[LT] Aprašyti specifinis fermentinio protoporfirinogeno virsmo protoporfirinu inhibitorius ir farmacinė kompozicija pieno liaukos naviko ląstelių numarinimui, apšvitinant tas ląstels šviesa, kuri suaktyvina ten dalyvaujantį tetrapirolą, patobulinant ta prasme, kad minėtas ląsteles veikia junginiu, slopinančiu fermentinį protoporfirinogeno virsmą protoporfirinu IX, veikiant nurodytose ląstelėse protoporfirinogenoksidazei ir tuo pačiu iššaukiant protoporfirino IX susidarymą jose. Be to, aprašytas protoporfirino IX gavimo būdas, auginant eukariotinius mikroorganizmus algae, dalyvaujant protoporfirinogenoksidazės inhibitoriui.
[EN]
[0001] Šis išradimas yra susijęs su specifiniu fermentinio protoporfirinogeno virsmo protoporfirinu IX, veikiant ląstelėse esančiai protoporfirinogenoksidazei, inhibi-toriumi ir jo panaudojimu farmacinėse kompozicijose, skirtose pieno liaukos naviko ląstelių suardymui, diag-nozavimui ir lokalizavimui, bei protoporfirino IX gavimo būdu.
[0002] Gerai žinomas būdas, kai, norint iššaukti ląstelių iri-mą, i, pieno liaukos naviką įvedamas hematoporfirino darinys arba mišinys porfirinų, kurie taip pat yra hematoporfirino dariniai, pavyzdžiui, preparatas "Photofrin II", po to veikiant tam tikro bangos ilgio šviesos spinduliais. Tokiam fotodinaminės terapijos metodui skiriama serija straipsnių, sudarančių specialų žurnalo Photochemistry and Photobiology, 1987, 46 t., Nr. 5 (toliau sutr. P&P 46-5) leidinį. Straipsniuose nurodoma, kad fotodinaminė terapija plačiai taikoma, gydant įvairius vėžinius susirgimus (tame skaičiuje bronchų, šlapimo pūslės, stemplės, plaučių, odos, galvos organų, kaklo, smegenų, storosios žarnos, o t.p. akies vidaus ir ginekologinius vėžinius susirgimus). Tvirtinama, kad minėta porfirininė fotosensibilizacij a yra lydima biocheminių efektų, kaip skersinių proteino ryšių membranose susidarymas, lipidų peroksidinimas, lizosomų ir mitochondrijų apvalkalų skaidymPs, eilės fermentų aktyvumo sumažėjimas ir porfirino įsisavinimo ląstelėmis padidėjimas (P&P 46-5, 695 psl.). Porfi-rininį preparatą, kaip įprasta, įveda injekcijų keliu (pvz., į veną ar pilvo ertmę); tipinė dozė - 2 mg preparato "Photofrin" vienam kūno masės kilogramui.
[0003] Be to, porfirininį preparatą galima įjungti į liposomą ir įvesti injekcijos būdu (pvz., į pilvo ertmę), kaip tai nurodyta straipsnyje Spikes ir kt. " Fotodinaminis porfirinų elgesys modelinėse audinių ląstelių ir navi-kinėse sistemose" (Photodynamic behavior of Porphyrins in Moda Cell, Tissue and Tumour Systems) rinkinyje "Navikų ir kitų susirgimų fotodinaminė terapija (Photodynamic Therapy of Tumour and others Diseases), redaguotame Jori ir Perria: Paduja, leid. Libreria Pogretto, 1985, psl. 45-53, o t.p. ir aukščiau pami-nėtame specialiame leidinyje.
[0004] Specialioje literatūroje kalbama apie tai, kad įvedus protoporfiriną i tokias ląsteles, kaip, pvz., žmogaus kraujo eritrocitai arba leukemija sergančių pelių ląs-telės, pastebimas ryškus fotosensibilizacijos efektas; žiūr.: Dabbleman ir kt. "Biochimica et Biophysica Actą, 1978, 511 t., 141-151 psl.; Kessel, Cancer Research, 1982, 42 t., Nr.5, 1703-1706 psl. Keselio straipsnyje tvirtinama, kad iš visų išbandytų fotosensibilizuo-jančių reagentų protoporfirinas - pats aktyviausias. Tačiau kai Kesselis ir kiti tyrinėtojai, pvz., Berenbaumas su bendradarbiais (žiūr.: Br.C. Cancer, 1982, 45 t., 571-581 psl.) leido porfiriną gyvuliams, pastebimo protoporfirino kiekio navikuose neaptiko, o tai liudija, kad vykstant kraujotakai, įvestas panašiu būdu į organizmą protoporfirinas gali būti greitai iš-neštas .
[0005] Aktyvusis junginys, skirtas naudoti fotodinaminėje terapijoje arba žinomuose navikų diagnozavimo ir lo-kalizavimo metoduose, pagal vieną iš šio išradimo aspektų yra ne porfirinas arba ne tik porfirinas.
[0006] Skirtingai nuo paprasto porfirino, duotasis junginys minėtose ląstelėse duoda impulsą fermentinei protoporfirinogeno hematogenezei, tuo pačiu sužadindamas endo-geninio protoporfirino IX susidarymą ląstelėse. Autoriai nustatė, kad tokie reagentai, kaip kai kurie her-bicidiniai junginiai, stabdantys fermentini porfiri-nogenų perėjimą į chlorofilą augalų ląstelėse, taip pat stabdo ir fermentinį porfirinogeno pasikeitimą pieno liaukos ląstelių struktūroje. Autoriai mano: minėtas šių reagentų slopinantis poveikis, tikriausiai, turi įtakos ir protoporf irinogeno virsmui i, protoporf iriną IX, veikiant fermentui (protoporfirinogenoksidazė, EC 1.2.3.4.) tokiu būdu, kai protoporfirinogenas nebe-virsta protoporfirinu IX normaliu keliu, o vietoj to oksidinasi ląstelių viduje, (pvz., plazmoje) neįprastu fermentiniu procesu (pvz., organelos apvalkalėlyje), ko pasekoje protoporfirinas IX kaupiasi tose srityse, kur jis neprieinamas normaliam virsmui į hemą; veikiant ląsteles šviesa, susikaupęs tokiu būdu protoporfirinas IX sukelia ląstelių irimo efektą, panašų i, tą, kuris buvo stebimas aukščiau aprašytos fotodinaminės terapijos atveju.
[0007] Atitinkantys šiam išradimui aktyvūs junginiai, slopinantys fermentus, yra specifiniai protoporfirinogen-oksidazės inhibitoriai ta prasme, kad jie funkcionuoja ne kaip paprasti fermentų nuodai, panašiai kaip reagentai, iššaukiantys denatūraciją arba tarpgrandininių jungčių susidarymą (pvz., kaip reagentai sulfihidrilo pagrindu) ; jie nėra visų pirma tokiais veikiančiais i, oksidinimo sąlygas preparatais, kaip elektronų akcep-toriai ir, vadinasi, aktyvūs junginiai, atitinkantys šiam išradimui, turi neigiamesni, redoks-potencialą, negu -500 mV ir dar neigiamesni,, būtent, lygų -800 mV, išmatuotą, pvz., tinkamame duotam junginiui tirpiklyje įprastu metodu: ciklinės voltametrijos metodu arba poliarografijos metodu). Vertinga tai, kad aktyvus junginys nėra tetrapirolas, ir kad jo rodiklis I50 protoporfirinogen-oksidazei yra mažiau, nei 1 (iM, pvz., mažiau, nei 0,3 įiM; būtent, I50 apytikriai lygus 0, 1, 0,03 ar 0,01 fiM ar dar mažiau.
[0008] Yra tinkamas toks fermentą slopinantis aktyvus junginys, kuris pasižymi padidintu pajėgumu suardyti augali-nių preparatų plazmalemą ( plasmalemma). Vienas iš tokio pajėgumo tyrimo metodų aprašytas Holingo ir Piterso straipsnyje "Išplovimo eksperimentas" Plant Physiology, 1987, 84 t., 1114-5 psl. Pagal ši tyrimą (smulkiau jis aprašytas A priede) tinkamiausi reagentai rodo bent 50% bendrą išplovimą, esant apdirbimo lygiui 100 (J.M, geriau esant apdirbimo lygiui 1 (J.M ir mažiau, pvz., 100 nM. Labai aktyvių preparatų, kaip 1-(4-chlor-2-fluor-5-pro-pargiloksifenil) - 3-metil-4-dif luormetil-A2-l ,2,4-tria-zolinas-5 arba laktofenas (žiūr. žemiau), bendras iš-plovimo laipsnis viršyja 90%, koncentracija - 100 nM.
[0009] Kita metodika, nustatanti preparato pajėgumą suskaldyti augalinės medžiagos plazmolemą, yra vadinama "Pažalia-vimo, sukelto apšvietimu, slopinimo tyrimai", smulkiai aprašyta žemiau Priede B. Pagal tą metodiką nustato preparato pajėgumą nuslopinti pažaliavimą išblyškusių tamsoje mikroorganizmo kultūrų Clamydomonas rein hardi, y-J (mikroorganizmų algae tipas, kuris auga tamsoje, nesudarydamas chlorofilo). Turima omenyje, kad masė algae išbąla, nes joje yra šviežios, nepažaliavę ląs-telės, bet šviesoje vėl suformuoja chlorofilą. Daugelis tinkamų aktyvių junginių, naudojamų pagal ši išradimą, pajėgūs nuslopinti apšvitinimo sukeltą pažaliavimą bent jau 50%, esant naudojamo junginio koncentracijai 10~5 M, dar geriau 10 6 M ir mažiau, pvz., 10~7 M. Be to, tas junginys gali būti toks, kuris nurodyto tyrimo eigoje sudaro iškylanti, i, paviršių produktą, kurio absorbcijos maksimumas yra ties 405 nm, o tai viršyja maksimumą chlorofilui, kuris duotoje sistemoje yra 669 nm, pvz., iškylantis produktas rodo prie 405 nm maksimumą, kuris 2, 3 ar 4 kartus viršyja maksimumą prie 668 nm.
[0010] Tarp fermentus slopinančių aktyvių junginių, kuriuos galima panaudoti šio išradimo įgyvendinimui, yra kelių tipų (A-D) herbicidai.
[0011] A. Aril-heterocikliniai herbicidai, kurių bendra formulė:
[0012] kur Ph - pakeistas fenilas, geriau 2,4-dipakeistas fenilas, dar geriau 2,4,5-tripakeistas fenilas, o NHet - 5 ar 6-naris heterociklinis žiedas (su 1-4 azoto atomais žiede), kurio formulė:
[0013]
[0014] I junginys - tai herbicidas ariloksidiazolo pagrindu, būtent 2-tret.-butil-4-(2,4-dichlor-5-izopropoksife-nil)- A2-l,3,4-oksidiazolin-5-onas. Kiti 2-alkil-4-(2,4,5-tripakeistas fenil)- A2-l,3,4-oksidiazolin-5-onai, kuriuos galima panaudoti pagal ši, išradimą, charakterizuoti, pvz., JAV patentuose Nr.Nr. 3 385 862, 3 836 539, 3 876 413.
[0015] II junginys - tai herbicidas aril-tetrahidroindazolo pagrindu, būtent 3-chlor-2-(4-chlor-2-fluor-5-izopro-poksifenil)-4,5,6,7-tetrahidro-2H-indazolas.
[0016] III, IV ir V junginiai - tai herbicidai aril-tetrahid-roftalimido pagrindu. Kiti aril-tetrahidroftalimidai, kuriuos galima panaudoti pagal ši, išradimą, charak-terizuojami, pvz., JAV patente Nr. 4 439 229 (nuo 4 psl.
[0017] Kiti tinkami Ph - NHet tipo herbicidai yra: aril-trialinonai, kurie aprašyti JAV patentuose Nr.Nr. 4 318 731, 4 398 943, 4 404 019, 4 702 945, 4 705 557, 4 702 763, 4 761 174, o taip pat tarptautinėse paraiš-kose Nr.Nr. WO 85/01637, WO 85/04307, WO 87/00730, WO 87/03782, WO 86/04481 ir WO 88/01133;
[0018] aril-tetrazolinonai, kurie aprašyti JAV patente Nr. 4 734 124, o t.p. tarptautinėse paraiškose Nr.Nr. W0 85/01939 ir WO 87/03873;
[0019] aril-triazindionai, kurie aprašyti JAV patentuose Nr.Nr. 4 755 217 ir 4 766 233, o t.p. tarptautinėje paraiškoje WO 86/00072;
[0020] aril-hidantoinai, kurie aprašyti JAV patente Nr. 4 427 438;
[0021] aril-urazolai, kurie aprašyti JAV patente Nr. 4 452 981;
[0022] aril-heksahidropiridazinai, kurie aprašyti JAV patente Nr. 4 619 687.
[0023] B. Aril- heterocikliniai uretanai, kurie aprašyti JAV patente Nr. 4 521 242. C. Herbicidai paprasto fenilo eterio pagrindu iš tų, kurie turi para- halogen- arba para- nitro- fenoksifeni-linę struktūrą, būtent, tokie kaip šie prekyboje esantys preparatai: 5-( 2- chloro- 4-( trifluorome- metil 5-( 2, 4- dichlorofe-til) fenoksi)- 2- nitro- N- noksi)- 2- nitrobenzoatas metanesulfonilbenzamidas ( bifenox)
[0024] natrio 5-( 2- chloro- 4-( tri- 2- chlor- l-( 3- etoxy- 4- nit-fluorometil ) fenoksi)- 2- rofenoksi)- 4- trifluorome-nitrobenzoatas ( acifluorfen) til- benzenas ( oxyfluorfen)
[0025]
[0026] Kiti tinkami ir prekyboje esantys herbicidai paprastų difenilinių eterių pagrindu yra šie junginiai: " Laktofen" : 1-( karboetoksi)- etil- 5-( 2- chlor- 4- trifluor-metil- fenoksi)- 2- nitrobenzoatas;
[0027] " Fliuorogliukofen" : ( karboetoksi)- metil- 5-( 2- chlor- 4-trifluormetilfenoksi)- 2- nitrobenzoatas;
[0028] " Fromesofen" : 5-[ 2- chlor- 4-( trifluormetil)- fenoksi] - N-metilsulfonil- 2- nitrobenzamidas;
[0029] " Chloronitrofen" : 2, 4, 6- trichlor-( 4- nitrofenoksi) - benzenas;
[0030] " Chlorodifen" : 2- nitro- l-( 4- nitrofenoksi)- 4- trifluorme-til- benzolas;
[0031] " Nitrofen" : 2, 4- dichlor- l-( 4- nitrofenoksi)- benzenas;
[0032] " Chlometoksifen" : 4-( 2, 4- dichlorfenoksi)- 2- metoksi- l-nitrobenzenas.
[0033] Be to, dar vienu tinkamu paprastu difenilo eteriu yra oksim- O- acetatas 5- ( 2- chlor- 4- trifluormetilfenoksi)- 2-nitroacetofenonas. D. Herbicidai aril- pirazolų pagrindu, kurie aprašyti JAV patentuose Nr. Nr. 4 563 210, 4 496 390 ir 4 459 150, o taip pat Vokietijos paraiškoje Nr. 3 530 327 AI.
[0034]
[0035] kur x - deguonis arba siera, o Ph reikšmė tokia, kokia buvo nurodyta aukščiau; šie junginiai aprašyti Europos patento paraiškoje Nr. 273417, o t. p. kataloge Dervent Abstracts ( žiūr. Nr. 87- 040449).
[0036] Aktyvų jungini, galima vartoti kaip sterilią kompo-ziciją, kuri yra reagentas, ištirpintas arba disper-guotas farmacijoje naudojamoje terpėje, pvz., vandeniniame izotoniniame tirpale, tokiame kaip sūrus vanduo (0,9% NaCl) arba pasūdytas Dulbecco buferinis tirpalas, kurio koncentracija yra 2,5 mg/ml eilės. Arba aktyvus junginys gali būti įjungtas i, tokią liposominę sistemą, kurią galima gauti fosfolipidinėje terpėje, kaip tai aprašyta 1659-1660 psl. žinyne Remington's Pharmacen-tical Science, 17-me firmos "Mack Publishing Co" leidinyje. Pavyzdžiui, analogiškai receptūrai, kurią ap-rašė Jori su bendr. (žiūr.: Br.J. Cancer, 1983, 48 t., 307 psl.), galima ištirpinti 51,6 mg dipalmitoildi-fosfatidilcholino 10-je ml 1 mM reagento tirpalo miši-nyje chloroformo su metilo spiritu (tūriniu santykiu 9:1) su tolimesniu tirpiklio pašalinimu (prieš tai kruopščiai sumaišius) 30°C temperatūroje, vakuume. Re-zultate gaunama kieta medžiaga, kurią vėl galima pervesti į suspenduotą būklę 10-je ml 0,01 M fosfatinio buferinio tirpalo, turinčio 150 mM NaCl, kurio pH=7,4 su tolimesniu drumsto tirpalo apdorojimu ultragarsu 50°C temperatūroje 30 min.
[0037] Fermentus slopinančius reagentus, galima sujungti ar surišti su tinkamais monokloniniais antikūnais, speci-fiškai veikiančiais auglį (MABs) , panaudojant surišimo techniką, gerai žinomą šios srities specialistams, ir reagentas, slopinantis fermentus, pristatomas į konk-retų auglio pažeistą plotelį.
[0038] Pageidautina naudoti tokius fermentus slopinančius reagentus, kaip tirpias vandeny druskas arba rūgštinius junginius, sudarančius tirpias vandeny natrio ar kalio druskas, t.y. tokius, kaip sulfamidas, aprašytas Tarp-tautinėse paraiškose W0 87/037873 (pvz., reagentas 6c žemiau pateiktame 6 pavyzdyje) o t.p. W0 85/001939, WO 87/037873, arba jo vandeny tirpi druska, arba ati-tinkama karboksi rūgštis arba jos vandeny tirpi druska, pvz., natrio druska, žinoma "Acifluorfeno" pavadinimu. Fermentus slopinančius aktyvius junginius, pagal ša, iš-radimą, galima įjungti i, Įprastus farmacijos preparatus, tokius kaip tabletės (pvz., presuotos tabletės, ant kurių užtepta cukraus pasta ir/arba sirupas), žva-kutės, kapsulės (pvz., kietos želatininės kapsulės), suspensijos, tirpalai, milteliai ar ampulės. Tokiuose preparatuose aktyvusis komponentas gali būti mišinyje su farmacijoje vartojamais kietais ar skystais nešik-liais, kurie esant pageidavimui, gali būti maisto pro-duktai. Pavyzdžiui, tai gali būti kietas produktas, kaip kukurūzų krakmolas arba skystas, kaip vanduo, arba maistinis ar mineralinis aliejus, arba tirpiklis: di-metilsulfoksidas ir pan. Galima vartoti fermentus slopinančių aktyvių komponentų mišinius, pvz., aktyvaus komponento 6c, nurodyto 6 pavyzdyje, mišini, su "Acifluorfenu" apytikriai vienodais kiekiais. Skiriamą dozę galima nustatyti įprastu eksperimentiniu keliu, gerai žinomu duotos srities specialistams, pagal eks-perimento, aprašyto preparatui "Fotofrin" (Photophrin), metodiką Daferti straipsnyje "Piktybinių auglių foto-dinaminė terapija (FDT)", žiūr.: CRC Critical Reviews leidinyje Geneology Hematology, 1984, 2 t., 2 leid., 83-116 psl.
[0039] HeLa ląstelės (linija žmogaus navikinių ląstelių, pap-rastai naudojamų navikų tyrimams, išvesta iš kultūrų banko American Type Culture Collection), esančios loga-ritminio augimo fazėje (išaugintos 37°C temperatūroje per 5 paras 1 1 talpos falkoninėse kolbose audinių kul-tūroms) , buvo išplautos buferiniame fosfatiniame druskos tirpale (BFDT). Vėliau prie jų pridėjo 0,25% tripsino tirpalo 2 ml BFDT. Po kelių minučių preparatą atsargiai ištraukė iš kolbos ir patalpino i, stiklinę su 100 ml 25 mM HEPES tirpalo minimalioje pagrindinėje terpėje (MEM), pridėjus prie MEM 10% (svorio, dalys) neaktyvuotos veršelių plazmos, 1,1 ml 200 mM glutamino tirpalo 0,85% druskos tirpale, o t.p. 11.000 vienetų penicilino/11.000 kg streptomicino.
[0040] Gautą ląstelinę kultūrą, vėl pervestą i, suspenduotą būklę, porcijomis po 5 ml patalpino \ 50 ml talpos falkonines kolbas audinių kultūroms ir (išskyrus kontrolini, bandini,), sumaišė su aktyviu junginiu. Nurodytas porcijas 3 paras išlaikė tamsoje, 37°C temperatūroje. Po to audinių kultūras ištraukė ir ekstrahavo žalioje šviesoje tokiu būdu: Nuo kolbos dugno ląsteles pakėlė, pridėdami 0,8 ml 0,25% tripsino tirpalo BFDT. Po 1 vai. trukusio inku-bacinio auginimo tamsoje, ląsteles ir terpę išėmė iš kolbos, patalpino i, apvaliadugni, centrifugavimo mėgin-tuvėlį ir, norėdami suardyti ląsteles ir suteikti gali-mybę ekstrahuoti, atliko du užšaldymo - atšildymo cik-lus. Ląstelių suspensijos tyrimai po šios ardančios operacijos nerodė nesuardytų ląstelių.
[0041] Po to i, kiekvieną mėgintuvėli įpylė po 10 ml šarminio acetono tirpalo (90% acetono: 10% 0,1 N NH4OH) ir centrifugavo, norėdami pašalinti proteiną ir ląstelių gaba-lėlius. Į iškilusią paviršiuje medžiagą pridėjo po 50 ml vandens, o po to - po 0,5 ml sotaus vandeninio NaCl tirpalo. pH reguliavo iki 6,8, įlašindami lašais 2 M KH2P04 tirpalo. Po to užpildė C8 Baker Prop. tipo kolo-nėlę acetono - vandeniniu ekstraktu. Kolonėlę išdžio-vino ir kiekvieną plovė 2 ml vandens. Tetrapirolus išplovė CH40H:H20 mišiniu santykiu 90:10; mišinio tūris 2x1,5 ml. Po to buvo atlikta ekstraktų kiekybinė ana-lizė spektrofluorimetru.
[0042] Nagrinėjamame eksperimente buvo panaudoti šie aktyvus j unginiai: A. 5 - aminolevulino rūgštis, žinoma kaip tarpinis produktas tetrapirolų sintezėje.
[0043] Aktyvus junginys A buvo naudotas kaip sterilizuotas filtravimu 250 mM vandeninis tirpalas (pH=6,5). Aktyvūs junginiai B, C, D ir E (žiūr. formules žemiau) buvo naudoti kaip 50 rnM tirpalai acetone. 1 kontrolini, bandini, taip pat buvo pridėta 0,2% (tūrio dalys) acetono.
[0044]
[0045] E. Herbicidas, kurio formulė:
[0046] HeLa ląsteles logaritminėje augimo fazėje augino 6 paras šešiose 1 1 talpos falkoninėse kolbose audinių kul-tūroms 37°C temperatūroje, po to išplovė buferiniu fos-fatiniu druskos tirpalu (BFDT). Vėliau prie jų pridėjo 0,25%-nio tripsino tirpalo buferyje (BFDT) ir po kele-tos minučių ląsteles atsargiai ištraukė ir patalpino i, stiklinę su 110 ml 25 mM HEPES tirpalo minimalioje pagrindinėje terpėje (MEM), pridėjus 10% (tūrio dalys) neaktyvuotos veršelių plazmos, 1,1 ml 200 mM gliutamino tirpalo 0,85%-niame druskos tirpale, o t.p. 11.000 vie-netų penicilino/11.000 (J.g streptomicino.
[0047] Gautą ląstelinę kultūrą, vėl pervestą i, suspenduotą būklę, porcijomis po 5 ml patalpino i, 50 ml talpos falkonines kolbas audinių kultūroms su herbicidu arba be jo; inkubacinis apdorojimas tamsoje 37°C tempera-tūroje vyko 4 paras, be to, analogiškai 1 pavyzdžiui, herbicidą pridėjo praskiestame acetono tirpale. Acetoną taip pat pylė ir į kontrolinius bandinius, kad acetono koncentracija juose būtų 0,2% (tūrio dalys). Herbicido kiekis buvo toks, kad būtų gaunamos koncentracijos, nurodytos žemiau 2 lentelėje.
[0048]
[0049] Ekstrahavimą vykdė tokiu būdu. Terpę iš kiekvienos kolbos patalpino i, stiklinius apvaliadugnius mėgintuvė-lius, be to, ląsteles, prilipusias prie falkoninių kol-bų dugnų, išlaisvino, pridedant 0,5 ml 0,25% tripsino tirpalo BFDT; išlaikius keletą minučių 37°C temperatū-roje, nurodytą ląstelių kultūrą iš kolbos nupildavo ir sujungdavo su ląstelių terpe.
[0050] Vėliau iš kiekvienos ląstelių suspensijos atskyrė ly-gias porcijas po 100 įiI, norėdami nustatyti ląstelių kultūros tankį. Likę 5,4 ml ląstelių kultūros suspensijos 30 min. buvo apdorojama ultragarsu, norint suardyti ląsteles.
[0051] Po to i, kiekvieną mėgintuvėli, įpylė po 10 ml šarminio acetono tirpalo (90% acetono:10% NH4OH) ir centrifugavo, norėdami pašalinti proteiną ir ląstelių gabalė-lius. Į iškilusią paviršiuje medžiagą pridėjo po 50 ml vandens, o po to - po 0,5 ml sotaus vandeninio NaCl tirpalo. pH reguliavo iki 6,8, įlašindami lašais 2 M KH2P04 tirpalo.
[0052] Produktą ekstrahavo iš terpės vanduo/acetonas, pakrau-dami i, C8 Baker Prop. kolonėlę. Kolonėlę pradžioj džio-vino, o po to plovė 3 ml metilo alkoholio ir vandens (90:10) mišiniu. Analogiškai 1 pavyzdžiui, visos eks-trahavimo operacijos buvo atliekamos tokiose sąlygose, kad protoporfirinas pilnai būtų apsaugotas nuo ji, su-žadinančio šviesos poveikio, t.y. žalioje šviesoje arba tamsoje, pvz., induose su balta danga. Po to nusta-tinėjo ekstraktų fluorescencijos parametrus spektrofluorimetru CPEX.
[0053] Susikaupusio protoporfirino (Proto IX) kiekybinius ro-diklius nustatinėjo, pasitelkdami iš anksto rastus gę-simo koeficientus. Rezultatai pateikti 2 lentelėje.
[0054] Operacijas visose atskyrimo stadijose atlieka esant ap-švietimui, neiššaukiančiam Proto IX sužadinimo, pvz., žalioje šviesoje, kaip tai aprašyta A Priede, pava-dintame " Apdirbimas tamsoje", arba pilnoje tamsoje. Geležies chelatas nejautrus šviesai, taigi, naudojant ši, jungini,, galima dirbti šviesoje.
[0055] Algae mikroorganizmus geriau auginti ląstelių kultūros suspensijos pavidalu 15- 30°C temperatūroje. Aktyvaus junginio - inhibitoriaus koncentracija gali, pvz., būti nuo 10 5 iki 10 7 M. Tinkamų algae mikroorganizmų pa-vyzdžiai: Scenedesmus sp ., Chlamydomonas reinhardi , Englena sp ., Bumilleriopsis filiformis .
[0056] Mikroorganizmo Clamydomonas reinhardi ( laukinė atmaina) kultūras augino nerūdyjančio plieno rezervuare, pvz., 300 1 talpos, naudodami žemiau aprašytą kultivacinę terpę. Į kultūrą pridėjo 1-( karboetoksi)- etil- 5-( 2-chlor- 4- trifluormetilfenoksi)- 2- nitrobenzoato ( taip va-din. " Laktofen", techninis fenileterinis herbicidas) tirpalo acetone, užtikrindami aktyvaus komponento kon-centraciją 10 5 M ir galutinę acetono koncentraciją, lygią 0, 1%. Mikroorganizmų išauginimui mišini, palikdavo ramybėje 4- 7 paroms 25°C temperatūroje, atsargiai me-chaniškai ir/ arba aerodinamiškai pamaišydami. Kaip ir kitas operacijas, rezervuaro turinio filtravimą atlik-davo tamsoje: filtratą analizuodavo, nustatydami jame protoporfiriną IX.
[0057] Vienas iš protoporfirino IX nustatymo analizės metodų susideda iš reakcijos rezervuaro turinio (visą laiką esančio tamsoje) filtravimo ir acetono pridėjimo i, filtratą. Vėliau ši, mišini, ekstrahavo petrolio eteriu. Po to vandens-acetono terpę ekstrahavo dietilo eteriu, kuri, iš nuosėdų pašalindavo garinimu. Tas nuosėdas tirpino metilo alkoholyje, ir protoporfirino IX nu-statymui panaudojo atvirkštinės fazės chromatografiją. Be to, galima panaudoti ir duoto junginio nustatymo metodiką, aprašytą 1 ir 2 pavyzdžiuose.
[0058]
[0059] Mišinio koncentratas, turintis metalų pėdsakus:
[0060] Kaip alternatyva mikroorganizmų Clamydomonas reinhardi pritaikymui yra pritaikymas kultūros Sendesmus sp., išaugintos aukščiau nurodytoje terpėje, kur natrio acetatas pakeistas gliukoze.
[0061] Šis pavyzdys analogiškas 3 pavyzdžiui, išskyrus tai, kad vietoje "Laktofeno" naudojamas 1-(4-chlor-2-fluor-55-propargiloksifenil)-3-metil-4-difluormetil-A 2-1,1,4-triazolin-5-nas.
[0062] Preparato Proto IX tiekėjas buvo firma "Porphyrin Products" iš Logeno miesto, Jutos štato, JAV. Ši, prepa-ratą išskyrė gryname pavidale ir aprašė Fuesleris su bendradarbiais (T.P. Fuesler et all.: Plant Physiol., 1981, 67 t., 246-249 psl.). Šviežią Protogeną IX gaudavo, redukuodami Proto IX, panaudojant Na/H amalgamas, kaip tai aprašė Jacobs ir Jacobs (N.J. Jacobs and J.M. Jacobs: Enzyme, 1982, 28 t., 206-219 psl.), dirbę su 300 įiM koncentracijos išgrynintu Proto IX.
[0063] Agurkų daigus ( Cacumis sativus L., Wiskonsin SMR 18) augino užtemdytoje daiginimo kameroje vermikulite, su-drėkintame skystomis firminėmis trąšomis (9-45-15). Daigus augino 25°C temperatūroje, esant santykiniam oro drėgnumui 80-90%. Daigus apšviesdavo dozuoto intensy-vumo 25 |iE/m trūkčiojančia šviesa su (PAR) , naudodami firmos "General Electric" šviesos šaltini, Bright Stiek, valdomą elektroniniu taimeriu, per 60 min. ciklą ap-šviečiant daigus 1 min. Tokiu būdu buvo gautas augali-nis audinys, sugebantis pagreitintai sintetinti chloro-filą, suvedant iki minimumo rezervinio krakmolo kieki, ir pradinio chlorofilo lygį.
[0064] Išsiskiriantys chloroplastai buvo izoliuojami pagal me-todą, kuri, aprašė T. P. Fuesleris su bendradarbiais ( žiūr. : Plant Physiol., 1984, 75 t., 662- 664 psl.) iš-skyrus tai, kad galutinėje valymo stadijoje plasticidus centrifugavo per 40% ( tūr. dalys), o ne per 45% įdėklą iš Perco II medžiagos. Po to chloroplastai vėl buvo pervedami i, koloidinę būklę buferiniame tirpale, tu-rinčiame 0, 5 M manitolo, 20 įj M TES', 10 įi M HEPES, 1 | iM etilendiarnintetraacto rūgšties, 1 fiM MgCl, 1% ( ma-sės/ tūrio) jaučio serumo albumino ir 1 | iM ditioeritritolo, esant pH=7, 7 ir galutiniam proteino kiekiui 2 mg/ l.
[0065] Bandiniai buvo paruošti taip, kaip tai aprašė Jacobs ir Jacobs ( J. M. Jacobs and N. J. Jacobs: Arch. Biochem. Biophys. 1984, 229 t., 312- 319 psl.). Chloroplastų suspensijos pavyzdžiai ( po 0, 2 ml) buvo preliminariai 15 min. apdoroti tamsoje, esant skirtingoms acifluorfen- metilo ( AFM) koncentracijoms arba, kontrolinio ban-dinio atveju, esant acetono koncentracijai 0, 2% ( tūrio dalys) . Po to 50 p. 1 šviežiai paruošto apie 15 nM kone. preparato " Protogen" įpylė i, suspensiją, kad prasidėtų reakcija. Bandinių paruošimas baigėsi tuo, kad buvo įvesta 2, 75 ml fluorometrinės medžiagos, kurią pasiūlė Jacobs ir Jacobs ( J. M. Jacobs and N. J. Jacobs: Enzyme 1982, 28 t., 206- 219 psl., susidedančios iš 1% ( tūrio dalys) tvin- 20 ( polioksietilensorbitano monolauratas), 50 mM tris-HCl ir 1 mM etilendiamintetraacto rūgšties pH=8,5, be to, 1 mM ditioeritritolo buvo pakeista 5 mM gliutationo. Po to suspensiją analizavo tiesioginio skaitymo metodu spektrofluorimetru SPEX Fluorog-2, ap-rūpintu fluorescencijos indikatoriumi drumstiems biolo-giniams pavyzdžiams. Susidariusio Proto IX kieki, nu-statinėjo pagal priklausomybės tarp kiekybinės Proto IX emisijos prie 630 nm ir sužadinimo prie 400 nm grafiko standartinę kreivę, beje, ši kreivė buvo gauta grynam Proto IX fluorometrinėj e terpėje.
[0066] Norėdami kiekybiškai nustatyti nefermentinio oksidinimo iki Proto IX laipsni aukščiau aprašytame bandinyje, pa-ruošė toki, pat bandini, išskyrus tai, kad vietoj ak-tyvių chloroplastų suspensijos panaudojo suspensiją, kurioje chloroplastai buvo pervesti i neaktyvią būklę, 15 min. šildant 85°C temperatūroje. Atskaičius Proto IX kieki, gautą tokiu būdu, iš jo kiekio, gauto dalyvaujant aktyviems chloroplastams kaip tik ir gauname Proto IX kieki, susidariusį fermentiniu keliu. Rezultatai grafiškai pavaizduoti Fig. 1, kur LSD - mažiausia skirtumo reikšmė (bendrai priimtas žymėjimas).
[0067] Fig. 1 matome, kad rodiklis I50 (koncentracija, užtik-rinanti 50%-ni, slopinimą) sudaro mažiau nei 0,1 fxM, pvz., apie 0,03 M.
[0068] Bandymas, kaip veikia 10 įiM AFM i fermentini Proto IX virsmą magneziniu Proto IX chloroplasto suspensijoje (dalyvaujant ATP), neparodė jokio slopinančio AFM poveikio i ši virsmą.
[0069] Pagal ši pavyzdi fermentus slopinantys aktyvūs kompo-nentai buvo pridėti i maistą pelių, kurios yra navikų nešiotojos, tuo tarpu i kelių kontrolinių pelių maistą jokių preparatų nepridėjo. Po to peles numarindavo, iš-imdavo inkstus, žarnyną, antinksčius, kepenis, navikus ir analizuodavo juos, nustatydami Proto IX kieki,. Buvo panaudoti šie fermentus slopinantys aktyvūs junginiai:
[0070] Bandymams buvo panaudojamos DBA/2 Ha linijos pelės, kurioms nulinę dieną i, dešini, peti, suleisdavo poodini, navikini, preparatą SMT-F. Pirmą dieną po to pelės gaudavo specialų maistą graužikams: Purina Rodent Chow 5001 Mash be priedų. Toliau 2-10 parų pelės gaudavo tą pati, maistą su tiriamo fermentus slopinančio aktyvaus junginio 2 promilių priedu (kontrolinės pelės gaudavo tą pati, maistą, bet be priedų) . Priedą įvesdavo i, maistą, įmaišydami nedideli, kieki, tiriamo aktyvaus junginio tirpalo acetone. Dešimtą parą peles numarindavo, išskyrus pelę, paveiktą aktyviu junginiu, pažymėtu 6j : šią pelę numarindavo jau septintą parą. Gyvulėlių audinius palikdavo nakčiai 4°C temperatūroje, kad at-šaltų, po to drėgmę pašalindavo sugeriamuoju popieriumi ir nustatydavo kiekvieno audinio pavyzdžio masę. Vėliau iš audinių ruošė homogeninę suspensiją 5-se ml (žarnyno ir kepenų audiniams - 10 ml) acetono ir 0,1 N NH4OH mišinyje, kur tūrinis jų santykis 9:1. Po to homo-geniniai preparatai buvo centrifuguojami, esant 1500 g, ir išplautos i, paviršių medžiagos buvo analizuojamos SPEX FA112 spektrofluorometru. Proto IX optimalūs yra sužadinimas prie 400 nm ir emisija esant bangos ilgiui 630 nm. Proto IX susikaupimą nustatinėjo pagal fluores-centini, blykstelėjimų skaičių 1 g audinio per sekundę. Rezultatai pateikiami žemiau 3 lentelėje (kiekvienam preparatui reikšmės yra vidutinės pelių porai, išskyrus bandymus su aktyviais junginiais 6f, 6h, 6i ir 6j, kai bandymams ėmė tik vieną pelę.
[0071] Pelės suėsdavo tokius maisto su aktyviu junginiu kiekius: 6a) 22 ir 35 g; 6b) 37 ir 35 g; 6c) 25 ir 22 g;
[0072] 6d) 41 ir 32 g; 6e) 40 ir 44 g; 6f) 27 g; 6g) 33 ir 40 g; 6h) 36 g; 6i) lOg; 6j) 20 g.
[0073] Vykdant eksperimentus, aprašytus 6 pavyzdyje, su gyvū-nėliais, nesančiais navikų nešiotojais, buvo naudojamas aktyvus junginys (jeigu nenurodyta kitaip), kuris šiame pavyzdyje pažymėtas 6c, ir operacijų seka buvo tokia: a) nustatant aktyvaus junginio rodikli, LD50 jis pasi-rodė besąs virš 2600 mg/kg (t.y., mg aktyvaus junginio 1 kg kūno masės) žiurkėms, kai tą rodikli, nustatinėjo po 14 dienų, vieną kartą gyvūnams suėdus porciją kuku-rūzų aliejaus su 15% aktyvaus junginio ir virš 700 mg/kg pelėms, kai tą rodiklį nustatinėjo po 14 dienų, vieną kartą gyvūnams suėdus to paties aliejaus su 5% aktyvaus junginio. b) Tiriant sąstatus be aktyvaus junginio, skirtus in-jekcijoms i, pilvo ertmę, buvo aptikta, kad pelės gali atlaikyti 0,5 ml dozės injekcijas mišinio iš lygių da-lių dimetilsulfoksido ir vandens. c) Bandant aktyvų jungini,, įvedama injekcija i, pilvo ertmę mišinyje iš 60% kukurūzų aliejaus ir 40% dimetilsulfoksido buvo nustatyta, kad pelės gali atlaikyti dozę 100 mg/kg.
[0074] 1) per 8 dienas kasdien sumaitinama dozė 50 mg/kg (naudojant 1% aktyvaus junginio acetone tirpalą), 2) per 8 dienas kasdien suleidžiama i, pilvo ertmę 50 mg/kg dozė 1%-nės aktyvaus junginio mineraliniame aliejuje dispersijos, paruoštos tirpinant aktyvų jungini, dimetilsulfoksido laše ir sumaišant gautą tirpalą su mine-raliniu aliejumi, 3) per 8 dienas kasdien užtepama ant odos 50 mg/kg 1% dimetilsulfoksido tirpalo dozė, 4) per 8 dienas maitinama standartiniu maistu, pridėjus
[0075] 5) per 4 dienas kasdien suleidžiama i, veną 50 mg/kg 2%-nio dimetilsulfoksido dozė.
[0076] Po to peles, su kuriomis atlikti eksperimentai, numarindavo ir nustatydavo Proto IX susikaupimą jų audiniuose .
[0077] Kitame eksperimente Fisher 344 linijos žiurkės patinėlį per 24 dienas šėrė maistu su 5 promilėm aktyvaus junginio 6c, po to gyvūną numarindavo. Tos žiurkės audiniuose buvo pastebėti padidinti Proto IX kiekio lygiai, palyginus su kontroliniu gyviu, beje, žymesnis lygių padidėjimas buvo inkstų, žarnyno, skrandžio ir galvos smegenų audiniuose, tuo tarpu raumenų audiniuose "pa-stebėtas tik nežymus lygio pakilimas.
[0078] Visuose aukščiau aprašytuose eksperimentuose žiurkės ir pelės buvo laikomos standartiniame apšvietimo režime: 12 vai. šviesoje ir 12 vai. tamsoje.
[0079] Atliekant seriją eksperimentų pagal 1 ir 2 pavyzdžius, HeLa kultūros ląsteles inkubavo, dalyvaujant žemiau iš-vardintiems 100 |aM koncentracijos įvairiems vaistiniams aktyviems junginiams. Rodikliai %-tais, kurie pateikiami po kiekvieno vaistinio aktyvaus junginio žymė-jimo, rodo, kad dalyvaujant duotam vaistiniam aktyviam junginiui, susidariusio Proto IX kiekis padidėja, lygi-nant su tuo kiekiu, kuris susidaro to paties ekspe-rimento kontroliniame pavyzdyje.
[0080] 6-me pavyzdyje panaudoti aktyvus junginiai turi tokias reikšmes: 6a) 337%; 6b) 336%; 6c) 297%; 6d) 1200%; 6e) 1210%; 6f) 280%; 6g) 326%; 6h) 431%; 6i) 544%; 6j) 469%; kitų aktyvių junginių formulės ir atitinkamos procentinės reikšmės tiems junginiams pateiktos žemiau,
[0081] Šiame pavyzdyje fermentus slopinanti, aktyvų jungini, 6c iš 6 pavyzdžio sumaitino žiurkėms su įskiepytu naviku, po to navikinę zoną apšvitino šviesa, tuo būdu iššauk-dami naviko rezorbciją.
[0082] Būtent, trims Sprague Dawley linijos žiurkėms, kurių masė vidutiniškai po 120 g, 6 dienų periodui buvo pa-skirtas maisto racionas su 2 promilių aktyvaus junginio priedu. Trečią parą ant kiekvienos žiurkės dešinės užpakalinės kojos implantavo chondrosarkomą, įleisdami 0,3 ml navikinių ląstelių suspensijos (1 milijonas na-vikinių ląstelių). Šeštą parą nuskuto kiekvienos žiur-kės dešinės užpakalinės kojos plaukų dangą ir matavo kiekvieno naviko dydi,. Toliau naviko pažeistą sriti, ir aplinkinę odą švitino nešiluminėmis dozėmis šviesos, kurios bangos ilgis 630 nm, energijos srovės tankis 270 Dž/cm. Kitą dieną pasirodė, kad 2 žiurkės žymiu laipsniu išsigelbėjo nuo savo navikų (t.y., naviko masė daugiau neapčiuopiama), o trečios žiurkės navikas be-veik rezorbavosi. Visoms žiurkėms oda apie navikus ir raumenų ląstelės truputi, pabąlo ir atrodė lyg patinę, bet žymiai mažiau, negu tai būna naudojant preparatą Photofrin II fotodinaminėje terapijoje.
[0083] Bandymas nustatyti išplovimo procentini, rodikli
[0084] Bandymo eigoje, nustatant išplovimo procentini rodikli, naudojo sėklaskiltes, surinktas iš tamsoje sudaigintų agurkų daigų. Pirmoje stadijoje sėklaskilčių masę apdorojo tamsoje vandeniniu tirpalu (dalyvaujant buferiniam junginiui), turinčiu cukrų su radioaktyviais žy-mėtaisiais atomais. Po to matavo cukraus, kuri, įsisa-vino sėklaskiltes, kieki, pagal žemiau aprašytą skai-čiavimo metodiką. Visą sėklaskilčių masę dalino i, dvi porcijas. Vieną iš tų porcijų apdorojo tamsoje vandeniniu tirpalu (dalyvaujant buferiniam junginiui), ku-riame yra tiriamas junginys, o kitą lygiai taip pat apdorojo tamsoje tuo pačiu tirpalu, tik be tiriamojo junginio (kontrolinis bandinys) . Pamerktos i, nurodytus vandeninius tirpalus sėklaskiltes 16 vai. buvo švi-tinamos šviesa, po to jas atskyrė nuo vandeninių tir-palų, kuriuose matavimo ir skaičiavimo metodu nusta-tinėjo medžiagos su radioaktyviais žymėtaisiais atomais kiekius. Gauti rezultatai buvo po to pateikti kaip išplovimo procentinis rodiklis (IPR) , paskaičiuojamas pagal formulę:
[0085] kur S, ST ir Sc - atitinkamai medžiagos su radioaktyviais žymėtaisiais atomais skilimų skaičiai (vienai sėklaskiltei) :
[0086] a) toje medžiagoje, kurią įsisavino sėklaskiltes jų pradinio apdirbimo metu, b) vandeniniame tiriamojo junginio tirpale po švitinimo ir c) kontroliniame vandeniniame tirpale po švitinimo.
[0087] Panaudotos medžiagos, o t.p. bandymo sąlygos, nustatant IPR, detaliau charakterizuojamos toliau.
[0088] Vermikulite, sudrėkintame prekyboje turimomis trąšomis 9-45-15, buvo sudaigintos agurkų sėklos Cocumis Salivus L., rūšis Wisconsin SMR, iš kurių inkubacinėje kameroje 25°C temperatūroje, esant santykiniam oro drėgnumui 80-90% tamsoje išaugino daigus. Po 5 parų nuo pasėjimo momento iš po blyškių, tamsoje išaugusių daigų ūglių surinko sėklaskiltes ir išplovė jas 1,0 mM CaCl2 tirpale. Visas tas operacijas atliko žalioje šviesoje.
[0089] Tirpale yra 1 mM KC1, 1 mM CaCl2, 2,0 mM kalio fosfato; jo pH sureguliuotas iki 6,5 (kaip ir naudojant NaOH).
[0090] Ta cukraus rūšis yra 3-0-metil-3[ 11-14C] -gliukozė su specifiniu aktyvumu 10,9 GBk/mM; tiekėjas: firma "Amersham Corp." Arlingtono miestas, Ilinoiso valstija, JAV.
[0091] 180-230 vienetų išplautų sėklaskilčių supylė i, plačia-gurklę 250 ml talpos Erlenmėjerio kolbą su putų poliuretano kamščiu, d, kurią įpilta 50 ml buferinio tirpalo ir įdėta cukraus su radioaktyviais žymėtaisiais atomais toks kiekis, kad jo koncentracija tirpale būtų 600 nM. Tamsoje ant besisukančio įrenginio 24 vai. bėgyje kolbą kratė 125 min."1 dažniu. Po to sėkla-skiltes iškrovė ant neiloninio tinklo ir 3 kartus plovė 1 mM CaCl2, tirpalo porcijomis, kurių kiekviena - 20 ml. Cukraus su radioaktyviais žymėtaisiais atomais įsisa-
[0092] vinimą nustatinėjo, ištirpindami 3 pavyzdžius, kurių kiekviename buvo po 5 sėklaskiltes, audinių tirpiklyje (markė NCS, firmos "Amersham Corp." gamyba) ir sumarinį suvartojimą paskaičiuodavo skysčio scintiliacijos spek-trometre .
[0093] Buvo nustatyta, kad suvartojimo nustatymo eksperimentas ekvivalentiškas analogiškiems nustatymams, sudeginant atrinktus sėklaskilčių bandinius savireduktoriuj e.
[0094] Apdirbimas panaudojant tiriamą jungini,, o taip pat kontrolinis apdirbimas
[0095] Penkias sėklaskiltes paliko plaukioti 3 ml buferinio tirpalo, įpilto i, 35 mm diametro plastmasinę Petri lėkštelę su dangteliu, paviršiuje. Po to ten įpylė tokį tiriamo junginio (jo tirpalo acetone) kiekį, kad būtų užtikrinta reikiama (apie kurią buvo pasakyta aukščiau) tiriamo junginio koncentracija buferiniame tirpale. Acetono kiekis buferiniame tirpale sudarė 0,1% (tūrio dalys) kaip kontroliniame bandinyje, taip ir tirpale su tiriamu junginiu. Plaukiančios sėklaskiltes 16 vai. su-kosi ratu verpete, kuris susidarė kratant lėkšteles 90 min.-1 dažniu besisukančio kratančio įrenginio pa-viršiuj e.
[0096] Petri lėkšteles su sėklaskiltėmis, plaukiančiomis tir-palų paviršiuje, 16 vai. švitino keturių fluorescen-tinių lempų GE F20T12-CW šviesa, esant duotam inten-syvumui 150 (iE/m spektrinėje fotosintezės srityje (SFSS), be to, minėtą intensyvumą matavo sėklaskilčių paviršiuje, kai lėkštelės tuo metu buvo nenutrūkstamai kratomos.
[0097] Skystyje esančios medžiagos su radioaktyviaisiais žymė-taisiais atomais kiekio matavimas
[0098] Visą skystį atskyrė nuo sėklaskilčių; skysčių scintiliacijos spektrometru nustatinėjo skilimų skaičių.
[0099] Iki švitinimo šviesa stadijos, visas kitas apdorojimas buvo atliekamas žalioje šviesoje, kurią skleidė fluo-rescentinis šaltinis, t. y. šviesoje, praėjusioje per žalią atskirianti, plastmasini, šviesos filtrą, pralei-džianti, 450- 600 nm bangos ilgio šviesą.
[0100] 5 lentelė
[0101] M terpė
[0102]
[0103] Mišinio, turinčio metalų pėdsakus, koncentratas
[0104] A terpę kulturoms ruošė, pridėdami i, M terpę 10 ml/ 1 10% vandeninio natrio acetato tirpalo ( koncentracija 7 , 5x10~ 3 M) .
[0105] Visus komponentus pylė į distiliuotą vandeni, aukščiau nurodyta tvarka, po to juos 15 min. apdorojo autoklave 1, 05 kg/ cm slėgyje.
[0106] Konservuoto preparato kultūrų auginimui šviesos po-veikyje atsarga
[0107] Užkonservuotas y- I kultūras akseniškai pervesdavo i, skystas kultūras A arba M terpėje, geriau A terpėje, Erlenmejerio kolbose, uždarytose poliuretano kamščiais, 25°C temperatūroje tokio ciklo sąlygomis: 14 vai. ap-švietimo ir 10 vai. tamsos. Konservuotas kultūras in-kubuodavo ( be papildomo aeravimo) ant besisukančio kratančio įrenginio, dirbančio 125 min 1 dažniu. Ap-švietimo intensyvumas kultūros sluoksnio lygyje sudaro 120 | j. E/ kv. m. s ( SOFS) . Tokiose sąlygose kultūros yra pusiausinchroninio augimo režime iki tol, kol jos ne-pereina i, stacionarinę fazę, turinčią ( 2- 4) xl0 ląstelių viename ml.
[0108] Kultūrų auginimas be šviesos ( kultūros, auginamos tamsoje)
[0109] 7, 5 ml šviesoje išaugintų ląstelių, esančių stacio-narinėje kultivavimo fazėje iš konservuotos kultūros, pernešė į Erlenmejerio kolbą su 750 ml A terpės. 3- 4 paras ląsteles inkubavo tamsoje, aeruodami per įgilintą aeracinį vamzdį 25°C temperatūroje. Per tą laiką turėjo įvykti 7- 8 ląstelių y- I kultūros skilimai, netenkant viso matomo chlorofilo ir esant ląstelių koncentracij ai ( 2- 3) xl0 vnt./ ml.
[0110] Ląsteles išskirdavo iš 750 ml šviežiai paruoštos, tamsoje išaugintos kultūros, centrifuguodami apie 5 min. 20°C temperatūroje prie mažų apsisukimų (apie 2000 min *) . Tas ląsteles atsargiai vėl pervesdavo i, suspenduotą būklę 50 ml A terpės. To suspensijos bandinyje (0,25 ml) nustatinėjo ląstelių judrumą, o užfiksavę 1%-niu vandeniniu gliceraldehido tirpalu - skaičiavo ląstelių kieki, 1-me ml. Dažniausiai ląstelių skaičius būna 5xl07 vnt./ml. Ląstelių kultūrų porcijas po 1 ml, tu-rinčias po 10 vnt. ląstelių, patalpina i, indus bandymams, pvz., i, falkonines lėkšteles, skirtas audinių kultūroms, su 24 duobutėmis. Šioje stadijoje ląstelės yra nusidažiusios geltona spalva ir yra labai judrios.
[0111] Tiriamą jungini, tirpino tinkamame tirpiklyje, pvz., acetone, etilo spirite, dimetilsulfokside ar vandenyje (geriausia - acetone), kad gaunama koncentracija 1000 kartų viršytų galutinę. Penkių ar dešimties įj.1 mikro-švirkšto pagalba i, kiekvieną duobučių porą įleisdavo po 1 jai minėto tiriamo tirpalo. Ant kiekvienos lėkštelės analogiškai ruošė 4 kontrolines duobutes be tiriamo junginio. Lėkšteles audinių kultūroms uždengdavo per-matomais plastmasiniais dangteliais ir 13-16 vai. augino kameroje 25°C temperatūroje, esant apšvietimui 70-90 |xE/kv.m.s. Jei duobučių turinys geltonavo, tai ji, išimdavo taip, kaip tai aprašyta žemiau punkte "Re-zultatų įvertinimas". Jeigu gi bandomųjų duobučių turinys pasirodė permatomas ar blyškiai-žalsvas, tai prieš ji, išimant talpino ant besisukančio kratančio įrenginio, dirbančio 125 min 1 dažniu ir 2 vai. švitino šviesa, kurios intensyvumas apie 600 p.E/kv.m.s.
[0112] Į kiekvieną bandomąją duobutę pildavo 250 Įil 10% vandeninio natrio dodecilsulfato tirpalo ir 1 ml metilo spirito, po to duobutės turini, rūpestingai permai-šydavo. Gautus mišinius laikė tamsoje 3-4 vai. Lėkš-teles su augalinėm kultūrom 5 min kambario tempera-tūroje apdorojo centrifūgoje su mažais apsisukimais (apie 2000 min x) . Išplaukiančią i paviršių medžiagą nuimdavo ir analizuodavo 35 modelio Bekmano (Beckman) spektrofotometru bangos ilgio intervale 350-800 nm (nustatant protoporfiriną IX, kuriam sistemoje su minėtu tirpalu charakteringas chlorofilo sugėrimo pikas ties 668 nm) , o t.p. ties 720 nm, panaudojant drumstumo fo-nini, rodikli,.
[0113] Duomenų analizė
[0114] Pažaliavimo rodikli, kiekvienai duobutei gaudavo, iš-skaičiuodami iš reikšmės, gautos ties 668 nm reikšmę, gautą ties 720 nm. Atitinkami dydžiai yra vidutiniai kiekvienai tiriamojo junginio koncentracijai, o t.p. kontroliniam bandymui. Procentini, slopinimo rodikli, nustato pagal formulę:
[0115] k - vidutinės pažaliavimo rodiklio reikšmės kiekvienai konkrečiai koncentracijai santykis su kontrolinio ban-dinio vidutine pažaliavimo rodiklio reikšme.
1. Specifinis fermentinio protoporfirinogeno virsmo protoporfirinu IX, veikiant protoporfirinogenoksidazei pieno liaukos naviko ląstelėse, inhibitorius, tuo pačiu iššaukiantis protoporfirino IX susidarymą tose ląs-telėse, besiskiriantis tuo, kad jis nėra tetrapirolo darinys, o yra aril- heterociklinis junginys, kurio formulėPh- NHet,kurioje Ph - pakeistas fenilas, o N- Het - 5- ar 6- naris heterociklinis žiedas, kurio formulė:
2. Inhibitorius pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėto junginio I50 protoporfirinogenoksidazei yra mažiau už 1 fj. M.
3. Inhibitorius pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad jo redoks-potencialas yra nei-giamesnis už -500 mV.
4. Inhibitorius pagal bet kurį iš 1-3 punktų, besiskiriantis tuo, kad jis yra 1-(4-chlor-2-fluor-5-propargiloksifenil)-3-metil-4-difluormetil-A2-l,2,4-triazolin-5-as.
5. Inhibitorius pagal 1-4 punktus, skirtas pieno liaukos naviko ląstelėms suardyti, veikiant ląsteles šviesa ir dalyvaujant tetrapirolui.
6. Inhibitorius pagal 1-4 punktus, skirtas pieno liaukos navikinėms ląstelėms diagnozuoti ir lokalizuoti, padidinus porfirino kiekį tokiose ląstelėse ir tiriant pieno liaukos ląsteles po apšvitinimo šviesa, aktyvuo-jančia porfiriną, bei matuojant fluorescenciją, kurios šaltiniu yra navikas.
7. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad jos sudėtyje yra junginys pagal bet kuri, iš 1-4 punktų, kuris yra specifinis fermentinio protoporfirinogeno virsmo protoporfirinu IX inhibitorius, iš-šaukiantis tuo pačiu protoporfirino IX susidarymą pieno liaukos naviko ląstelėse, ir farmaciškai priimtina terpė-nešiklis.
8. Farmacinė kompozicija pagal 7 punktą, skirta pieno liaukos naviko ląstelėms suardyti, .veikiant ląsteles šviesa ir dalyvaujant tetrapirolui.
9. Farmacinė kompozicija pagal 7 punktą, skirta pieno liaukos naviko ląstelėms diagnozuoti arba lokalizuoti, didinant porfirino kieki, šiose ląstele ir tiriant pieno liaukos ląsteles po apšvitinimo šviesa, aktyvuojančia porfiriną, be matuojant fluorescenciją, kurios šaltinis yra navikas.
10. Protoporfirino IX gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad ji išskiria iš eukariotų klasei pri-klausančių algae mikroorganizmų, išaugintų terpėje, kurioje yra inhibitoriaus pagal 1-4 punktus.