[LT] Sujungtų baltymų, geno struktūros, hibrido gavimo būdas ir streptomicetų ląstelių transformavimo būdas. @Genų struktūros, kurios koduoja signalinę seką ir nuo 7-tos iki 10-tos pirmųjų tandemo aminorūgščių, o taip pat pageidaujamas baltymas išskiria streptomicetų ląstelėse-šeiminikuose didele išeiga ir sujungti baltymai sekretuojami į terpę.
[EN]
[0001] Išradimas priskiriamas biotechnologijos sričiai ir susijęs su sujungtų baltymų, geno struktūros ir hibrido gavimo būdu bei streptomicetų ląstelių transformavimo būdu.
[0002] Žinomas sujungtų baltymų gavimo būdas, kai modifikuoto tandeminio geno būtinumo atveju pageidaujamo baltymo struktūrinį geną prijungia prie koduojančio siūlo 3'-galo, šitą geno struktūrą ekspresuoja į streptomicetų lęsteles-šeimininkus ir iš supernatantinio skysčio išskiria sekretuotą sujungtą baltymą (EP- Nr. A 0289936). Geriausiame variante tandeminis genas sutrumpinamas 3'-gale. Sutrumpinimui panaudojamos reslrikcinių fermentų BstEII tripletų 31 ir 32 srityje, StuI tripletų 43 ir 44 srityje, o taip pat Sau3 A tripetų 52 ir 53 srityje skaidymo vietos.
[0003] Toliau tobulinant šią idėją, buvo pasiūlyta gauti sujungtą baltymą, kurio tandeminėje dalyje yra sutrumpintas proinsulinas, kurio C-grandinė sudaryta tiktai iš vienos arba dviejų lizino liekanų ("mini-proinsulinas"). Toliau buvo pasiūlyta panašiuose sujungtuose baltymuose taip pat trumpinti tandeminę dalį (EP- Nr. A 367163 ).
[0004] Pastaruoju metu netikėtai surasta, kad sujungti baltymai su labai trumpa tandemine dalimi streptomicetų ląstelėje yra stabilūs ir išsiskiria į terpę. Tokiu būdu gauti sujungti baltymai dėl labai trumpos tandeminės grandinės elgiasi kaip "subrendę" baltymai ir terpėje egzistuoja taisyklingos tretinės struktūros pavidalu.
[0005] Iš EP- Nr.A 0177827 žinoma sintetinė signalinė DNR seka baltymų transportui į ekspresijos sistemas, kuri skiriasi tuo, kad ši DNR iš esmės atitinka gamtinę signalinę seką, bet turi vieną arba keletą endonukleazių skaidymo vietų, kurių nėra gamtinėje DNR. Jeigu transportuojamo baltymo genas prijungiamas prie tokios DNR sekos, šis sujungtas genas įstatomas į vektorių ir tokiu būdu transformuojama ląstelė-šeimininkas, kuri transportuoja išsiskyrusį baltymą iš citoplazmos,ir taip galima gauti eukariotinius, prokariotinius arba virusinius baltymus prokariotinėse ir eukariotinėse ląstelėse. Periplazminio baltymo - šarminės fosfatazės pavyzdžiu parodyta, kad E. coli ekspresijoje pageidautina, kad jis būtų įvestas po maždaug 40 pirmųjų šarminės fosfatazės aminorūgščių kodonų sekos prieš pageidaujamo baltymo struktūrinį geną.Tačiau daugeliu atvejų pakanka mažesnio papildomų aminorūgščių skaičiaus, pavyzdžiui 10, dar geriau - apie 5. Atitinkamas sujungtas baltymas su beždžionių proinsulinu maždaug iki 90 % transportuojasi į periplazminę erdvę.
[0006] Pasiūlytas sujungtų baltymų gavimo būdas, konstruojant mišrų oligonukleotidą, kuris koduoja sujungto baltymo balastinę dalį (PCT Nr. 91/03550 ).Sis oligonukleotidas įvedamas į vektorių tokiu būdu, kad jis būtų funkcionaliai sujungtas su reguliacijos sritimi ir norimo baltymo struktūriniu genu; taip gauta plazmidės populiacija transformuojamos tinkamos ląstelės-šeimininkai ir selekcionuojami tie klonai, kurie turi didelę koduoto sujungto baltymo išeigą. Šiuo atveju oligonukleotidas susideda daugiausia iš 4-12, ypatingais atvejais - iš 4-8 tripletų.
[0007] Bandyta gauti sujungtus baltymus su trumpa balastine dalimi. Pavyzdžiui, buvo gautas genų sujungimas, kuris koduoja sujungtą baltymą iš P-galaktozidazės pirmųjų 10 aminorūgščių ir somatostatino. Tačiau pasirodė, kad šio trumpo P-galaktozidzės fragmento nepakanka, kad sujuntas baltymas būtų apgintas nuo šeimininko proteazių
[0008] (US-A 4366246, 15 skiltis, 2 pastraipa). Išeinant iš to, EP- Nr.A 0290005 ir EP-Nr.A 0292763 aprašyti sujungti baltymai, kurių balastinė dalis sudaryta iš P-galaktozidazės fragmento, susidedančio iš 250 aminorūgščių.
[0009] Vistik dabartiniu metu sujungti baltymai, sudaryti iš tandemo pirmųjų maždaug 10 N-galinių aminorūgščių ir pageidaujamo baltymo, pavyzdžiui, proinsulino, netikėtai pasirodė stabilūs streptomicetų ląstelėse-šeimininkuose ir galintys išsiskirti į terpe, iš kurios jie gali būti išskirti su didele išeiga. Tai turi reikšmės palyginus nedideliems baltymams, tokiems kaip "mini-proinsulinai".
[0010] "Maždaug 10 aminorūgščių" reiškia, kad turima galvoje ir mažesnis aminorūgščių skaičius, pavyzdžiui, pirmosios 7 tandemo N-galo aminorūgštys, bet optimaliausia - ne daugiau 10. Optimalus variantas - kai sujungtų baltymų tandeminėje dalyje 7-je ir/arba 9-je padėtyse (kaip ir gamtinėje sekoje) yra prolinas.
[0011] Savaime aišku, pagal žinomus ir siūlomus variantus (EP- Nr.A 0367163)galima rinktis didele tandemine balastinę dalį, žinoma tuo pačiu vis labiau mažėja nedidelio "balasto" pranašumas.
[0012] Galima ir net rekomendviotina varijuoti tandeminės dalies gamtinę 7-10-tos padėties aminorūgščių seką, t.y. pakeisti nesančiomis gamtinėje sekoje aminorūgštimis. Be to, galima varijuoti aminorūgščių seką signaliniame peptide.
[0013] Išradimo esmė ta, kad paprastų preliminarinių bandymų dėka gali būti lengvai nustatomos ypatingai tinkamos sujungtos konstrukcijos.
[0014] Be to, išradimo idėjos gali būti įgyvendintos kitose gram-teigiamų bakterijų ląstelėse, pavyzdžiui bacilų arba stafilokokų ląstelėse,panaudojant signalines sekas, kurias "atpažįsta" šie šeimininkai.
[0015] Sujungti baltymai, gauti pagal šį išradimą, yra ištirpę terpėje, o tai yra labai patogu toliau apdorojant ir valant. Pavyzdžiui, galima vykdyti fermentinį apdorojimą betarpiškai su sekrecinio produkto pagalba, atskiriant balastinę dalį ir išvengiant apdorojimo stadijų, reikalingų netirpių sujungtų baltymų atveju. Prieš tolesnį apdorojimą, galima kondensuoti arba valyti, pavyzdžiui, afininės chromatografijos, o taip pat ultrafiltracijos, nusodinimo, jonų kaitos, adsorbcinės chromatografijos, gelfiltacijos arba aukšto slėgio skysčio chromatografijos būdu.
[0016] Konstruojant plazmidę, pradine medžiaga imta plazmidė pKK500, pasiūlyta EP-A 0367163. Ši pla/midė skiriasi nuo žinomos iš EP-Nr.A 0289936 plazmidės pKK400 tuo, kad proinsulino genas yra pakeistas analogišku genu, kuris vietoj C-grandinės koduoja tik aminorūgštį liziną, o taip pat ir tuo, kad po šio "mini-proinsulino" geno yra įvestas terminatorius. Kaip priedas prie aprašymo, duodamos 1 ir 2 lentelės iš EP-A 0367163, kuriose atvaizduotas "mini-proinsulino" genas, atitinkamai, terminatorius.
[0017] Plazmidės pKK400 ir pKK500 inhibuojančio a-amilazę geno signalinėje sekoje turi XmaIII skaidymo vietą (tripleto 5-7 srityje).
[0018] Plazmide pKK5()0 sukarpo restrikciniais fermentais EcoRI ir XmaIII ir gelio elektroforezės būdu ant 0,8 %-nio agarozės gelio išskiria didelį fragmentą, kurį po to atskiria elektroeliucijos pagalba. Šį fragmentą liguoja su DNR fragmentu (1), susintetintu fosforamidatiniu būdu (SEQ ID NO:l) ir liguotą mišinį transformuoja į E. coli.
[0019] Gauna plazmidę pKK510. Ji koduoja pre-proinsuliną, kuriame po signalinės tandemo sekos eina pirmosios,7 aminorūgštys ir po to mini-proinsulino grandinė.
[0020] Analogiškai aprašytam EP-A 0289936 plazmidės pKK400 pakeitimo į ekspresijos plazmidę pGF 1 būdui, plazmidę pKK510 paverčia ekspresijos plazmide pKFl: izoliuotą DNR-plazmidę pKK510 sukarpo restrikcinių fermentų Sphl ir SstI pagalba ir atskiria nedidelį fragmentą su sujungtu genu. Parduodamą ekspresijos plazmidę pIJ 702 (John Innes Foundation, Norvvich, Anglija) sukarpo tų pačių fermentų pagalba ir atskiria didelį fragmentą. Šiuos abu izoliuotus fragmentus liguoja, liguotą mišinį transformuoja į S. lividans TK24 ir iš tiostrepton-rezistentų, baltų (t.y. nesugebančių gaminti melanino) transformantų išskiria plazmidę.Klonus, kurie turi įvestą intarpą, augina pastoviai purtomoje kultūroje ir tiria sujungtų baltymų susidarymą.
[0021] Koduoto sujungto baltymo ekspresija vyksta žinomu būdu. Jeigu transformuotą štamą inkubuoja 4 dienas purtyklėje esančiose kolbose aukštesnėje nei 25 oC temperatūroje ir eentrifugavimu atskiria micelj nuo kultivavimo skysčio, tai dėka nudažymo COOMASSIE-mėliu, gaunant papildomą baltymo juostą, kuri neišryškėja kontroliniame eksperimente, kuriame štamas transformuotas tik pIJ 702 pagalba, susidariusį sujungtą baltymą galima aptikti po elektroforezės 20 jam supernatantiniame skystyje ir kultivavimo skysčio filtrate 15 %-niame poliakrilamido gelyje.
[0022] Jei kultivavimo skysčio filtratą paveikia lizilendoproteinaze, tai gelio elektroforezės būdu galima aptikti Des-(B30)-Thr-insuliną, kurį patvirtina autentiška kontrolė.
[0023] Toliau, insulino antikūnų pagalba arba imunoblokavimo keliu, arba radioimuninės insulino analizės pagalba kultivavimo skysčio filtrtae galima aptikti sujungtą baltymą.
[0024] Pagal 1 ir 2 pavyzdžiuose aprašytas metodikas, tik panaudojant sintetinį fragmentą
[0025]
[0026] Šios plazmidės koduoja sujungtą baltymą, kuris skiriasi nuo aprašyto 1 ir 2 pavyzdžiuose tuo, kad po pirmųjų 7 tandemo aminorūgščių seka asparaginas (vietoj gamtinės aminorūgšties - alanino), o devintoji aminorūgštis tandeme yra prolinas. Taigi, dėl alanino pakeitimo asparaginu įvedamas papildomas teigiamas krūvis į sujungto baltymo balastine dalį. Netikėtai, gaunama 20-30 % daugiau norimo produkto negu 2 pavyzdyje.
[0027] Pagal 1 ir 2 pavyzdžiuose aprašytas metodikas, bet panaudojant sintetinį fragmentą
[0028]
[0029] gauna atitinkamai plazmides pKK320 ir pKF3. Šios plazmidės skiriasi nuo plazmidžių, gautų 1 ir 2 pavyzdžiuose, tuo, kad jos koduoja tandeme pirmąsias 9 gamtines aminorūgštis. Lyginant su 2 pavyzdžiu, išeiga beveik 10 % didesnė.
[0030] Sujungtas baltymas, koduotas pKK500, tarp tandeminės dalies ir proinsulino B-grandinės turi Iinkerine seką, kuri koduoja aminorūgštis Asn-Ser-Asn-Gly-Lys. Galinį Lys ir sudarantį C-grandinę Lys pakeičia žemiau aprašytu būdu. Tam tikslui proinsulino sekoje kodono B30 iki Al srityje naudojama vienintelė kirpimo vieta Styl.
[0031] Išskirtą DNR-plazmidę pKK500 sukarpo Styl pagalba, išsikišusių galų pašalinimui paveikia SI nukleaze, kurios perteklių išekstrahuoja fenolio ir chloroformo mišiniu. Gautą linijine plazmide vėl karpo EcoRI, elektroforezės būdu atskiria didyjį fragmentą ir elektroeliueijos keliu jį išskiria. Šį fragmentą liguoja su sintetiniu fragmentu (4) (SEQ ID NO:4)
[0032] Koduoto sujungto baltymo ekspresijai fragmentas, ištyrus jo seką, liguojamas į vektorių pIJ 702, sukarpytą tų pačių fermentų ir gaunamas ekspresijos vektorius pGF4.
[0033] Koduotą pGF4 ir sekretuotą sujungtą baltymą galima nustatyti, pirma, testo ant plokštelių su a-amilazės inhibitoriumi pagalba (EP-A 0161629, 3 pavyzdys) ir, antra, analogiškai 2 pavyzdžiui, iš auginamos pastoviai purtant kultūros supernatantinio skysčio.
[0034] Jeigu pagal 5 pavyzdyje aprašytą metodiką fragmentas (4) įvedamas į vektorius pKK510, 520 ir 530, tai gaunami vektoriai pKK610, 620 ir 630. Sujungtus baltymus koduojančios sekos pagalba įmontuoti atitinkamai SphI-Sstl-fragmentai j vektorių pIJ 702 duoda ekspresijos vektorius pKFll, 12 ir 13. Sekretuotų sujungtų baltymų ekspresija patikrinama pagal 2 pavyzdį.
[0035] Plazmidės pIJ 702 produktų ekspresijos padidinimui, iš jos PstI ir Sphl pagalba pašalinamas melanininis promotorius ir pakeičiamas fragmentu (5) (SEQ ID NO:5)
[0036]
[0037] Taip iš sintetinio ir tandeminio promotorių gaunama tandeminė konstrukcija. Plazmidė pavadinta pGRI 10.
[0038] Jeigu į p(ikl 10 po kirpimo su Sphl ir SstI įstatomi sintetiniai fragmentai (1), (2) ir (3), gaunami ekspresijos vektoriai pGR200, 210 ir 220. Analogišku būdu fragmento (4) pagalba gaunami ekspresijos vektoriai pGR250, 260 ir 270.
[0039] Jeigu iripsino arba panašiai veikiančio fermento ir karboksipeptidazės B kombinacijos keliu iš insulino pirmtakų reikia gauti žmogaus insuliną, tai geriau atskyrimo reakcijos eigoje greitai atskirti balastinę dalį su amino galais, kad būtų paskatinamos skaidymo reakcijos B31 (Arg)-insulino kryptimi. Tam tikslui siūloma aminorūgščių prieš aminorūgštį BĮ (Phe) modifikacija.
[0040] l'agal 1 pavyzdyje aprašytą metodiką plazmidę pKK500 sukarpo restrikcinių fermentų EcoRI ir DralII pagalba. Po to pirminį fragmentą fosforamiditiniu metodu pakeičia į sintetinį DNR-fragmentą (6) (SEQ ID NO:6)
[0041]
[0042] Klonavimą E. coli ląstelėse ir ekspresiją Streptomyccs lividcins ląstelėse atlieka pagal atitinkamai 1 ir 2 pavyzdžius. Gauna atitinkamai plazmides pKK640 ir pKF14.
[0043] Analogiškai galima elgtis su plazmide, kurią gauna pagal 5 pavyzdį (įstačius fragmentą (4)).Taip gaunamos atitinkamai plazmidės pKK650 ir pKF15.
1. Sujungtų baltymų gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad pageidaujamo baltymo struktūrinį geną suriša su signalinės sekos kodonu ir tandemo pirmomis maždaug dešimtimi aminorūgštimis, šią geno struktūrą įveda į streptomicetų ląsteles-šeimininkus ekspresijai ir sekretuotą sujungtą baltymą išskiria iš supernatantinio skysčio, ir tandeminio geno sekos gali būti modifikuotos.
2. (ieno struktūros gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad signalinę seką ir ir maždaug dešimt pirmų tandemo kodonų suriša su kito baltymo struktūriniu genu.
3. Būdas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad tandeminėje dalyje praleidžia, pakeičia arba įveda į ją aminorūgščių kodonus.
4. Būdas pagal 2 arba 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad tarp tandeminio geno ir pageidaujamo baltymo struktūrinio geno įvesda linkerinę seką.
5. Hibrido gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad geno struktūrą pagal 2, 3 arba 4 punktą įveda į streptomicetinį vektorių.
6. Streptomicetų ląstelių transformavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad į šias ląsteles vektorių įveda pagal 5 punktą.