[LT] Vabzdžių augimo ir vystymosi kontrolės agentas, kuriame yra genai, koduojantys baltymus, kurie įtakoja vabzdžių augimą, vystymąsi ir elgesį. Genas arba aktyvuojamas, norint užkirsti kelią vabzdžių nėrimuisi ir virtimui lėlyte, arba inaktyvuojamas, norint kad sumažėtų vabzdžių mityba ir augimas , o to pasekoje vabzdys-kenkėjas greičiau žūva. Tokio vabzdžių augimo ir vystymosi reguliatoriaus pavyzdys yra bakulevirusas, kuriame inaktyvuotas genas, koduojantis ekdisteroid-gliukoziltransferazę. Be to, tokie bakulevirusai taip pat gali būti modifikuoti taip, kad būtų iššaukta baltymo, įtakojančio metamorfozę, ekspresija. Įtraukti taip pat vabzdžių kontrolės agentų gavimo būdai ir vabzdžių augimo ir vystymosi kontrolės būdai, paveikiant vabzdžius nurodytu kontroliuojančiu agentu.
[EN]
[0001] Siūlomas išradimas susijęs su vabzdžių-kenkėjų page-rintos biologinės kontrolės būdais ir kompozicijomis. Imant siauriau, šis išradimas susijęs su lazdelės pavidalo geno ir šio geno produkto, kuris yra efektyvus reguliuojant vabzdžių augimą ir vystymąsi,, panaudojimu. Šis išradimas taip pat susijęs su genetiškai pakeistu lazdelės pavidalo virusu ir kitais vabzdžių kontrolės agentais, kurie nepalankiai paveikia infekuotų vabz-džių-kenkėjų vystymąsi.
[0002] Susidomėjmą vabzdžių-kenkė jų biologine kontrole apspren-džia tradicinių cheminių pesticidų trūkumai. Paprastai cheminiai pesticidai paveikia ir naudingas ir nenau-dingas rūšis. Yra tendencija, kad vabzdžiai-kenkėj ai įgyja atsparumą panašiems chemikalams, tuo būdu greitai gali išsivystyti atsparių tokiems pesticidams vabzdžių populiacija. Dar daugiau, cheminių medžiagų liekanos kenkia aplinkai ir potencialiai žmonių sveikatai. Bio-loginė kontrolė yr.a alternatyvus vabzdžių kontrolės bū-das, leidžiantis sumažinti priklausomybę nuo cheminių pesticidų.
[0003] Pagrindinė biologinės kontrolės strategija apima panau-dojimą gamtoje sutinkamų organizmų, kurie yra patoge-niški vabzdžiams (entomopatogenai), ir auginimą kultū-rų, atsparesnių vabzdžiams-kenkėjams. Šio išradimo spren-dimo traktavimas apima identifikavimą ir charakteri-zavimą vabzdžių genų ir genų produktų, kurie gali tar-nauti tinkama baze vabzdžių kontrolės agentams, iden-tifikavimą ir eksploatavimą anksčiau nenaudotų mikro-organizmų (prie to taip pat priklauso gamtoje egzis-tuojančių nepatogeninių mikroorganizmų modifikavimas, norint paversti juos patogeniniais vabzdžių atžvilgiu), šiuo metu naudojamų entomopatogenų modifikavimą ir pagerinimą, otaip pat sukūrimą genų inžinerijos metodais kulturų, kurios yra atsparesnės vabzdžiams-ken-kėj ams.
[0004] Eutomopatogenams, pasiūlytiems kaip biologiniai pesticidai, priklauso virusai, sukeliantys natūralias epizo-otijas vabzdžių populiacijose. Lazdelių pavidalo virusai (bakulevirusai) sudaro didelę grupę virusų, infe-kuojančių tik naruotakojus vabzdžius (Miller Z.K. /1981/, Genetic Engineering in the Plant Sciences, N. Panopoulous (ed) Praeger Pabl., New York, pp. 203-224; Carstens (1980) Trends in Biochemical Science 52: 107-110; Harrapf Payne (1979) Advances in Virus Research. Vol. 25, Zawber et al . , (eds) Academic Press N. Y. pp. 273-355) . Daugelis bakulevirusų infekuoja vabz-džius, kurie yra pramonei svarbių žemės ūkio ir miškų kultūrų kenkėjai. Tokie bakulevirusai yra potencialiai vertingi biologinės kontrolės agentai (JAV gamtos apsaugos agentūra. U.S. Environment Protection Agency), kaip insektidų panaudojimui, užregistravo keturis laz-delių pavidalo virusus. Vienas iš bakulevirusų, kaip biologinių pesticidų, privalumų yra jų specifiškumas vabzdžio-šeimininko atžvilgiu. Ne tik bakulevirusai, kaip grupė, infekuoja tik nariuotakojus, tačiau taip pat ir individualus lazdelės pavidalo viruso štamas infekuoja tik vieną ar kelias vabzdžių rūšis.Tuo būdu jie nėra pavojingi nei aplinkai, nei žmogui, ir gali būti naudojami, nekenkiant naudingų rūšių vabzdžiams.
[0005] Bakulevirusų grupė apima branduolinės poliedrozės viru-sų (BPV) , branduolinės granuliozės virusų (GV) ir laz-delės formų virusų, nesudarančių įsiterpimo kūnų, po-grupius. Lazdelės formos virusų okliuduojančiose formo-se virjonai (apgaubti apvalkalu nukleokapsidai) yra kristalinės baltyminės matricos viduje. Tokia struk-tūra, taip vadinamas įsiterpimo kūnas arba "įtaškytas" kūnas - tai viruso radimo gamtoje forma, kuri sąlygoja infekcijos perdavimą organizmui nuo organizmo. Išskir-tinis BPV virusų bruožas yra tai, kad kiekviename įsi-terpimo kūne yra daug virjonų. BPV-virusų įsiterpimo kūnai yra santykiniai dideli (iki 5 mikrometrų) . GV-virusų įsiterpimo kūnai yra mažesni ir turi po vieną virjoną. Abiejų formų įsiterpimo kūnų kristalinė bal-tyminė matrica daugiausia yra sudaryta iš vieno poli-peptido nuo 25000 iki 33000 daltonų, vadinamo polied-rinu arba granulinu. Neokliuduoj ančių formų lazdelės pavidalo virusai negamina poliedrino arba granulino baltymus ir nesudaro įsiterpimo kūnų.
[0006] Gamtoje infekcija inicijuojama, kai vabzdys ryja laz-delių pavidalo virusais užterštą maistą, dažniausiai įsiterpimo kūnų pavidale. Vabzdžio vidurinio žarnyno šarminėje terpėje įsiterpimo kūnai disocijuoja, išskir-dami atskiras virusines daleles, kurios po to patenka į žarnyno sieneles dengiančias epitelines ląsteles. Ląs-telės šeimininko viduje lazdelės pavidalo virusas migruoja į branduolį, kur įvyksta replikacija. Pradžioje infekuotoje ląstelėje taip vadinamų "ankstyvųjų genų" sintezuojami kai kurie specifiniai virusiniai baltymai transkripcijos ir transliacijos būdu. Be kitų funkcijų, šie baltymai yra būtini virusinės DNR replikacijai, kuri prasideda po 4-6 valandų po viruso patekimo į ląstelę. Virusinės DNR intensyvi replikacija tęsiasi maždaug 12 valandų po užsikrėtimo (post infektion=pi). Maždaug po 8-10 valandų pi infekuota ląstelė pagamina didelius kiekius taip vadinamų "vėlyvųjų virusinių genų produktų". Jiems priklauso nukleokapsido, supančio vi-rusinę DNR dukterinių virusinių dalelių susidarymo proceso metu, komponentai. Dukterinės virusinės dalelės pradeda susidaryti maždaug po 12 valandų pi. Pradžioje dukteriniai virusai migruoja prie ląstelės membranos, kur, įšėję į ląstelės paviršių, įgyja apvalkalą. Tokios rūšies neokliuduotas virusas po to gali infekuoti kitas vabzdžio-šeimininko ląsteles. Poliedrino sintezė prasideda po 12-18 valandų po užsikrėtimo ir po 24 valandų pi ji pasiekia labai aukštą lygį. Tuo metu stebimas iš ląstelės išėjusių virusinių dalelių skaičiaus suma-žėjimas, o po to dukterinis virusas sudaro įsiterpimo kūnus. Įsiterpimo kūnų susidarymas tęsiasi iki ląstelės mirties arba dalinimosi. Kai kurie lazdelės pavidalo virusai infekuoja visus vabzdžio-šeimininko audinius, tuo būdu, pasibaigus infekcijos vystymosi procesui, visas vabzdys pavirsta skysčiu, išsiskiriant dideliam įsiterpimo kūnų kiekiui, kurie perneša infekciją ki-tiems individams. (Apžvalga pateikta The Biology of Baculeviruses, vol. I and II, Granados and Federici (eds), CRS Press, Boca Raton, Florida, 1986).
[0007] Vienas iš esminių lazdelės formos virusų, kaip pesti-cidų, panaudojimo trūkūmų yra ilgas laiko tarpas momento, kai vabzdys įryja virusą, ir kai miršta. Tuo metu kenkėjas maitinasi ir kankia derliui. Kadangi mažai įtikėtina, kai šeimininkas bers pesticidus iki to momento, kad užkrėtimas nepasidarys akivaizdžiai ma-tomu, tai pagrindiniu dalyku turėtų būti vabzdžio maitinimosi laiko sumažinimas iki minimumo.
[0008] Jei ko reikia, tai biolaginio pesticido, kuris su-mažintų vabzdžio maitinimosi apimtį iki jo mirties. Pirmenybę turi biologinis pesticidas, kadangi aplinkai jis yra mažiau kenksmingas už cheminį. Taip pat pa-geidautina, kad vabzdys mirtų greičiau. Geno (genų) pa-naudojimas, kurie koduoja baltymo (baltymų), kontro-liuojančių vabzdžių vystymąsi, susidarymą, ir jų įvedi-mas į įvairius organizmus leis pagerinti biologinę vabzdžių-kenkėjų kontrolę.
[0009] Išradimo esmė
[0010] Šis išradimas apibūdina lazdelės pavidalo viruso geną ir šio geno produktą, įtakojantį vabzdžių augimą, vystymąsį ir elgesį. Šis išradimas užtikrina šio geno
[0011] ir jo produkto panaudojimo būdus, o taip pat šio geno arba jo produkto inaktyvavimo būdus, norint kontroliuoti vabzdžius. Pirmenybę turinčiame realizavimo variante egt genas koduoja viruso AcMNPV ekdisteroid-UDP-gliukozil-transferazę (EGT). Lazdelės pavidalo virusų egt geno ekspresija iššaukia EGT susidarymą, kuri inaktyvuoja hormonus, sąlygojančius vabzdžių nėrimąsi, tuo būdu užkirsdama kelią nėrimuisi arba lervos virtimui lėlyte. Lazdelės pavidalo virusų egt geno inak-tyvavimas leidžia normaliai vykti nėrimuisi ir lervos virtimui lėlyte.
[0012] Siūlomas išradimas apima visą eilę vabzdžių kontrolės agentų, panaudojant egt genus ir šių genų funkcionavimo produktus. Šio išradimo vabzdžių kontrolės agentai vabzdžiui kenkėjui iššaukia arba netinkamą EGT baltymo sintezę, arba slopina normalų EGT baltymo funkcionavimą arba pasireiškimą, tuo būdu sutrikdomas normalus vabz-džio vyatymasis.
[0013] Tinkamiausia, kad - organizmas, turintis egt geną, būtų specifinis tai vabzdžių rūšiai virusas, ir kad viruso egt genas būtų inaktyvuotas, o tai leistų ilgiau vys-tytis šiuo virusu infekuotam vabzdžiui-šeimininkui. Vabzdžio šeimininko vystymasis susijęs su tokiu jo elgesio pakitimu, kaip mitybos sumažėjimas, ir užsikrėtus virusiniu pesticidu, sulėtėja vabzdžio augimas ir jis greičiau miršta. Šis išradimas taip pat apima pagerinto virusinio pesticido gamybos būdą. Be to, šis išradimas apima vabzdžių kenkėjų kontrolės būdą, kurio esmė yra ta, kad vabzdys-kenkėjas yra paveikiamas pagerintu virusiniu pesticidu.
[0014] Šiuo išradimu siūlomi genetiškai pakeisti virusai yra efektyvesni pesticidai, lyginant su iki šiol naudotais virusais. Lazdelės pavidalo virusuose, tokiuose kaip, pavyzdžiui, branduolinės poliedrozės virusas Autographa
[0015] californica (AcMNPV) arba branduolinės poliedrozės virusas Orgyia pseudotsugata (OpMNPV) , natūraliai pasi-reiškia egt genas. Jo ekspresija prailgina laiko pe-riodą, kurio metu infekuota lerva maitinasi, neka-muojama virusinės infekcijos. Šis išradimas apima egt geno inaktyvavimą viruso genome, ir, pavyzdžiui, ne tik lazdelės pavidalu egt geną galima inaktyvuoti, įvedant jo vietą arba į ji kitą geną, pavyzdžiui, geną-markerį, koduojanti, p-galaktozidazės sintezę. Turėtų būti aišku, kad egt geno pažeidimui gali būti naudojama bet kuri DNR seka, kadangi ji pažeidžia egt koduo-jančios sekos pasireiškimą. Priešingai, ištrinant ati-tinkamą koduojanti, DNR segmentą, galima pašalinti iš genomo visas egt geno dalis, arba pašalinti ar pakeisti reguliuojančią genomo dali,, kontroliuojančią egt geno ekspresiją. Lazdelės pavidalo virusai su ištrynimais, inaktyvuo j ančiais egt geną, taip pat gali būti gauti nuosekliai praleidžiant virusą per vabzdžio ląstelių kultūrą. Taip gauti virusai su ištrynimais turi ši, privalumą: juose nėra svetimos DNR ir jie skiriasi nuo laikinio tipo virusų tik funkcinio egt geno nebuvimu. Panašūs modifikuoti bakulevirusai, kaip kenkėjų kontro-lės agentai, yra efektyvesni už tuos, kurie naudojami šiuo metu. Kaip paprasti mutantai su ištrynimais jie turi būti taip pat priimtini reguliuojančioms žinyboms (pavyzdžiui, U.S. EPA) kaip pesticidai, gauti genų inžinerijos būdu, kadangi juose nėra nehomologinės DNR. Lazdelės pavidalo virusai, kuriuose nepasireiškia funkcinis egt genas, gali būti pakeisti įvedant besi-skiriančius nuo egt genus, kurie gali įtakoti vabzdžio vystymąsi, tuo pačiu padidindami tokių virusų, kaip vabzdžių kontrolės agentų, efektyvumą.
[0016] Šis išradimas taip pat apima vabzdžių-kenkėjų kontrolės būdą, infekuojant vabzdžių lervas mutantiniu virusu, kuriame nėra intaktinio egt geno, arba jis nesugeba gaminti funkcinį EGT produktą. Lervos, infekuotos mu-
[0017] tantiniu virusu, stengiasi nertis ir virsti lėlyte, ir, reiškia, jų mitybos laikas sutrumpėja, lyginant su lervomis, infekuotomis laukinio tipo ar kitais šiuo me-tu žinomais virusais. Mutantiniu virusu užkrėstos lervos tip pat miršta greičiau, negu lervos, infekuotos laukinio tipo ar kitais šiuo metu naudojamais virusais.
[0018] Šio išradimo tikslas yra sukūrimas rekombinantinio viruso, kuris yra efektyvesnis, lyginant su laukinio tipo ar šiuo metu naudojamais virusais. Šio išradimo pavyzdys yra rekombinantinis virusas AcMNPV, žymimas kaip vEGTZ, kuriame dalis egt geno pašalinta ir pakeista bakteriniu genu lacZ, koduojančiu p-galaktozidazės su-sidarymą. Šios srities specialistams aišku, kad gali būti pakeista bet kuri DNR seka, inaktyvuoj anti egt geną. Šio išradimo realizavimo pavyzdys taip pat yra rekombinantinis lazdelės pavidalo virusas, žymimas vEGTDEL, kuriame pašalinta dalis egt geno. Šio išradimo realizavimo pavyzdys yra pesticidas, pagamintas laz-delės pavidalo viruso, su pašalintu egt genu, pagrindu. Jiems taip pat priklauso lazdelės pavidalo virusai, kuriuose natūraliu būdu įvykusios mutacijos, įskaitant ištrynimą, sukėlė egt geno inaktyvavimą.
[0019] Šio išradimo tikslas yra, atitinkamai, egt genas ir šio geno pasireiškimo produktas, efektyviai veikiantys kontroliuojant vabzdžius kenkėjus. Šis išradimas taip pat žymiu mastu apima ekdisteroid-UDP-gliukozil-tran-sferazę ir jai specifinius antikūnius. egt genas gali būti identifikuotas pagal egt geno nukleotidų sekos homologiškumą, pateiktą 1 lentelėje, arba nustatant EGT germento aktyvumą ir po to atliekamą DNR analizę. Pagal čia pateiktas definicijas, egt genas yra bet kuri DNR grandinė, koduojanti ekdisteroid-UDP-gliukozil-transfe-razės susidarymą, egt geno aktyvumo produktas - baltymas gali būti išvalytas ir išbandytas žinomais būdais, aprašytais 4 pavyzdyje. Turima omenyje, kad egt balty-
[0020] mas yra pakankamai švarus, jei jame yra ne mažiau kaip 70% (svorio) ekdisteroid-UDP-gliukozil-transferazės. Re-kombinant inis egt baltymas, tai baltymas, kuri, gamina bet koks organizmas, besiskiriantis nuo tokio, kuriame natūraliame pavidale yra šio baltymo sintezę koduojantis genas. Rekombinantinio geno pasireiškimas yra genų inžinerijos arba technikos rezultatas - DNR rekom-binacij a.
[0021] Dar vienas šio išradimo tikslas yra, panaudojus genų inžineriją, sukūrimas viruso, kuris būtų efektyviu pesticidu ir tuo pat metu būtų nežalingas aplinkai.
[0022] Šio išradimo tikslas taip pat yra rekombinantinis pesticidas, kuriame nebūtų funkcinio egt geno ir pa-sireikštų antras genas, įtakojantis vabzdžių vystymąsi, be to organizme šio antro geno natūraliu pavidalu nėra. Nurodytas antras genas koduoja metamorfozę įtakojančio produkto sintezę. Tokiu geno produktu gali būti vabz-džių hormonas, įtakojantis vabzdžio vystymąsi, arba fermentas, inaktyvuoj antis metamorfozę reguliuojantį hormoną. Ypatingi pavyzdžiai yra protorakotropinis hormonas, išsilukštenimo hormonas ir juvenylinio hormono esterazė. Jei, norint gauti vabzdžių kontrolės agentą, į vabzdžių virusą reikia įvesti baltymus koduojančius genus, tai šiame viruse neturi būti egt geno arba jis turi būti jame inaktyvuotas.
[0023] Dar vienas šio išradimo tikslas yra sukūrimas gene-tiškai pakeisto organizmo, skirto naudoti vabzdžių vystymosi kontrolės agentu, kuriame pasireiškia genų inžinerijos metodais įvestas egt genas, ir kuriame natūraliomis sąlygomis nebūtų egt geno ekspresijos. Tokie genetiškai pakeisti organizmai, kuriuose pasi-reiškia EGT, turėtų nepalankiai veikti vabzdžius-ken-kėjus, o to pasekoje sumažėtų žemės ūkio kultūrų pa-kenkimas .
[0024] Kitas šio išradimo tikslas yra sukūrimas insekticidinių kompozicijų, tinkamų naudoti žemės ūkyje. Kaip žinoma, i, tokių kompozicijų sudėti, įeina ūkio prasme tinkamas nešėjas ir vabzdžių virusas, pavyzdžiui lazdelės pavidalo virusas, prieš tai genetiškai modifikuotas taip, kad nurodyto viruso egt genas yra inaktyvuotas. Po to tokiems egt bakulevirusams gali būti įvykdyti genetiniai pakitimai, iššaukiantys heteroroginio geno, kuris koduoja vabzdžių hormono, įtakojančio metamorfozei, arba fermento, inaktyvuoj ančio toki, įtakojanti, metamor-fozę vabzdžių hormoną, ekspresiją. Heterologiniams ge-nams, kurių produktai įtakoja metamorfozę, priklauso, tačiau tuo neapsiribojama, protorakotropinis hormonas, išsilukštenimo hormonas ir juvenylinio hormono este-razė. Pirmenybę turinčioje realizavimo formoje insek-tidinės kompozicijos, turinčios genetiškai pakeistus lazdelės pavidalo virusus, yra skirtos išpurškimui.
[0025] Kaip insektidinės kompozicijos nagrinėjamos taip pat ir tokios, į kurių sudėtį įeina žemės ūkiui tinkamas ne-šėjas ir genetiškai pakeistas vabzdžių parazitas. Vabzdžių parazitas - tai organizmas, kuris gyvena ir dauginasi tampriame tarpusavio ryšyje su vabzdžio lerva, o tai neigiamai atsiliepia lervai. Vabzdžių para-zitu gali būti bakterija, grybelis, virusas arba kitas vabzdys. Tokio genetiškai pakeisto vabzdžių parazito, turinčio egt geną, veikimas vabzdžių kontrolės agentu stiprės dėl šio geno inaktyvacijos.
[0026] Bet kuri iš aukščiau minėtų insekticidinių kompozicijų taip pat gali turėti savo sudėtyje ingredientus, sti-muliuojančius vabzdžių mitybą. Vabzdys-kenkėjas gali ryti šio išradimo insekticidines kompozicijas, užneštas ant augalų, ir vabzdžiai-kenkėj ai, kurie yra jautrūs šios kompozicijos vabzdžių kontrolės agentui, pradės mažiau maitintis ir mirs.
[0027] Taip pat šio išradimo tikslas yra užtikrinti modi-fikuotą biologini, pesticidą, kuris inhibuoja egt geno arba šio geno funkcionavimo produkto pasireiškimą.
[0028] 1 figūra schematiškai vaizduoja genomą AcMNPV, parodanti, egt geno lokalizaciją. AcMNPV genomas pateiktas sąlyginiais vienetais, o taip pat Eco RI ir Hind III restrikcijos kortos pavidalu. 2 figūroje schematiškai pateikti egt geno sekos tyrimų ir šios sekos analizės rezultatai. 2A figūroje pa-vaizduota šios genomo srities endonukleazinės restrikcijos korta. 2B fig. pateikti sekos kompiuterinės ana-lizės rezultatai, ieškant atvirų nuskaitymo rėmelių. Vertikaliomis linijomis parodyti terminuojantys kodo-nai, kurie yra polipeptidinės grandinės sintezės su-stabdymo signalai. Seka "transliuojama" vesose trijose potencialiai atidarytuose nuskaitymo rėmeliuose, kiekvienoje DNR gijoje (1, 2, 3, 1', 2', 3'). egt atitinkan-tis atviras nuskaitymo rėmelis (2) pažymėtas kaip EGT. 3 figūra schematiškai vaizduoja egt geno sričių struk-tūras viruse AcMNPV(A) ir rekombinantiniuose virusuose (B) ir vEGTDEL(C). Užštrichuotas stačiakampis yra lacZ genas . 4 figūroje schematiškai pateikti elektroforezė agarozės gene ir dėmių analizė pagal Southern'y, kurios atlie-kamos lazdelės pavidalo OpMNPV egt geno indetifi-kacij ai. 6 figūra vaizduoja kontrolinių neinfekuotų lervų arba ketvirto amžiaus lervų, užkrėstų laukinio tipo virusais AcMNPV arba vEGTZ, svorio padidėjimo grafiką. 7 fig. pateiktas lervų, užkrėtus 4 amžiaus lervas laukinio tipo virusais AcMNPV arba vEGTZ, mirtingumo grafikas . 8 fig. yra svorio padidėjimo grafikas, infekavus 5 am-žiaus lervas laukinio tipo AcMNPV virusais arba vEGTZ. 9 fig. pateiktas lervų, infekavus 5 amžiaus lervas laukinio tipo virusais AcMNPV arba vEGTZ, mirtingumo grafikas . 10 fig. pateiktas lervų, infekavus pirmo amžiaus lervas laukinio tipo virusais AcMNPV arba vEGTZ, kuriuose poliedrinių įsiterpimo kūnų (PĮK) koncentracija yra 4,8 x 10 PĮK/ml, mirtingumo grafikas. 11 fig. pateiktas lervų, infekavus pirmo amžiaus lervas laukinio tipo virusais AcMNPV arba vEGTZ, kuriuose PĮK koncentracija yra 2,4 x 10 PĮK/ml, mirtingumo grafikas.
[0029] Detalus išradimo realizavimo variantų aprašymas
[0030] Žvynasparniai vabzdžiai vystymosi nuo kiaušinėlio iki suaugusio individo procese keičiasi pagal gerai cha-rakterizuotą virsmų seką (detalesnį aprašymą žr. Comprehensive Insekt Physiology, Biochemistry and Pharmacology, Vels. 7 and 8, Kerkut and Gilbert (eds)., Pergamon Press, Oxford, 1984) .
[0031] Po išėjimo iš kiaušinėlio pas vabzdžio lervą prasideda intensyvios mitybos periodas, kurio metu ji kelis kartus išsiners, o tai užtikrina jos nepertraukiamą augi-mą. Laiko tarpai tarp nuosekliai einančių nėrimųsi yra vadinami amžiaus (lervingumo) stadijomis. Pasibaigus augimo periodui, lerva virsta lėlyte ir galų gale pavirsta suaugusiu vabzdžiu. Nėrimosi ir virtimo lėlyte procesus (apibendrinančiai vadinamus metamorfoze) regu-liuoja bendras kelių įvairių hormonų grupių veikimas. Pradinis stimulas yra tam tikrų smegenų ląstelių iš-skiriamas proktorakotropinis hormonas (PTTH). Tai sti-muliuoja ekdisteroidų, kurie dažnai vadinami vabzdžių nėrimosi hormonais, sekreciją grotorakalinėmis liau-komis. Esant juvenyliniam hormonui, yra garantuotas lervos nėrimasis, o jam nesant virs lėlyte. Išsilukš-tenimo hormonas taip pat yra svarbus kai kurių su metamorfoze susijusių elgsenos pakitimų realizavimui.
[0032] Lazdelės pavidalo virusas AcMNPV, naudojamas kaip mo-delinė sistema daugelyje lazdelių pavidalo virusų tyrimų, visai nelauktai įsikiša i, aukščiau aprašytą vabzdžio vystymosi procesą. Infekuotos AcMNPV vabzdžių lervos nebesugeba daugiau nertis ir virsti lėlyte, o tai susiję su tuo, kad AcMNPV valdo sintezę fermento, kuris žinomas kaip ekdisteroid-UDP-gliukozil-transfe-razė (EGT), ir kuris selektyviai inaktyvuoja vabzdžių ekdisteroidus.
[0033] Šio išradimo autoriai identifikavo EGT koduojanti, geną AcMNPV genome jis tęsiasi nuo 8,4 iki 9,6 sąlyginių vienetų (1 ir 2 fig.). Kaip parodyta 1C fig., virusinės DNR fragmentai, supantys egt geną, buvo klonuoti į pUC 19, Bluescript M13+ ir Bluescript M13 plazmidus. 2 fig. parodyta egt genomo srities restrikcijos korta ir kom-piuterinė analizė, norint nustatyti šioje srityje at-virų nuskaitymui rėmelių buvimą. Tik 2 rėmeles turi są-lyginai ilgą, atvirą nuskaitymui seką, kuri buvo iden-tifikuota kaip egt geno kodavimo sritis. 1 lentelėje pateikta egt geno nukleotidų seka ir iš jos išvesta 506 aminorūgščių seka. egt geno koduojamoji seka tęsiasi maždaug nuo 149 iki 1670 nukleotido.
[0034] Nukleotidų seka ir AcMNPV viruso egt geno aminorūgščių pranašauta seka
[0035] Pirmenybę turinčiame šio išradimo realizavime AcMNPV bakuleviruso egt genas inaktyvuoj amas, pakeičiant jo dali, bakterine seka, koduojančia (3-galaktozidazes. Toks rekombinantinis bakulevirusas žymimas vEGTZ. Antrame pirmenybę turinčiame realizavimo variante, kaip parodyta 3 fig., viruso AcMNPV egt geno dalis pašalinama be pakeitimo. Baltymų, sintezuojamų infekuojant laukinio tipo AcMNPV ir vEGTZ, palyginimas parodė, kad EGT baltymas yra peptidinė grandinė su 60 kDa molekuline mase, išskiriama infekuotomis ląstelėmis. Vabzdžių viruso egt geno inaktyvavimo alternatyvinis mechanizmas yra įter-pimas geno, kuris koduoja hormono, įtakojančio■metamor-fozę, arba inaktyvuojančio tokį hormoną fermento sin-tezę, ir kuris pasireiškia nurodytu virusu infekuotoje vabzdžių ląstelėje.
[0036] Genų banko duomenų Bazės tyrimai parodė, kad nuo 21 iki 22% egt aminorūgščių sekos yra homologiška žinduolių UPD-gliukozil-transferazėms. egt aminorūgščių linijinės sekos ir kai kurių šių fermentų sugretinimas parodytas 2 lentelėje.
[0037] 2 lentelė iliustruoja egt aminorūgščių linijinės sekos ir kitų biologinių rūšių UDP-gliukozil-transferazių sugretinimą. Pranašauta egt aminorūgščių seka lyginama su žmogaus (HUMVDPGAT) (Jackson et al. (1987) Biochem. J. 242:531), pelių (MVSVDPGAT) (Kimura and Owens (1987) Eur. J. Biochem. 163:515) ir žiurkių (RATVDPGAT)
[0038] (Mackenzie (1987) J. Biol. Chem. 262:9744) UDP-gliu-koronozil-transferazėmis ir su kukurūzų (ZMAYVDPGT)
[0039] (Ralston et al. (1988) Genetics 119:185) UDP-gliukozi1-transferaze, panaudojant FASTER algoritmą (Zipman and Pearson (1985), siūlomo International Biotechnologics.) . Viršutinio registro raidės rodo tikslų sutapimą; apa-tinio registro raidės apibrėžia pakeitimus, kurie daž-nai sutinkami tarp giminingų baltymų (Dayhoff, (1978)
[0040]
[0041] Atlas of Protein Seąuence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Vol . 5 Supplement 3, Silver Spring, MD); taškai žymi retai sutinkamus pakeitimus; brūkšnelis rodo praleidimą sekoje; intarpas duodamas aminorūgščių pašalinimo iš sekos vietose. vEGTZ ir vEGTDEL egt geno aminorūgštys tarpuose tarp strėlyčių yra pašalintos. AcMNPV geno homologiškumas žinomoms UDP-gliukozil-transferazei ir UDP-gliukorono-zil-transferazei patvirtina identifikavimą šios AcMNPV sekos, kaip koduojančios egt geno sekas.
[0042] Pas žinduolius UDP-gliukuronazil-transferazės katalizuoja gliukurono rūgšties pernešimą į visą eilę kaip egzogeninių, taip ir endogeninių lipofilinių substratų
[0043] (žiūrėk apžvalgą Glucuronidation of Drugs and Other Compounds, Dutton (ed), CRC Prees, Boca Raton Florida, 1988). Ši prisijungimo reakcija atlieka esmini, vaidmenį detoksikacijoje ir saugiame tam tikrų vaistinių prepa-ratų ir kancerogenų pašalinime. Be to per junginius su gliukurono rūgštimi vyksta normalaus metabolizmo ir įvairių endogeninių junginių, kaip bilirubinas ir ste-roidiniai hormonai, paskirstymo procesai.Turimi duomenys apie vabzdžių sistemas rodo, kad panašios cukrų prisijungimo reakcijos apima gliukozės, o ne gliukurono rūgšties pernešimą (žiūrėk apžvalgą Smith (1977) Drug Metabolism From Microbs to Man, Parke and Smith (eds), Taylor and Francis LTD London, pp. 19-232) . Kaip ir pas žinduolius, taip ir pas vabzdžius panašiose prisijungimo reakcijose dalyvauja įvairūs egzogeniniai ir endogeniniai junginiai.
[0044] Šio išradimo autoriai parodė, kad AcMNPV viruso EGT baltymas yra UDP-gliukozil-transferazė, kuri selektyviai sujungia gliukozę su tokiais ekdisteroidais, kaip ekdizonas, 20-hidroksiekdizonas ir makisteronas A (žiū-rėk 3 lentelę). Nei lizatai, nei neląstelinė neinfe-kuotų ląstelių arba infekuotų vEGTZ ląstelių terpe nemodifikuoja ekdizono. Didžioji dalis aktyvios ekdisteroid-gliukozil transferazės, gaminamos AcMNPV infekuotomis ląstelėmis, išsiskiria i, tarpląstelinę terpę; santykinai žemas jos aktyvumo lygis yra stebimas AcMNPV infekuotų ląstelių lizatuose.
[0045] Panaudojant AcMNPV viruso egt geną kaip žymę, egt genas, kaip parodyta 4 fig., buvo identifikuotas kitame lazdelės pavidalo viruse, ir būtent branduolinės po-liedrozės viruse Orgyia preudotsugata (OpMNPV). Specialistui turi būti suprantami pranašumai, kuriuos tei-kia šis atradimas, tai yra bet kurio lazdelės pavidalo viruso, vabzdžio ar vabzdžių viruso, egt genas gali būti lokalizuotas, charakterizuotas ir analogišku būdu išskirtas, egt ger\ai, kurių nukleotidinė seka ne mažiau kaip 70% homologiška sekai, pateiktai 1 lentelėje, lai-komi ekvivalentiški šiai sekai, su sąlyga, kad homolo-giški genai koduoja fermentą, kuris yra ekdisteroid-UDP-gliukozil-transferazė.
[0046] egt geno funkciniais ekvivalentais yra tokie ekvivalentai, kaip ekdizonas, kurie taip pat katalizuoja ekdisteroidų inaktyvaciją, pernešdami pusę gliukozės nuo UDP-gliukozės i, ekdisteroidą (ekdisteroidus) . Tokie funkciniai egt-ekvivalentai gali būti identifikuoti čia aprašytais metodais.
[0047] Lokalizuojant, identifikuojant ir išskiriant egt geną, patyręs specialistas, pasinaudodamas šiuo išradimu ir žinomomis metodikomis, gali inaktyvuoti ši, geną ir gauti agentą, užtikrinantį vabzdžio vystymosi ir augimo efektyvesnę kontrolę.
[0048] Lygindami vEGTZ savybes su laukinio tipo (wt) AcMNPV, šio išradimo autoriai parodė, kad egt geno ekspresija užkerta kelią vabzdžio nėrimuisi ir virtimui lėlyte. Vabzdžiai, infekuoti wtAcMNPV, nesineria ir nevirsta lėlytėmis, tuo tarpu infekuotieji vEGTZ-neriasi ir stengiasi virsti lėlyte (žr. II pavyzdžio 4 lentelę).
[0049] Dėl nėrimosi ir virtimo lėlyte slopinimo, infekavimas laukinio tipo virusu AcMNPV iš tikro gali prailginti lervos mitybos periodą. Lervos, užkrėstos laukinio tipo virusu penktos amžiaus stadijos pradžioje (paskutinė amžiaus stadija), maitinasi iki pat mirties, kuri įvyk-sta 5 arba 6 dieną po užkrėtimo. Tačiau neinfekuotos lervos, besiruošdamos virsti lėlyte, nustoja maitintis po 2-3 dienų, sulaukus penktos amžiaus stadijos (žiūrėk 8 fig.). Analogiški efektai stebimi ir tiriant ankstes-nių amžiaus stadijų lervas. Nėrimosi metu neinfekuotos lervos nustoja maitintis maždaug 24 valandas, tuo tarpu wtAcMNPV užkrėstos lervos nesineria ir, atitinkamai, toliau maitinasi (žiūr. 6 fig.).
[0050] Rekombinantiniai lazdelės pavidalo virusai, neturintys funkcinio egt geno, neprailgina lervos mitybos periodo trukmę. Tuo būdu infekuotos lervos penktos amžiaus pradiniame periode, praėjus dviems dienoms po užkrė-timo, nustoja maitintis ir ruošiasi virtimui lėlyte (žiūr. 8 fig.). Tačiau, kaip parodyta 9 fig., jos nevirsta lėlytėmis ir vietoje to miršta nuo virusinės infekcijos net greičiau, negu laukinio tipo virusu infekuotos lervos. Analogiškai lervos, infekuotos virusu ankstyvojoje ketvirtoje amžiaus stadijoje, nustoja maitintis praėjus dviem dienoms po užkrėtimo ir po to miršta greičiau, negu infekuotosios laukinio tipo virusu (žiūrėk 6 ir 7 fig.) . Tai, kad lazdelės pavidalo virusas, neturintis funkcinio geno, užmuša vabzdžius greičiau, o tai aiškiai matyti, tada, kaip parodyta 10 ir 11 fig., kai AcMNPV ir vEGTZ virusais infekuojamos tik ką iš kiaušinėlių išsiritusios pirmos amžiaus stadijos lervos. vEGTZ užkrėstos lervos nuo virusinės infekcijos miršta 3-4 dienomis anksčiau, lyginant su to-mis, kurios buvo užkrėstos wtAcMNPV. Reiškia, rekombinantiniai lazdelės pavidalo virusai, neturintys funkcinio egt geno, yra žymiai efektyvesni kaip vabzdžių kontrolės agentai, negu laukinio tipo lazdelės pavidalo virusai. Šios srities specialistams turėtų būti aki-vaizdūs privalumai šio išradimo, kurio esmė yra tame, kad egt genas bet kuriuo žinomu būdu gali būti pada-rytas nefunkciniu bet kuriame lazdelės pavidalo viruse arba vabzdžių viruse.
[0051] Aukščiau ir žemiau esančiuse pavyzdžiuose aprašytas efektas laukuose bus dar stipresnis. vEGTZ infekuotos lervos turi sunkumų su nėrimusi, tačiau tai sėkmingai realizuojasi tik kruopščiai kontroliuojamose laborato-rinėse sąlygose. Nesant griežtai temperatūros ir ap-švietimo kontrolei, daugelis lervų negali baigti nėri-mosi. Tokie vabzdžiai napradeda vėl maitintis ir po to greitai miršta.
[0052] Nežiūrint i, tai, kad kiek sutrumpėja laikas, per kuri, viruso palikuonys gali kauptis lervije, užkrėstoje lazdelės pavidalo virusu, neturinčiu funkcinio egt geno, ir sumažėja infekuoto vabzdžio mityba, yra pa-stebimas žymus dukterinio viruso gaminimasis. Viruso kiekis, skaičiuojant vienai lervai, gautas po vėlesnių amžiaus stadijų lervų užkrėtimo vEGTZ, sudaro maždaug pusę to, kas gaunama užkrėtus laukinio tipo virusu. To užtenka, kad būtų užtikrintas viruso pernešimas i lauką ir efektyviai, kainos prasme, būtų gauti dideli viru-sinių dalelių kiekiai.
[0053] Kitame šio išradimo realizavimo variante vabzdžių vi-rusą, kuriame nėra funkcinio egt geno, genų inžinerijos pagalba modifikuoja taip, kad jo, kaip biologinės kont-rolės agento, efektyvumas išauga geno, kurio produktas įtakoja vabzdžio vystymąsi, įvedimo sąskaita.
[0054] Genas, koduojantis PTTH (peptidinis hormonas) gali būti įvestas i, viruso, neturinčio egt geną, genomą, ir PTTH ekspresija bus pakankamai aukšta, kad įtakotų nėrimosi procesus. Pas tokio tipo virusu infekuotas lervas yra aukščiausiu laipsniu pažeista vystymosi hormoninė kont-rolė. Tokie vabzdžiai greitai suserga, o tai kenkia vystymuisi ir augimui, ir yra mitybos sumažėjimo ir mirties priežastimi.
[0055] Išsilukštenimo hormonas taip pat yra smulkus peptidinis hormonas, kurio genas, panaudojant žinomus metodus, ga-li būti įvestas į virusinį genomą su nefunkciniu egt genu. Ryšium su tuo, kad išsilukštenimo hormonas ap-sprendžia daugelį su metamorfoze susijusių elgsenos pakitimų, vabzdys, užkrėstas Egt- virusu, gaminančiu šį hormoną užtektinai dideliais kiekiais, nenormaliai elg-sis ir/arba vystysis, pavyzdžiui, mažiau maitinsis.
[0056] Vabzdyje pirminiu juvenylinio hormono aktyvumo regu-liatoriumi yra fermentas esterazė, inaktyvuoj antis ju-venylinį hormoną. Rekombinantinis virusas, neturintis funkcinio egt geno ir gaminantis pakankamai aukštą juvenylinio hormono esterazės lygį, gali neigiamai įta-koti vabzdžio elgesį ir/arba vystymąsi.
[0057] Svarbu pažymėti, kad nors visi aukščiau paminėti genai gali būti įvesti į laukinio tipo virusų genomą, negalima laukti, kad šiuo atveju jie žymiu mastu įtakotų vabzdžio elgesį, kadangi egt geno ekspresija laukinio tipo virusais inaktyvuoja ekdisteroidinius nėrimosi hormonus ir tai kliudo, nežiūrint į kitų hormonų ga-mybą, normaliai metamorfozės eigai. Tuo būdu sėkminga strategija turi apimti, kaip aprašyta šiame išradime, generavimą virusų metamorfozės eigos pakeitimui, pri-klausomai nuo prieš tai atlikto egt geno inaktyvavimo.
[0058] Specialistams aišku, kad šio išradimo vabzdžių kont-rolės agentams priklauso mutantiniai organizmai, kuriuose nėra intaktinio egt geno, arba jis nesugeba gaminti funkcinį egt produktą, o taip pat taip genetiškai pakeisti organizmai, kad jie išskiria kitą fermentą arba peptidinį hormoną, kurie modifikuoja hormoną.
[0059] Kaip parodyta, egt geno produktas galingai ir speci-fiškai įtakoja vabzdžių vystymąsi. Ekdisteroidai vaidi-na lemiamą vaidmenį pagrindinai visų vabzdžių rūšių vystymesi (žr. apžvalgą Comprehensive Insert Physiology, Biochemistry and Pharmacology, Kerkut and Gilbert (eds) Pergamon Press, Oxford (1984). Tuo būdu egt genas siūlo plačias potencialias galimybes plataus masto vabzdžių kontrolės strategijai. Pavyzdžiui, ketvirtame pirmenybę turinčiame šio išradimo realizavimo variante, žemės ūkio kultūra, panaudojant žinomus metodus, yra taip ge-netiškai pakeičiama, kad ji žymiu mastu pradeda gaminti EGT baltymą. Ant tokios kultūros besimaitinantys vabz-džiai nesugebės baigti vystymąsi ir virsti suaugusiu individu, tuo būdu užtikrinama ilgalaikė žemės ūkio kultūros apsauga. Bakterijos, paprastai esančios ant augalo arba jo viduje, taip pat gali būti analogišku būdu pakeistos, panaudojant žinomus genų inžinerijos metodus, ir to pasekoje gaminti EGT fermentą. Tokios bakterijos taip pat gali aktyviai funkcionuoti kaip vabzdžių kontrolės biologiniai agentai.
[0060] Norint iššaukti egt geno ekspresiją, genetiškai gali būti pakeistos nefitopatogeninės besikolonizuojančios ant augalų bakterijos. Augalai su tokių genetiškai modifikuotų bakterijų kolonijomis bus apsaugoti nuo vabzdžių-kenkėjų, jautrių išryškinamų baltymų (baltymo) poveikiui.Nefitopatogeninės bakterijos, sudarančios ko-lonijas ant augalų, yra aprašytos, pavyzdžiui, U.S. Patent Nr 4.798.723, o kai kurių ant augalų besi-kolonizuoj ančių bakterijų genetinis modifikavimas ap-rašytas U.S. Patent Nr 4. 771.131 ir EPO Publication Nr 0185005. Taip pat yra žinomos kitos ant augalų besikolonizuojančios bakterijos. Ekspresyvių genų įve-dimui, tam kad būtų užtikrintas vabzdžių kontrolės su-kūrimas, gali būti panaudoti visi metodai, panašūs aukščiau aprašytiems.
[0061] Vabzdžiams įrijus tokią genetiškai modifikuotą medžiagą arba augalinę medžiagą, kurioje yra tokių genetiškai modifikuotų bakterijų kolonijos, atsiras jų normalaus vystymosi sutrikimai.Yra žinoma, kad kai kurie vabz-džiai, pavyzdžiui amarai, turi ypatingai pralaidų žar-nyną. Prityrę specialistai supranta, kokios moleku-linės-biologinės stadijos yra būtinos tokio augaluose pasireiškiančio geno sukonstravimui ir ką būtina atlikti, kad ši, ganą įvesti i, augalo genomą.
[0062] Atrodo, jog yra įmanoma, kad tam tikrose gyvenimo ciklo stadijose pačiuose vabzdžiuose pasireiškia egt genas, ir kad jis yra svarbus vystymosi reguliavimo mechanizmo komponentas. Tuo būdu, matyt, vabzdžių egt genas pasi-rodys besąs tinkama naujos vabzdžių kontrolės strategijos priemone. Šis išradimas užtikrina būdą, lei-džiantį tokios strategijos planavimą.
[0063] Papildomą šio išradimo realizavimo formą sudaro ekdi-steroidų analogai, kurie susijungia su EGT fermentu, tačiau jų atskilimas nuo fermento nėra įmanomas. Tokie "savižudybės substratai" sudarys konkurenciją prisi-jungimui prie EGT fermento ir slopins arba blokuos jo veikimą, tuo pačiu įsikišdami į vabzdžio vystymąsi. Priešingai, rekombinantiniai organizmai gali būti pakeisti genų inžinerijos metodais, pasinaudojant tei-giniais, aprašytais šiame išradime, tuo būdu vabzdžio egt geno ekspresija bus nuslopinta gaminantis, pa-vyzdžiui, anti-RNR.
[0064] Šiame išradime vabzdžių kontrolės agentas yra kompozicija arba aktyvus ingredientas kompozicijos, kuri nepalankiai veikia vabzdį kenkėją. Reakcija į vabzdžių kontrolės agentą yra mitybos sumažėjimas, pažeidžiama normali metamorfozė, ko pasekoje vabzdžio mirtis yra neišvengiama. Pagal ši, išradimą vabzdžių kontrolės agentu gali būti vabzdžių virusas, genetiškai pakeistas norint inaktyvuoti geną, koduojanti, fermento, apspren-džiančio ekdisteroido modifikaciją, sintezę, arba vabz-džių virusas su tolimesniais genetiniais pakitimais, kurių rezultatas yra heterologinio geno, įtakojančio metamorfozę, ekspresija, arba tai gali būti augalas, vabzdžių parazitas arba nefitopatogeninė bakterija, be to bet kuriame iš šių organizmų, genų inžinerijos pasekoje, pasireiškia heterolitinis genas, koduojantis metamorfozę įtakojančio baltymo sintezę.
[0065] Insekticidinės kompozicijos, tinkamos užnešti ant auga-lų, norint kontroliuoti vabzdžius-kenkėjus, turi žemės ūkio atžvilgiu priimtiną nešėją ir vabzdžių vystymąsi kontroliuojantį agentą. Šio išradimo insekticidinės kompozicijos užnešimas gali apsaugoti augalus nuo vabz-džių-kenkėjų, jų mitybos sumažėjimo ir jautrių vabzdžių nužudymo pasekoje.
[0066] Specialistai žino, kokiu būdu parinkti vabzdžių kontro-lės agentą, pavyzdžiui, virusą, tinkamą atitinkamam vabz-džiui kenkėjui.
[0067] Specialistams aišku, kad vabzdžiai-kenkėj ai gali būti paveikti šio išradimo kontroliuojančiu agentu bet kuriuo tradiciniu budu, įskaitant ryjimą, įkvėpimą ir tiesiogini, kontaktą.
[0068] Kaip kontroliuojantys agentai gali būti naudojami taip pat augalai arba entomopatogeniniai mikroorganizmai su atitinkamais genetiniais pakitimais ir todėl gaminantys bent vieną baltymą, įtakojanti, vabzdžių vystymąsi. To-kių baltymų pavyzdžiai apima, tačiau neapsiriboja, pro-torakotropinį hormoną, nėrimosi hormoną, juvenylinio hormono esterazę ir ekdipon-gliukozil-transferazę.
[0069] Norint iššaukti egt geno ekspresiją, taip pat gali būti genetiškai pakeisti vabzdžių parazitai, įskaitant virusus, bakterijas, grybelius ir kitus vabzdžius. Tokių parazitų parazitavimas ant atitinkamų vabzdžių iššauks, be simptomų, susijusių paprasčiausiai su nemodifikuotų buvimu, vabzdžio normalaus vystymosi pažeidimas. Infekuoto vabzdžio vystymosi pažeidimai sustiprins ligotumo būvį. Vabzdžio-kenkėjo infekavimo pasekoje sumažėja mityba ir greičiau įvyksta mirtis.
[0070] Genetiniam modifikavimui organizmo, kurio tikslas yra vabzdžių kontrolės agento gaminimas, gali būti pa-naudotos DNR sekos, koduojančios sintezę šiame išradime aprašyto EGT-baltymo, kuris įtakoja vabzdžio vystymąsį ir kurio ekspresiją kontroliuoja tą organizmą atitin-kantis promotoris. Tokie genetiniai pakitimai gali būti atlikti vabzdžių parazitams, augalams ir ant augalų be-si koloni zuo j ančioms nefitopatogeninėms bakterijoms.
[0071] Į šio išradimo sferą patenka egt genas, šio geno produktas, nukreipti prieš paskutinįjį antikūnį visi kiti reagentai, aukščiau išvardintų komponuotų dariniai arba su jais susiję. EGT baltymas gali būti žymiu mastu išvalytas panaudojant čia aprašytus, o taip pat žinomus metodus.
[0072] Šiame išradime aprašyti lazdelės pavidalo virusai su genetiniais pakitimais pagrindinai naudojami kaip komponentai žemės ūkio kompozicijų, skirtų užnešimui ant augalų, tam kad būtų galima biologiškai kontroliuoti vabzdžius, kurie yra augalų kenkėjai. Yra žinomi įvai-rūs tokių vabzdžių kontrolės kompozicijų, priimtinų že-mės ūkiui, gamybos būdai.
[0073] Kontroliuojančio agento koncentracija, reikalinga gavi-mui efektyvių insekticidinių kompozicijų, naudojamų že-mės ūkyje augalų apsaugai, priklauso nuo organizmo ti-po, naudojamos mutacijos ir kompozicijos receptūros. Specialistui suprantama, kad efektyvias kontroliuo-jančio agento koncentracijų reikšmes kompozicijoje galima lengvai nustatyti eksperimentiškai. Pavyzdžiui, viruso koncentraciją, kuri jau pasižymi insekticidinių efektu, lengvai galima nustatyti bet kuriuo iš būdų, pateiktų VI-XI pavyzdžiuose.
[0074] Žemės ūkio kompozicijos turi būti tinkamos naudoti že-mės ūkyje ir gerai disperguotis lauke. Bendru atveju kompozicijos komponentai neturi būti fitotoksiški ir kenkti visai okliuduoj ančių virusų bendrijai. Užnešimas ant palų neturi kenkti lapams ir žaloti juos. Be ati-tinkamų kietų arba, o tai turi pirmenybę, skystų ne-šėjų, žemės ūkio kompozicijos gali turėti komponentus, kurie padidina lipnumą ir adheziją, emulgatorius ir drėkintojus, tačiau ne komponentus, kurie mažina vabz-džių mitybą arba viruso funkcionavimą. Gali būti pagei-dautina įvesti komponentus, apsaugančius kontroliuo-jantį agentą nuo inaktyvacijos ultravioletiniu spindu-liavimu. Vabzdžių-kenkėjų kontrolės žemės ūkio kompozicijos taip pat gali turėti agentus, stimuliuojančius vabzdžių mitybą.
[0075] Yra apžvalgų, kuriuose aprašomi vabzdžių biologinės kontrolės agentų užnešimo ir jų naudojimo žemės ūkyje būdai. Žiūrėk, pavyzdžiui, Couch and Ignoffo (1981) Microbial Control of Pests and Plant Disease, 1970-1980, Burgės (ed) chapter 34, pp. 621-634; Carke and Rishbeth, ibid, chapter 39, pp. 717-732, Brockwell (1980) Methods for Evaluating Nitrogen Fixation, Bergsen (ed) , pp. 417-488; Burton (1982) Biological Nitrogen Fixation Technology for Tropical Agriculture, Graham and Harris (eds) pp. 105-114; ir Roughley (1982) ibid, pp. 115-127, The Biology of Baculevirusses, vol. II supra.
[0076] Šis išradimas iliustruojamas žemiau pateiktais pavyz-džiais, į kuriuos jokiu būdu negalima žiūrėti kaip i, šio išradimo srities apribojimą. Aišku, kad specialistams gali atsirasti įvairūs konkretaus realizavimo variantai, išradimo modifikacijos ir ekvivalentai, ne-išeinantys iš šio išradimo idėjos ir/arba pridedamos išradimo apibrėžties ribų.
[0077] 1 fig. parodyta egt geno padėtis AcMNPV genome, virš AcMNPV genomo kortelės parodytas mastelis sąlyginiais vienetais. Norint nustatyti šio geno ir jam gretimų sričių nukleotidinę seką, o tai leistų po to atlikti genetines manipuliacijas, iš pradžių reikia klonuoti kai kuriuos DNR fragmentus, flankuojančius šią sritį, į plazmidžių vektorius (standartines klonavimo metodikas žiūrėk: T. Maniatis et al. (1982) Molekular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N 4) . 1 fig. A panelėje parodyta AcMNPV genomo linijinė kortelė, po jo suskaidymo Eco RI ir Hind III restrikcinėmis endonukleazėmis. B panelėje padidintu masteliu parodyta genomo sritis nuo 7,6 iki 11,1 sąlyginio vieneto, parodanti egt padėtį. Kaip pradinis AcMNPV buvo naudojamas štamas L1 (Lee and Miller
[0078] (1978) J. Virol. 27:754). Klonuojami DNR fragmentai ir gautų plazmidžių pavadinimai parodyti 1 fig., C panelė. 1 fragmentas, užimantis stiti, nuo PstI saito, esančio 7,6 s.v. taške, iki DamHI saito (11,1 s. v.), klonuojamas i, plazmidinį vektorių pUC19; abu fragmentai 2 ir 3 (atitimkamai nuo PstI (7,6 s.v.) iki EcoRI (8,65 s.v.) ir nuo EcoRI (8,65 s.v.) iki Salį (10,5 s.v.) klonuojami į vektorius Bluescript M13+ ir Buescript M13 (Stratagene, San Diego, Californij a) . 5 fragmentas (esantis nuo BstEII (8,35 s.v.) iki BstEI (8,7 s.v.) klonuojamas j, Bluescript M13+.
[0079] Po to generuojasi daug BCPSE ir BGES plazmidų paklonių
[0080] (Henikoff (1984) Gene 28:251). Šie pakloniai besiskiria nuosekliai didėjančiais virusinių intarpų ištrynimais, tuo būdu jie turi skirtingus virusunės DNR kiekius, ku-riems iki pilno virusinio fragmento trūksta iki 50 ba-zinių elementų porų. Po to daugeliui tokių paklonių ir BCB plazmidei yra atliekamas priauginimas (Sander et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463), tuo bū-du abiejose kryptyse atstatoma pilno egt geno seka. Po to gauta nukleotidinė seka yra analizuojama, nirint nustatyti nuskaitymui atvirus rėmelius, kurie gali koduo-ti baltymus. Tam naudojamos kompiuterinės programos Pūsteli and Kefatas (1984) Nucl. Acids Res. 12:643-655 ir Devereaux et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:387-396. Tokia analizė rodo, kad egt genas koduoja baltymą, su-sidedanti, iš 506 aminorūgščių. egt geno nukleotidų seka ir šio geno produkto pranašauta aminorūgščių seka pateikta 1 lentelėje.
[0081] Tam, kad sukonstruoti rekombinantinius virusus, nesu-gebančius atlikti egt geno ekspresijos, reikia atlikti tolimesnes manipuliacijas su 1 pavyzdyje aprašytais plazmidžių klonais. pUCBCPsB plazmidą suskaido pasinaudojant EcoRI ir Xbal restriktuojančiomis endonukle-azėmis (restrikcijos egt geno viduje saitus žr. 3 fig.) ir atmeta mažą fragmentą. lacZ Escherichia coli genas, atskeltas nuo pSKS 104 (Casadabom et al. (1983) Methods Enzimol. 100:2 93-303), panaudojant EcoRI ir Aha III endonukleazes, po to, kai laisvi Xbal galai užpildomi T4 fago DNR-polimeraze, Įsiterpia tarp saitų EcoRI ir Xbal. gauta plazmidė žymima PEGTZ.
[0082] Į šią plazmidę įterptas lacZ genas yra rėmelio ribose kartu su prieš tai buvusia koduojančia egt seka. Prie-šingai, pEGTDEL plazmidę konstruoja paprasčiausiai su-jungiant EcoRI ir Xbal saitus (po to kai abu abiejų saitų galai užpildomi), neistatant tarp jų jokios nu-kleotidinės sekos. Visi virusai yra štamo L-l AcMNPV (Lee and Miller (1978) supra išvestinės, gryna linija gauta per ženklelius ir padauginta nusistovėjusioje ląstelių linijos kultūroje Spoclopetra frugiperda IPLB-SF2L (SF-ląstelės) (Vaughn et al. (1977) In vitro 13:213-217), naudojant aukščiau aprašytus metodus (Lee and Miller (1978); Miller et al. , (1986) Genetic Ingi-neering Principles and Methods, vol. 8 (eds. J.Setlow and A.Hollaender), Plenum Press, N.Y., 277-298, 1986).
[0083] Po to, pasinaudojant laukinio tipo AcMNPV DNR, pEGTZ plazmidė buvo perkelta i, SF-ląsteles. Ši procedūra leidžia atlikti homologišką rekombinaciją tarp viru-sinės ir plazmidinės DNR sekų, to pasekoje viruso egt genas pakeičiamas plazmidės egt-lacZ genų jungtimi. Kadangi pasiliekanti egt koduojanti seka lieka rėmelyje kartu su lacZ sekomis, tai toks rekombinantinis virusas gamins jungtini baltymą, kuris bus sudarytas iš 84 egt aminorūgščių, sujungtų su |3-galaktozidaze. Rekombinantini virusą žymimą cEGTZ, galima identifikuoti, kadangi (3-galaktozidazės ekspresijos pasekoje susidaro žydros virusinės žymės, esant tokiam chromogeniniam indikato-riui, kaip 5-brom-4-chlor-3-indolin-p-D-galaktopirano-zidas (X-gal). vEGTZ viruso egt geno diagrama pateikta 3 fig. B panelėje.
[0084] Rekombinantinis virusas vEGTDEL gaunamas pernešant pEGTDEL plazmidę ir DNR iš vEGTZ viruso i, SF-ląsteles . Homologinės rekombinacijos pasekoje vEGTZ geninė jung-tis egt-lacZ pakeičiama egt genu su pEGTDEL ištrynimu. Rekombinantinis vEGTDEL virusas identifikuojamas pagal jo nesugebėjimą sudaryti žydras žymes, esant X-gal. vEGTDEL viruso egt geno struktūra parodyta 3 fig., C.
[0085] egt geno produktą identifikuoja lyginant baltymus, sin-tezuotus laukinio tipo AcMNPV virusu (kuris gamina EGT) ir sintezuojamus cEGTZ arba vEGTDEL virusais (kurie nesugeba gaminti EGT) . SF-ląstelės infekuojamos arba laukinio tipo AcMNPV, arba vEGTZ su gaugybe užkrėtimų
[0086] (M0l)20, kaip tai aprašyta O'Reilli and Miller (1990) J. Virol. 64:1321-1328. Infekuotas ląsteles taip pat analizuoja. Praėjus 6 valandoms po užkrėtimo, ląsteles 1 valandą infekuoja, esant radioaktyviais / 3 5S/ izotopais žymėtam metioninui, tam, kad radioaktyvios žymės būtų įvestos į visus baltymus. Po to ląstelės li-zuojamos ir baltymai atskiriami elektroforizuoj ant SDS-poliakrilamido gelyje (SDS-PAGE) (Laemmli et al. (1970) Nature 227:68-685) . Visi ląstelių pagaminti baltymai taip pat surenkami ir analizuojami. Po SDS-PAGE radio-izotopais žymėti baltymai nustatomi, panaudojant auto-radiografiją. Iš infekuotų wtAcMNPV ląstelių buvo iš-skirtas 60 kDa molekulinės masės baltymas, kas nebuvo gauta vEGTZ infekuotų arba neinfekuotų ląstelių atveju. Šis baltymas nėra nustatomas lizatinėse ląstelėse, infekuotose laukinio tipo AcMNPV, o tai įrodo jo sek-reciją ląstelėmis. Šie duomenys rodo, kad egt geno produktu yra sintezuojamas 60 kDa baltymas, o tai gerai derinasi su duomenimis apie nukleotidų ir aminorūgščių seką .
[0087] EGT baltymo fermentini, aktyvumą nustatinė j ome lyginant SF-ląsteles, infekuotas wtAcMNPV arba vEGTZ. SF-ląs-telės, infekuotos wtAcMNPV arba vEGTZ, aprašytos III pavyzdyje. Po 12 valandų "pi" ląstelės ir tarpląstelinė terpė buvo surenkami ir apdorojami atskirai. Lygia-grečiai buvo apdorojamos neinfekuotos ląstelės. Ląs-telinį lizatą ir tarpląstelinę terpę inkubavome esant 1 mM UDP-gliukozės ir 0,25 ĮiCi/_3H/ ekdizono, kaip tai aprašyta pas O'Reilly and Miller (1989) Science 245:1110-1112.
[0088] Ekdisteroid-UDP-gliukozil-transferazės aktyvumas ląste-liniuose lizatuose ir tarpląsteliniame skystyje ka-talizuos gliukozės pernešimą nuo UDP-gliukozės i, ek-dizoną, susidarant ekdizono-gliukozės junginiui (konja-gatui). Ekdizonas ir ekdizono-gliukozės junginys atskiriami plonasluoksnės chromatografijos ant silika-gelio pagalba (Bausal and Gessner (1988) Anai. Biochem. 109-321) ir vizualizuojami autoradiografijos būdu. Ekdizono-gliukozės junginiai (b) susidaro tik testuojant AcMNPV infekuotus ląstelinius lizatus arba tarp-ląstelini, skysti,. Junginiai nestebimi, jeigu naudojamos neinfekuotos arba vEGTZ infekuotos ląstelės arba tarp-ląstelinis skystis, o tai įrodo, kad aktyvumą apspren-džia egt ekspresija. Didžioji aktyvumo dalis yra susi-kaupusi tarpląstelinėje terpėje, o tai atitinka III pavyzdyje aptariamus duomenis. Gliukozės prisijungimo prie ekdizono įrodymą gauna testuojant wt-infekuotus lizatus aukščiau aprašytu būdu, išskyrus tai, kad UDP-gliukozę pakeičia radioaktyviais izotopais žymėta UDP/U-14C/-gliukoze. Reakcijos, vykstančios dalyvaujant nežymėtai UDP-gliukozei arba žymėtai UDP/U-14C/-gliukozei, abiejose reakcijose dalyvaujant /_ OH/ ekdizonui, ir susidarančių junginių scintiliacijų paskaičiavimas ro-do, kad gali būti nustatytas 3H iš ekdizono ir 14 C iš gliukozės. Šie duomenys rodo, kad egt geno produktu yra UDP-gliukozil-transferazė, kuri yra gliukozės pernešimo nuo UDP-gliukozės i, ekdizoną katalizatoriumi.
[0089] Toliau atliekami eksperimentai, norint detaliau išsi-aiškinti EGT specifiškumą substratui. Šiuose eksperi-mentuose buvo inkubuojami įvairūs substratai (1 mM), esant tarpląstelinei terpei, gauti iš wtAcMNPV infe-kuotų ląstelių, kuriuose buvo stebimas gana aukštas egt aktyvumas. Norint įsitikinti, kad visus stebimus jun-ginių susidarymo atvejus sąlygoja EGT, kiekvienas subs-tratas taip pat buvo inkubuojamas su terpe, gauta iš neinfekuotų arba infekuotų vEGTZ ląstelių, kurios nesugeba gaminti EGT. Kiekvienu atveju reakcijoje daly-vaudavo 0,05 ĮiCi UDP/U14C/-gliukozės. Visi junginiai, kurie EGT atžvilgiu elgiasi kaip substratai, turi pri-sijungti gliukozę; juos galima nustatyti, kadangi gliu-kožė žymėta radioaktyviais izotopais.
[0090] Substratus inkubuoja esant terpei, gautai iš atitinkamu būdu infekuotų ląstelių ir 0r05 (0,Ci UDP/U14 C/-gliuko-zės. Perneštos gliukozės kiekis apskaičiuojamas iš scinciliacijų skaičiaus nuo atitinkamų chromatografinės plokštelės vietų.
[0091] Norint pademonstruoti, kad šiose reakcijose gliukurono rūgštis nėra pernešama, tolimesnei kontrolei UDP/U14 C/-gliukurono rūgštis buvo įvedinėjama i, reakcijų sistemas su terpėmis, gautomis ląstelių, infekuotų laukinio tipo virusu. Gauti rezultatai pateikti 3 lentelėje. Kaip substratai buvo identifikuoti tik ekdizonas, 20-hidroksiekdizonas ir makisteronas A, visi - ekdisteroidai. Terpėse, gautose iš neinfekuotų arba vEGTZ infekuotų ląstelių, konjugatai neaptikti, o tai patvirtina, kad stebimą aktyvumą apsprendžia egt ekspresija. Naudojant UDP/U14 C/-gliukurono rūgštį, konjugatai nestebimi, o tai rodo, kad gliukurono rūgštis nėra pernešama su EGT pagalba.
[0092] Tam, kad gauti taip pat ir kitų bakulevirusų genų, žymiu mastu homologiškų AcMNPV egt genui, buvimo įrodymą, buvo atskirta OpMNPV DNR ir atskirai paveikta restrikcinėmis endonukleazėmis EcoRI, BamHI ir hind III. Šie fermentai suskaldo virusinę DNR i kelis įvairaus dydžio segmentus, kurių padėtis OpMNPV genome jau yra žinoma (Leisy et al. (1984) J. Virol. 52:699). Po to buvo atlikta hibridizacija pagal Southern'y, pagal būdą, aprašytą T. Maniatis et al. (1982) supra. Pasinaudojant fermentais EcoRI ir Xbal, iš plazmidės BGES buvo išpjautas AcMNPV egt geno vidinis segmentas (žr.
[0093] 1 fig.) . Si, fermentą pažymėjome radioaktyviu izotopu 3 2P ir naudojome kaip bet kurių giminingų sekų OpMNPV genome nustatymo būdą. Aišku, kad atitinkamomis są-lygomis DNR fragmentas prisijungs kitą fragmentą, kurio sudėtyje yra analogiška arba identiška seka. Tuo būdu, ant neiloninės membranos vyksta AcMNPV egt geno-žymės prisijungimas prie bet kokio DNR OpMNPV fragmento, kuriame yra giminingos DNR sekos. Vietoje prijungimo, žymes galima vizualizuoti, panaudojant membranos ekspo-ziciją rentgeno spinduliais. Pradžioje vyksta egt-žymės hibridizacija su neilonine membrana švelniomis sąly-gomis/lM natrio chloridas, 0, 3M natrio citratas, 5% dekstrino sulfato, 5x Denhardt'o tirpalo, 0,25% SDS, esant 37°C/. Tai leidžia žymės hibridizaciją su sąly-ginai tolimomis giminingomis sekomis. Po to palaipsniui griežtina hibridizacijos sąlygas, keliant hibridizacijos temperatūrą, arba i hibridizacijos tirpalą įve-dant formamidą tol, kol neatsiras specifiniai hibri-dizaciniai ryšiai. Hibridizacija, parodyta 4 fig., vyksta šiomis sąlygomis: 1M natrio chloridas, 0,3M natrio citranas, 5% dekstrino sulfatas, 5x Denhardt'o tirpalo 0,25% SDS, temperatūra 68°C, trukmė 15val. Po to membraną du kartus praplauna, kiekvieną kartą po 15 minučių, 0,3M natrio chlorido, 0, 1M natrio citrato ir 0,1% SDS tirpale, esant 68°C temperatūrai. 4 fig. parodyta, kad AcMNPV egt-žymė jungiasi prie tam tikrų OpMNPV DNR, ir būtent, prie EcoRI B fragmento, BamHI A fragmento ir prie Hind III ir S fragmentų. Pažymėtina, kad egt genas OpMNPV genome užima tą pačią sąlyginę vietą, kaip ir AcMNPV genas (5 fig.). Analogiškas raštas yra naudojamas egt-homologiškų genų identifika-cijai kituose entomopatogenuose. Aišku, kad EGT aktyvumo patvirtinimui, esant stipriai besiskiriančioms se-koms, prireiks testavimo metodo, aprašyto IV pavyzdyje. Tada geno, koduojančio EGT fermentą, išskyrimui reikės molekulinės-genetinės analizės, kurios metodologija yra žinoma.
[0094] EGT geno radimui kituose organizmuose naudojamas, skir-tingai nuo aukščiau aprašytojo, specifinis aktyvumo UDP-gliukozil-transferazei testavimo būdas, aprašytas IV pavyzdyje. Šis testas naudojamas enzimo nustatymui valymo standartiniais biocheminiais metodais procese. Po valymo standartiniais biocheminiais metodais, nusta-toma EGT baltymo dalinė aminorūgščių seka. Gautą infor-maciją naudoja oligonukleotidinės žymės sukūrimui, su kurios pagalba po to nustato EGT geno padėti, genome.
[0095] Ekdisteroido titras hemolimfoje keičiasi cikliškai, re-guliuodamas pasikeitimus ir lerva-lerva ir lerva-lelytė, ir kadangi daroma prielaida, kad gliukozės prisijungimas inaktyvuoja ekdist roidus (Warren et al.
[0096] (1986) J.Lią. Chromatogr. 9:1759; Thompson et al.
[0097] (1987) Arch. Insect Biochem. Physiol. 4:1; Thompson et al . (1988) Arch. Insect Biochem. Physiol. 7:157), tai yra įmanomas tarpusavio ryšys tarp vabzdžio normalaus vystymosi proceso pažeidimo ir infekavimo AcMNPV virusu su egt ekspresija. Vystymosi pažeidimą demonstruoja šiuo būdu: tik ką nusinėrusias ketvirto amžiaus S. frugiperda lervas įpurškimo būdu infekavo wtAcMNPV ir vEGTZ virusais ir kasdien stebėjo jų įmanomus vystymosi pakitimus. Neigiamai kontrolei vienai grupei lervų ivedė audinių kultūros skysti,. Eksperimento rezultatai pateikti 4 lentelėje, žiūrėk žemiau. Visos lervos, kurioms buvo įvesta audinių kultūra (netikras infekavimas), nusinėrė, ir kaip buvo laukta, virto penkto amžiaus lervomis. Iš 16 lervų, infekuotų laukinio tipo virusu, panaši transformacija buvo pastebėta tik pas vieną lervą. Priešingai, visos lervos, infekuotos mutantiniu virusu vEGTZ, nusinėrė iš ketvirtos į penktą amžiaus stadiją. Tuo būdu, wtAcMNPV viruso egt geno ekspresija aiškiai ir specifiškai slopina vabz-džio-šeimininko nėrimąsi. Po to abi infekuotos lervų grupės žuvo nuo virusinės infekcijos, kas įrodo, kad VEGTZ viruso egt funkcijos pažeidimas nekliudo jam nužudyti šeimininką.
[0098] Ketvirto amžiaus S. frugiperda lervoms įvedė 1 x 10 "'pfu wtAcMNPV arba vEGTZ 5-se fil. Netikrai infekuotoms lervoms įvedė 5 įj,1 skystos audinio kultūros. Kiekvienoje grupėje buvo po 16 lervų, kurios buvo laikomos šiomis sąlygomis: dirbtinė dieta (R.L. Burton (1969) ARS publication pp. 33-134), 28°C temperatūra, ciklas švie-sa :tamsa=14:10 valandų. Lervos kiekvieną dieną buvo apžiūrimos ar nenusinėrė, ir 7-ą dieną buvo• regist-ruojamas mirtingumas.
[0099] Atlikus viruso injekciją penktos ankstyvosios stadijos lervoms, gauti analogiški rezultatai. Nė viena iš ką tik nusinėrusių penkto amžiaus lervų, infekuotų laukinio tipo virusu, nerodė lėlytės susidarymo požymių, tuo tarpu kai dauguma vEGTZ infekuotų lervų rodė kai kuriuos elgesio nukrypimus (nustojo maitintis, neramumas kokono pynimas), o tai yra artėjančio lervos virtimo lėlyte požymiai. Tačiau visos lervos, kurioms buvo įvesta virusinė infekcija, žuvo iki lėlytės susidarymo. Šie duomenys rodo, kad infekavimas AcMNPV kliudo lervų nėrimuisi ir lėlytės susidarymui. Jie taip pat rodo, kad tokios rūšies vabzdžių vystymosi pažeidimą sąlygoja egt geno ekspresija.
[0100] Laukinio tipo AcMNPV/wt/ ir vEGTZ bisanalizė in vivo išryškino, kad egt geno ekspresija prailgina laiką, kurio metu lerva maitinasi, ir kad egt funkcijos pa-žeidimas gerina viruso, kaip pesticido, charakte-ristiką. Atliekant šiuos tyrimus, S. frugiperda lervoms buvo daromos arba wtAcMNPV, arba vEGTZ injekcijos ankstyvoje 4-je stadijoje. Palyginimui kontrolinėms lervoms buvo įvedama audinio kultūra, kuri neturėjo viruso. Kiekvieną dieną buvo tikrinamas lervų priesvoris, nėrimosi požymiai ir mirtingumas. 6 ir 7 fig., atitinkamai, pateiktas įvairių grupių lervų dienos priesvoris, o taip pat mirtingumo procentas. Kontro-linės grupės lervos per pirmas dvi dienas nuosaikiai augo, o po to nustojo maitintis ir pasiruošė virsti lėlyte. Tik viena iš 16 lervų, infekuotų wtAcMNPV, nusinėrė, vietoje to tris dienas po užkrėtimo lervos nepertraukiamai augo. Šioje stadijoje jos suserga, tačiau iki 5 dienos nė viena lerva nežuvo. 6-ai dienai visos wtAcMNPV infekuotos lervos žuvo. Priešingai, visos vEGTZ infekuotos lervos nusinėrė iš ketvirtos į penktą amžiaus stadiją ir per tą laiką nesimaitino. Tuo paaiškinamas priesvorio nebuvimas nuo 1-os iki 2-os dienos. Po nėrimosi jos vėl pradeda maitintis, tačiau 3-ai dienai joms pradeda reikštis ligos požymiai. Pra-ėjus 4 dienoms po užkrėtimo, jos pradeda mirti ir 5-ai dienai visos žūva. Lervos, infekuotos išvestiniu iš AcMNPV virusu, kuriame nėra funkcinio egt geno, mažiau maitinasi ir žūsta nuo užkrėtimo greičiau, lyginant su lervomis, infekuotomis laukinio tipo AcMNPV.
[0101] Infekavus 5-os amžiaus stadijos lervas, šie reiškiniai stebimi dar aiškiau (8 ir 9 fig.) . Kaip ir tikėtasi, kontrolinės lervos per dvi dienas žymiai išaugo, o po to nustojo maitintis, ruošdamosis lėlytės susidarymui. Nustojimą maitintis lydi staigus svorio sumažėjimas. Lervoms, infekuotoms wtAcMNPV, nepasireiškė maitinimosi nustojimo požymiai; jos toliau maitinosi ir jų svoris didėjo dar dvi dienas, o po to pradėjo reikštis su-sirgimo požymiai. Iki 7-sios dienos po užkrėtimo mirtingumas nebuvo visiškas.
[0102] Galima padaryti šią išvadą. Lervos, infekuotos vEGTZ, kaip ir kontrolinės, maitinasi tik pirmas dvi dienas po užkrėtimo. Po to stebimas ryškus svorio sumažėjimas, kadangi lervos ruošiasi lėlytės susidarymui. Tačiau nė viena lerva nevirsta lėlyte, trečiai dienai stebimi ligos požymiai, o per šešias dienas po užkrėtimo visos jos žūsta.
[0103] Palyginama užkrėtimo vEGTZ ir wtAcMNPV įtaka ką tik išsiritusioms pirmo amžiaus S. frugiperdi lervoms. Ką tik gimusioms S. frugiperdi lervoms duoda maistą, kuriame yra įvairūs kiekiai vEGTZ ir wtAcMNPV poliedrinių įsiterpimo kūnų, ir kiekvieną dieną stebimas jų mirtingumas. 10 ir 11 fig. pateikti rezultatai, gauti naudojant dvi skirtingas dozes. Galima matyti, kad abiem atvejais vEGTZ infekuotoms lervoms mirtis, žymiu mastu, įvyksta daug anksčiau, palyginus su lervomis, infekuotomis laukinio tipo virusu. Bendrai paėmus, lervos, užkrėstos rekombinantiniu virusu, žūsta 3-4 die-nom anksčiau, negu užkrėstos wt-virusu. Šis rezultatas yra papildomas įrodymas to, kad bakulevirusai, turintys inaktyvuotus egt genus, kaip biologiniai pesticidai geriau veikia, negu laukinio tipo bakulevirusai su intaktiniais genais.
[0104] Rekombinantiniu virusų su protorakotropinio hormono (PTTH) ekspresija konstravimui, PTTH geną klonuoja i, perdislokavimo plazmidą pEV mod XIV, kuris aprašytas U.S. Patent application Šeriai No 07/353.847, 1989 gegužės 17d: čia paraiška įtraukta kaip nuoroda. Ši plazmidė turi poliedrino AcMNPV geno, kuris yra ekspre-syvinio PTTH geno rekombinacijos į EGT virusą media-torius, kylančią ir nusileidžiančią sekas. Daugybinio klonavimo saitas prie įprastinio poliedrino transliacijos indukavimo saito, žemyn nuo LS XIV-modifikuoto poliedrino promotorio (Rankin et al. bene 70:39
[0105] (1988)). PTTH Bombix more genas išskiriamas iš pBc22k-C19 plazmidės (Kowakami et al. , Science 247:1333,
[0106] (1990), panaudojant restrikcinį fermentą Hind III. Hind III rišamieji galai yra užpildomi su fago T4 DNR-polimeraze, o po to plazmidę suskaido panaudojant EcoRI. Plazmidę pEV mod XIV suskaldo panaudojant Kpnl, nukarusį Kpnl galą pašalina su fago T4 DNR-polimeraze ir plazmidą suskaido panaudojant EcoRI. Fragmentą, kuriame yra PTTH genas, klonuoja per šiuos saitus į perdislokavimo plazmidą. Gautoje plazmidėje žymimoje pEVPTTH, PTTH genas yra betarpiškai žemiau LSXIV-modifikuoto poliedrino promotorio. Rekombinantinius virusus su PTTH ekspresija gauna per-nešant pEVPTTH i, SF-ląsteles per virusų wtAcMNPV ir EGT E. Rekombinacijos tarp sekų, flankuoj ančių poliedriną virusinėje DNR, ir sekų, flankuoj ančių PTTH geną pEVPTTH plazmide, pasekoje poliedrino genas pakeičiamas PTTH genu. Virusai, kurių genome yra tokia rekom-binancija pagal neigiamą okliuzijos fenotipą (Miller et al., Genetic Engineering, Principles and Methods, vol. 8, J.Setlav and A.Hollaender, eds. , Plenum Press N.Y., 1986, pp. 277-298). Atitinkami rekombinantiniai virusai žymimi vEGTTPTTH ir vwTPTTH.
[0107] Analogišku būdu gaunami rekombinantiniai virusai su juvenylinio hormono esterazės ekspresija. Pradžioje iš-pjauna juvenylinio hormono esterazės geną Helithis virescens Hanzlik et al., (1989) J. Biol. Chem. 264:12119) iš plazmidės pCHEL6B (Hammock et al. (1990) Nature 334:458), panaudojant skaidymą EcoRI ir Kpnl . Perdislokavimo plazmidą pEV mod XIV taip pat atskelia panaudojant EcoRI ir Kpnl ir fragmentą, turinti, juvenylinio hormono, esterazės geną, įterpia tarp šių saitų. Tuo būdu pEVIHE savo sudėtyje turi poliedrino geno sekas, flankuojančias juvenylinio hormono este-razės geną. EGT IHE ir vwTIHE rekombinantiniai virusai gaunami pEVIHE transfekuoj ant, atitinkamai, su vEGTZ arba wtAcMNPV, ir atrenkant ženklelius be įsiterpimo kūnų.
[0108] Rekombinantinių virusų su išsilukštenimo hormono ekspresija konstravimui iš plazmidės pF5-3 išpjauna išsi-lukštenimo hormono Manduca sexta geną (Horodyski et al.
[0109] (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8123), suskaldant EcoRI ir HpaI pagalba. pEV mod XIV suskaido panaudojant Kpnl, laisvą Kpnl galą pašalina panaudojant fago T4 DNR polimerazę, o po to suskaido su EcoRI. Fragmento, turinčio išlukštenimo hormono geną, įterpimas į perdislokavimo plazmidę duoda pEVEH rekombinantą, kuriame išsilukštenimo hormono genas eina žemyn nuo poliedrino LSXIV-modifikavimo promotorio. Šio plazmido kontra-sfekcija su vEGTZ arba vDA26l DNR leidžia išskirti rekombinantinius virusus, atitinkamai, vEGT EH ir vDA26ZEH. vDA26Z yra rekombinantinis virusas su lacZ E. coli geno intarpu DA26 geno viduje (O' Reilly et al. , J. Gen. Virol., in Press). DA26 geno funkcija nėra žinoma, tačiau metamorfozės atžvilgiu pagal fenotipą vDA26Z yra laukinio tipo. Dėl lacZ geno buvimo, vDA26Z išvestinės, esant X-gal, duoda žydrus ženklelius.
[0110] Tam kad in vitro įvertinti tokių rekombinantinių virusų efektą, S. frugiperda lervoms įvedė po 2xl05 pfu vEGTDL, vEGT'PTTH, vwTPTTH virusų, arba tuo pat metu vEGT PTTH ir vEGT IHE (po lxl05 pfu kiekvieno) ; lervos buvo vėlyvoje 3-je amžiaus stadijoje, arba ankstyvoje 4-je. Įvedus visus EGT -virusus, infekuoti vabzdžiai išsinėrė ir pergyveno 4-ą stadiją, ir 3-iai dienai buvo pastebėtas galvos kapsulės nuslydimas, o tai rodo artėjanti, nėrimąsi. Infekavus vien tik vEGT PTTH arba vEGT PTTH kartu su vEGT IHE, vabzdžiai greitai suserga, ir 4-ai dienai stebimas žymus mirtingumas. Priešingai, vabzdžiams infekuotiems vEGTDEL, iki 5-os dienos nebuvo stebimas žymus mirtingumas. Kaip ir buvo tikėtasi, vabzdžiai, infekuoti vwPTTH virusu, niekada nerodo nėrimosi i, 5-ą stadiją požymių. Galvos kapsulės nuslydimas nėra stebimas, ir iki 6-os dienos nebuvo pa-stebėta žymaus mirtingumo. Tuo būdu, PTTH ekspresija, nesant EGT, priartina vabzdžių žuvimą dėl užkrėtimo 1-a diena, lyginant su vEGTDEL infekcija. Šie duomenys iliustruoja bakulevirusų pesticidinių savybių page-rinimą dėka ekspresijos genų, įtakojančių vabzdžių metamorfoze, ir rodo, kad tokios strategijos efektyvumas yra įmanomas tik inaktyvuoj ant egt geną.
[0111] Sudarančių įsiterpimo kūnus virusų su heterologinių baltymų, įtakojančių vabzdžių vystymąsi, ekspresija ge-neravimas gali būti atliekamas pagal šią schemą. Pra-džioje konstruojamas neokliuduoj antis virusas su p-glaktozidazės ekspresija. lacZ geną, koduojanti, fer-mentą p-galaktozę, klonuoja i, perdislokavimo vektorių pSyn VI , aprašytą U.S. Patent Application Šeriai No 07/353.847, 1989m. gegužės 17d. Vektorius pSyn VI savyje turi sekas, esančias genome i, viršų ir i, apačią nuo poliedrinio geno, be to daugybinio klonavimo saitas yra betarpiškai i, apačią nuo sintetinio modifikuoto poliedrino promotorio. lacZ genas nupjaunamas nuo plazmido PSKS105 (Casadaban et al. (1988, supra), suskaldant su PstI. Laisvas PstI galas pašalinamas panaudojant nukleazę numg bean, ir plazmidas suskaidomas su SstlI. pSyn YI suskaido pagal saitus EcoTI ir SstlI ir lacZ geną klonuoja i, tuos saitus. Gautas plazmidas žymimas pSynYI gal, jame lacZ genas yra betarpiškai i, apačią nuo sintetinio modifikuoto poliedrino promotorio. pSynYI gal į SF ląsteles yra pernešami su vEGTDEL viruso DNR, ir yra atskiriami neokliuduoj antys ženkleliai su p-galaktozidazės ekspresija, kurie yra cEGT SynYI virusas.
[0112] Norint sukurti įsiterpimo kūnus sudaranti, rekombinantini, virusą su PTTH ekspresija, PTT geną klonuoja i, perdislokavimo vektorių pSpXIYYI+X3.
[0113] Konstruojant pSpXIYYI+X3, pradžioje padaromas tarpinis pSpXIYYI+plazmidas. Plazmidė pSpLSXIYYI+CAT (aprašytas JAV patento paraiškoje, Ser. No 07/353.847, 1989m. gegužės 17d.) yra pjaunamas pagal BglIII, ir galai yra užpildomi DNR-polimeraze. Plazmidė pSynYI +wtp (aprašy-tas JAV patento paraiškoje, Ser. No 07/353.847, 1989m. gegužės 17d.) yra pjaunamas per EcoRI ir SacI, ir mažą fragmentą EcoRI-SacI nuvalo. Dviejų plazmidžių produktus sujungia ir atrenka pSpXIYYI+. Plazmidė pSpXIYYI+ yra identiškas plazmidei pSpLSXIYYI+CAT, išskyrus tai, kad daugybinio klonavimo saitas tarpe tarp BglIII saito ir SacI saito sutampa su pSynYI+wtp. Daugybinio klonavimo saito v3 (aprašyto JAV patento paraiškoje, Ser. No 07/353.847, 1989m. gegužės 17d.) konstravimui tarp pSpXIYYI+plazmidės saitų EcoRI-SacI įvedimas polilinkeris. pSpXIYYI+X3 daugybinio klonavimo saito seka nuo saito BglIII iki saito SacI yra tokia:
[0114] Šioje plazmidėje yra intaktinis poliedrino genas, kuri, kontroliuoja laukinio tipo poliedrino promotoris. Sin-tetinis modifikuotas poliedrino promotoris yra aukščiau nuo poliedrino jono ir su priešinga orientacija. Daugybinio klonavimo saito padėtis leidžia įterpti genus, kurių ekspresija turėtų vykti kontroliuojant sin-
[0115] tetiniam modifikuotam poliedrino promotoriui. PTTH geną nupjauna nuo pBc22k plazmido (Kawasaki et al., (1990) supra), suskaldant pagal Hind III. Laisvą Hind III galą užpildo fago T4 DNR-polimeraze ir plazmidą skaido pagal EcoRI. pSpXIYYI+X3 skaido pagal EcoRI ir SmaI, ir PTTH geną klonuoja i tuos saitus, kurie duoda pSpPTTH plaz-midę. Šioje plazmidėje PTTH genas yra žemyn nuo sintetinio modifikuoto poliedrino promotorio einančioje atšakoje, tačiau kaimynystėje, jo orientacija ir koduo-jančios sekos yra priešingi laukinio tipo poliedrino promotoriui. Abu genai, PTTH genas ir poliedrino genas, flankuojamų i, AcMNPV genomo poliedrino geno aukštyn ir žemyn einančias sekas.
[0116] pSpPTTH i, SF-ląsteles yra pernešamas su cEGT SynYI gal DNR. Rekombinacijos tarp aukštyn ir žemyn einančiomis poliedrino sekomis virusinėje DNR ir sekomis, flankuo-jančiomis PTTH ir poliedrino genus pSpPTTH, pasekoje lacZECT SynVI gal genas yra pakeičiamas PTTH ir poliedrino genais iš pSpPTTH. Rekombinantinis EGTSpPTTH virusas yra identifikuojamas pagal fenotipą, kuris yra neigiamas pagal [3-galaktozės požymi, ir teigiamas pagal okliuzijos požymi,.
[0117] Konstruojant okliuduo j anti, virusą su juvenylinio hormono esterazės ekspresija, juvenylinio hormono estera-zės geną išpjaudavo iš PHEI6B plazmido (Hammock et al.,
[0118] (1990) supra), suskaldant pagal Kpnl, pašalinant laisvą galą su fago T4 DNR-polimerazės pagalba ir nu-pjaunant pagal EcoRI. Po to juvenylinio hormono este-razės geną klonavo i, pSpXIYYI+X3 plazmidę, kuria skaidė pagal EcoRI ir SmaI. Gauta plazmidė pSpJHE kontrasfe-kuojamas su vEGT^SynYI'gal DNR, gaunamas rekombinantinis virusas vEGT SpJHE. Tokiame okliuduojančiame viruse juvenylinio hormono esterazės ekspresija vyksta kontroliuojant sintetiniam modifikuoto poliedrino promotoriui . Analogišku būdu išpjauna išsilukštenimo hormono geną iš pF 5-3 plazmidės (Horodyski et al. (1990) supra)f per-kertant jį per EcoRI ir HpaI, ir klonuojant i, pSpXIYYI+X3, kuris po to suskaidomas pagal EcoRI ir Smal. Gautos PSpEH plazmidės kontrasfekcijos su vEGT SynYI gal DNR pasekoje gaunamas rekombinantinis virusas vEGT pEH.
[0119] Po to sudarantys įsiterpimo kūnus EGT -virusai yra toliau genetiškai keičiami, sukeliant ekspresiją baltymo, kuris įtakoja vabzdžių metamorfozę (vabzdžių peptidinis hormonas arba fermentas, inaktyvuoj antis vabzdžių hormonus), to pasekoje jie sumažina mitybą ir pagreitina infekuotų vabzdžių lervų mirtį efektyviau, lyginant su laukinio tipo bakulevirusais, arba bakulevirusais, kuriuose genetiniai pakitimai iššaukė tik egt geno inaktyvavimą.
[0120] Kadangi XI pavyzdžio augimo ir vystymosi reguliatoriai sudaro įsiterpimo kūnus, šie virusai gali būti įvedami į efektyvias insektidines, priimtinas žemės ūkiui, kompozicijas, kurias galima užnešti ant infekuotų pa-sėlių. Vabzdžių maitinimosi tokiomis okliuduotomis vi-rusinėmis dalelėmis pasekoje, virusai ir, tuo pačiu, kontroliuojantis agentas pasklis po lauką. Infekcija iššauks vabzdžių žuvimą ir, iš to seka, apsaugos pa-sėlius nuo vabzdįų-kenkėjų.
[0121] Turi būti aišku, kad tai, kas aukščiau parašyta, yra susiję su ypatingais, pirmenybę turinčiais šio išradimo realizavimo pavyzdžiais, ir kad daugybė modifikacijų ir pakeitimų gali atitikti išradimo idėjų ir sritį, kaip tai yra postuluojama pridedamoje išradimo apibrėžtyje.
1. Kovos su vabzdžiais agentas, besiskiriantis tuo, kad jis yra vabzdžių parazitas, kuriame yra inaktyvuotas genas, koduojantis modifikuojanti, ekdiste-roidą fermentą.
2. Agentas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas genas, koduojantis viruso ekdisteroid-UDP-gliukoziltransferazę (egt genas).
3. Agentas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas vabzdžių parazitas yra vabzdžių virusas.
4. Agentas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas vabzdžių virusas yra bakulevirusas.
5. Agentas pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas bakulevirusas yra branduolinės po-liedrozės virusas.
6. Agentas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytą branduolinio poliedrono virusą pasirenka iš grupės, susidedančios iš branduolinio poliedrono viruso Autographa californica ir branduolinio poliedrono viruso Orgyia pseudotsugata.
7. Agentas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas vabzdžių virusas, turintis inak-tyvuotą geną, koduojantį ekdisteroid-UDP-gliukoziltran-sferazę, yra rekombinantinis virusas, kuriame dalis egt geno pašalinta ir pakeista bakteriniu genu lacZ, koduojančiu (3-galaktozidazės susidarymą (vEGTZ), arba rekombinantinis virusas, kuriame pašalinta dalis egt geno (vEGTDEL).
8. Agentas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad vabzdžių papildomai modifikuoja, įterpiant bent vieną heterologini, geną; šis heterologinis genas ekspresuojasi vabzdžių ląstelėse, infekuotose nurodytu virusu, ir koduoja metamorfozę veikianti, baltymą.
9. Agentas pagal 8 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytą heterologini, geną pasirenka iš gru-pės, apimančios baltymus koduojančius genus, kurie yra protoraciklotropinis hormonas, išsilukštenimo hormonas ir juvenylinio hormono esterazė.
10. Agentas pagal 9 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas heterologinis genas yra protoraciklotropinis hormonas.
11. Agentas pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra rekombinantinis virusas su proto-cikotropinio hormono ekspresija (vEGTSpPTTH).
12. Agentas pagal 9 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas heterologinis genas yra išsilukš-tenimo hormonas.
13. Agentas pagal 12 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra rekombinantinis virusas su išsilukš-tenimo hormono ekspresija (vEGTSpEH).
14. Agentas pagal 9 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas heterologinis genas yra juvenylinio hormono esterazė.
15. Agentas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra rekombinantinis virusas su juvenylinio hormono esterazės ekspresija (vEGTSpJHE).
16. Kovos su vabzdžiais pagerinto agento gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad atlieka šias stadij as:(a) geno, kuris koduoja metamorfozę veikianti, baltymą, išskyrimą ir(b) šio geno įvedimą i, organizmą, kuriame natūraliomis sąlygomis nėra šio geno ekspresijos.
(a) geno, kuris koduoja metamorfozę veikianti, baltymą, išskyrimą ir(b) šio geno įvedimą i, organizmą, kuriame natūraliomis sąlygomis nėra šio geno ekspresijos.17. Būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas genas koduoja baltymą iš metamorfozę veikiančių baltymų grupės, apimančios ekdisteroid-UDP-gliukoziltransferazę, protoracikotropini, hormoną, išsi-lukštenimo hormoną ir juvenylinio hormono esterazę.
18. Būdas pagal 17 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas organizmas yra vabzdžių virusas, kuriame nėra egt geno ekspresijos.
19. Būdas pagal 18 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytą geną išskiria iš bakuleviruso.
20. Būdas pagal 19 punktą, besiskiriantis tuo, kad bakulevirusas yra branduolinės poliedrozės virusas.
21. Būdas pagal 20 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytą branduolinės poliedrozės virusą pasirenka iš branduolinės poliedrozės virusų grupės, susidedančios iš branduolinės poliedrozės viruso Autographa californica ir branduolinės poliedrozės viruso Orgyia pseudotsugata.
22. Būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytą organizmą pasirenka iš grupės, ap-imančios vabzdžių parazitus, nefitogenines ant augalų besikolonizuojančias bakterijas, entomopatogeninius grybelius ir augalus.
23. Kovos su vabzdžiais pagerinto agento gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad organizme atlieka geno, koduojančio ekdisteroid-modifikuoj antį fermentą, inaktyvavimo stadiją; šis nurodytas genas yra nurodyto organizmo genomo natūrali dalis.
24. Būdas pagal 23 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas genas koduoja ekdisteroid-UDP-gliu-koziltransferazę.
25. Būdas pagal 24 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas organizmas yra vabzdžių virusas.
26. Būdas pagal 25 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas vabzdžių virusas yra bakulevirusas.
27. Būdas pagal 26 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas bakulevirusas yra branduolinės po-liedrozės virusas.
28. Būdas pagal 23 punktą, besiskiriantis tuo, kad iš nurodyto viruso pasažų serijos vabzdžių ląstelių kultūroje išskiria branduolinės poliedrozės viruso Autographa californica darini, turinti ištry-nimą, kuris inaktyvuoja geną, koduojanti, ekdisteroid-UDP-gliukoziltransferazę.
29. Būdas pagal 27 punktą, besiskiriantis tuo, kad branduolinės poliedrozės virusą pasirenka iš grupės, susidedančios iš branduolinės poliedrozės viruso Autographa californica ir branduolinės poliedrozės viruso Orgyia pseudotsugata.
30. Būdas pagal 29 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas branduolinės poliedrozės virusas yra vEGTZ arba vEGTDEL.
31. Būdas pagal 23 punktą, besiskiriantis tuo, kad papildomai atlieka nurodyto organizmo ge-netinės modifikacijos stadiją, įvedant heterologinį geną, sugebanti ekspresuoti vabzdžio ląstelėje; šis genas koduoja metamorfozę veikiantį baltymą.
32. Būdas pagal 31 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytą antrąjį geną pasirenka iš grupės, susidedančios iš genų, koduojančių protoracikotropinį hormoną, išsilukštenimo hormoną ir juvenylinio hormono esterazę.
33. Kovos su vabzdžiais būdas, besiskiriantis tuo, kad atlieka stadiją, kurioje nurodytas vabzdys paveikiamas kovos su vabzdžiais agentu, kuris genų inžinierijos būdu yra pakeistas taip, kad eks-presuotųsi genas, .koduojantis ekdisteroido modifikavimo fermentą; šis fermentas nepalankiai veikia vabzdį.
34. Kovos su vabzdžiais būdas, besiskiriantis tuo, kad vabzdį paveikia kovos su vabzdžiais agentu, turinčiu geną, koduojantį ekdisteroido modifikavimo fermentą; nurodytas genas yra inaktyvuotas.
35. Būdas pagal 34 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas genas koduoja ekdisteroid-UDP-gliu-koziltransferazę.
36. Būdas pagal 35 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas kovos su vabzdžiais agentas yra vabzdžių virusas.
37. Budas pagal 36 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas vabzdžio virusas yra bakulevirusas.
38. Būdas pagal 37 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas bakulevirusas yra vienas iš bran-duolinės poliedrozės virusų Autographa californica arba Orgyia pseudotsugata.
39. Būdas pagal 38 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas genas yra inaktyvuotas intarpu heterologinio geno, kuris ekspresuojasi nurodytu virusu infekuotoje vabzdžio ląstelėje, o šis heterologinis genas koduoja metamorfozę veikianti, baltymą.
40. Būdas pagal 39 punktą, besiskiriantis tuo, kad geną pasirenka iš grupės genų, koduojančių protoracikotropini, hormoną, išsilukštenimo hormoną ir juvenylinio hormono esterazę.
41. Insekticidinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad i, ją įeina kovos su vabzdžiais agentas ir tinkamas naudoti žemės ūkyje nešiklis, kurioje nurodytas kovos su vabzdžiais agentas yra genetiškai modifikuotas taip, kad natūralioje būsenoje esantis genas, koduojantis ekdisteroid-UDP-gliukoziltransferazę, yra inaktyvuotas .
42. Insekticidinė kompozicija pagal 41 punktą, besiskirianti tuo, kad joje yra kovos su vabz-džiais agentas, papildomai modifikuotas taip, kad ekspresuojasi heterologinis genas, koduojantis metamor-fozę veikianti, baltymą.
43. Agentas pagal 41 ir 42 punktus, besiskiriantis tuo, kad jis yra vabzdžio virusas.
44. Agentas pagal 43 punktą, besiskiriantis tuo, kad vabzdžio virusas yra bakulevirusas
45. Agentas pagal 44 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas bakulevirusas yra branduolinės po-liedrozės virusas.
46. Agentas pagal 45 punktą, besiskiriantis tuo, kad branduolinės poliedrozės virusą pasirenka iš grupės, sudarytos iš Autographa californica ir Orgyia pseudotsugata.
47. Rekombinantinė DNR molekulė, besiskirianti tuo, kad ji turi geno, koduojančio ekdisteroid-UDP-gliukoziltransferazę, seką.
48. Rekombinantinė DNR molekulė pagal 47 punktą, besiskirianti tuo, kad jos nukleotidų seka yra tokia:
49. Vabzdžių virusas, besiskiriantis tuo, kad jis yra gautas būdu pagal 19 punktą.
50. Viruso vEGTZ gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad atlieka šias stadijas:a) plazmidę pUCBCPSB perpjauna restrikcinėmis endonu-kleazėmis Ecol ir Xbal ir valo gautą dideli, fragmentą;b) panaudojant restrikcines endonukleazes EcoRI ir Aha III atskelia lacZ geną nuo pSKS104;c) nurodytą lacZ geną liguoja su nurodytu dideliu (EcoRIXbaI) pUCBCPJB fragmentu po to, kai, panaudojant T4 fago DNR-polimerazę, buvo užpildytas Xbal ir gautas pEGTZ;d) pEGT ir AcMNPV koperneša i, SF-ląsteles;e) identifikuoja virusinius rekombinantus pagal (3-ga-laktozidazės ekspresiją; irf) valo rekombinantini, virusą, kuris yra vEGTZ.
a) plazmidę pUCBCPSB perpjauna restrikcinėmis endonu-kleazėmis Ecol ir Xbal ir valo gautą dideli, fragmentą;b) panaudojant restrikcines endonukleazes EcoRI ir Aha III atskelia lacZ geną nuo pSKS104;c) nurodytą lacZ geną liguoja su nurodytu dideliu (EcoRIXbaI) pUCBCPJB fragmentu po to, kai, panaudojant T4 fago DNR-polimerazę, buvo užpildytas Xbal ir gautas pEGTZ;d) pEGT ir AcMNPV koperneša i, SF-ląsteles;e) identifikuoja virusinius rekombinantus pagal (3-ga-laktozidazės ekspresiją; irf) valo rekombinantini, virusą, kuris yra vEGTZ.51. Viruso vEGTDEL gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad atlieka šias stadijas:a) plazmidę pUCBCPS suskaido, panaudojant restrikcines endonukleazes EcoRI ir Xbal, ir valo gautą didelį fragmentą;b) "užbukina" (a) stadijoje nurodyto didelio DNR fragmento abu galus;c) liguoja (b) stadijoje nurodytą didelį DNR fragmentą;d) pEGTDEL ir vEGTZ koperneša i, SF-ląsteles, kas lei-džia atlikti homologinę rekombinaciją;e) identifikuoja rekombinantini, vEGTDEL pagal tai, kad nevyksta p-galaktozidazės ekspresija;f) valo nurodytą rekombinantini vEGTDEL.
a) plazmidę pUCBCPS suskaido, panaudojant restrikcines endonukleazes EcoRI ir Xbal, ir valo gautą didelį fragmentą;b) "užbukina" (a) stadijoje nurodyto didelio DNR fragmento abu galus;c) liguoja (b) stadijoje nurodytą didelį DNR fragmentą;d) pEGTDEL ir vEGTZ koperneša i, SF-ląsteles, kas lei-džia atlikti homologinę rekombinaciją;e) identifikuoja rekombinantini, vEGTDEL pagal tai, kad nevyksta p-galaktozidazės ekspresija;f) valo nurodytą rekombinantini vEGTDEL. 52. Rekombinantinė ekdisteroid-UDP-gliukoziltransfera-zė, turinti tokią aminorūgščių seką:
53. Išvalyta ekdisteroid-UDP-transferazė, turinti 52 punk-te nurodytą aminorūgščių seką, arba homologišką jai bent 70 %.