LT3971B

HORMONO, ATPALAIDUOJANČIO LIUTEINIZACIJOS HORMONĄ, ANTAGONISTAI

LUTEINIZING HORMONE RELEASING HORMONE ANTAGONISTS

Referatas

[LT] Šis išradimas apima du aspektus: 1) hipotalaminį liuteinizacijos hormoną atpalaiduojančio hormono (LHRT) antagonistų konstravimo ir sintezės metodus, ir 2) produktus, gaunamus panaudojus aukščiau minėtus metodus. Naudojant [NAc-D2Nal1, DpClPhe2, D3Pal3, Ser4, Tyr5, DArg6, Leu7, Arg8, Pro9, DAla10] NH2 kaip pradinį junginį, buvo gauta serija naujų analogų [NAc-D2Nal1, AA2, AA3,Ser4, AA5, AA6, Leu7, AA8, Pro9, DAla10]NH2, modifikuojant tiek lipofilinę, tiek ir bazinę pradinės molėkulės sritis. Tokiu būdu išlaikomas aukštas antiovuliacinis pradinio junginio aktyvumas ir sumažinamas histamino atpalaidavimo aktyvumas iki klinikinių reikalavimų lygio.

[EN]

Aprašymas

[0001] Šiame išradime aprašomi produktai ir jų pritaikymas, konstruojant ir sintetinant

[0002] Liuteinizacijos hormoną atpalaiduojančio hormono (LHRH), antagonistai, turintys negamtines aminorūgštis 6-je padėtyje, aprašyti K.Liu et ai., International Journal of Peptide and Protein Research, 35, No.2, 157-160 (1990); LHRH antagonistai, turintys pakaitus tam tikrose padėtyse, aprašyti K.Folkers et al., Z. Naturforsch., 41C, 1087-1091

[0003] (1986) bei K.Folkers et al., Z. Naturforsch., 42B. 101-106 (1987).

[0004] Pateikiamas išradimas susijęs su naujais peptidais ir jų dariniais, turinčiais tikslią

[0005] cheminę struktūrą. Išradime taip pat aprašyti jų gavimo ir pritaikymo metodai.

[0006] Hipotalaminį liuteinizacijos hormoną atpalaiduojantis hormonas (LHRH) veikia priekinį hipofizį, stimuliuodamas liuteinizacijos hormono (LH) sekreciją ir folikulus stimuliuojantį hormoną (FSH). LHRH antagonistiniai analogai veikia priekinį hipofizį greitai, pasižymi ilga veikimo trukme ir gali būti saugiai ir reversiškai naudojami kontracepcijai arba selektyviam gonadrotropino sekrecijos slopinimui. Šia pritaikymo prasme LHRH antagonistai yra geresni negu agonistai. Iki šio laiko žinoma per du tūkstančius sukonstruotų ir susintetintų LHRH analogų, tarp kurių "Nal-Arg" analogas pasižymi pakankamai aukštu priešnėštuminiu aktyvumu. Tačiau "Nal-Arg" analogas turi labai aukštą histamino-išskyrimo aktyvumą (HRA). Dėl to, kai daromų injekcijų dozė 50-100 kartų viršija terapinę dozę, žiurkėms atsiranda trumpalaikė snukio ir galūnių edema. Klinikinių bandymų rezultatai pademonstravo histaminą išskiriančios sistemos efektus. Kiti LHRH antagonistai, turintys DArg⁶ arba DLys⁶, pasižymėjo panašiais šalutiniais poveikiais, jų HRA ED₅₀ buvo mažiau 1 jug/ml.

[0007] Šiame išradime siūlomi nauji LHRH antagonistai, kurie pasižymi labai aukštu antiovuliaciniu aktyvumu (AOA) ir labai žemu histamino išskyrimo aktyvumu (HRA), bei nedideliais šalutiniais poveikiais.

[0008] Išradimo sukūrimo metodologija remiasi topologiniu panašumu tarp pirminio junginio

[0009] molekulės (II) ir neuropeptido substancijos P, kurių savybės modifikuoti pirminio junginio molekulėje tiek bazinę, tiek lipofilinę sritį įgalina sukurti naują antagonistą, turintį aukštą AOA ir žemą HRA. Terminas "modifikacija" šiuo atžvilgiu reiškia aminorūgščių pritaikymą ar pakeitimą (II) molelulės Tyr^5-DArg^6-Arg⁸ srityje C-gale ir aromatinių rūgščių - N-gale. Tiksliau sakant, konstravimo metodas yra atitinkamų bazinių grupių įvedimas ir negamtinių aminorūgščių pakeitimai (H) molekulės 2, 3, 5, 6 ir 8 padėtyse.

[0010] 1. D3Pal, kuri yra aromatinė aminorūgštis, turinti atitinkamą bazingumą, pakeitimas vietoje DArg⁶ (E) molekulėje, norint gauti analogą (UI):

[0011]

[0012] AA³=D3Pal,Ar-Ala, D-Ar Ala, DPhe, D-XCH₂Phe;

[0013] AA⁵=Arg, Dmap, Pip, Tyr, Pal, Tep, Map, Phe, Eap, Pap, Bap, Dmop;

[0014] _AA⁶=D_3Pal, D-ArAla, D-XCH₂Phe;

[0015] AA8 =Pip, Mop, Tep, Map, Eap, Pap, Bap, Arg;

[0016] Ar=

[0017]

[0018] R'=CH₃-, CH₃CH₂-, C₃H₇-, C₄H₉-, H-;

[0019] R'=CH₃-, CH₃CH₂-, C₃H₇-, C₄H₉-, H-;

[0020] LHRH antagonistai, kaip medicininiai peptidai, gauti pagal aukščiau aprašytą metodą, gali būti naudojami reprodukcinės endokrininės sistemos sutrikimų, tokių kaip " endometriozės, vaikų ankstyvojo lytinio subrendimo, prostatos vėžio, krūties vėžio gydymui taip pat sėkmingai, kaip ir vyrų bei moterų naudojama kontraceptinė priemonė gimimų reguliavimui; taip pat gali būti panaudojami, diagnozuojant ir gydant nevaisingumą ir 1.1. Tokie medicininiai peptidai gali būti paruošti įprastos injekcinės formos, injekcinių kapsulių arba kita vaisto forma, pritaikyta patogiam vartojimui.

[0021] substancija P vaidina labai didelį vaidmenį; jos histamino išskyrimo aktyvumas (HRA) ED₅₀ yra 5-15 Substancijos P (SP) cheminė struktūra yra

[0022] [Arg\Pro2,Lys3,Pro4,Gln5,Gln6,Phe7,Phe8,Gly9,Leu10,Metn]NH2. Jos struktūros ir HRA ryšio tyrimai parodė, kad Arg^1-Pro^2-Lys³ aminorūgštys, esančios SP molekulės N-gale, yra esminės HRA aktyvumui, kadangi šių trijų aminorūgščių iškirpimas visiškai panaikina jos HRA. Priešingai, vienos, dviejų ar trijų aminorūgščių iškirpimas molekulės C-gale, palieka HRA tokį pat aukštą, koks ir buvo. Tolesnis Phe⁸ ir Phe⁷ iškirpimas HRA sumažina atitinkamai 4 % ir 0,57%. Gln5 ir Gln6 iškirpimas neduoda žymaus HRA pasikeitimo. Pagal šiuos duomenis daroma išvada, kad aplink Phe⁸ ir Phe⁷ esanti lipofilinė sritis apsprendžia HRA dydį ir ši sritis dalyvauja, susirišant receptoriui su mast-ląstelės receptoriumi.

[0023] Kaip anksčiau minėta, LHRH analogai (D2Nal^*, DArg⁶) rodė labai aukštą HRA, jų molekulinė struktūra turi topologinį panašumą su SP: DArg^6-Leu^7-Arg⁸ pirmame darinyje atitinka Arg^1-Pro^2-Lys³ antrame darinyje, abu susidaro iš poros labai bazinių aminorūgščių liekanų, tarp kurių yra tiktai viena neutrali aminorūgšties liekana; abu LHRH analogai D2Nal¹ ir DArg⁶ ir substancija P turi dvi labai bazines aminorūgšties liekanas, kurios yra 1- ir 3-je padėtyse. Iš kitos pusės, manoma, kad aromatinių aminorūgščių liekanų grupė darinyje atitinka Phe⁸ ir Phe⁷ sritį substancijoje P pagal HRA reikšmės dydį.

[0024] Pagal pateikiamą išradimą, konstravimas apima du aspektus: vienas yra Tyr^3-DArg^6-Arg⁸ srities modifikavimas C-gale, kitas - po modifikavimo optimizavimo, geras aromatinių aminorūgščių pritaikymas bazinėje srityje C-gale. [NAc-D2Nal¹,DpClPhe², D3Pal3,Ser4,Tyr5,DArg6,Leu7,Arg8,Pro9,DAla10]NH2 (II) molekulė yra naudojama kaip pradinis junginys, kuris rodo AOA 100 %, esant 0,5 _^g kukurūzų aliejuje, ir - 57 % , esant 0,25 _/Ag.

[0025] Pirmiausia, DArg⁶ (II) junginyje gali būti pakeista bazinėmis ar neutraliomis rūgštimis, tokiomis kaip D3Pal, D6Qal, tetrahidrotriptofanu, metiltriptofanu. [NAc-D2N_al^I,DpClPhe²,D3Pal³,Ser⁴,Tyr⁵,D3Pal⁶,Leu⁷,Arg⁸,Pro⁹,DAla¹⁰]NH₂ (EI) junginys buvo gautas, D3Pal⁶ pakeitus vietoje DArg⁶ (II) junginyje. (III) junginys turėjo AOA 100 %, esant 3 / j. g, 83 % , esant 1 ju.g (kukurūzų aliejuje), ir jo HRA ED₅₀ buvo mažiau negu 1 jug/ml. Matyt, visos molekulės bazingumas gali būti lygus arba artimas tam. kad arginino pora pasiektų aukštą AOA. Kadangi 5-ta padėtis, kaip ir 6-ta padėtis, nedalyvauja receptoriniame ryšyje, daug aminorūgščių, įskaitant argininą, gali būti įterpiama 5-je padėtyje. Buvo sukurtos naujų analogų serijos. Pavyzdžiui, Arg⁵ pakeitimas vietoje Tyr³ (III) molekulėje davė (IV) junginį [NAc-D2Nal¹,DpClPhe",D3Pal³,Ser⁴,Arg⁵, D3Pal⁶,Leu⁷, Arg⁸,Pro⁹,DAla¹⁰]NH₂. Abu junginiai, (IV) ir (II), turi du argininus, bet atstumas tarp dviejų argininų (IV) junginyje, kurio geometrinis ryšys tampa 1, 4, tai yra tarp šių dviejų argininų yra dvi kitos aminorūgštys, yra didesnis, negu (II) darinyje. Todėl, HRA sumažės, ir, iš kitos pusės, kadangi yra du argininai, AOA nebus žemesnis, negu (II) junginio. Pagal biotyrimus, (IV) molekulės HRA buvo ED₅₀ 3,5 _ftg/ml, nors AOA buvo 60 %, esant 0,12 _ftg (kukurūzų aliejuje), 85 %, esant 0,25 ?g ir 100 %, esant 0,5 _^.g. Tai buvo pirmą kartą LHRH antagonistų pasiektos AOA ED₅₀ reikšmės, kurios buvo lygios ar mažesnės už 0,125 _fxg.

[0026] (IV) molekulėje yra keturios bazinės liekanos: DPal^3,6 ir Arg^5,8, tuo tarpu, kai (H) molekulė turi tik tris bazines liekanas. Todėl yra tikslinga pakeisti vieną D3Pal neutralia aminorūgštimi; iš kitos pusės, (IV) molekulė pasižymėjo labai stipriu hidrofiliškumu, todėl hidrofiliškumo sumažinimas, pakeičiant hidrofobine aminorūgštimi D3Pal vietoje, bus sėkmingas, norint išlaikyti organizme ilgesnį laiko tarpą vaistus, tuo padidinant jų efektyvumą. Pakeičiant D3Pal, buvo sukonstruotos naujos analogų serijos. (V) junginys rodė AOA 100 %, esant 1 įi % (fiziologiniame tirpale), kas atitinka pradinio junginio (IV) aktyvumą, tuo tarpu HRA sumažėjo per pusę: HRA ED₅₀ buvo 7,4 _/ig/ml.

[0027] Tolesnis DPhe² pakeitimas vietoje DpCIPhe² sumažino lipofiliškumą šioje molekulės srityje ir sumažino HRA.

[0028] Atrodo, kad Arg^5-D3Pal^6-Leu^7-Arg⁸ (IV) molekulės C-gale vaidina pagrindinį vaidmenį, įjungiant histamino išskyrimą. D3Pal jungia aromatiškumo, bazingumo ir hidrofiliškumo savybes vienoje molekulėje ir, be to, yra stereo-priėmėjas receptoriniam ryšiui LHRH antagonistuose. Panašiai, naujų negamtinių aminorūgščių serijų konstravimas buvo tokio pačio pobūdžio, kaip ir D3Pal, ir įgalino pagerinti LHRH antagonistus, lyginant su (IV) ir (V).

[0029] Gamtinių lipofilinių aromatinių aminorūgščių, pavyzdžiui, fenilalanino, modifikavimas pagal žemiau aprašytą metodą "Naujų negamtinių aminorūgščių sintezė", įgalino sukurti naujas aminorūgštis, kurios vienoje molekulėje jungia aromatiškumą, hidrofiliškumą ir bazingumą ir gali būti atvaizduojamos formule: R iR 2NCH 2C 6H 4CH 2CH(NH 2)C02H (VI), kurioje Ri ir R₂ gali būti tokios pačios arba skirtingos grupės, kurios gali būti atviros grandinės arba ciklinės, o taip pat turėti heteroatomą. Pakeitus R_i ir R₂, gali būti gaunamos tokios aminorūgščių serijos, kuriose sistemiškai pakeistas bazingumas ir hidrofiliškumas, arba pakeisti optiniai izomerai. Šių aminorūgščių įvedimas (IV) molekulės 5-, 6- ar 8-je padėtyse davė tris LHRH naujų antagonistų serijas. Biotyrimų rezultatai parodė, kad kiekviena serija turi mažiausiai vieną naują antagonistą, kurio AOA pasireiškia 100 %, esant 1 pg; šis rezultatas panašus į (IV) molekulės, nors HRA buvo žymiai mažesnis. Kaip pavyzdys buvo (VII): [NAc-D2Nal¹,DpClPhe²,D2Pal³,Ser⁴,Mop_5,D3Pal⁶,Leu⁷,Arg⁸,Pro⁹,DAla¹⁰]NH₂, kurio AOA, esant 1 įx g, pasireiškia 100 %, HRA ED₅₀ yra 14,7 ju-g/ml, ir šis rezultatas buvo geresnis, negu (V) junginio. Pakeitus Arg⁸ (IV) molekulėje, HRA pasireiškimas buvo tiesiog proporcingas R ilgiui (VI) molekulėje; tuo būdu HRA ED₅₀ gali būti aukštesnis, negu 200 ju.^g_/ml, ir tokios rūšies junginiai gali būti lengvai ištirpinami vandeniniame tirpale, ir tikimasi, kad klinikoje toks junginys, kaip vaistinė forma, bus panaudojamas be problemų. Iš rezultatų matosi, kad Arg⁸ ar Lys⁸ nebuvo esminiai LHRH antagonistų pasireiškimui. Atitinkamas bazinis centras, esnatis 8-je padėtyje, gali užtikrinti aukštą AOA, tuo tarpu indukuojamų mast-ląstelių aktyvumas išskirti histaminą buvo pastebimai sumažėjęs, kai anksčiau minėtas bazinis centras paveikiamas žymių erdvinių trukdymų.

[0030] Šis išradimas apima modifikacijas N-gale ir C-gale ir tuo įgalina pagerinti LHRH antagonistus.

[0031] 1. Naujų negamtinių aminorūgščių sintezė

[0032] Per 60 serijų ir neįeinančių į serijas, D- arba L-aminorūgščių yra sukonstruota ir susintetinta keturiais sintezės būdais, kurių schemos duotos žemiau. Šių negamtinių aminorūgščių struktūra parodyta bendra struktūrine formule, pateikta toje pačioje schemoje. Kai kurios iš šių aminorūgščių pasižymi bazingumu, hidrofiliškumu arba aromatiškumu pasirinktinai, tuo tarpu kitos aminorūgštys turi visas šias savybes vienoje molekulėje.

[0033]

[0034] Sintezė pradedama peptido C-gale ant benzhidrilamino hidrochlorido dervos nešiklio, naudojant Merrifieldo sukurtą kietos fazės peptidų sintezės metodą. Šiame trijų stadijų procese yra pritvirtinimas, surišimas ir atskėlimas. Dichlormetanas (DCM) yra pagrindinis tirpiklis, naudojamas plovimui po kiekvienos reakcijos stadijos, nors, jeigu reikia, naudojamas ir izopropilo alkoholis (IPA) ir N,N-dimetilformamidas (DMF). Surišimo reakcija vykdoma dicikloheksilkarbodiimido (DCC) pertekliumi, pridedant adekvatų kiekį 1-hidroksibenzotriazolo (HOBT). Surišimo reakcijos laipsnis sekamas Kaises ninhidrino metodu. Sekanti sintezės stadija daroma tuo atveju, jei Kaises testas yra teigiamas. Po galutinio visų reikalingų reakcijų įvykdymo peptido grandinė atskeliama nuo dervos, naudojant bevandenį vandenilio fluoridą (HF), esant anizolui, kol bus atskeltos visos apsauginės grupės. Perplovus etilo acetatu arba eteriu, nevalytas LHRH antagonistų produktas gaunamas, ekstrahuojant vandenine acto rūgštimi, po to liofilizuojama. Šio proceso išeiga per 50 %.

[0035] 1. Peptidas gryninamas gelfiltracija arba per silikagelio koloną, kurios aukštis yra 60-100 cm, su UV/TLC detektoriumi. Grynas LHRH gaunamas liofilizavus pagrindines frakcijas. Išeiga yra 50-90 %, o švarumas gali būti virš 90 %. 2. Peptidas toliau gryninamas Waters'o didelio efektyvumo skystiniu chromatografu (HPLC), naudojant atvirkščių fazių C-18 kolonėlę (7,8 x 300 mm) (_/i-Bondapak 84176). Šioje stadijoje išeiga yra 20-50 %, o grynumas ne mažesnis nei 99 %. 4. Peptido grynumo analizė

[0036] Chromatografija vykdoma ant plastikinės plokštelės, padengtos silikagelio 60 F254 sluoksniu; plokštelės aukštis 5-10 cm. Penkiose skirtingose tirpiklių sistemose peptidai davė vieną dėmę.

[0037] Visi peptidai eliuavosi, duodami vieną piką dviejose tirpiklių sistemose, naudojant Waters HPLC sistemą, analitinė kolonėlė (^,-Bondapak 27324); optinis tankis matuotas prie 210 nm. Mėginio dydis - 10-200 ĮjLg. 5 . Peptido aminorūgščių analizė

[0038] Pagal PICO-TAG metodą, sukurtą Waters'o kompanijos, 50 _fxg mėginio, kuris prieš tai 2 vai. išdžiovinamas vakuume, buvo pasverta 10"⁵ tikslumu. Ištirpinama vandenyje ir 10 _/xg mėginio įpilama į reakcijos vamzdį, kuriame atitinkamai pagal instrukciją įpilta druskos rūgšties 1:1 (turinčios 1 % fenolio). Reakcija vyksta 22-24 vai. 105 °C temperatūroje sandarioje talpoje, kuri buvo užpildyta azotu ir vakuumu iš reakcijos vamzdžio pašalintas deguonis. Siekiant gauti aminogrupę, išgarinus druskos rūgšties perteklių, pridedama fenolio izotiocianato. Po to analizuojama HPLC sistema su PICO-TAG aminorūgščių analitine kolonėle, matuojant optinį tankį 254 nm bangoje. Apskaičiuojamas aminorūgščių kiekis ir santykinė molekulinė masė; norint žinoti mėginio aminorūgščių sudėtį, lyginama kiekvienos aminorūgšties integruota sritis su Waters'o H-standartiniu pavyzdžiu. Klasikinis jonų mainų ninhidrino metodas (IEN) buvo naudojamas kaip kontrolė ir davė tokius pačius rezultatus. Tačiau, norint gauti patenkinančius rezultatus, jam reikėjo 10 kartų daugiau medžiagos.

[0039] Buvo naudotas Korbin'o antiovuliacinis žiurkių metodas. Eksperimente naudotos sveikos, suaugusios SD žiurkių patelės (200-250 g svorio). Visi gyvuliukai buvo laikomi 22-24 °C temperatūroje 14 vai. /10 vai. (šviesa/tamsa) režime. Gyvuliukai maitinami įprastu maistu ir vandeniu, jo neribojant. Žiurkės turėjo mažiausiai du nuoseklius 4 dienų estralinius ciklus, kurių metu pagal paimtus iš vaginų tepinėlius buvo nustatyta, ar gyvūnai tinkami naudoti šiame eksperimente. Estralinio ciklo viduryje žiurkėms skirtingomis dozėmis fiziologiniame tirpale injekuoti peptidai (LHRH antagonistai). Kitą dieną žiurkės pjaunamos ir, siekiant nustatyti kiaušialąsčių kiekį, jų kiaušintakiai iš abiejų pusių tiriami preparavimo lupa. Pagal gautą dozę, žiurkės buvo suskirstytos į keletą grupių, apie 10 žiurkių kiekvienoje, taip pat 9-10 žiurkių kontrolinė grupė, kurioms suleistas toks pats kiekis fiziologinio tirpalo. Antiovuliacinis aktyvumas (AOA) išskaičiuojamas pagal lygtį:

[0040] Eksperimente naudotos sveikos, suaugusios žiurkių SD patelės (200-250 g svorio), laikytos vienodose sąlygose. Po ansestezijos su CO₂, pilvo ertmė plaunama 50 ml PIPES AC terpe, turinčia 20 vienetų heparino. Nucentrifugavus 200xg 8 min. 4 °C temperatūroje, ląstelės vėl plaunamos ir po to suspenduojamos iki 8-24 x 10⁵ bendro leukocitų sk./ml koncentracijos PIPES AC terpėje. Tokioje suspensijoje yra apie 5-10 % mast-ląstelių. Perplautos ląstelės naudojamos tuoj pat po surinkimo, pašildomos 5 min. 37 °C temperatūroje prieš supilstant į mėgintuvėlius, kuriuose yra po 0,3 ml skiesto peptido. Mišiniai inkubuojami 15 min. 37 °C temperatūroje, ir reakcija sustabdoma, mišinius nucentrifuguojant 400xg 15 min. 4 °C temperatūroje. Po ekstrakcijos n-butanoliu ir n-heptanu, histamino kiekis nuopiluose nustatomas įprastu fluorimetriniu metodu. Histamino kiekis surandamas pagal histamino standartinę kreivę (žr. žemiau). Išskiriamo histamino kiekis procentais gali būti išskaičiuojamas pagal formulę:

[0041] kurioje E - eksperimentinio mėginio reikšmė, B - mėginio, kuriame yra ląstelės ir buferis, reikšmė ir C - ląstelės, apdorotos HCIO₄.

[0042] Standartinė kreivė gaunama, nubraižant tiksliai pasverto histamino hidrochlorido nuosekliai kintančių koncentracijų tirpalų optinio tankio (OD) reikšmes, išmatuotas fluorimetriškai, kai fluorescencija sužadinama 350 nm banga, o fluorescencijos atsakas registruojamas 450 nm bangoje. Santykinis dydis r, išskaičiuotas iš histamino standartinės kreivės yra 0,9998, ir mažiausia histamino koncentracija, kurią galima išmatuoti, yra 0,5 ng/ml.

[0043] Peptido aktyvumo dydis ED₅₀ gali būti išskaičiuojamas iš dozę atitinkančios kreivės, nubraižytos ant pusiau logoritminio popieriaus, atidedant histamino išskyrimo priklausomybę nuo peptido koncentracijos.

[0044] Visi peptido pavyzdžiai testuojami su mast-ląstelėmis, paimtomis iš 3 skirtingų žiurkių..

[0045] Šiame eksperimente naudojamos sveikos, suaugusios žiurkių SD patelės (250 g svorio). Žiurkėms daromos Evan'o blue (po 1 ml 0,05 % koncentracijos) tirpalo intraveninės injekcijos. Po to, tuoj pat po 0,05 ml peptido tirpalo (atitinkamai 5, 0.5 ir 0,05 jLtg/ml koncentracijos) ir fiziologinis tirpalas, kaip kontrolė, suleidžiamas po oda į gyvuliuko užpakalio nuskustą vietą. Praėjus 30 min. po injekcijos, žiurkės pjaunamos, ir nulupama nugaros oda. Pažeistos odos diametrai išmatuojami dvejomis statmenomis kryptimis skriestuvu. Kontrolinės odos diametras paprastai yra mažesnis negu 5,5 mm.

[0046] Evan'o blue kiekis, patekęs į odą iš kraujo indų, taip pat gali būti spektrofotometriškai išmatuotas. Pažeistos srities oda išpjaunama ir pamerkiama nakčiai į acetono/fiziologinio tirpalo (7:3, tūris/tūris) mišinį. Kitą dieną nucentrifuguojama, ir Evan'o blue kiekis supernatante išmatuojamas spektrofotometru (UV-260) 610 nm bangoje, lyginant su kontroliniu acetono/fiziologinio tirpalo (7:3, tūris/tūris) mišiniu. Kiekvienas peptidas buvo testuojamas, darant injekcijas trims skirtingoms žiurkėms.

[0047] Pagal aukščiau aprašytą metodą buvo sukonstruota ir susintetinta įvairūs nauji LHRH antagonistai. Trumpai tariant, naujos LHRH analogų struktūros gautos kaip atskiros arba sudėtinės medžiagos, sudarytos iš daugelio gamtinių ir negamtinių aminorūgščių, išvardintų ankstesniuose skyriuose.

[0048] Dalis naujų LHRH antagonistų pavyzdžių pateikiama 1 lentelėje.

[0049]

[0050] Abejotina, kad čia aprašyti LHRH antagonistai, kaip medicininių peptidų rūšis, būtų įvedami oraliniu būdu. Tačiau jie gali būti nesunkiai padaromi liofilizuotų miltelių pavidalu, ištirpinant juos fiziologiniame tirpale ir naudojant injekcijoms į veną, po oda ir į raumenis.

[0051] Dar daugiau, yra tiriama ilgo veikimo išnešiojimo sistemos, tokios kaip biodegradacija ir injekcinės kapsulės. Kapsulės galėtų būti implantuotos po oda specialiu švirkštu ir būtų audinių absorbuojamos po to, kai išsiskirtų visas peptido kiekis ir nereikėtų jų pašalinti chirurginiu būdu. Ilgo veikimo išnešiojimo sistema yra specialiai naudojama klinikoje, įvedant ilgalaikius LHRH analogus.

[0052] Toliau pateikiami pavyzdžių (imant tris analogus IV, V ir VII, kaip tipinius pavyzdžius) analizės rezultatai:

[0053] Gaunama tik viena dėmė, chromatografuojant penkiose skirtingose tirpiklių sistemose.

[0054] Eliuuojasi tiktai vienu piku, chromatografuojant dviejose skirtingose tirpiklių sistemose. Rf dydis ir sulaikymo trukmė (TR) parodyta 2 lentelėje, su nuoroda į 1-4 figūras.

[0055] Analizė vykdoma pagal klasikinį IEN ir naują PICO-TAG metodą, ir rezultatai pateikiami 3 lentekėje ir 5, 6 figūrose.

[0056] Biotyrimų rezultatai, parodantys antiovuliacinį aktyvumą, esant skirtingoms dozėms, ir histamino-išskyrimo aktyvumą ED₅₀ in vitro, pateikiami 4 lentelėje, kurioje, kaip pavyzdžiai, išvardinti 26 antagonistai.

[0057] Pateikiami sutrumpinimai, kurie buvo naudojami šio patento dokumento tekste.

[0058] Ala alaninas AOA antiovuliacinis aktyvumas Arg argininas

[0059] Bap dibutilaminometilfenilalaninas Boc t-butiloksikarbonilas BuOAc butilo acetatas

[0060] CAT odos anafalaktoidinis testas DCC dicikloheksilkarbodiimidas DCM dichlormetanas

[0061] ED₅₀ efektyvi dozė, duodanti 50 % atsaką EtOAc etilo acetatas

[0062] FSH folikulus stimuliuojantis hormonas Glu glutamino rūgštis

[0063] HPLC ninhidrino darinių didelio efektyvumo skystinė chromatografija HRA histamino-išskyrimo aktyvumas HRT histamino-išskyrimo testas

[0064] IEN jonų mainų chromatografija su papildomomis operacijomis IPA izopropilo alkoholis

[0065] LHRH liuteinizacijos hormoną atpalaiduojantis hormonas Leu leucinas

[0066] nBuOH n-butilo alkoholis NS fiziologinis tirpalas

[0067] Pipes piperazin-N,N'-bis(2-etansulsorūgštis) Pro prolinas

[0068] Tep tetrahidroperolil-metilfenilalaninas

Apibrėžtis

1. Liuteinizacijos hormoną atpalaiduojančio hormono (LHRH) antagonistų konstravimo ir sintezės būdas, besiskiriantis tuo, kad naudoja aukšto aktyvumo LHRH antagonistą:[NAc-DZNal¹, DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Tyr⁵, _Arg⁶, Leu⁷, _Arg⁸, _Pro⁹, D Ala10] NH₂ (D) kaip tėvinį junginį ir modifikuojant šios molekulės šarminę ir lipofilinę sritis, siekiant gauti naujus LHRH antagonistus, pasižyminčius aukštu antiovuliaciniu aktyvumu (AOA) ir žemu histaminą išskiriančiu aktyvumu (HRA), pagrįstas jų topologiniu panašumu su neuropeptido molekule_.substancija P.

2. Būdas pagal 1 punktą, besisikiriantis tuo, kad (d) molekulėje pritaiko ir pakeičia amino rūgštis Tyr^5-Arg^6-Arg⁸ C-gale ir aromatinės amino rūgštis N-gale.

3. Būdas pagal 1 ir 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad atitinkamą bazinę grupę įterpia 2-, 3-, 5-, 6-, 8-je padėtyse ir aukščiau išvardintose padėtyse įjungia negamtines aminorūgštis.

4. Būdas pagaal 1 ir 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad D3Pal pakeičia DArg (H) molekulėje ir gauna analogą (UI):[NAc-D2Nal¹, DpCIPhe², D3Pal\ Ser⁴, Tyr⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, _Arg⁸, _Pro⁹, D Ala10] NH₂.

5. Būdas pagal 1 ir 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad Arg⁵, pakeičia vietoje Tyr⁵ (III) molekulėje ir gauna analogą (IV): [NAc-D2Nal¹, DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, D Ala10] NH₂..

6. Būdas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad DPhe³ pakeičia vietoje D3Pal³ (IV) molekulėje ir gauna analogą (V): [NAc-D2Nal¹, DpCIPhe², DPhe³, Ser⁴, Tyr⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, ^DAla¹⁰] NH₂.

7. Būdas pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad DPhe³ pakeičia vietoje D3Pal³ (TTT) molekulėje ir gauna analogą (VI): [NAc-D2Nal¹, DpCIPhe², DPhe³, Ser⁴, Tyr⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰] NH2

8. LHRH antagonistas pagal 1 punktą, besiskiraintis tuo, kad jo formulė yra [NAc-D2Nal\ AA², AA³, Ser⁴, AA⁵, AA⁶, Leu⁷, _AA⁸, Pro⁹, DAla¹⁰] NH₂, kurioje AA yra natūralios ar nenatūralios amino rūgštys formulėse D- ar L-ArAla, kuriose

9. LHRH antagonistai pagal 8 punktą, besiskiriantys tuo, kad AA² = D-pCIPhe, D-ArAla, DPhe, Ar-Ala, DXCH₂Phe;AA³ = D3Pal, Ar-Ala, D-ArAla, DPhe, D-XCH₂Phe;AA⁵ = Arg, DMap, Pip, Tyr, Pal, Mop, Tep, Map, Phe, Eap, Pap, Bap, DMop; AA⁶ = D3Pal, D-Ar-Ala, D-XCH₂Phe;AA⁸ ₌ Pip, Mop, Tep, Map, Eap, Pap, Bap, Arg;kuriose

10. LHRH antagonistai pagal 8 arba 9 punktus, skirti panaudoti reprodukcinės endokrininės sistemos sutrikimų, tame tarpe endometriozės, vaikų ankstyvojo lytinio subrendimo, taip pat prostatos vėžio ir krūties vėžio gydymui, bei kaip vyrų ir moterų kontraceptinė priemonė gimimų reguliavimui arba nevaisingumo diagnostikai ir gydymui.

11. LHRH antagonistai pagal 8 arba 9 punktą, besiskiriantys tuo, kad jų vaisto forma yra įprastos injekcinės medžiagos, injekcinės kapsulės ar kitos vaistinės kompozicijos pavidalu.

12. Junginys, kurio formulė yra [N-Ac-D2Nal¹, P-Cl-D-Ph_e², D3Pal³, Ser⁴, Mop⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, A_rg⁸, Pro⁹, D Ala10] NH₂ arba [N-Ac-D2Nal\ P-Phe², D3Pal³, Ser⁴, Mop⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, A_rg⁸, Pro⁹, D-Ala¹⁰] NH₂ arba [N-Ac-D2Nal¹, P-Cl-D-Ph_e², D3Pal³, Ser^4, _Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, D Ala10] NH2

Brėžiniai