,0-17,0
- stambiamolekulinių junginių, turinčių molekulinę masę My^>10,0kDa - iki 2,0- žemamolekulinių junginių, turinčių molekulinę masę Myn=0,8-10,0 kDa-2,5-11,5- laisvų monomerų Mym<0,8 kDa - 6,0-17,08. Biologiškai aktyvios medžiagos, turinčios imunomoduliuojančią savybę, gavimo būdas, apimantis plautos žaliavos iš gyvulio audinio susmulkinamą, gautų ingredientų hidrolizę, hidrolizės produktų atskyrimą filtracija ir supernatanto, kaip galutinio produkto išskyrimą, b e s i s k i r i antis tuo, kad žaliavai naudoja gyvulinį audinį, modifikuotą embriogenezės ir/arba proliferacijos procesų metu, ir/arba ląstelių diferencijacijos, ir/arba patologijos, prieš ir/arba lydimos regeneracijos ir/arba audinių reparacijos, o prieš hidrolizę homogenizuoja ir valo nesuirusius audinio elementus, išskiria supernatantą, turintį ingredientų su morfoplazmos ir glikokalikso ląstelėmis.
9. Būdas pagal 8 punktą, besiskiriantis tuo, kad žaliavai naudoja audinį, paimtą iš tokios eilės: embrioninis audinys, diferencijuotų užkrūčio liaukos timocitų audinys, sėklidžių spermatogonijos ir spermatocitai, kaulų čiulpų ląstelės, epitelinis žarnyno audinys, placenta, atsistatantis odos audinys, regeneruotų kepenų audinys, varliagyvių galūnių atsistatantis audinys, patalogiškai pakitęs audinys, paimtas prieš regeneraciją, arba jų bet kokia kombinacija.
10. Būdas pagal 8 punktą, besiskiriantis tuo, kad nuo nesuirusių audinio elementų po homogenizacijos fiziologiniame ir/arba buferiniame tirpale, valo filtravimo ir/arba centrifugavimo būdu, greičiu 150-250 g per 10 min.
11. Būdas pagal 8 punktą, besiskiriantis tuo, kad iki homogenizacijos žaliavą iš gyvulinio audinio susmulkina iki visiško ląstelių suirimo, po to ekstrahuoja, papildomai plauna, filtruoja ir/arba centrifuguoja, greičiu 300-15000 g per 10-20 min. iki išskiria ekstraguotą susmulkintą audinį.
12. Būdas pagal 8 arba 9, arba 10, arba 11 punktus, besiskiriantis tuo, kad hidrolizuojamų ingredientų sudėtyje yra morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų 30-60% nuo bendros organinių junginių masės.
13. Būdas pagal 8 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrolizuoja Tp=4-45 °C temperatūroje.
14. Būdas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrolizuoja kartu su konservantu.
15. Būdas pagal punktus 8 arba 9, arba 10, arba 11, arba 13, arba 14, b e s i skiriantis tuo, kad hidrolizės produktų ingredientus termiškai apdirba Th=60-120 °C temperatūroje iki pilnos termolabilių komponentų denatūracijos ir filtruoja ir/arba centrifuguoja, greičiu 1500 g per 20-40 min. ir išskiria supernatantą, kaip galutinį turintį termostabilių komponentų, produktą.
16. Būdas pagal punktą 8 arba 9, arba 10, arba 11, arba 13, arba 14, b e s i skiriantis tuo, ingredientų hidrolizės produktus frakcionuoja per pusiau pralaidžią plėvelę dializės ir/arba ultrafiltracijos, ir/arba gelfiltracijos būdu iki žemamolekulinių komponentų su molekuline mase M<10,0 kDa frakcijos, kaip galutinio produkto išskyrimo.
17. Būdas pagal 15 punktą besiskiriantis tuo, kad ingredientų hidrolizės produktus frakcionuoja dializės per pusiau pralaidžią plėvelę ir/arba ultrafiltracijos, ir/arba gelfiltracijos būdu iki žemamolekulinių komponentų su molekuline mase M<10,0 kDa frakcijos, kaip galutinio produkto išskyrimo.
18. Preparatas, turintis biologiškai aktyvią gyvulinio audinio ingredientų hidrolizės produktų medžiagą ir užpildą besiskiriantis tuo, kad biologiškai aktyvi medžiaga hidrolizės produktų sudėtyje turi termostabilių, žemamolekulinių morfoplazmos ir glikokalikso ląstelių komponentų, modifikuotų embriogenezės ir/arba proliferacijos procesuose, ir/arba ląstelių diferencijacijos, ir/arba patologijos, prieš ir/arba lydimos regeneracijos ir/arba audinių reparacijos, 0,001-85% masės preparate.
19.Preparatas pagal 18 punktą besiskiriantis tuo, kad biologiškai aktyvi medžiaga turi organinių junginių tokiu masės santykiu, %
20. Preparatas pagal 18 ir 19 punktus susidedantis iš 0,001-85% biologiškai aktyvios medžiagos ir 15,0-99,999% užpildo, besiskirian t i s tuo, kad panaudojamas žmonių ir gyvulių fiziologinei būklei normalizuoti farmaciškai efektyviu kiekiu injekcijomis į raumenis ir/arba inhaliacijomis ir/arba sublingvaliai ir/arba girdymui, ir/arba piliulėmis ir/arba internazaliai ir/arba aplikacijomis.