[LT] Išradimas susijęs su fitazės gamyba mikrobiologiniu būdu, konkrečiai DNR, koduojančios fitazę, išskyrimu ir išgryninimu. Šios DNR sekos išskyrimas ir klonavimas atliekamas specifinių nukleotidinių zondų, sukonstruotų specialiai šiam išradimui, pagalba. Šis išradimas taip pat apima ekspresijos vektoriaus, kuriame yra bent dalis DNR, koduojančios fitazę, sukonstavimą. Aprašytas ląstelės, pageidautina bakterijų, transformuotos šiuo vektoriumi, gavimas.
[EN]
[0001] Fosforas yra nepakeičiamas elementas, reikalingas bet kokio organizmo augimui.
[0002] Gyvulininkystėje, norint kad greitai augtų gyvūnai su paprastu skrandžiu (pavyzdžiui, kiaulės, žuvys, naminiai paukščiai), pašaras yra praturtinamas neorganiniu fosforu.
[0003] Atvirkščiai, į atrajojančių gyvūnų pašarus fosforas nėra dedamas, nes didžiąjame skrandyje esantys mikroorganizmai produkuoja fermentus, kurie katalizuoja fitato
[0004] Fitatas yra rezervinis fosforo šaltinis beveik visuose augaliniuose maisto produktuose (žiūr. apžvalgą: Phytic acid, Chemistry and applications, E.Graf (ed), Pilatus Press, Minneapolis, M N, USA, 1986). Fitato kiekis riešutuose, grūdinėse, ankštinėse ir aliejinėse kultūrose, sporose ir žiedadulkėse yra 1-3 %. Sudėtinės fitinės rūgšties druskos vadinamos fitinais. Laikoma, kad fitinė rūgštis blogina virškinimą, nes ji yra chelatuojantis agentas tokiems elementams, kaip kalcis, cinkas, geležis ir magnis, ir be to, gali reaguoti su baltymais, ir tokiu būdu susilpnėja jų įsisavinimas ir sumažėja mineralinių elementų kiekis pašare.
[0005] Fitate esantis fosforas praeina per gyvūnų su vienskilčiais skrandžiais virškinimo traktą ir pasišalina su ekskrementais. Nors storojoje žarnoje vyksta dalinė fitato hidrolizė, išsilaisvinęs neorganinis fosforas neturi maistinės vertės, nes jis gali rezorbuotis tik plonajame žarnyne. Todėl tokie gyvūnai neįsisavina didelės fosforo dalies, kuris turi didelę maistinę vertę, nors ir gauna jį su maistu.
[0006] Fitate esančio fosforo išsiskyrimas su ekskrementais turi savas pasekmes.
[0007] Paskutiniais dešimtmečiais labai padaugėjo naminių gyvulių, kartu padaugėjo ir mėšlo kiekis, o tai sudaro grėsmę aplinkai įvairiuose rajonuose. Dalinai tai apspręsta fosforo, esančio mėšle, susikaupimu paviršiniuose vandenyse, ir taip eutrofikuojami vandens telkiniai.
[0008] Mikroorganizmų sintetinami fermentai, kurie katalizuoja fitato skilimą į inozitolą ir neorganinį fosforą, žinomi kaip fitazės. Mikroorganizmai, kurie produkuoja šiuos fermentus yra bakterijos: Bacillus subtilis (V.K.Paver and VJ.Jagannathan, 1982, J. Bacteriol., 151, 1102-1108) ir Pseudomonas (D.J.Cosgrove, 1970, Austrai. J. Biol. Sci., 23, 1207-1220), melės: Saccharomyces cerevisiae (N.R. Nayki and P. Markakis, 1984, Lebensmittel Wissenschaft und Technologie, 17, 24-26), grybai: Aspergillus terreus (K.Yamada, Y. Minoda and S. Yamamoto, 1986, Agric. Biol. Chem., 32, 1275-1282). Fitazę produkuoja ir kitos Aspergillus rūšys, tarp kurių Aspergillus ficuum sintetina didelio specifinio aktyvumo termostabilų fermentą, palyginus su fitazėmis iš kitų mikroorganizmų
[0009] Idėja pridėti bakterinę fitazę į gyvūnų su paprastu skrandžiu pašarus buvo išsakyta ne kartą (žiūr., pvz., Ware I.H., Bluff L. and Shien T.R., 1967, US Patent No.3297548; Nelson T.S., Shien T.R., Wodzinski R.J. and Ware I.H., 1971, J. Nutrition, 101, 1289-1294), bet iki šiol jos praktinis pritaikymas buvo ekonomiškai netikslingas dėl didelės mikrobiologinės fermentų gamybos kainos (Y.W. Han, 1989, Animal Feed Sci.& Technol.,24, 345-350). Dėl ekonominio netikslingumo iki šiol pridedamas neorganinis fosforas į gyvūnų su paprastu skrandžiu pašarus.
[0010] Bakterinės fitazės turi kitą pritaikymą žemės ūkyje. Kaip pavyzdį galima paminėti pramoninę krakmolo gamybą iš grūdinių kultūrų, tokių kaip kukurūzai ir kviečiai. Malant produktus, gaunami gliutenai, parduodami gyvūnų pašarams. Mirkant pašarus, įdedama fitazės; technologinės sąlygos ypatingai palankios fitazėms iš grybų (temperatūra apie 50°, pH 5,5) (žiūr. paraišką Europos patentui Nr.0321004 Alno Ltd.). Svarbi aprašytojo metodo ypatybė yra ta, kad iš gamybos atliekų galima gauti gyvūnams pašarus, kuriuose yra fosfatas vietoj fitato.
[0011] Taip pat pasiūlyta panaudoti fitazę perdirbant soją (Finas TM Enzymes by Alno - informacinė brošiūra išleista kompanijos Alno Ltd., Rajamani, Suomija). Sojų pupelės turi daug fitato - faktoriaus, kuris blogina virškinimą; sojos baltymų negalima naudoti vaikų maitinimui, taip pat žuvų, veršiukų ir neatrajojančių gyvūnų pašarams. Praturtinus šį svarbų baltymų šaltinį atitinkamais fermentais, padidėja šios medžiagos komercinė ir maistinė svarba.
[0012] Buvo atlikti bandymai įvairioms fitazėms charakterizuoti, patobulinti jų gavybos būdus ir praktinį pritaikymą. Ullak pasiūlė fitazės iš laukinio kamieno Aspergillus ficuum valymo metodą, taip pat ištyrė galutinio valymo produkto biocheminius parametrus (Ullak A., 1988a, Preparative Biochem., 18, 443-458). Šio autoriaus gauti rezultatai pateikti 1 lentelėje.
[0013] Aminorūgščių seka iš N-galo A ficuum fitazės buvo pateikta Ullak du kartus: Ullak A., 1987, Enzyme and Engineering Conference IX, October 4-8, 1987, Santa Barbara, California (poster presentation) ir Ullak A., 1988b, Prep. Biochem., 18, 459-471. Šio autoriaus nustatyta aminorūgščių liekanų seka pateikta Fig.lA (seka E).
[0014] Iš Ullak gautų duomenų seka kelios įdomios išvados. Pirmiausia, "išvalytas" preparatas, jo aprašytas 1988a ir 1988b, elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje su natrio dodecilsulfatu metu duoda dvi baltymo juostas. Mes nustatėme, kad išgrynintoje iš A. ficuum fitazėje yra pašalinė medžiaga, kuri elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje metu duoda vieną iš dviejų juostų, kurią Ullak identifikavo kaip fitazę.
[0015] Iš Ullak publikuotos (1987, 1988a; palyginkite sekas A ir B su seka C Fig.lA) aminorūgščių sekos galima padaryti analogiškas išvadas. Mes parodėme, kad viena iš vidinio fitazės peptido aminorūgščių sekų, kuri aprašyta Ullak (žiūr. Fig.lB, seka E), iš tikrųjų yra pašalinis baltymas, kurio molekulinė masė lOOkD (Fig.lC), kuris randamas preparate, gaunamame pagal Ullak metodą, ir duoda vieną iš dviejų juostų elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje su natrio dodecilsulfatu metu (Ullak, 1988a, 1988b). Ullak nepripažįsta, kad yra tokia pašalinė medžiaga, o tą juostą priskiria kitai fitazės formai. Tarp kitko, šis pašalinis komponentas apsunkina atranką ir identifikavimą tos nukleotidų sekos, kuri koduoja fitazės biosintezę. Be to, jo buvimas sumažina santykinį testuojamo baltymo aktyvumą.
[0016] Tęsiant Ullak duomenų analizę, reikia pažymėti, kad buvo nustatyta, kad 12-toji aminorūgšties liekana yra glicinas. Naudojant baltymų ir DNR sekvenavimą, mes parodėme, kad šioje vietoje iš tikrųjų yra ne glicinas, o cisteinas (žiūr. Fig.6 ir 8).
[0017] Pagaliau, pagal Ullak, fitazės molekulinė masė yra 85 kD, kuri po deglikozilinimo sumažėja iki 61,7 kD (Ullak, 1988c). Ši reikšmė mažesnė, nei to paties autoriaus pateikta - 76 kD (Ullak A. and Gibson D., 1988, Prep. Biochem., 17( 1), 63-91), kuri buvo nustatyta pagal santykinį polisacharidų kiekį, išsiskiriantį hidrolizuojant, ir natyvaus baltymo molekulinę masę, kuri nustatoma elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje su natrio dodecilsulfatu pagalba. Mūsų tyrimuose buvo nustatyta, kad glikozilintos fitazės molekulinė masė vienareikšmiškai yra 85 kD, tuo tarpu kai neglikozilinto baltymo molekulinė masė yra nuo 48 iki 56,5 kD, priklausomai nuo deglikozilinimo laipsnio.
[0018] Mullancy et al. (Filamentous Fungi Conference, April, 1987, Pacific Grove, California, poster presentation) pranešime taip pat pateikiama fitazės iš A. ficuum charakteristika. Ir šiame darbe elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje su natrio dodecilsulfatu metu buvo gautos dvi juostos: vienos molekulinė masė - 85 kD, kitos - 100 kD, ir abi "išvalytame" preparate. Autoriai identifikavo šias juostas kaip dvi skirtingas fitazės formas. Bet šiame darbe neaprašoma bakterijų ląstelių-recipientų transformacija. Klonavimo, DNR sekos, klonuojančios fitaze, išskyrimo metodų aprašymų taip pat nėra.
[0019] Akivaizdu, kad rentabilaus fitazės gamybos būdo sukūrimas yra labai svarbus, dalinai gaminant pramoniniu būdu pašarus gyvulininkystei. Vienas šio tikslo pasiekimo būdų yra rekombinantinė DNR technika, kurios pagalba galima sustiprinti fermento ekspresiją įvairiose mikroorganizmų rūšyse, kurie produkuoja didelio aktyvumo peptidus ir baltymus. Tačiau šiuo metu nėra sukurta išskyrimo ir klonavimo DNR sekų, koduojančių fitazę, būdų.
[0020] Šis išradimas yra DNR sekos, koduojančios fitazę, gavimo ir valymo būdas. Tokios sekos išskyrimas ir klonavimas buvo atliekamas, naudojant specifinius nukleotidinius zondus, kurie buvo specialiai susintetinti šiam tikslui. Reikalinga DNR seka, koduojanti fitazę, buvo gauta iš grybų, konkrečiai iš Aspergillus siūlinių grybų šeimos.
[0021] Kitas išradimo tikslas yra vektoriaus, turinčio ekspresijos faktorių, gavimo būdas; šiame vektoriuje turi būti mažiausia viena replika, mažiausiai viena (pageidautina homologinė) DNR, kuri koduoja fitazę. Tokia DNR seka funkciškai surišta su atitinkama reguliavimo sritimi, kuri užtikrina didelį peptidų arba baltymų su fitazės aktyvumu ekspresijos lygį tinkamuose šiam tikslui ląstelėse-šeimininkuose.
[0022] Ekspresijos faktorius, pagal šį išradimą, gali būti įterptas į vektorių, pageidautina į plazmidę, kuris sugebėtų transformuoti bakterinio recipiento ląsteles ir įsijungti į genomą.
[0023] Dar vienas šio išradimo tikslas - transformuotų ląstelių gavimo būdas, pageidautina bakterijų, transformuojamų vektoriumi, kuris aprašytas ankstesniame paragrafe. Pagal išradimą tokiomis transformuojamomis ląstelėmis gali būti siūliniai grybai šių genčių: Aspergillus, Trichoderma, Mucor ir Peniciilium, mielės: KJuyveromyces ir Saccharomyces arba bakterijos Bacillus. Geriausia naudoti recipientais siūlinius grybus Aspergillus. Transformuotos ląstelės sugeba pramoniniu mastu sintetinti daug rekombinantinės fitazės su pakankamu rentabilumu.
[0024] Kiti išradimo aspektai - tai rekombinantiniai baltymai ir peptidai, kurie pasižymi fitaziniu aktyvumu, tiek glikozilinti, tiek ir neglikozilinti; tokių neglikozilintų baltymų ir peptidų gavimo būdai; baltymai ir peptidai, kurie pasižymi fitaziniu aktyvumu, be pašalinių priemaišų; monokloniniai antikūnai, sugebantys reaguoti su šiais rekombinantiniais arba išgrynintais baltymais. 1 lentelėje palygintos fitazės, gautos Ullak iš laukinio kamieno A. ficcum ir papildomai išgrynintos fitazės iš A. ficuum laukinio tipo, gautos pagal šį išradimą, biocheminės charakteristikos. Reikia atkreipti dėmesį į santykinį aktyvumą, kuris mūsų gauto fermento yra du kartus didesnis, nei fitazės, aprašytos Ullak.
[0025] Sis išradimas tai nukleotidų seka, koduojanti baltymus su fitaziniu aktyvumu, taip pat šių baltymų aminorūgščių sekos. Gautas sekas galima panaudoti oligonukleotidų zondų sukūrimui, kurie naudojami hibridizacijos skryninge fitazės genams kituose šaltiniuose identifikuoti, ypatingai įvairiuose mikroorganizmuose, kurie po to gali būti išskirti ir klonuoti.
[0026] Sekos, gautos pagal šį išradimą, gali būti panaudotos kaip pradinė medžiaga, konstruojant "antros kartos" fitazės. "Antros kartos" fitazės - tai fitazės, pakeistos mutageniniais faktoriais (konkrečiai kryptingos mutagenezės metodas) ir pasižyminčios savybėmis, kurios skiriasi nuo laukinių arba rekombinantinio tipo fitazių savybių, pavyzdžiui, nuo gaunamų šiame išradime. Optimizuojant vieną arba kitą procesą, keičiami jo parametrai, tokie kaip temperatūra ir optimali pH reikšmė, santykinis baltymų aktyvumas arba giminingumas substratams.
[0027] Terminas "fitazė" šiame išradime apjungia šeimą fermentų, kurie katalizuoja reakcijas, kurių dėka pašalinamas neorganinis fosforas iš įvairių mioinozitolfosfatų.
[0028] Fitazės aktyvumui nustatyti yra daug metodų, jų pasirinkimas neapribojamas šiuo išradimu. Iliustracijai galima pateikti kiekybinį fermento aktyvumo nustatymo metodą pagal fermento sunaudojamą kiekį, reikalingą neorganinio fosforo atskėlimui iš 1,5 mM natrio fitato, kai greitis yra 1 ^iM/min, 37° temperatūroje, esant pH 5,50.
[0029] Taip pat reikia turėti omenyje, kad terminas "fitazė", naudojamas šiame aprašyme, apima visus baltymus ir poilpeptidus, kurie pasižymi fitaziniu aktyvumu. Šis teiginys iliustruojamas Fig.lA, kurioje palyginamos A ir B sekos (mūsų tyrimuose nustatytos sekos) su C seka, nustatyta Ullak (1988b). Figūra, parodo, kad mūsų metodu galima gauti baltymus, kuriuose nėra natyvios fitazės iš A. ficuum pirmųjų 4 aminorūgščių liekanų
[0030] (Baltymas, kurio seka A, neturi 7 pirmųjų aminorūgščių liekanų). Tačiau šie nurodyti baltymai vistiek turi fitazinj aktyvumą. Pilna fitazės baltymo aminorūgščių seka, gauta analizuojant nukleotidų seką, pateikta Fig.8.
[0031] Fitazės, gaunamos pateikiamu būdu, gali būti panaudotos įvairiuose procesuose, kuriuose reikia fitatą paversti į inozitolą ir neorganinį fosforą.
[0032] Atskiru atveju, naudojant fitazę, gautą pagal šį išradimą, galima sumažinti jos mikrobiologinės gamybos kainą ir užtikrinti rentabilumą, naudojant ją pašarų gyvūnams gamyboje ir galų gale pasiekti tokį pat efektyvumą, kaip ir naudojant pašarų priedais neorganinį fosforą. Be to, žymiai sumažėja fosforo kiekis mėšle.
[0033] Fitazės gamyba tokiomis pat kainomis kaip ir neorganinio fosforo, pridedamo į pašarus, praplės pašarų gamybos galimybes ta prasme, kad padidės kokybiškų pašarų asortimentas. Pavyzdžiui, pašarų praturtinimas fitaze įgalina atsisakyti nuo neorganinio fosforo ir padidinti juose fitato turinčių komponentų dalį.
[0034] Be gaunamos pagal šį išradimą fitazės panaudojimo kaip priedo gyvūnų pašarams ir panaudojimo perdirbant soją (žiūr. aukščiau), ji gali būti pritaikyta šiose pramonės šakose: - skystų pašarų gamyboje kiaulėms ir naminiams paukščiams. Šiuo metu plačiai taikomas pašarų mirkymas kelias valandas prieš šėrimą. Per šį laiką fitazė paverčia fitatą į inozitolą ir neorganinį fosforą; - inozitolo arba inozitolfosfato pramoninė gamyba iš fitato; - kiti pramoniniai procesai, kuriuose naudojami fitatą turintys substratai, tokie kaip krakmolo gamyba ir fermentacija, įskaitant ir alaus gamybą. Metalų jonų surišimas į chelatus fitato pagalba gali padaryti juos neprieinamus mikroorganizmams. Fitato fermentinė hidrolizė pašalina šią problemą.
[0035] Šie ir kiti šio išradimo privalumai tampa dar akivaizdesni detaliau aprašius šį išradimą.
[0036] Fig.lA. Išgrynintos fitazės aminorūgščių liekanų seka iš N-galo. Aminorūgščių liekanų sekos, pažymėtos raidėmis A ir B, nustatytos naudojant fitazės poformas, kurių izoelektrinai taškai, atitinkamai, yra 5,2 ir 5,4. Seka C pateikiama pagal Ullak publikacijas (1987, 1988b). Pagal mūsų duomenis 12-tos aminorūgšties liekana sekose A ir B nėra glicinas (ženklas * reiškia abejonę, o ženklas ** - nustatomos liekanos nebuvimą). Fig.lB. Viduryje esančių fragmentų N-galų aminorūgščių liekanų seka po suskaldymo CNBr. Aminorūgščių sekos, pažymėtos raidėmis A ir B, kurių apytikrės molekulinės masės atitinkamai yra 2,5 ir 36 kD, nustatytos mūsų tyrimuose. Sekos C ir E pateikiamos pagal Ullak (1988c). Fig.lC. Aminorūgščių liekanų seka iš N-galo baltymo, kurio molekulinė masė yra 100 kD, kuris pagal šiuos tyrimus randamas nevalytuose fitazės preparatuose. Fig.2A. Oligonukleotidiniai zondai, sukonstruoti pagal Fig.lA duomenis (peptidai
[0037] Fig.2B. Oligonukleotidiniai zondai, sukonstruoti pagal Fig.lB duomenis (peptidai A ir B). Fig.3. Oligonukleotidinaia zondai, naudojami geno, koduojančio rūgštinę fosfatazę, išskyrimui. Fig.4. Bakteriofago lambda AF 201, turinčio fitazės A. ficuum lokusą, restrikcinis žemėlapis. Rodykle nurodomas fitazės genas ir transkripcijos kryptis. Klonas # nurodo subklonus, kurie gaunami nurodytų restrikcijos fermentų pagalba iš fago AF 201 plazmidėje pAN 8-1 (subklonui pAF 28-1) ir plazmidėje pVC 19 (visiems kitiems subklonams). Fig.5. Plazmidės pAF 1-1 fizinis žemėlapis. Fragmentas BamHI, kurio ilgis 10 kilobazių, įterptas j pVC19, jame yra pilnas genas, kuris koduoja rūgštinę fosfatazę iš A. ficuum. Fig.6. Plazmidžių pAF 2-3, pAF 2-8 ir pAF 2-7 nukleotidų sekos su fitazės chromosominiais geno lokusais. Fitazę koduojanti sritis yra tarp 210 ir 1713 nukleotido. Intronas chromosominiame gene yra tarp 254 ir 355 nukleotido. Parodyti ir kiti reikšmingi požymiai: pradinis ir galinis fitazės kodonai, restrikcijos vietos ir introno padėtis. Fig.7. Detalus sekvenuoto chromosominio fitazės lokuso fizinis žemėlapis. Rodyklėmis pažymėta srities, kuri koduoja fitazę, dviejų egzonų lokalizacija. Fig.8. Fitazės kDNR transliacinės zonos fragmento nukleotidų seka ir atitinkama jai aminorūgščių liekanų seka. Pradžia subrendusios baltymo molekulės pažymėta +1 padėtimi. Vidinio baltymo, kurio molekulinė masė 36 kD, N-galo pradžia yra 241 padėtyje, o baltymas, kurio molekulinė masė yra 2,5 kD, prasideda nuo 390 padėties. Fig.9. Fitazės ekspresijos bloko pAF 2-2S fizinis žemėlapis. Rodyklėmis parodytos genų transkripcijos kryptys. Fig.10. Fitazės superekspresijos transformuotose ląstelėse A. ficuum NRRL3135 įrodymas izoelektrofokusavimu ir elektroforeze poliakrilamidiniame gelyje. Tie patys kiekiai kultūrinio skysčio A. ficuum (juosta 1) ir transformuotų ląstelių pAF 2-2S SP7 (juosta 2) augintos vienodomis sąlygomis, analizuotos elektroforezės sistemoje Phast (Farmacia) elektrofokusavimu ir elektroforeze poliakrilamidiniame gelyje, kai pll yra nuo 4,5 iki 6,0. Palyginimui buvo analizuojama homogeninė fitazė iš A. ficuum arba atskirai (juosta 4) arba mišinyje su kultūriniu skysčiu (juosta 3). Geliai buvo dažomi arba
[0038] selektyviai (tik fosfatazė), arba bendras baltymas (Coomasie Briliant blue, B).Fitazės juostos pažymėtos žvaigždutėmis.
[0039] Fig.ll. Fitazės superekspresijos transformuotose ląstelėse A. niger CBS 513.88 įrodymas izoelektrofokusavimu ir elektroforeze poliakrilamidiniame gelyje. Tie patys kultūrinio skysčio kiekiai tėvinio kamieno A. niger (juosta 1) ir transformuotų ląstelių pAF 2-2S # 8 (juosta 2), pFYT3 # 205 (juosta 3) ir # 232 (juosta 4) buvo analizuojamos izoelektrofokusavimu ir elektroforeze poliakrilamidiniame gelyje, figūroje aprašytomis sąlygomis. Geliai buvo dažomi tik bendram fosfatazės aktyvumui (A) ir bendram baltymui
[0040] Fig.12. Plazmidės p AB 6-1 fizinis žemėlapis. HindlII DNR iš plazmidės pVC19
[0041] intarpas, kurio dydis 14,5 kilobazių, kuriame yra pilnas gliukoamilazės iš A niger lokusas. Fig.13. Promotoriaus AG ir fitazės geno sujungimo polimerazinės grandininės reakcijos schema. Visų pradmenų nukleotidinės sekos nurodytos tekste.
[0042] Fig.15. Fitazės ekspresijos tarpinių blokų pXXFYTl ir pXXFYT2 ir bloko pXXFYT3, kuriuose XX - lyderinė seka (L), fiziniai žemėlapiai. Į plazmidės pl8FYT# ir p24FYT# įterptos lyderinės sekos AG 18 aa ir 24 aa, tuo tarpu plazmidėje pFYT# kaip lyderis panaudota fitazė.
[0043] Fig. 19. Chromosominės DNR autoradiografija po skaldymo PvuII (A) ir BamHI (B) ir hibridizacijos, zondu naudojant su 32P žymėtą fitazės iš A. ficuum kDNR, šių mikroorganizmų: S. sercvisiae (juosta 2), B. subtilis (juosta 3), K. lactis (juosta 4), P.
[0044] erysogenus (juosta 5), P. aeruginosa (juosta 6), S. lividans (juosta 7), 1 /xg A. niger (juosta 8), 5 /xg A. niger (juosta 9), kontrolė (juosta 10), C. thcrmocellum (juosta 11). Juosta 1 - markerinė DNR.
[0045] Genų, koduojančių tam tikrus baltymus, kurie produkuojami mikroorganizmuose, klonavimas gali būti atliktas įvairiais būdais. Vienas iš jų: reikalingo baltymo išgryninimas, nustatymas jo aminorūgščių liekanų sekos iš N-galo, pasirinkto mikroorganizmo genominės bibliotekos skryningas, naudojant DNR oligonukleotidinį zondą, kuris sintetinamas pagal nustatytą aminorūgščių liekanų seką iš baltymo N-galo. Kaip sėkmingą pavyzdį galima pateikti izopenicilin-N-sintetazės iš Cephalosporium aeremonium geno klonavimą (S.M. Samson et al., 1985, Nature, 318, 191-194) ir geno, koduojančio TAKA amilazę iš Aspcrgilus oryzac, išskyrimą (Boel et al., 1986, Europos paraiška patentui Nr.0238023).
[0046] Naudojantis šia strategija, mes pamėginome išskirti geną, kuris koduoja fitazę iš Aspergillus ficuum. Baltymas buvo kruopščiai išgrynintas ir nustatytos jo biocheminės savybės. Gauti duomenys buvo palyginti su Ullak tyrimų duomenimis (1988a). Abiejų tyrimų rezultatai pateikti 1 lentelėje.
[0047] Geno, koduojančio fitazę, išskyrimui iš pradžių buvo sintetinami oligonukleotidiniai zondai, kurių konstravimas aprašytas aukščiau (Fig.2A), remiantis nustatyta aminorūgščių liekanų seka. Viso proceso kontrolei tokiu pat būdu buvo išskirtas genas, koduojantis rūgštinę fosfatazę, naudojant šiam tikslui Ullak ir Cummins (Prep. Biochem., 17, 397-422, 1987) nustatytas baltymo charakteristikas. Rūgštinės fosfatazės geno išskyrimas nebuvo sudėtingas. Visai kitaip buvo su fitazės geno išskyrimu. Nežiūrint daugelio mėginimų naudojant zondus, gautų pagal nustatytą aminorūgščių liekanų seką baltymo N-gale, nepasisekė išskirti kDNR genominių fragmentų ar genominės bibliotekos klonų, kuriuose vienareikšmiškai galima būtų įrodyti esant fitazę koduojantį geną.
[0048] Šio uždavinio sprendimui fitazė buvo suskaldyta CNBr, išskirti gauti baltymo fragmentai, nustatytos šių fragmentų aminorūgščių liekanų sekos iš N-galo (Fig.lB).
[0049] Panaudojant gautus duomenis, buvo konstruojami nauji oligonukleotidiniai zondai (Fig.2B). Šių nukleotidinių zondų pagalba buvo galima identifikuoti specifinius DNR fragmentus ir panaudoti šiuos zondus reikalingų genominės bibliotekos klonų atrankai. Nepavyko kryžminė hibridizacija tarp gautų naujų klonų arba DNR fragmentų ir oligonukleotidinių zondų pirmo rinkinio arba klonų, kurie buvo atrinkti, panaudojant pirmą zondų rinkinį.
[0050] Todėl antras zondų rinkinys taip pat gali būti naudojamas koduojančių atitinkamas fitazes sekų identifikavimui.
[0051] Naujai atrinkti klonai buvo hibridizuojami (Northern blot hybridization). Diskretines iRNR galima buvo nustatyti tik tais atvejais, kai jos buvo išskiriamos iš micelio, produkuojančio fitazę. Hibridizacijos signalo nebuvo, kai iRNR būdavo skiriama iš micelio, kuris neprodukuoja fitazės. iRNR ilgis apytikriai buvo 1800 bazių ir teoriškai galėjo produkuoti baltymą, kurio maksimali molekulinė masė galėjo būti apie 60 kD. Ši molekulinės masės reikšmė atitinka neglikozilinto baltymo ir molekulinei masei baltymo, kuri apskaičiuojama iš DNR sekos.
[0052] Be to, transformuojant tokia iRNR grybų ląsteles, buvo stebimas fitazinio aktyvumo padidėjimas. Tai neabejotinai įrodo, kad buvo gauta nukleotidų seka, kuri koduoja fitazę. Aminorūgščių liekanų seka išgrynintos fitazės ir baltymų fragmentų, gautų suskaldant baltymą CNBr, buvo tokia pati, kaip aminorūgščių liekanų seka, nustatyta iš klonuojamo geno nukleotidų sekos. Nukleotidų seka ir iš jos išvesta aminorūgščių liekanų seka pateiktos Fig.6 ir 8, tai yra papildoma klonuojamo geno, koduojančio fitazę, struktūros iliustracija.
[0053] Nukleotidų sekos, koduojančios fitazę, išskyrimas yra prielaida fitazės gavimui pramoniniu mastu, naudojant dabartinę rekombinantinės DNR technologiją, kuri susideda iš tokių operacijų, kaip geno amplifikavimas, reguliacinių elementų pakeitimas (promotorių, sekrecijos signalų) arba įvairių metodų kombinacija.
[0054] Todėl šio išradimo objektas yra transformuotos ląstelės-šeimininkai, kuriose vyksta su didelėmis baltymo koncentracijomis efektyvi baltymų ir peptidų, kurie pasižymi fitaziniu aktyvumu, ekspresija, o taip pat (jei to reikia) - efektyvi rūgštinių fosfatazių ekspresija. Tokios ląstelės gali būti ir iš šių siūlinių grybų genčių: Mucor, Aspergillus, Trichoderma ir Penicillium, mielės: Kluyvermyces ir Sacharomyces ir bakterijos, priklausančios Bacillus genčiai. Rekomenduojama recipientais naudoti tokias mikroorganizmų formas, kuriose gali vykti intensyvi savų endogeninių baltymų sekrecija.
[0055] Ypatingai idomūs pramoniniai Aspergillus kamienai, tokie kaip A. niger, A. ficuum, A. awamori, A. oryzoe. Kaip alternatyvą, galima naudoti Trichoderma reesei, Mucor michei, Kluyvermyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis.
[0056] Transformuotose ląstelėse yra nukleotidų sekos, kurios koduoja norimą baltyminį produktą, taip pat jose įterpiama signalinė sekrecijos seka, sugebanti funkcionuoti tame šeimininke, kurios dėka sintetinamas peptidas arba baltyminis produktas yra sekretuojamas.
[0057] Pagal šį išradimą, galima naudoti įvairias signalines sekas. Pirmiausia, galima naudoti signalines sekas, kurios yra homologinės klonuotai ekspresuojamai nukleotidų sekai. Iš kitos pusės, homologinės rekombinacijos optimizacijai galima naudoti signalinę seką, kuri yra pilnai homologinė arba dalinai homologinė signalinei sekai atitinkamam recipiento geno lokusui. Be to, galima naudoti specialiai sukonstruotą signalinę seką norimo produkto sekrecijos padidinimui, pavyzdžiui, aprašytą darbuose Von Heyne
[0058] (1983), Eur. J. Biochem., 133.17-21, Perlman & Halverson (1983) J. Mol. Biochem., 167. DNR seka, koduojanti signalinę seką, gali būti prijungta tiesiogiai prie koduojančios procesingo signalą (skėlimo vietos atpažinimo sritis) sekos arba per trumpą intarpą, kurio ilgis paprastai būna ne didesnis, nei dešimt kodonų.
[0059] Pagal šį išradimą pageidautina naudoti signalines sekas, homologinės klonuojamai ekspresuojamai nukleotidų sekai, 18 aminorųgščių liekanų gliukoamilazės (AG) signalinę seką arba 24 aminorūgščių liekanų gliukoamilazės (AG) signalinę seką. Abi šios sekos gali būti homologinės arba heterologinės ekspresuojamai nukleotidų sekai.
[0060] Ekspresijos produktu arba reikalinga nukleotidų seka gali būti DNR, kuri gali būti homologinė arba hetrologinė pasirinktam recipientui. Šiame išradime terminas "homologinė" DNR suprantama kaip ląstelių, kurios yra tos pačios genties kaip ir recipientas, DNR. Pavyzdžiui, Aspergillus grybų ląstelės transformuojamos DNR iš Aspergillus grybų genties. Toks būdas įgalina pagerinti pasirinktos genties grybų savybes, suteikaint jiems tokias savybes, kurios nėra būdingos pasirinktam organizmui be transformavimo.
[0061] "Heterologinė" DNR - tai DNR, gauta iš kelių mikroorganizmų genčių ląstelių
[0062] (pagal pavyzdį, pateiktą ankstesniame paragrafe, heterologine DNR gali būti DNR iš kitų nei Aspergillus mikroorganizmų, kuri naudojama ekspresijai Aspergillus ląstelėse).
[0063] Nukleotidų sekas, koduojančias baltymus su fitaziniu aktyvumu, pageidautina išskirti iš grybų. Pirmenybė teikiama nukleotidinėms sekoms, koduojančioms fitazę, iš grybų Aspergillus ficuum arba Aspergillus niger.
[0064] Atviroje 5' skaitymo rėmelio srityje turi būti reguliacinė, inicijuojanti transkripciją, zona (arba promotorius). Galima panaudoti bet kurią recipiento funkcijai aktyvią nukleotidų seką, tame tarpe promotorių ir homologinę ekspresuojamą nukleotidų seką, kuri koduoja fitazinį aktyvumą. Bet daugeliu atvejų naudojama sritis homologinė lokuso sričiai-taikiniui. Tai įgalina pakeisti lokuso-taikinio ekspresijos produktą. Šiuo atveju reguliacinė transkripcijos iniciavimo sritis patenkina keliamus reikalavimus ta prasme, kad yra pasiekiamas baltymo, koduojamo lokusu-taikiniu, ekspresijos ir sekrecijos lygis, ir pasiekiama efektyvi baltymo produkcija. Tačiau kai kuriais atvejais gali būti reikalingas didesnis transkripcijos lygis, negu tas, kuris pasiekiamas su lokusu-taikiniu, arba, iškilus būtinybei, ekspresijos produktą gauti naudojant specifinį indukcijos faktorių. Tokiais atvejais naudojama transkripcijos iniciavimo reguliacinė sritis, kuri skiriasi nuo srities, esančios pasirinkto geno lokuse-taikinyje. Žinoma daug funkciškai aktyvių transkripcijos inicijavimo reguliacinių sričių iš įvairių siūlinių grybų rūšių. Tokios sritys yra tos, kurios koduoja gliukoamilazę (AG), grybų amilazę, rūgštinę fosfatazę, GAPDH, TrpC, AmdS, AleA, AldA, histoną H2A, PyrG, PyrY, izopenicilin-N-sintetazę, FGK, rūgštinę proteinazę, aciltransferazę ir kt.
[0065] Pageidautina, kad lokusas-taikinys koduotų didelio ekspresijos lygio baltymo geną, t.y. geną, kurio ekspresuojamo produkto koncentracija būtų ne mažesnė, nei 0,1 g/l (fermentacijos pabaigoje). Tokio proceso trukmė, be kitų faktorių, gali priklausyti nuo produkuojamo baltymo prigimties. Tokio geno pavyzdys gali būti genas, koduojantis gliukoamilazę (AG). Kiti dominantys genai: grybų alfa-amilazės, rūgštinės fosfatazės, proteinazės, lipazės, fitazės ir celobiodegradazės. Ypatingai vertingi glikoamilazės iš A. niger geno lokusai, amilazės iš A., oryzae, celobiohidrolazės iš T. reesei, rūgštinės proteinazės iš Mucor michei, laktazės iš Kluyromyces Iactis ir invertazės iš Saccharomyces ccrevisiae.
[0066] Transkripcijos pabaigos reguliacinė sritis gali būti gauta iš panaudojamo geno, lokuso-taikinio arba kita tinkama seka. Esant ląstelėje dviems sekoms, einančioms po naudojamo geno (pagal transkripcijos kryptį), transkripcijos pabaigos sritis, jei ji homologinė lokusui-taikiniui, turi būti žymiai trumpesnė, nei homologinė flankuojanti sritis.
[0067] Paprastai naudojamas selektyvumo markeris, kuris yra transformuojamo ekspresuojamo genomo dalis, arba atskiras nuo transformuojamos srities, ko pasekoje jis gali būti įterptas už panaudojamo geno ribų. Kadangi rekombinantinės molekulės, pagal šį išradimą, transformuojamos į pramoninius mikroorganizmų kamienus, tai selektyvumo markeriai, kurie naudojami transformacijos kontrolei, turi būti dominuojantys. Jų įterpimas į recipiento ląsteles neturi iššaukti mutacijų. Pavyzdžiu markerių, kurie apsprendžia transformuotų ląstelių augimą selektyvioje terpėje, gali būti A. nudulams amdS genas, kurio dėka transformuotos A. niger ląstelės gali augti tik esant acetamidui, kaip vieninteliam maitinimo komponentui; markerių, įgalinančių augti ląsteles, esant antibiotikams, pavyzdys gali būti blc genas, suteikiantis atsparumą fleomicinui, arba hph genas, suteikiantis atsparumą higromicinui B.
[0068] Selektyvumo genas turi turėti savas reguliacines iniciavimo, transkripcijos ir transliacijos sritis, todėl kad tai reikalinga nepriklausomai markerio ekspresijai. Kaip buvo minėta aukščiau, žinoma daugybė transkripcijos iniciavimo reguliacinių sričių, kurias galima panaudoti kartu su markeriniu genu. Tais atvejais, kai naudojamas atsparumas antibiotikams, jų koncentracija gali kisti priklausomai nuo atsparumo genų tipo ir būti nuo 30 iki 300 jug/ml.
[0069] Atskiras sekas galima prijungti vienu iš dviejų egzistuojančių būdų, pavyzdžiui, kerpant, komplementarias restrikcines vietas junginiuose, liguojant juos, gaunami buki galai, lipnius galus liguojant Bal, pradmens reparacija, mutagenėze in vitro ir kt. Esant būtinybei, galima naudoti daugelio ryšių sekas (polilinkerį) ir adapterius. Jie įvedami ir iškerpami įprastais metodais ekspresijos elementų konstravimui palengvinti. Kiekviename tokių blokų sintezės etapų naudojamas fragmentų klonavimas, restrikcinė analizė, sekvenavimas, hibridizavimas ir kitos operacijos. Yra daugybė vektorių klonavimui, bet šių vektorių pasirinkimas neapribojamas šiuo išradimu. Paprastai klonavimas vykdomas E. coli ląstelėse.
[0070] Flankuojančiose srityse gali būti tik dalis atviros nuskaitymui lokuso-taikinio srities, ypatingai jos signalinė seka, reguliacinės lokuso-taikinio 5' ir 3' geno sritys gali būti už reguliacinės srities. Paprastai flankuojančios srities ilgis būna ne mažesnis, nei 100 bazių porų, pageidautina ne mažiau 200 bazių porų, bet gali būti 500 bazių porų ir ilgesnė. Flankuojančios sritys pasirenkamos tokiu būdu, kad būtų pertraukiamas genas-taikinys ir tuo būdu jis tampa neekspresuojamu. Šis tikslas gali būti pasiektas, įterpiant ekspresijos bloką (kuriame yra ekspresuojama seka ir, jeigu reikia, tokie papildomi elementai, kaip signalinė seka, reguliacinė transkripcijos iniciavimo sritis ir/arba reguliacinė transkripcijos nutraukimo sritis) į nuskaitomą sritį šalia 5'-srities, pakeičiant geno-taikinio visą arba tik jo dalį sukonstruotu ekspresijos bloku, arba įterpiant sukonstruotą ekspresijos bloką tarp reguliacinės transkripcijos iniciavimo lokuso-taikinio srities ir atviro nuskaitymo rėmelio. Kaip buvo minėta, kai yra homologija tarp reguliacinės transkripcijos nutraukimo srities ir lokuso-taikinio srities, 3'-flankuojančios srities ilgis turi būti žymiai didesnis, nei reguliacinės transkripcijos srities, kuri yra transformuojamame genome.
[0071] Šio išradimo objektas taip pat yra pradinės konstrukcijos "antros kartos" fitazių sukūrimui, t.y. fermentų su fitaziniu aktyvumu, kurie savo savybėmis skiriasi nuo iki šiol išskirtų fermentų. Antros kartos fitazės gali būti charakterizuojamos pakeistais pH, temperatūros veikimo optimumais, specifiniu aktyvumu arba giminingumu substratui, o taip pat kitais skirtumais, kurie išplečia jų pritaikymo galimybes įvairiuose procesuose. Geriausias tokių mutacijų, tame tarpe ir kryptingų, objektas yra E. coli ląstelės. E. coli ląstelės nesugeba pašalinti intronų, kurie gali būti fitazės gene. Ekspresijai šiuose organizmuose geriausia naudoti klonuotą fitazės iDNR. Klonuota iDNR seka lengvai paveikiama žinomais būdais atliekamų mutacijų, po to mutuotas genas gali būti įterptas į norimą genomą.
[0072] Naujai sukonstruotą bloką galima transformuoti į recipientą linijiniu arba žiediniu vektoriumi, o esant būtinybei, jis gali būti pašalinamas iš vektoriaus. Geriausias vektorius yra plazmidė, kurią paprastai linearizuoja, tam kad įterptų iki 1 kilobazės ilgumo klonuojamo geno seką. Pageidautina įterpti fitazės ekspresijos bloką, gaunamą pagal šį išradimą, į tam tikros mikroorganizmų rūšies genomą.
[0073] Yra daugybė transformacijos į siūlinius grybus metodų. Iš jų reikia paminėti protoplastų suliejimą arba transformaciją, elektroperforaciją arba ląstelių mikrobombardavimą. Ypatingai geri rezultatai gaunami protoplastų transformacija, jos naudojimas turi daug privalumų.
[0074] Iš pradžių pasirinkto grybo kamieno micelis pervedamas, lizuojant ląstelių sieneles fermentais, į protoplastus, osmozei stabilizuoti naudojant Kcl arba sorbitolą. CaCl; panaudojimas palengvina DNR įsijungimą į protoplastus. Analogišku poveikiu pasižymi koncentruotas polietilenglikolio tirpalas, be to, jis sukelia protoplastų agregaciją, kurios metu vyksta DNR įterpimas į protoplastus ir po to įjungiamas transformavimo faktorius. Po to protoplastai regeneruojami agarizuotoje terpėje, kurioje yra osmozės stabilizatoriai, ir esant būtinybei, selektyvumo reagentas, atsparumas kuriam yra koduojamas transformuojančiojoje DNR.
[0075] Po transformuotų ląstelių atrankos reikalingo geno įsijungimą galima nustatyti įvairiais būdais. Jei sintetinamas produktas yra hetrologinis recipienui, geno ekspresija nustatoma antikūnų pagalba. Kitas metodas yra vienas hibridizacijos variantas, kurio pagalba galima aptikti įterptą geną arba jo transkripcijos produktą.
[0076] Nukleotidų sekos amplifikacija arba transformuoto genomo ekspresija vykdoma standartiniais metodais: kelių transformanto kopijų įvedimas į transformacijos vektorių, selektyvumo markerio amds (žiūr., pavyzdžiui, Weinars et aL, 1985, Current Genetics, 9, 361-368) panaudojimas. Amplifikuojama DNR seka gali būti, kaip nurodyta aukščiau, arba homologinė arba heteroliginė recipiento DNR.
[0077] Atlikus visas šitas operacijas, ląsteles galima auginti įprastoje terpėje. Auginant ląsteles, naudojami nedidelėmis koncentracijomis proteinazių inhibitoriai: fenilmetilsulfonilfluoridas, alfa-2-makroglobulinas, pepstatinas ir kiti. Paprastai šių inhibitorių koncentracijos yra nuo 1 įi g/ml iki 1 mg/ml. Norint išvengti baltyminio produkto proteinolizės, galima inaktyvuoti proteinazių geną(-us).
[0078] Transformuotas ląsteles galima auginti nepertraukiamos arba periodinės fermentacijos būdu, po kurios atskiriamas kultūrinis skystis ir iš jo ekstrahuojamas galutinis produktas.
[0079] Išgryninti galutinį produktą galima įvairiais metodais: chromatografija (tame tarpe ir HPLC), ekstrakcija tirpikliais, elektroforeze, taip pat kitais metodais arba jų deriniais.
[0080] Šio išradimo objektas taip pat yra baltymo maštabavimas, kurio metu atliekamas kultūrinio skysčio (esant reikalui, iš anksto apdoroto) filtravimas, po šio filtravimo atliekama sterilizuojanti filtracija, po to tirpalas koncentruojamas. Tokiu būdu gautą skystą koncentratą galima apdoroti tokiais būdais: a) nepertraukiamai maišant, išsodinant fitazę ir kitus baltymus acetonu iki galutinės jo koncentracijos 60% (tūrio procentai). Nuosėdas galima išdžiovinti vakuume
[0081] 35° temperatūroje. Susmulkinus sausus miltelius, fermentacijos produktas naudojamas praktinio jo pritaikymo bandymuose. Šio būdo galutinio produkto išeiga sudaro 90 %.
[0082] c) sumaišant su užpildais, pavyzdžiui, su kviečių sėlenomis. Gautus mišinius galima
[0083] d) stabilizuojant osmotinį slėgį, pridedant, pavyzdžiui, sorbitolo. Apsaugojimui nuo mikroorganizmų augimo naudojami konservantai, pavyzdžiui, benzoinė rūgštis.
[0084] Šios aprašytos keturios galutinio produkto formos gali būti parduodamos pusfabrikačių gamintojams, kombinuotų pašarų gamintojams, kitiems vartotojams ir fermeriams.
[0085] Pateikiami pavyzdžiai yra išradimo iliustracija ir neapriboja šio išradimo pritaikymo. Šios srities specialistams nesunku suprasti, kad fitazės genas, pagal šį išradimą, gali būti panaudotas heterologinės hibridizacijos eksperimentuose, norint išskirti fitazę koduojantį geną iš kitų mikroorganizmų rūšių.
[0086] NRRL 3135 Aspergillus ficuum kamienas buvo gautas iš Northern Region Research Lab. USDA, 1815, Northern Univ. str. Peoria, JAV. Grybų sporų preparatai buvo paruošiami pagal standartinę metodiką.
[0087] Sporos, o po to ir ląstelės, daug kartų buvo persėjamos Erlenmejerio kolbose ir pernešamos į 10 litrų fermentatorių. Po ciklinio kultivavimo, šiame fermentatoriuje išaugusi kultūra buvo naudojama inokuliantu 500 litrų galutinei fermentacijai.
[0088] Naudojamos terpės sudėtis: 91 g/l kukurūzų krakmolo (BDH Chemicals Ltd.), 38 g/l gliukozės kristalohidrato, 0,6 g/l MgS04-7H20, 0,6 g/l KC1, 0,2 g/l FeS04-7H20 ir 12 g/l KNO3. pH buvo palaikomas 4,6±0,3, automatiškai titruojant 4N NaOH ir 4N H2SO4 tirpalais.
[0089] Ląstelės buvo auginamos 28° temperatūroje, automatiškai reguliuojant jsotinimą deguonimi, palaikant jo 25 %. Maksimali fitazės produkcija nuo 5 iki 10 v/ml buvo pasiekiama po 10 dienų nuo fermentacijos pradžios.
[0090] Nufiltravus, 100 jul kultūrinio skysčio (jei reikia, praskiedžiama) arba supernatanto, arba tirpiklio (kontrolei) buvo pridedama į inkubacijos tirpalą:
[0091] Mišinys buvo inkubuojamas 30 min. 37° temperatūroje. Reakcija buvo stabdoma, pridedant 1 ml 10% TChA (trichloracto rūgštis) tirpalo. Po reakcijos sustabdymo buvo pridedama 2 ml reagento (3,66 g FeS04.7H20 50 ml amonio molibdato tirpale (2,5 g (NH4)6Mo7024-4H20 ir 8 ml H2SO4, praskiesto 250 ml tirpiklio)). Susidariusios mėlynos spalvos intensyvumas buvo matuojamas spektrofotometru 750 nm ilgio bangoje. Matavimų rezultatai rodo, kad išsiskyrusio reakcijos metu fosfato kiekis buvo nuo 0 iki 1 mM/1 (nustatant pagal fosfato kalibracinę kreivę).
[0092] Komponentai, kurie pasižymi fosfataziniu aktyvumu, buvo nustatomi izoelektrofokusavimu, naudojant įprastą dažą. Gelis buvo inkubuojamas alfa-naftilfosfato ir Fast Garnet GBC, Sigma (atitinkamai 0,1 ir 0,2 % (svoris/tūris) 0,6 M natrio acetatiniame buferiniame tirpale, pH 5,5. Reakcija, kurios metu susidaro juodos nuosėdos, sustabdoma metanolio ir acto rūgšties mišiniu, tūrių santykis 30:10 arba, norint išgauti baltymą su fitaziniu aktyvumu, perplaunant distiliuotu vandeniu.
[0093] Fitazė buvo gryninama iš A. ficuum NRRL 3135 kultūrinio skysčio iki homogeninės. Kultūrinis skystis buvo filtruojamas sterilizuojančios filtracijos būdu. Filtratas buvo koncentruojamas Filtron ultrafiltracijos įrangos pagalba su 30 kD filtrais. Reikalinga joninė jėga ir pH buvo pasiekiami, perplaunant koncentratą 10 mM natrio acetatiniu buferiniu tirpalu, pH 4,5. Šios stadijos metu pasiekiamas 20-ties kartų sukoncentravimas.
[0094] Po koncentravimo tirpalas buvo sorbuojamas ant jonų mainų sorbento (kolona HR 16/10, 20 ml, su sorbentu S-sefaroze (Fast-Flow, Pharmacia), chromatografija buvo atliekama su pagreitinta baltymų gryninimo sistema (Waters Preparative 650 Advanced Protein Purification System). Sorbuoti baltymai buvo eliuuojami nuo 0 iki 1 M natrio chlorido koncentracijos gradientu, fitazė desorbavosi, esant 250 mM NaCl koncentracijai. Frakcijos, kuriose buvo fitazinis aktyvumas, buvo koncentruojamos ir nudruskinamos ultrafiltracijos būdu. Gautas tirpalas buvo užpilamas ant jonų mainų sorbento kolonėlės (katijonų mainų Q-sefarozė Fast Flow, HR 16/10, 20 ml, Pharmacia), baltymai buvo eliuuojami natrio acetatiniu buferiu su NaCl koncentracijos gradientu nuo 0 iki 1 M taip, kaip aprašyta aukščiau. Fitazė buvo eliuuojama, kai NaCl koncentracija pasiekdavo 200 mM.
[0095] Po šių stadijų produkto santykinis fitazės aktyvumas buvo nuo 40 iki 50 v/mg baltymo, buvo pasiekiamas 25 kartų išgryninimas.
[0096] Analizuojant dalinai išgrynintą fitazės preparatą, buvo nustatyta vienintelė priemaiša, kurios molekulinė masė apytikriai buvo lygi 100 kD (Fig.lB, seka E). Izoelektrofokusavimu buvo nustatyti keli fermentai, pasižymintys fitaziniu aktyvumu, tame tarpe 3-4 fitazės formos, kurių izoelektriniai taškai buvo tarp 5,0 ir 5,4 (Fig.lA, sekos A ir
[0097] B).
[0098] Norint gauti homogeninį fosfatazės preparatą, preparatas buvo du kartus gryninamas izofokusavimu sistemos LBB Multiphor pagalba plokštelėse Ampholine PAG (pH intervalas nuo 4,0 iki 6,5). Baltymai su fitaziniu aktyvumu (tame tarpe ir fitazė) buvo nustatomi, dažant bendras fosfatazės, kaip nurodyta aukščiau. Atitinkamos juostos buvo išpjaunamos iš gelio ir aktyvus baltymas eliuuojamas, 16 valandų inkubuojant gelio gabaliukus 10 mM natrio acetatiniame buferiniame tirpale, pH 5,5. Baltymų frakcijos buvo analizuojamos, norint nustatyti santykinį fitazės aktyvumą pagal 2 pavyzdyje aprašytą metodą ir norint atskirti po analizės fitazę nuo kitų rūgštinių fosfatazių. Galutinis išvalymo laipsnis buvo 60 kartų (santykinis išgryninto baltymo aktyvumas buvo 100 v/mg). Šioje paskutinėje valymo stadijoje pasisekdavo išskirti fitazės izoformas (Fig.lA, sekos A ir B).
[0099] Efektyvus išgryninimas buvo pasiekiamas, naudojant monokloninius antikūnus A. ficuum. Antikūnai buvo imobilizuojami ant cianobromidu aktyvuotos sefarozės 4B (5 mg/ml sorbento), gautas sorbentas buvo naudojamas imunoafininei chromatografijai. Sorbento imlumas buvo apie 1 mg fitazės 1 ml. Fitazė buvo eliuuojama buferiniu tirpalu, kurio pH 2,5 (100 mM HCl-glicino, 500 mM NaCl), chromatografijos metu nebūdavo aktyvumo nuostolių. Šį valymo būdą galima panaudoti, išgryninant fitazę iki homogeninės iš kultūrinės terpės, vienintelės šios stadijos pagalba. Šio būdo išeiga - 80 %, išvalymo laipsnis - 60 kartų.
[0100] Fitazės iš A. ficuum (70 /xg baltymo) buvo inkubuojama su 25 vienetais N-glikazės (Genzyme) 0,2 M natrio fosfatiniame buferiniame tirpale, pH 6,8, su 10 mM 1,10-fenantrolinu, bendras reakcijos tūris - 30 y\.
[0101] Po 18 valandų inkubacijos 37° temperatūroje deglikozilinimo laipsnis buvo įvertinamas elektroforezės sistemos Phast System (Pharmacia) pagalba. Fitazės molekulinė masė sumažėdavo nuo 85 kD iki apytikriai 56,5 kD. Dažant cukrams selektyviu dažu - Šifo reagentu ,- norint nustatyti polisacharidų kiekį baltymo juostoje, nebuvo rasta polisacharidų liekanų baltyme. Pilnas angliavandenių nebuvimas papildomai buvo tikrinamas didelio jautrumo metodu - blotuojant lėktinu. Natyvi ir deglikozilinta fitazė (po 1,5 įxg) buvo analizuojama elektroforezės metodu standartinėmis sąlygomis poliakrilamidiniame gelyje su natrio dodecilsulfatu, baltymai pernešami ant membranos PVDF (Immobilon, Millipore) 25 mM Tris-glicininiame buferiniame tirpale, pH 8,3, su 20% metanolio 16 valandų, esant 30 V įtampai.
[0102] Po to membrana buvo inkubuojama su 1 % stambiųjų raguočių serumo albuminu fosfatiniame buferiniame tirpale, po to konkavalin-A-peroksidazės konjugato (Sigma) (10 ju.g/ml) tokiame pačiame buferinaime tirpale.
[0103] Šiuo jautriu metodu taip pat nebuvo aptikta angliavandenių liekanų deglikozilintoje fitazėje.
[0104] Po deglikozilinimo fermentas pilnai netekdavo aktyvumo, matyt dėl molekulių agregacijos.
[0105] Fitazės aminorūgščiu liekanų sekos nustatymas ir oligonukleotidiniu zondu konstravimas A. Aminorūgščiu liekanų sekos nustatymas iš baltymo N- galo
[0106] Po elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje su natrio dodecilsulfatu ir po izofokusavimo fitazė buvo pernešama ant membranos. Elektroblotingas buvo atliekamas 10 mM CHAPR (3-cikloheksilaminopropansulfoninė rūgštis) buferiniame tirpale, pH 11,0, su metanoliu (10 % pagal tūrį) 16 valandų, esant 30 V įtampai, 4° temperatūroje.
[0107] Baltymo lokalizacija buvo nustatoma, dažant Kumasi brilianto mėliu. Atitinkama juosta buvo iškerpama, išblukinama metanolyje ir buvo nustatoma seka dujų-fazinio sekvenavimo pagalba. Ši procedūra buvo kartojama keletą kartų, naudojant skirtingus pavyzdžius. Gauti rezultatai pateikti Fig.lA (sekos A ir B).
[0108] Lygiagrečiai buvo nustatoma ir 100 kD baltymo, kuris būdavo dalinai išgrynintame preparate, aminorūgščiu liekanų seka. Šie duomenys pateikti Fig.lC. Nustatyta aminorūgščiu liekanų seka tam tikru laipsniu buvo homologinė fosfatazės, išskirtos iš Aspergillus niger, aminorūgščiu liekanų sekai, kuri buvo nustatyta (Mac Rac et ai., 1988, Gene, 17, 339-348).
[0109] Ultracentrifugavimo būdu išvalyta homogeninė fitazė buvo pridėta į 100 mM NaHCC>3 tirpalą, naudojant mikrokoncentratorių Centricon 30 (Amicon). Po to baltymas buvo liofilizuojamas, tirpinamas 70 % (masė/tūris) trifluoracto rūgštyje ir inkubuojama su 300 kartų moliniu CNBr pertekliumi 6 valandas. Reakcija buvo stabdoma, praskiedžiant inkubacijos mišinį vandeniu. Po to mėginys buvo praskiedžiamas elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje su dodecilsulfatu buferiniu tirpalu su DTT (ditiotrietolis), ir pagal nurodytą elektroforezės metodiką buvo įvertinamas baltymo suskaldymas. Analitiniams SDS elektroforezės tikslams buvo naudojamas Phast System (Pharmacia) elektroforezės aparatas, naudojamo gelio koncentracija buvo 20%. Mažų peptidų funkcionavimo elektroforezės metu padidinimui iš pradžių buvo atliekama elektroforezė be mėginių, tuo būdu gaunama vienoda buferinė sistema gelyje (tai buvo atliekama, prisilaikant gamintojo instrukcijų). Peptidai buvo nustatomi dažant sidabru; toks metodas plačiai taikomas tokiems tikslams, nes dažant Kumasi brilianto mėliu, mažų peptidų nepasiseka nustatyti. Atlikus skaldymo operaciją, buvo nustatyta, kad fitazė pilnai buvo suskaldyta j polipeptidus, kurių molekulinės masės buvo nustatytos 2,5, 36, 57 ir 80 kD.
[0110] Šie peptidai buvo išskirti dujų-faziniu sekvenavimu, panaudojant elektroforezę poliakrilamidiniame gelyje su tricinu ir natrio dodecilsulfatu, kaip aprašyta Schragger & Jagav (1987, Anai. Biochem., 166, 368-379), po to buvo atliekamas elektroblotingas pagal aukščiau aprašytą metodiką.
[0111] Fragmento, kurio molekulinė masė 57 kD, aminorūgščių liekanų seka iš baltymo N-galo buvo identiška aminorūgščių liekanų sekai iš fitazės N-galo, kuri buvo aprašyta Ullak (1988c, supra), ji skyrėsi tik tuo, kad nurodytame fragmente nebuvo pirmųjų 4 aminorūgščių liekanų (Fig. 1 A, seka B). Peptidų, kurių molekulinės masės buvo 2,5 ir 36 kD, aminorūgščių liekanų seka iš N-galo pateikta Fig.lB (sekos A ir B).
[0112] Oligonukleotidinių zondų konstravimas rėmėsi nustatytomis aminorūgščių liekanų sekomis (Fig.lA ir 1B). Jų sintezė buvo atliekama DNR sintezatoriumi Applied Biosystems ABI 380B. Šie oligonukleotidai pavaizduoti Fig.2A ir 2B.
[0113] Genominiu kompleksu ir genominiu bibliotekų hibridizacija su pirmuoju oligonukleotidu zondu rinkiniu
[0114] Genominės DNR iš A ficuum buvo išskiriamos po micelio susmulkinimo skystame azote pagal standartines metodikas (šiuo atveju naudojant metodiką Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. USA, 1470-1474). Genominė biblioteka buvo konstruojama bakteriofago lambda EMBL3 vektoriuje, panaudojant dalinai restriktuotą Sau3A A. ficuum kamieno NRRL 3135 chromosominę DNR (pagal standartinę metodiką, aprašytą Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., N.Y., 1982). Tokiu būdu gauta genominė biblioteka sudaro 60-70 kartinį A. ficuum genomą. Tuščių dėmių be intarpo kontrolė bibliotekoje buvo vykdoma hibridizacijos pagalba su labiau uždaru fago lambda EMBL 3A fragmentu. Hibridizuojant su lambda EMBL 3A zondu dėmes, hibridizuodavosi ne daugiau 1 %. Intarpo dydis buvo 13-17 kilobazių.
[0115] Zondų, reikalingų genominės bibliotekos skryningui, sąlygų ir savybių išaiškinimui genominė DNR buvo suskaldyta keliais restrikcijos fermentais, fragmentai atskirti agarozėje ir blotuojami Genescreen aparatu pagal gamintojo rekomendacijas. Gauti preparatai hibridizavosi su visais oligonukleotidiniais zondais. Hibridizacija buvo vykdoma sąlygose, besiskiriančiose limitavimo laipsniu (6xSSC, nuo 40 iki 60° hibridizacijos metu ir iki 0,2xSSC 65° perplaunant). Genominės bibliotekos skryningui buvo pasirinkti zondai 1068 ir 1024 (Fig.2A), nors bendri DNR fragmentai, kurie hibridizuotųsi su abiem zondais, nebuvo rasti. Zondas 1025 šarminei fosfatazei (Fig.3) davė specifinį diskretinį hibridizacijos signalą. Todėl jis buvo pasirinktas rūgščios fosfatazės genominės bibliotekos skryningui.
[0116] Visų trijų zondų pagalba galima nustatyti genominėje bibliotekoje hibridizuojančiąsias dėmes. Hibridizacijos signalas, atitinkantis zondui 1025 (rūgštinės fosfatazės), buvo intensyvus ir atsikartojantis. Zondai 1024 ir 1068 duodavo kintamo intensyvumo hibridizacinius signalus, jie charakterizavo fitazės savybes. Kryžminės reakcijos tarp abiejų serijų nebuvo pastebėtos. Buvo atliktas pakartotinis skryningas visų trijų serijų dėmių, iš aštuonių vienetinių, sugebančių hibridizuotis dėmių, buvo išskirta DNR (Maniatis et al., supra). Kiekvienoje serijoje buvo identifikuoti klonai, turintys identiškus hibridizuojančiuosius fragmentus. Tai įrodo, kad klonuose esantys intarpai dalinai gali persidengti vienoje ir toje pačioje genominės DNR srityje. Bet ir šiuo atveju kryžminės hibridizacijos nebuvo (naudojant dvi serijas specifinių fitazės zondų 1024 ir 1068). Tokiu būdu, nors abu zondai, kurie buvo naudojami dviejų klonų serijų analizei, buvo sukonstruoti pagal baltymo aminorūgščių liekanų iš N-galo seką, identifikavosi ir klonavosi skirtingi genominės bibliotekos DNR fragmentai.
[0117] Visos trys klonų serijos hibridizavosi su dėmėmis, kuriose buvo iRNR, išskirtomis iš aktyvuoto ir neaktyvuoto micelio (Northerm blots, 6 pavyzdys). Specifiški rūgštinei fosfatazei klonai ir išskirtas iš šių klonų vidinis fragmentas Salį, kurio ilgis 3,1 kilobazės, hibridizavosi tik su indukuotas iRNR pavyzdžiais. Identifikuotos su specifiniais rūgštinės fosfatazės zondais iRNR ilgis buvo apytikriai 1800 bazių, tai atitinka žinomam baltymo dydžiui (68 kD pagal Ullak & Cummins, 1987, Prep. Biochem., 17, 397-422). Specifiški fitazei klonai nesihibridizavo su specifiškomis iRNR. Todėl mes padarėme išvadą, kad aprašytosios metodikos pagalba negalima klonuoti geno, koduojančio fitazę. Kita išvada - šis metodas nėra blogas, nes jo pagalba buvo klonuotas genas, koduojantis rūgštinę fosfatazę. Lambda klonas, turintis savyje rūgštinės fosfatazės geną, buvo perduotas saugojimui į Centrinį grybų kultūrų biurą Baarn, Olandija (Central Bureu voor Schimmelentures. Baarn, Netherlands) 1989 m. balandžio 24 d., kuriam buvo suteiktas numeris CBS 214.89. Iš dėmės Z1 buvo išskirtas BamHI fragmentas, kurio ilgis 10 kilobazių, kuris buvo klonuotas į pUC19. Šis paklonis turi pilną geną, koduojantį rūgštinę fosfatazę. Paklonis, pažymėtas pAF 1-1 (Fig.5), buvo perduotas saugojimui 1989 m. balandžio 24 d., jam buvo suteiktas numeris CBS 213.89.
[0118] Geno, koduojančio fitazę, išskyrimas, naudojant antraii oligonukleotidiniu zondu rinkini Zondai buvo konstruojami pagal aminorūgščių liekanų sekas iš peptidų fragmentų N-galų, kurie buvo gaunami skaldant baltymą CNBr (Fig.2B, zondai 1295,1236 ir 1297), ir buvo hibridizuojami, kaip aprašyta aukščiau, su genomine DNR. Šių zondų tinkamumas fitazę koduojančio geno nustatymui buvo tikrinamas, hibridizuojant juos su genominiais kompleksais (Southern hybridization). Šiuo atveju, naudojant visus tris zondus, buvo gaunami hibridiniai atitinkamo ilgio fragmentai, nežiūrint į tai, kad zondai buvo sukonstruoti iš persidengiančių sričių. Nebuvo hibridizacijos tarp naujo zondų rinkinio ir klonų, atrinktų pirmuoju zondų rinkiniu (4 pavyzdys). Todėl buvo atlikti specialūs pakartotiniai genominės bibliotekos skryningo su trimis zondais bandymai. Taip pat nustatyta pogrupės (lambda AF 201, 219, 241 ir 243) klonų, kurie buvo atrinkti su vienu iš trijų zondų, su kitais dviem zondais hibridizacija. Tai parodo, kad naudojant tris skirtingus zondus, buvo išskirti klonai iš vienos ir tos pačios genomo srities. Buvo pabandyta hibridizuoti naujai atrinktus klonus su zondais 1024 ir 1068. Abiem atvejais nauji klonai su šiais zondais nesihibridizavo tokiose sąlygose, kuriose šie zondai hibridizavosi su klonais, atrinktais šių zondų pagalba (4 pavyzdys). Tai įrodo, kad naujai atrinkti klonai buvo nehomologiniai zondams, sukonstruotiems pagal fitazės N-galo aminorūgščių liekanų seką.
[0119] Klonas lambda-EMBL3, kuris hibridizavosi su visais trimis zondais (1295, 1296 ir 1897), buvo pavadintas lambda-AF201 (Fig.4). Jis buvo perduotas saugojimui 1989 m. kovo 9 d., jam buvo suteiktas numeris CBS 155.89.
[0120] Klono AF201 BamHI fragmentas, kurio ilgis 5,1 kilobazių, subklonuotas į pUC19 ir pažymėtas pAF 2-3 (žiūr. Fig.4), hibridizavosi su visais trimis oligonukleotidiniais zondais ir buvo naudojamas blotingui. Šiuose eksperimentuose buvo išskirta diskretinė iRNR, kurios ilgis buvo 1800 bazių. Ši iRNR buvo tik aktyvuotuose miceliuose. Panašūs rezultatai buvo gauti, naudojant oligonukleotidinius zondus. Todėl, naudojant naują zondų rinkinį, buvo identifikuotas bendras DNR fragmentas, kuris specifiškai hibridizavosi su indukuota iRNR. Šios RNR ilgis (1800 bazių) yra pakankamas baltymo, kurio molekulinė masė yra apie 60 kD, kodavimui, t.y. tokio pat dydžio, kaip ir neglikozilintas fitazės baltymas. Akivaizdu, kad išskirtuose fragmentuose yra bent dalis geno, koduojančio fitazę.
[0121] Iš literatūros žinoma, kad fitazės sintezė A. ficuum ląstelėse griežtai kontroliuojama priklausomu nuo fosfato mechanizmu (Han & Callagher, 1987, J. Industr. Microbiol., l, 295-301). Todėl mes laikėme, kad parodžius panašų reguliacijos mechanizmą išskirtam genui, mes įrodysime šio geno klonavimą.
[0122] Norint išskirti iRNR, sintezuojamą produktyviomis ir neproduktyviomis sąlygomis, A. ftcuum ląstelės (kamienas NRRL 3125) buvo auginamos tokiu būdu. Iš pradžių sporos buvo auginamos per naktį neindukuojančioje terpėje. Kitą dieną buvo surenkamas micelis, perplaunamas steriliu vandeniu ir pernešamas į aktyvuojančią ir neaktyvuojančią terpes, kurios sudėtis: 20 g/l kukurūzų krakmolo, 7,5 g/l gliukozės, 0,5 g/l MgSO^HaO, 0,2 g/l FeS04.7II20 ir 7,2 g/l KN03. Fitazės indukcijai į terpę buvo pridedama iki 2 g/l kukurūzų ekstrakto, o į neindukuojančią terpę įdedama iki 2 g/l K2HPO4. Micelis buvo auginamas ne mažiau 100 valandų, imant mėginius po tam tikro laiko tarpo. Fitazės produkcija buvo kontroliuojama pagal metodiką, aprašytą 2A pavyzdyje. Denatūruota DNR buvo išskirta elektroforezės ir bloto Genescreen plus aparate būdu. Gautos dėmės buvo hibridizuojamos su žymėtu 32P pAF 2-3 arba su išskirtu iš pAF 1-1 Salį fragmentu, kurio ilgis 3,1 kilobazių pagal 4 pavyzdį (rūgštinės fosfatazės atveju). Šio eksperimento rezultatai pateikti 2 lentelėje. 2 lentelė Dėmių hibridizacija su specifiniu fitazei fragmentu BamTI, kurio ilgis 5,1 kilobazių (A), arba specifiniu rūgštinei fosfatazei fragmentu Salį, kurio ilgis 3,1 kilobazių (B), naudojamų zondais. Ženklas + parodo esant fitazės iRNR, kurios ilgis 1800 bazių, arba rūgštinės fosfatazės iRNR, kurios ilgis 1800 bazių. Santykinis fitazės aktyvumas buvo nustatomas mėginiuose, gautuose po 24 valandų kultivavimo. Aktyvuotose kultūrose fitazės aktyvumas buvo 10 kartų didesnis, nei neaktyvuotose.
[0123] Hibridizacija tarp specifinio fitazei fragmento BamHI, kurio ilgis 5,1 kilobazių, ir specifinio rūgštinei fosfatazei fragmento Salį, kurio ilgis 3,1 kilobazių, su išskirta iRNR vyko tik tais atvejais, kai ląstelės buvo auginamos indukuojančiomis fitazės ir rūgštinės fosfatazės biosintezę sąlygomis. Iš šių rezultatų buvo padaryta išvada, kad šie išskirti genai yra reguliuojami aprašytais fitazės ir rūgštinės fosfatazės reguliavimo mechanizmais.
[0124] Norint neginčijamai įrodyti, kad sėkmingai išskirtas fitazę koduojantis genas ir pademonstruoti galimybę padidinti jos ekspresijos lygį, šis genas buvo subklonuotas į atitinkamą vektorių ir juo buvo transformuotos A. niger 402 (ATCC 9092) kamienas. Šiam tikslui buvo išskirtas fitazės genas iš klono lambda AF 201 fragmento Nrul pavidalu, kurio ilgis 10 kilobazių, ir jis buvo klonuotas StuI saite vektoriuje pAII 1-3, kuriame selektyvumo markeris buvo atsparumas fleomicinui (Mathern I.E. & Puni P.J., 1988, Fungal Genetics Newsletter, 35, 25). Gautas darinys buvo pavadintas pAF 28-1 (Fig.4) ir buvo transformuotas į A. niger 402 kamieną pagal metodiką, aprašytą 9 pavyzdyje, su tuo skirtumu, kad protoplastai buvo užnešami ant minimalios Aspergillus kultūrinės terpės, į kurią buvo pridedama 30 ju-g/ml fleomicino ir kietinama su 0,75 % agaro. Atskiri transformantai po atrankos buvo valomi ir buvo nustatomas jų produktyvumas, auginant mikrobiologinėse kolbose, kaip aprašyta 1 ir 2 pavyzdžiuose. Kontrolei buvo naudojami transformantai, turintys savyje tik vektorius arba netransformuotas ląsteles-recipientes (3 lentelė). Buvo nustatyta, kad fitazę, susirišančią su specifiniais antikūnais fitazei iš A. ficuum, sintetino tik A niger 402 kamienas, kuris turėjo pAF 28-1. Fermentas, kuris rišosi su nurodytais antikūnais, buvo eliuuojamas nuo imunoafininio sorbento esant pH 2,5. Pagal molekulinę masę, glikozilinimo laipsnį, izoelektrinį tašką ir santykinį aktyvumą eliuuotas baltymas nesiskyrė nuo fitazės iš A. ficuum. Šie duomenys pilnai įrodo, kad ląstelės A. niger 402, transformuotos pAF 28-1, ekspresuoja fitazę, praktiškai identišką fermentui iš/4, ficuum. Analogiška ekspresija kontrolėje nebuvo pastebėta.
[0125] Lambda klonai, kuriuose yra fitazės genas, buvo analizuojami įvairių restrikcijos fermentų pagalba. Genominės srities, kurioje yra fitazės genas, žemėlapis pateiktas Fig.4.
[0126] Aukščiau (5 pavyzdys) buvo parodyta, kad esančiame pAF 2-3 BamFII fragmente, kurio ilgis 5,1 kilobazių, yra bent dalis fitazės geno. Be to, oligonukleotidinai zondai 1295 ir 1237 hibridizavosi su Salį intarpu pAF 2-7 (žiūr. Fig.2B; klonų pAF 2 padėtys nurodytos
[0127] Šių eksperimentų rezultatai parodo, kad koduojanti fitazę seka yra lokalizuota kairėje BamHI intarpo dalyje plazmidėje pAF 2-3.
[0128] Sekančių bandymų metu buvo pilnai iššifruota intarpų plazmidėse pAF 2-3, pAF 2-6 ir pAF 2-7 nukleotidų seka. Šiam tikslui buvo naudojama didezoksi-grandžių nutraukimo metodika (Sauger et ai., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467) ir bombardavimo metodika, aprašyta Messing et ai., 1981, Nucl. Acids Res., 9, 309-321. Specifiški oligonukleotidai sintetinami pagal nukleotidų sekas, gautas sekvenavimo metu.
[0129] Klonų pAF 2-3, pAF 2-6 ir pAF 2-7 pilna nukleotidų seka, įjungiant ir chromosominį fitazės geno lokusą, pateikta Fig.6, o lokuso schema - Fig.7.
[0130] Analizuojant ar gali pilna nukleotidų seka koduoti baltymą, buvo nustatyta, kad N-galo aminorūgščių liekanų seka suformuotoje baltymo molekulėje koduojama nukleotide sritimi, kuri yra 381 padėtyje (pagal Ullak duomenis, N-galąs lokalizuotas 369 padėtyje). Taip pat nustatyta, kad vidinių peptidų fragmentų, kurių molekulinės masės 53 ir 2,5 kD (žiūr. Fig.lB, sekos B ir A), N-galo seka koduojama nukleotidų sekomis, kurios yra atitinkamai 1101 ir 1548 padėtyse. Atviras skaitymo rėmelis baigiasi 1713 padėtyje.
[0131] Šie rezultatai pilnai patvirtina, kad fitazę koduojanti DNR seka yra aprašytame aukščiau chromosominiame lokuse.
[0132] Nuskaitomoje sekoje, kuri yra prie atviro nuskaitymo rėmelio subrendusio baltymo sekos, 3' kryptimi nuo chromosominės nukleotidų sekos, kuri koduoja pilną fitazės molekulę, nesurastas startinis kodonas ATG. Tačiau, remiantis šalia esančios zonos tarp egzono ir introno savybėmis, galima postuluoti, kad yra intronas tarp nukleotidų 254 ir 355. Galima laikyti, kad ATG kodonas yra 210 padėtyje sekos, kuri apima subrendusios fitazės kodavimą. Atkurta aminorūgščių liekanų seka iš nukleotidų sekos baltymo N-galo pilnai atitinka sekai, atsakingai už sekrecijos signalą, kurią nustatė von Heyne (Eur. J. Biochem., 1983, 133,17-21).
[0133] Norint patvirtinti išsakytas hipotezes, buvo pabandyta išskirti fitazės kDNR amplifikacijos pagalba su specifiniu pradmeniu, naudojant kaip matricą bendros populiacijos iRNR/DNR. Procedūra aprašyta žemiau.
[0134] Bendra RNR buvo išskirta iš A. ficuum NRRL 3135 kamieno, kultivuojamo aktyvuojančioje terpėje, kaip aprašyta 6 pavyzdyje. Sausas micelis buvo užšaldomas skystame azote ir susmulkinamas. Po to milteliai buvo homogenizuojami homogenizatoriuje Ultra-Turrax 1 minutę, maksimaliu greičiu 3M LiCl ir 6M karbamido tirpale, 0° temperatūroje. Homogenizatas buvo paliekamas nakčiai 4° temperatūroje, kaip aprašyta Auffrey & Raugear (Eur. J. Biochem., 1980, 187, 303-314). Bendra ląstelinė RNR buvo gaunama po 30 minučių centrifugavimo, esant 16000 g, ir po dviejų, viena po kitos einančių, ekstrakcijų fenolio, chloroformo ir izoamilo alkoholio mišiniu (50:48:2). RNR buvo išsodinama etilo alkoholiu ir praskiedžiama iki 1 ml 10 mM Tris-HCl buferiniu tirpalu (pH 7,4) su 0,5 % natrio dodecilsulfato. Poli-A+RNR atrankai bendra RNR buvo pašildoma 60° temperatūroje 5 minutes ir užnešama ant oligo(dT)-celiuliozės. Po kelių perplovimų tirpalu, kuriame buvo 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) su 0,5 % natrio dodecilsulfato ir 0,1 M NaCl, poli-A+RNR buvo eliuuojama 10 mM Tris-HCl buferiniu tirpalu, pH 7,4, su 0,5 % natrio dodecilsulfato.
[0135] kDNR sekos, koduojančios fitazę, buvo išskirtos dviem fragmentais grandininės polimerazinės reakcijos (GPR) pagalba. Pagal genominę fitazę koduojančią seką, parodytą Fig.6, buvo konstruojami oligonukleotidiniai pradmenys:
[0136]
[0137] Oligo 1 seka yra 5'-kryptimi nuo startinio ATG kodono (padėtys 210-231) ir flankuojančiu per 5' ribą saitu EcoRI. Oligo 2 seka yra prie saito Salį 3'-kryptimi (padėtys 1229-1109) ir taip pat flankuota papildomu saitu EcoRI. Oligo 3 seka yra prie saito BamHI (padėtys 845-865). Oligo 4 seka yra nukleotidų seka 5'-kryptimi nuo fitazės stop kodono (padėtys 1890-1867) ir flankuota papildomai PsaI saitu.
[0138] Grandininė polimerazinė reakcija buvo vykdoma pagal Taq polimerazės gamintojų
[0139] (Cetus) rekomendacijas. Kaip matrica fitazės N-galo sekos amplifikacijos reakcijoje buvo naudojamas aukščiau paminėtų iRNR/kDNR hibridų tirpalas (1,5 /xl), kaip pradmenys buvo naudojami oligo 1 ir oligo 2 (po 0,3 ^g kiekvieno), ir oligo 3 ir oligo 4 C-galo sekos tos pačios kDNR amplifikacijos reakcijoje (žiūr. Fig.3). Po 7 minučių denatūracijos 100° temperatūroje ir pridėjus 2 vientus Taq polimerazės, amplifikacijos reakcija buvo vykdoma 25 ciklus Perkin Elmer amplifikatoriuje (Cetus) (kiekvienas ciklas po 2 minn. 55°, 3 min. 72°, 1 min. 94° temperatūrose). Paskutiniame cikle denatūravimo stadija buvo praleidžiama. Po restrikcijos (EcoRI N-galo kDNR sekai ir BamHI ir PstI C-galo kDNR sekai) abu kDNR fragmentai buvo klonuojami į atitinkamus saitus plazmidėje pTZ18R (P. range).
[0140] Abiejų gautų nukleotidų fragmentų sekos buvo nustatomos didezoksi-grandžių nutraukimu (Sanger, supra), naudojant sintetinius oligonukleotidus, sukonstruotus pagal chromosominio fitazės geno seką. Šie oligonukleotidai buvo naudojami pradmenimis, matrica buvo amplifikuota kDNR. kDNR srities seka, koduojanti fitazę, ir pagal ją išvesta šio fermento aminorūgščių liekanų seka pateikta Fig.8.
[0141] kDNR analizė patvirtino esant intronus nusakytoje lokalizacijoje, ir parodyta, kad nėra chromosominėje geno sekoje kitų intronų. Fitazės genas koduoja pirminį trasliacijos produktą, kuris susideda iš 487 aminorūgščių liekanų, jo molekulinė masė 51091 D. Po pirminio produkto procesingo, kurio metu atskeliamas signalinis peptidas, susidaro subrendęs baltymas, pasižymintis fitazės aktyvumu, jo sudėtyje yra 444 aminorūgščių liekanos (įskaitant 4 pirmas liekanas, kurias minėjo Ullak), šiuo atveju molekulinė masė yra 49232 D.
[0142] Fitazės superekspresija Aspcrgillus genties grybuose po papildomu genominiu fitazės DNR
[0143] Visi vektoriai buvo konstruojami, naudojant standartinius molekulinės biologijos metodus, kurie aprašyti laboratoriniame klonavimo vadove (Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982).
[0144] Ekspresijos vektorius pAF 2-2S buvo gaunamas, subklonuojant pvull DNR fragmentą, kurio ilgis 6 kilobazės, iš genominio fitazės lambda-AF201 klono į SmaI saitą
[0145] (Fig.9). Tokiu būdu gauta plazmidė buvo pažymėta pAF 2-2 (Fig.4). Selektyvumo markeriu transformacijoje \ Aspergillus buvo naudojamas EcoRI/KpnI DNR fragmentas iš plazmidės pGU 325 (Wernars K., Thesis, Agr. Univ. Wageningen, Netherlands, 1986), kurioje yra homologinis amdS genas iš Aspergillus nidulans. Šis fragmentas buvo įterptas į EcoRI/KpnI saitą plazmidėje pAF 2-2. Tokiu būdu sukonstruotas ekspresijos vektorius buvo pažymėtas pAF 2-2S. Jis parodytas Fig.9.
[0146] Plazmidė pAF 2-2S buvo įvedama į A. ficuum kamieno NRRL 3135 ląsteles transformacijos metodu, aprašytu Tilburn J. et al., (Gene, 1983, 26, 205-221) ir Kelly J. & Hynes M. (EMBO, J., 1985, 4, 457-479) su šiais pakeitimais: - micelis buvo auginamas grybų Aspergillus minimalioje terpėje (Cove D., Biochem. Biophys. Actą, 1966, 113, 51-56), praturtintoje 10 mM arginino iir 10 mM prolino, 30° temperatūroje 16 valandų mikrobiologinėse kolbose, purtomose- 300 apsisukimų per minutę dažniu. - formuojant protoplastus, vietoj chelikazės buvo naudojama Novozym 234 (Novo Industry).po 30 minučių po protoplastų susidarymo j suspensiją buvo įdedama 1 suspensijos tūris STC (1,2 M sorbitolo, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM CaC^) buferinio tirpalo ir centrifuguojama esant 2500 g 4° temperatūroje 10 minučių, po to protoplastai išplaunami ir suspenduojami STC buferiniame tirpale taip, kad ląstelių koncentracija būtų lygi 108 ląstelių 1 ml. - į 100 ju.1 protoplastų suspensijos buvo pridedama plazmidinė DNR 10 įA TB buferinio tirpalo (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, ir 0,1 mM EDTA). - po protoplastų suspensijos su DNR 25 minučių inkubacijos 0° temperatūroje lašinant buvo pridedama 200 /xl polietilenglikolio tirpalo (25 % polietilenglikolis 4000, Merck) ir 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, su 50 mM CaCl2 ). Po to, pastoviai maišant, lėtai pripilama dar 1 ml polietilenglikolio tirpalo (60 % polietilenglikolis 4000, ištirpintas 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, su 50 mM CaCŲ. Po inkubacijos kambario temperatūroje suspensija buvo praskiedžiama STC buferiniu tirpalu, sumaišoma purtant ir centrifuguojama 2000 g 4° temperatūroje 10 minučių. Protoplastai buvo atsargiai resuspenduoti 200 įj\ STC buferinio tirpalo ir užsluoksniuoti ant minimalios Aspergillus grybų auginimui terpės, kurioje papildomai buvo 20 mM acetamido, kaip vienintelio azoto šaltinio, 15 mM CsCl ir 1 M sacharozės; terpė buvo sukietinta 0,75 % bakteriologiniu agaru #1 (Oxoid). Auginama 35° temperatūroje 6-10 dienų.
[0147] Buvo atrinkti atskiri transformantai, pažymėti SP4, SP7 ir SP8, išvalyti ir buvo tikrinamas jų sugebėjimas sintetinti fitazę, auginant mikrobiologinėse kolbose, pagal 1 ir 2 pavyzdžiuose aprašytą metodiką. Analogiškos operacijos buvo atliekamos su transformantais, kuriuose buvo tki vektorius (amdS genas plazmidėje pVC 19), arba su netransformuotais recipientais (kontroliniai bandymai).
[0148] Grybų kamienas buvo auginamas aktyvuojančiomis sąlygomis (žiūr. 6 pavyzdį), pavyzdžiai analizei buvo imamai po 96 valandų kultivavimo. Buvo analizuojamas fitazės aktyvumas (4 lentelė) ir vykdomas elektrofokusavimas poliakrilamidiniame gelyje.
[0149] Mėginių, gautų auginant vienodomis sąlygomis A. ficuum ir A, ficuum pAF 2-2S kultūras, vienodi tūriai buvo analizuojami izofokusavimu poliakrilamidiniame gelyje (Phast System, Pharmacia) pH intervale nuo 4,5 iki 6,0. Elektroforezė buvo atliekama pagal gamintojo rekomendacijas. Gelis buvo dažomas Kumasi brilianto mėliu bendram baltymui (Fig.lOB) arba dažu, selektyviu fosfataziniam aktyvumui, kaip aprašyta 2 pavyzdyje (Fig.lOA).
[0150] Be to buvo naudojama fitazė iš A. ficuum, išgryninta iki homogeniškos imunoafininės chromatografijos pagalba, kaip aprašyta 7 pavyzdyje, viena arba mišinyje su kultūriniu skysčiu.
[0151] Kaip buvo pažymėta aukščiau, fitazė atskiruose mėginiuose būna įvairiose izoformose (pažymėtos žvaidždutėmis). Išgryninta fitazė, dažant abiem būdais, duoda gerai matomas juostas 3 ir 4, kurios atitinka dviems fitazės izoformoms (A ir B). Analogiškos juostos gaunamos, dažant fitazę, gautą iš tėvinio kamieno A. ficuum. Transformuotame kamiene pAF 2-2S SP7 jos yra intensyvesnės.
[0152] Ekspresijos vektorius pAF 2-2 buvo įterptas į ląsteles A. niger CBS 513.88, jas transformuojant, kaip aprašyta A ficuum atveju. Transformantai buvo išskiriami, išvalomi ir buvo nustatomas jų sugebėjimas produkuoti fitazę, auginant mikrobiologinėse kolbose indukuojančiose sąlygose, kaip aprašyta 6 pavyzdyje. Ekspresijos lygis atskiruose transformantuose, pažymėtuose pAF 2-2S #8, #20 ir #33, o taip pat kontroliniuose kamienuose buvo nustatomas, kaip aprašyta 9A pavyzdyje, duomenys pateikti 5 lentelėje.
[0153] Fitazės ekspresijos lygis transformuotose A. niger ląstelėse buvo panašus ekspresijos lygiui A. ficuum kamienuose. Be to, parodyta, kad A. ficuum fitazės promotorius yra aktyvus A. niger kamienuose.
[0154] Tolimesnė analizė buvo atliekama, naudojant transformuotų ląstelių pAF 2-2S #8 kamieno kultūrinį skystį elektroforezės ir izofokusavimo pH intervale nuo 4,5 iki 6,0 poliakrilamidiniame gelyje pagalba elektroforezės aparate (Phast System, Pharmacia) pagal aukščiau aprašytą metodiką. Vienodi supernatanto tūriai tėvinio kamieno A. niger ir transformuotų ląstelių pAF 2-2S #8, išaugintų vienodomis sąlygomis, buvo įdedami į gelį, kuris buvo dažomas po elektrofokusavimo, kaip aprašyta aukščiau.
[0155] Tėvinis kamienas A. niger sintetino labai nedidelį fitazės kiekį ir tokio kiekio nepasisekė aptikti elektroforezės pagalba. Kamienas pAF 2-2S #8 produkavo maždaug 90 kartų didesnį fermento kiekį, nei tėvinis kamienas. Šis skirtumas gerai matomas Fig.ll.
[0156] Buvo nustatytos kelios fermento formos (pažymėta žvaidždutėmis). Dažant visus baltymus, buvo nustatyta, kad atitinkamų juostų intensyvumas labai padidėja, tuo tarpu kitų baltymų juostos neišryškėja.
[0157] Fitazės ekspresija transformuotose ekspresijos vektoriais A niger ląstelėse, kuriose yra fitazės genas išA ficuum , sujungtas su promotoriumi ir/ arba signaline amilogliukozidazės ( AG) seka isA . niger
[0158] Norint pasiekti fitazės superekspresją A. niger ląstelėse, buvo sukonstruoti papildomi ekspresijos blokai, kuriuose fitazės iš A. ficuum genas kontroliuojamas amilogliukozidazės (AG) promotoriumi iš A niger deriniuose su skirtingomis signalinėmis sekomis. Plazmidėse pl8FYT3 ir p24FYT3 yra atitinkamai 18 ir 24 aminorūgščių liekanos geno AG iš A. niger lyderinės sekos, sujungtos su fitazės geno fragmentu, kuris koduoja subrendusį baltymą. Ekspresijos vektoriuje pFYT3 promotoriaus AG seka sujungta su seka, koduojančia fitazę, kurioje yra limituojanti šio baltymo biosintezę seka.
[0159] Promotoriaus AG sujungimas su 18 aa AG-lyderine seka su seka, koduojančia pilnai suformuotą fitazę, buvo atliekamas grandininės polimerazinės reakcijos pagalba. Buvo naudojamos dvi skirtingos matricos: pAF 2-2S, kurioje yra, kaip aukščiau minėta, pilnas fitazės genas, ir pABC-l-plazmidė, kurioje yra pilnas AG lokusas iš A. niger, išskirtoje iš A. niger plazmidinės bibliotekos, kurioje yra Hindll fragmentai, kurių ilgis 13-15 kilobazių, plazmidėje pVC19. Išskyrimui buvo naudojami AG specifiniai oligonukleotidai:
[0160] Abu oligonukleotidai buvo gauti pagal A niger nukleotidų seką (Boel et al., 1984, EMBO J., 3, 1097-1102; Boel et al., 1984, Mol. & Cell. Biol., 4, 1306-1315). Oligonukleotidiniai zondai buvo konstruojami remiantis seka, kuri yra aplink introną 2: oligo AG-1 lokalizuotas 3'-kryptimi introno atžvilgiu ir turi tokį patį poliariškumą, kaip ir AG iRNR, o ologo AG-2 yra 5'-kryptimi nuo introno 2 ir yra antilygiagretus AG iRNR. Plazmidėje pAB 6-1 yra AG genas HindlII fragmente, kurio ilgis yra 14,5 kilobazių.
[0161] Kaip amplifikacijos pradmenys buvo naudojami keturi sintetiniai oligonukleotidai tokios struktūros:
[0162] Grandininė polimerazinė reakcija buvo vykdoma pagal Saiki et al. metodiką (1988, Science, 239,487-491) su nedideliais pakeitimais (žiūr. 8 pavyzdį).
[0163] Sujungimui AG sekos su fitazę koduojančia seka buvo atliekamos dvi atskiros grandininės polimerazinės reakcijos. Pirmojoje - ampilfikacijai DNR fragmentui, kurio ilgis 300 bazių porų, kuriame yra 3' AG sritis - promotoriaus ir 18 aa AG lyderinė seka, flankuota 3' gale fitazės geno nukleotidais, pradmenimis buvo naudojami oligonukleotidai 1 ir 18-2, kaip matrica buvo naudojama p AB 6-1. Antrojoje reakcijoje buvo naudojama matrica pAF 2-2 ir oligonukleotidai 18-3 ir 4 kaip pradmenys, amplifikuojant DNR fragmentą, kurio ilgis 600 bazių porų, ir kuriame yra fitazės geno 5'-sritis, flankuota 5' gale 18 signalinio peptido AG nukleotidų. Amplifikacijos procedūra schematiškai pavaizduota
[0164] Tokiu būdu gauti DNR fragmentai buvo valomi elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje pagalba, išsodinama etanoliu, o po to jie buvo naudojami kaip matricos trečiojoje grandininėje polimerazinėje reakcijoje su oligonukleotidais 1 ir 4, kaip pradmenimis, sujungiant AG-fitazės sekas. Susidaręs DNR fragmentas buvo skaldomas EcoRI ir BamHI ir subklonuojamas j plazmidę pTZ18R. Gautas kompleksas buvo sekvenuojamas ir pažymėtas pl8FYTl.
[0165] Kita AG promotoriaus seka, einanti 3'-kryptimi, kurios ilgis 3,5 kilobazių, buvo gauta, skaldant plazmidę p AB 6-1 KpnI ir dalinai EcoRI, po to sujungta su EcoRI/BamHI fragmentu iš plazmidės pl8FYTl, kurio ilgis 1,1 kilobazės, ir klonuotas į KpnI/BamHI saitus plazmidėje pTZ18R. Tokiu būdu gauta plazmidė pavaizduota Fig.15. Papildomas Hindn saitas buvo įterpiamas, įvedant sintetinį fragmentą:
[0166] į EcoRI saitą, kuris flankuoja amdS geną plazmidėje pAF 2-2S. Tokiu būdu gauta plazmidė buvo pažymėta pAF 2-2S (Fig. 14) ir ji buvo naudojama pradine plazmidę, pakeičiant fitazės promotoriaus seką DNR fragmentais, gautais polimerazinės grandininės reakcijos pagalba sulietomis AG ir fitazės sekomis.
[0167] Paskutiniame konstravimo etape plazmidės pl8FYT2 ir pAF 2-2S buvo skaldomos KpnI ir dalinai BamHI. Plazmidės pl8FYT2 DNR fragmentas, kurio ilgis 4,6 kilobazių, ir plazmidės pAF 2-2S fragmentas, kurio ilgis 11 kilobazių, po išskyrimo buvo valomi elektroforezės pagalba, po to buvo liguojami ir pernešti į E. coli. Tokiu būdu gautas ekspresijos vektorius buvo pavadintas pl8FYT3 (Fig.15).
[0168] Promotoriaus ir 24 aa AG lyderinės sekos su seka, koduojančia subrendusį fitazės baltymą, sujungimas buvo vykdomas polimerazinės grandininės reakcijos pagalba pagal metodiką aprašytą aukščiau, konstruojant plazmidę pl8FYT3, su tuo skirtumu, kad pradmenimis buvo naudojami kiti oligonukleotidai:
[0169]
[0170] Buvo vykdomos dvi skirtingos polimerazinės reakcijos. Pirmosios reakcijos metu buvo naudojama matrica pAB 6-1, o oligonukleotidai 1 ir 24-2 naudojami kaip pradmenys, amplifikuojant DNR fragmentą, kurio ilgis 313 bazių porų, kuriame yra promotoriaus AG 3'-sritis ir 24 aa AG lyderinė seka, flankuota 3'-gale fitazės geno 18 nukleotidų. Antrojoje reakcijoje matrica buvo naudojama plazmidė pAF 2-2S, o nukleotidai 24-3 ir 4 naudojami kaip pradmenys, amplifikuojant DNR fragmentą, kuriama fitazės geno 5'-sritis, flankuota 5'-gale 18 nukleotidų 24 aa AG lyderinės sekos. Amplifikacijos procedūra schematiškai pavaizduota Fig.13.
[0171] Ekspresijos vektoriaus p24FYT3 galutiniame konstravimo etape, naudojant plazmidės p25FYTl ir p24FYT3, buvo klonuojama ta pačia klonavimo metodika, kaip aprašyta konstruojant vektorių pl8FYT3 per tarpines pl8FYTl ir pl8FYT2 konstravimo stadijas (Fig. 15).
[0172] Sujungimas AG-promotoriaus su fitazės geno seka, kuriame yra lyderinė seka, buvo atliekamas amplifikacijos grandininės polimerazinės reakcijos pagalba, kaip aprašyta aukščiau, konstruojant plazmidę pl8FYT3, tik su tuo skirtumu, kad buvo naudojami šie oligonukleotidai:
[0173] AG-promotorius, lyderinė seka
[0174] Buvo atliekamos dvi atskiros grandininės polimerazinės reakcijos. Pirmojoje reakcijoje matrica buvo naudojama plazmidė p AB 6-1, o nukleotidai 1 ir fyt2 naudojami kaip pradmenys, amplifikuojant DNR fragmentą, kurio ilgis 282 bazių poros, kuriame yra promotoriaus AG 3'-sritis, flankuota 3'-gale 18 nukleotidų iš lyderinės fitazės sekos. Antrosios reakcijos metu buvo naudojama matrica pAF 2-2S, o oligonukleotidai fyt2 ir 4 naudojami kaip pradmenys, amplifikuojant DNR fragmentą, kuriame yra fitazės 5'-geno 5'-sritis (su lyderine seka) ir flankuota 5'-gale 18 AG-promotoriaus nukleotidais. Amplifikacijos procedūra schematiškai pavaizduota Fig.13.
[0175] Ekspresijos vektoriaus pFYT3 galutiniame konstravimo etape per tarpines plazmides pFYTl ir pFYT2 buvo klonuojama ta pačia klonavimo metodika, kaip aprašyta konstruojant vektorių pl8FYT3 per tarpines plSFYTl ir pl8FYT2 konstravimo stadijas
[0176] Iš aprašytų aukščiau fitazės ekspresijos blokų, skaldant HindlH, buvo pašalinamos E. coli sekos. Po to A niger kamienas CBS 513.88 (atiduotas saugojimui 1988 m. spalio 10 d.) buvo transformuojamas 10 /ig DNR fragmentu tokiu pat būdu, kaip 9 pavyzdyje. Iš kiekvieno ekspresijos bloko buvo išskirti individualūs A. niger transformantai. Grybų sporos buvo pasėjamos ant selektyvių acetamid-agarinių plokštelių. Kiekvieno transformanto sporos buvo surenkamos po 3 dienų auginimo agarizuotose lėkštelėse, esant 0,4 % bulvių dekstrozės (Oxoid, England) 37° temperatūroje. Fitazės produkcija buvo įvertinama, auginant grybus mikrobiologinėse kolbose šiomis sąlygomis.
[0177] Apytikriai 108 sporų buvo įdedama į 100 ml pradinės terpės, kurioje yra: 1 g/l K2HPO4, 30 g/l maltozės, 5 g/l mielių ekstrakto, 10 g/l kazeino hidrolizato, 0,5 g/l MgS04.7H20 ir 3 g/l Tween 80. pH buvo nustatomas 5.5.
[0178] Po kultivavimo per naktį mikrobiologinėse kolbose 34° temperatūroje, 1 ml augančios kultūros buvo pridedamas į 100 ml pagrindinės terpės: 2 g/l K2HPO4, 70 g/l maltodekstrino (Maldex MDO3 Amylum), 12,5 g/l mielių ekstrakto, 25 g/l kazeino hidrolizato, 2 g/l K2S04, 0,5 g/l MgS04.7H20, 0,05 g/l MnS04.4H20 ir FeS04. Mišinio pH nureguliuojamas 5,6.
[0179] Micelis buvo auginamas ne mažiau 140 valandų. Fitazės produkcija buvo įvertinama pagal 2 pavyzdyje aprašytą būdą. Šio įvertinimo rezultatai, atsitiktinai pasirinkus transformantus iš kiekvieno ekspresijos bloko, pateikti 6 lentelėje.
[0180] Šie duomenys įtikinamai patvirtina didelį fitazės ekspresijos lygį transformuotose A. niger ląstelėse, kuriose fitazės genas kontroliuojamas AG-promotoriumi iš A. niger. Taip pat šie duomenys demonstruoja, kad fitazės maksimali ekspresija pasiekiama, kai naudojamas pFYT3 ekspresijos vektorius, kuriame yra lyderinė fitazės seka. Naudojant panašius ekspresijos vektorius, kuriuose yra fitazės genas be intronų (po transformacijos į A. niger), ekspresijos lygis buvo panašus, kaip ir A. niger grybuose, transformuotuose plazmide .
[0181] Papildomai ląstelių, transformuotų pFYT3#205 ir #282, kultūros supernatantas buvo analizuojamas izofokusavimu poliakrilamidiniame gelyje pH intervale nuo 4,5 iki 6,0. Vienodi supernatantų kiekiai tėvinės A. niger grybų kultūros ir abiejų transformantų, išaugintų vienodomis sąlygomis, buvo pridedami į gelį ir po izofokusavimo gelis buvo dažomas, kaip aprašyta 9 pavyzdyje. Tėvinis A. niger kamienas sintetino nedidelį fitazės kiekį. Kamienai pFYT3#205 ir #282 sintetino atitinkamai 250 ir 1400 kartų daugiau fitazės, nei tėvinis kamienas (palyginkite fitazės produkciją su tėviniu kamienu ir fitazės produkciją pagal 4 ir 5 lentelėse pateiktais duomenimis). Šis skirtumas gerai iliustruojamas Fig.ll. Identifikuotos kelios fitazės izoformos (pažymėtos žvaigždutėmis). Dažant bendrą baltymą, atsirasdavo labai intensyvios fitazės juostos, tačiau kitų baltymų juostos neišryškėdavo.
[0182] A. ficuum kamienai pAF 2-2S#4 ir NRRL 3135 buvo kultivuojami taip, kaip aprašyta 1 pavyzdyje. Abu transformuotų ląstelių tipai sintetino 50 kartų daugiau fitazės, nei laukinio to paties grybo kamienas.
[0183] A. niger kamienas pAF 2-2S#8, gautas transformuojant A. niger CBS 513.88 kamieną, ir tėvinis A. niger kamienas buvo kultivuojami taip, kaip aprašyta 1 pavyzdyje. Transformuotos ląstelės sintetino apytikriai 1000 kartų daugiau fitazės, nei pradinis tėvinis kamienas.
[0184] Konstruojant pREPFYT3 vektorių, kuriuo buvo pasiekiama fitazės ekspresija ir geno AG pakeitimas, plazmidė buvo skaldoma KpnI. Gautas linijinis fragmentas buvo panaudotas ligavimui dviem atvejais.
[0185]
[0186] i
[0187] 2 ligavimas, naudojant adapterį KpnI - HindlH*, kuriame HindlII restrikcijos vieta neišlieka po ligavimo:
[0188] Seka, gauta liguojant 1 būdu, dalinai buvo suskaldoma HindlII pagalba. Po fragmento, kuriame yra amdS genas, pašalinimo elektroforezės pagalba, likęs DNR fragmentas buvo ciklizuojamas liguojant ir įterptas į E. coli. Tokiu būdu gauta plazmidė buvo pažymėta pFYT amdS (žiūr. Fig.16).
[0189] Seka, gauta liguojant 2 būdu, taip pat buvo suskaldoma HindlH pagalba. DNR fragmentas HindlII/HindlH*, kurio ilgis 4 kilobazės ir kuriame yra amgS genas, buvo išskirtas elektroforezės pagalba ir liguojamas su dalinai suskaldyta Hindm plazmidė Hindm/Hindin*, po to buvo įterptas į E. coli. Plazmidė, kurioje 3'-gale fitazės geno buvo amdS genas, buvo pažymėta pFYT3 INT (žiūr. Fig. 17).
[0190] Norint įterpti DNR fragmentą Sall/HindlII iš plazmidės pAB 6-1, kurio ilgis 6 kilobazės ir kuriame yra 3'-flankuojanti AG sritis, plazmidė pFYT3INT buvo dalinai suskaldoma HindlII pagalba ir prijungiama prie adapterio:
[0191] (kuriame HindlII* skėlimo vieta neišlieka po ligavimo), o po to su plazmidės pAB 6-1 fragmentu Sal/HindlII). Po transformacijos į E. coli buvo gaunama tikslinė plazmidė pREPFYT3, kurioje yra 3'-flankuojanti AG seka reikalingoje vietoje.
[0192] Prieš A. niger transformaciją pREPFYT3 plazmidė, iš šios plazmidės buvo pašalinta E. coli seka (skaldant HindlII ir išskiriant elektroforezės pagalba). A. niger kamienas CBS 513.88 buvo transformuojamas 10 /xg DNR fragmento, panaudojant procedūrą, aprašytą 9 pavyzdyje. Tik dalis (apytikriai 20 %) iš atrinktų transformantų neturėji AG aktyvumo. Chromosominės DNR hibridizacijos analizė AG teigiamuose ir neigiamuose pagal fitazę transformantuose buvo naudojama AG geno pakeitimo kontrolei.
[0193] Norint išsiaiškinti fitazės geno konservatyvumą mikroorganizmuose, buvo atliekama dešimties rūšių mikroorganizmų chromosominės DNR hibridizacija, naudojant zondu A. ficuum fitazės kDNR.
[0194] Chromosominės DNR buvo išskiriamos iš siūlinių grybų, mielių ir bakterijų. Iš kiekvienos mikroorganizmų grupės buvo atrenkama ribotas rūšių skaičius, konkrečiai: siūliniai grybai: Penicillum chrysogenum ir Aspergillus niger, mielės prokariotų formos, kaip: Bacillus subtilis, Clostridium thermocellum, Streptomyces lividans ir gramm-neigiamos bakterijos Pseudomonas aeruginosa.
[0195] Šių rūšių mikroorganizmų didelės molekulinės masės chromosominė DNR buvo skaldoma pvull ir BamHI (atskirai) ir analizuojama elektroforeze 0,7 % agarozės gelyje.
[0196] Po perkėlimo ant nitroceliuliozinių membranų buvo vykdoma hibridizacija nelimituojančiomis sąlygomis (6x SSC 50° temperatūroje per naktį) su žymėtu 32P fitazės 5' kDNR fragmentu (kaip aprašyta 8 pavyzdyje). Kompleksai buvo perplaunami 6xSSC kambario trmperatūroje ir 18 valandų buvo ryškinama autoradiograma.
[0197] Kaip parodyta Fig.l9a ir 19b, praktiškai kiekvienoje autoradiogramoje yra matomos diskretiškos juostos, įrodančios didelį fitazės geno homologijos laipsnį įvairiuose mikroorganizmuose.
1.Išgryninta išskirta DNR seka, besiskirianti tuo, kad ji koduoja peptidą arba baltymą, pasižyminčius dideliu fitaziniu aktyvumu.
2. Išgryninta išskirta DNR seka pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad ji išskirta iš mikroorganizmų.
3. Išgryninta išskirta DNR seka pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad ji yra išskirta iš grybų.
4. Išgryninta išskirta DNR seka pagal 1 punką, besiskirianti tuo, kad ji yra išskirta iš Aspergillus.
5. Išgryninta išskirta DNR seka pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad ji yra išskirta iš Aspergillus ficuum arba Aspergillus niger.
6. Išgryninta išskirta DNR seka pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad ji koduoja fitazę, pasižyminčią tokiomis savybėmis:a) vykdant elektroforezę poliakrilamidiniame gelyje su natrio dodecilsulfatu, ji duoda vieną juostą, atitinkančią baltymą, kurio molekulinė masė yra 85 kD (ekspresuojant Aspergillus ląstelėse);b) po deglikozilinimo molekulinė masė yra nuo 48 iki 56,5 kD;c) jos santykinis aktyvumas yra apie 100 v/mg baltymo.
a) vykdant elektroforezę poliakrilamidiniame gelyje su natrio dodecilsulfatu, ji duoda vieną juostą, atitinkančią baltymą, kurio molekulinė masė yra 85 kD (ekspresuojant Aspergillus ląstelėse);b) po deglikozilinimo molekulinė masė yra nuo 48 iki 56,5 kD;c) jos santykinis aktyvumas yra apie 100 v/mg baltymo.7. Išgryninta išskirta DNR seka pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad ji pasižymi bent viena iš šių savybių:a) hibridizuojasi su oligonukleotidiniu zondu, gautu pagal DNR seką, pateiktą Fig.6, o Fig.6 yra šios apibrėžties dalis;b) hibridizuojasi su oligonukleotidiniu zondu, gautu pagal DNR seką, pateiktą Fig.8, o Fig.8 yra šios apibrėžties dalis.
a) hibridizuojasi su oligonukleotidiniu zondu, gautu pagal DNR seką, pateiktą Fig.6, o Fig.6 yra šios apibrėžties dalis;b) hibridizuojasi su oligonukleotidiniu zondu, gautu pagal DNR seką, pateiktą Fig.8, o Fig.8 yra šios apibrėžties dalis.8. Ekspresijos vektorius, besiskiriantis tuo, kad DNR seka pagal 1-7 punktus yra funkciškai surišta su reguliacine sritimi, kuri gali reguliuoti baltymo arba peptido, pasižyminčių fitaziniu aktyvumu, ekspresiją atitinkamame šeimininke.
9. Ekspresijos vektorius pagal 8 punktą, besiskiriantis tuo, kad jo reguliacijos srityje yra lyderinė seka, kuri užtikrina baltymo arba peptido, pasižyminčio fitaziniu aktyvumu, sekreciją.
10. Ekspresijos vektorius pagal 9 punktą, besiskiriantis tuo, kad baltymo arba peptido su fitaziniu aktyvumu ekspresijos reguliavimas vyksta, naudojant AG promotorių.
11. Ekspresijos vektorius pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad baltymo arba peptido, pasižyminčių fitaziniu aktyvumu, sekrecijai naudojama homologinė fitazės lyderinė seka.
12. Ekspresijos vektorius pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad baltymo arba peptido, kurie pasižymi fitaziniu aktyvumu, sekrecijai naudojama lyderinė AG seka, kuri sudaryta iš 18 aminorūgščių liekanų.
13. Ekspresijos vektorius pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad baltymo arba peptido, kurie pasižymi fitaziniu aktyvumu, sekrecijai naudojama lyderinė AG seka, kuri sudaryta iš 24 aminorūgščių liekanų.
14. Ekspresijos vektorius pagal 9 punktą, besiskiriantis tuo, kad baltymo arba peptido, kurie pasižymi fitaziniu aktyvumu, ekspresijos reguliavimui naudojamas homologinis fitazės promotorius.
15. Ekspresijos vektorius pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad baltymo arba peptido, pasižyminčių fitaziniu aktyvumu, sekrecijai naudojama homologinė fitazės lyderinė seka.
16. Ekspresijos vektorius pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad baltymo arba peptido, pasižyminčių fitaziniu aktyvumu, sekrecijai naudojama homologinė lyderinė seka AG, kuri yra sudaryta iš 18 aminorūgščių liekanų.
17. Ekspresijos vektorius pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad baltymo arba peptido, pasižyminčių fitaziniu aktyvumu, sekrecijai naudojama homologinė lyderinė seka AG, kuri yra sudaryta iš 24 aminorūgščių liekanų.
18. Vektorius, sugebantis transformuoti ląstelę-šeimininką, besiskiriantis tuo, kad jame yra ekspresijos blokas pagal 8-17 punktus.
19. Vektorius pagal 18 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra plazmidė.
20. Vektorius pagal 18 punktą, besiskiriantis tuo, kad yra naudojama plazmidė iš grupės, kurioje yra plazmidės pAF 28-1, pAF 2-2S, pAF 2-2, pAF 2-3, pAF 2-4, pAF 2-6, pAF 2-7, pl8FYT3, p24FYT3, pFYT3.
21. Transformuota ląstelė-šeimininkas, besiskirianti tuo, kad ji transformuojama vektoriumi pagal 18-20 punktus.
22. Transformuota ląstelė-šeimininkas pagal 21 punktą, besiskirianti tuo, kad ji yra mikroorganizmas, toks kaip bakterijos, mielės ir grybai.
23. Transformuota ląstelė-šeimininkas pagal 22 punktą, besiskirianti tuo, kad ji yra iš šių mikroorganizmų genčių: Aspergillus, Trichodcrma, Pcnicillium, Mucor, Bacillus, Kluyveromyccs, Saccharomyces.
24. Transformuota ląstelė-šeimininkas pagal 22 punktą, besiskirianti tuo, kad ji yra iš šių mikroorganizmų rūšių: Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzoe, Trichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyveromyccs lactis, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis.
25. Peptido arba baltymo, pasižyminčių fitaziniu aktyvumu, gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad transformuotos ląstelės-šeimininkai pagal 21-24 punktus kultivuojamos sąlygose, kurios aktyvuoja peptido arba baltymo, pasižyminčių fitaziniu aktyvumu, susidarymą.
26. Peptidas arba baltymas, pasižymintis fitaziniu aktyvumu, besiskiriantis tuo, kad fitazinis aktyvumas formuojamas procese pagal 25 punktą.
27. Išgryninta fitazė, besiskirianti tuo, kad ji turi šias savybes:a) elektroforezėje poliakrilamidiniame gelyje su natrio dodecilsulfatu yra viena juosta, atitinkanti baltymą, kurio molekulinė masė yra 85 kD (ekspresijos Aspergillus atveju);b) po deglikozilinimo jos molekulinė masė yra nuo 48 iki 56,5 kD;c) jos santykinis aktyvumas yra 100 v/mg baltymo.
a) elektroforezėje poliakrilamidiniame gelyje su natrio dodecilsulfatu yra viena juosta, atitinkanti baltymą, kurio molekulinė masė yra 85 kD (ekspresijos Aspergillus atveju);b) po deglikozilinimo jos molekulinė masė yra nuo 48 iki 56,5 kD;c) jos santykinis aktyvumas yra 100 v/mg baltymo.28. Gyvūnų pašarai, besiskiriantys tuo, kad juose yra pasižyminčio fitaziniu aktyvumu peptido arba baltymo pagal 26 ir 27 punktą.
29. Peptido arba baltymo, pasižyminčių fitaziniu aktyvumu, pagal 26 ir 27 punktą panaudojimas fitato skaldymui į inozitolą ir neorganinį fosforą.
30. Gyvūnų augimo stimuliavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad gyvūnų racione yra pašarai su fitazės priedais pagal 26 ir 27 punktą.
31. Fitato kiekio sumažinimo gyvūnų mėšle būdas, besiskiriantis tuo, kad gyvūnų racione yra pašarai pagal 26 ir 27 punktą, kuriuose yra fitazės kiekis, pakankamas pašaruose esančio fitato suskaldymui į inozitolą ir neorganinį fosforą.