[LT] Šis išradimas apima išgrynintą žmogaus folikulą stimuliuojančio hormono (FSH) receptorių, jo fragmentą ar mutaną, kuris suriša FSH, minėto receptoriaus, fragmento ar mutanto kodavimą DNR, ekspresijosvektorius, turinčius minėtą DNR, transfektuotas minėtas ekspersijos vektoriais ląsteles, ir minėtojo receptoriaus , fragmento ar mutano gavimo būdą, kultivuojant minėtas transfekuotas ląsteles. Šis išradimas taip pat apima farmacines kompozicijas, turinčias minėtą receptorių, fragmentą ar mutantą, kaip pacientų gydymo tokiomis kompozicijomis metodą, leidžiantį sumažinti endogeninio FSH bioaktyvumą. Taip pat šiame išradime atskleidžiamas patobulintas žmogaus FSH nustatymo būdas, naudojant receptorių, jo fragmentą ar mutantą.
[EN]
[0001] Šis išradimas susijęs su žmogaus folikulą stimuliuojančio hormono receptoriumi ir jo sinteze, naudojant rekombinantinės DNR metodus.
[0002] Folikulą stimuliuojantis hormonas (FSH) yra hipofizio veiklos heterodimerinis glikoproteininis hormonas, kuris siejasi struktūriniu panašumu su liuteinizacijos hormonu (LM) ir skydliaukės hormonu (TSH), kurie abu taip pat yra produkuojami hipofizyje ir chorioniniu gonadotropinu (CG), kuris produkuojamas placentoje. Hormonai yra santykinai dideli (28-38 kilodaltonai) ir yra sudaryti iš paprasto a subvieneto, nekovalentiškai surišto su atskiru P subvienetu, kas suteikia receptoriaus surišimo specifiškumą.
[0003] Ląsteliniai receptoriai šiems hormonams yra žinomi kaip membranos receptorių G baltymus surišančios klasės nariai, kurie, kai aktyvuoti, stimuliuoja adenilciklazės aktyvumo padidėjimą. To pasekoje išauga viduląstelinio transportinio adenozin-3', 5-monofosfato (cAMP) lygis, ir tas įgalina steroidų sintezės ir sekrecijos padidėjimą. Pagal aminorūgščių sekų hidrofiliškumą ir hidrofobiškumą, išskirti trys pagrindiniai domenai: (1) hidrofilinė N-galo sritis, laikoma N-galo ekstraląsteliniu domenu, (2) septyni hidrofobiniai segmentai membranoje, yra laikoma transmembraniniu domenu, ir (3) C-galo sritis, kurioje yra galimos fosforilinimo vietos (serino, treonino ir tirozino liekanos), laikoma C-galo viduląsteliniu ar citoplazminiu domenu. Glikoproteininio hormono receptorių šeima nuo kitų G baltymus surišančių receptorių, tokių kaip 02-adrenergikai, rodopsinas ir K receptorius, skiriasi hidrofilinio N-galo domeno, kuris dalyvauja hormono surišime, dideliu dydžiu.
[0004] FSH receptorius pasireiškia sėklidžių Sertoli ląstelėse ir kiaušidės granuliuotose ląstelėse. Pripažinta, kad reikalingas iš principo grynas žmogaus FSH receptorius, natūraliai gautų preparatų išgryninimas yra nepraktiškas ir neturėtų būti reikšmingas nustatant aminorūgščių seką. Neseniai viena grupė klonavo kDNR koduojančią žiurkės FSH receptorių, nustatė aminorūgščių seką ir ekspresavo jį žinduolių ląstelėse (Sprengel, Mol. Endocrinol. 4:525, 1990). Kita grupė, bandant klonuoti TSH receptorių, atrodo, taip pat klonavo ir identifikavo žmogaus FSH receptoriaus trasmembraninės srities dalį (Parmentier, Science 246:1620, 1989).
[0005] Šis išradimas apima iš esmės gryną žmogaus FSH receptorių, jo fragmentą ar mutantą, kuris suriša FSH, minėtą receptorių, fragmentą ar mutantą koduojančia DNR, ekspresijos vektorius, turinčius minėtą DNR, transfekuotas minėtais ekspresijos vektoriais ląsteles, ir minėto receptoriaus, fragmento ar mutanto gavimo būdus, kultivuojant minėtas transfekuotas ląsteles. Sis išradimas taip pat apima farmacines kompozicijas, turinčias minėtą receptorių, fragmentą ar mutantą, kaip pacientų gydymo tokiomis kompozicijomis metodą, siekiant sumažinti endogeninio FSH bioaktyvumą. Taip pat šiame išradime atskleidžiamas patobulintas žmogaus FSH tyrimas, naudojant receptorių fragmentą ar mutantą.
[0006] Fig. 1 yra žmogaus FSH receptoriaus kDNR klonų žemėlapis. Parodytas nepilnas restrikcinės endonukleazės žemėlapis buvo nustatytas, derinant DNR sekų duomenis, gautus iš penkių klonų kiekvienos dalies. Yra pažymėtas 0.2 kb padidėjimas. Regionai, kuriems priklauso klonai, yra pažymėti ištisinėmis linijomis po restrikciniu endonukleazinių žemėlapiu. Klono pažymėjimas ir apytikslis dydis kilobazėmis yra pažymėti atitinkamai kairėje ir dešinėje kiekvienos ištisinės linijos pusėje. Apytikslis koduojamo baltymo amino-galinio ekstraląstelinio domeno, transmembraninio domeno ir karboksi-galinio viduląstelinio domeno išsidėstymas yra pažymėtas punktyrinėmis rodyklėmis virš restrikcinės endonukleazės žemėlapio. Intarpo pozicija (tikriausiai introno arba introno dalies) 5-10 klone yra pažymėta atvira dėžute. Fig. 2A ir 2B vaizduoja strategiją, panaudotą "pilno ilgio" žmogaus FSH receptoriaus kDNR konstravime, siekiant, kad žinduolių ląstelių linijoje ekspresuotųsi koduojamas baltymas. Fig. 3 yra ekspresijos vektoriaus plazmidės diagrama, panaudota išvesti CHO-DUKX ląstelių linijas stabiliai transfekuotas žmogaus FSH receptoriumi. Fig. 4 yra ekspresijos vektoriaus plazmidės diagrama, panaudota išvesti Y1 ląstelių linijas stabiliai transfekuotas žmogaus FSH receptoriumi. Fig. 5 iliustruoja viduląstelinius cAMP kiekius, matuotus CHO-DUKX ląstelių linijoje CHOHFSHR4Q-13, paveikus skirtingomis FSH (rutuliukai) arba LH (trikampiukai) dozėmis. Kiekvienas taškas atitinka vidutinę reikšmę. Standartinės paklaidos nurodytos vertikaliais brūkšniais. Fig. 6 iliustruoja progesterono kiekius, išmatuotus Y1 ląstelių linijos Y1HFSHR4-38 kultūriniame skystyje, paveikus skirtingomis FSH dozėmis.
[0007] Vertikalūs brūkšniai žymi standartinę paklaidą, matuojant progesteroną po kiekvienos FSH dozės.
[0008] Išradime panaudotas žmogaus FSH receptorius, ir jo FSH surišantys fragmentai ar mutantai, remiasi polipeptidais, kurie sugeba atpažinti ir selektyviai susirišti žmogaus FSH ir kurie produkuoja nežymų imunologinį atsaką žmogaus organizme. Taigi, pateikiamas išradimas apima žmogaus FSH receptorių, turintį aminorūgščių seką atvaizduotą Seka ID Nr:2, ir taip pat kaip ir FSH-surišantys fragmentai ar mutantai, išlaiko labai aukštą homologiškumo laipsnį (identiškumas mažiausiai 95%), su pavaizduota aminorūgščių seka, ar bent su ekstraląsteline dalimi. Žmogaus FSH receptoriaus fragmentai, aprašomi šiame išradime, apima fragmentus, liekančius po to, kai citoplazminiai ir/arba transmembraniniai domenai yra nuskelti nuo viso polipeptido. Išradime ypač išskiriamas fragmentas yra N-galo ekstraląsteline dalis, turinti maždaug nuo 1 iki 349 aminorūgščių, žmogaus FSH receptoriaus aminorūgščių sekos, atvaizduotos Seka ID Nr:2. Kadangi kelios kilpos apsukę transmembranines sritis (išvardintas sekančioje dalyje, Seka ID Nr:2) yra taip pat ekstraląstelinės, jos gali būti susijungę (pavyzdžiui per atitinkamas tarpines molekules) į fragmentus, turinčius aminorūgščių liekanų sekas N-gale ekstraląstelinėje dalyje, tuo pagerindamos ryšį. Polipeptidai gali būti glikolizilinti, kaip kad yra natūraliuose receptoriuose arba gali būti dalinai ar pilnai deglikozilinti.
[0009] Yra manoma, kad tiktai dalis aukščiau aprašyto N-galo ekstraląstelinio domeno gali būti efektyviai panaudota FSH surišimui, kadangi labai tikėtina, kad pilnas eksraceliuliarinis domenas nėra būtinas šiam tikslui. Taigi, fragmentas kuris yra kažkiek trumpesnis, negu pilno ekstraląstelinio domeno 349 aminorūgštys, gali būti lengvai padaromas ir testuojamas, norint nustatyti efektyvų susirišimą su FSH. Tokia ilga, kaip ekstraląstelinės dalies FSH-surišanti sritis, išlieka nepažeista ir viso panaudojamo fragmento ilgis nėra lemiamas. Pagal šią nuostatą, taip pat tikimasi, kad rūgštys, kurios neinterferuoja, gali būti pridėtos prie bet kurio ekstraląstelinio domeno galo ar FSH-surišančio fragmento, nepakenkiant polipeptido FSH-surišimo sugebėjimui. Atsižvelgiant j tai, šis išradimas apima žmogaus FSH receptoriaus fragmentus, susidedančius iš ekstraląstelinio domeno dalių ir kurios išlaiko iš esmės tokias pačias FSH-surišimo savybes, kaip pilnas ekstraląstelinis domenas.
[0010] Aukščiau aprašytų receptorių ir fragmentų mutantinės formos yra taip pat šio išradimo sritis. Tokie mutantai apima nuo vienos iki dešimties aminorūgščių liekanų konservatyvius pakeitimus, ir tokių pakeitimų lokalizacija ir prigimtis buvo parinkta taip, kad nežymiai degradavo receptoriaus ar fragmento, kuris buvo modifikuotas, FSH-surišančios savybės.
[0011] Neaktyvuotas žmogaus FSH receptorius, fragmentas ar mutantas paruošiamas išskiriant ar klonuojant DNR, koduojamą kDNR ar genomine biblioteka, liguojant j DNR vektorių, transfekuojant į recipijento ląsteles tuo vektoriumi, kultivuojant transfekuotas recipijento ląsteles tokiose sąlygose, kurios įgalina receptoriaus, fragmento ar mutanto ekspresiją ir receptoriaus, fragmento ar mutanto išskyrimą iš kultūros.
[0012] DNR, kuri yra naudojama vektorių ekspresijai, gali būti genomo DNR ar kDNR, koduojanti žmogaus FSH receptorių ir gali turėti sritis padidinančias ekspresiją, tokias kaip intronai, promotoriai, sustiprintojai ir t.t. DNR gali būti lengvai modifikuota pakeičiant, iškerpant ar įterpiant nukleotidus (pavyzdžiui, specifinė vietos mutagenezė) taip, kad nepakentų ekspresuoto baltymo biologiniam ar FSH-surišimo aktyvumui. Pavyzdžiui, konservatyvūs pakeitimai (mutacijos) kurių metu yra pakeičiama nuo vienos iki dešimties aminorūgščių, gali būti padarytos nepakenkiant ekspresuoto baltymo (muteino) bendrai struktūrai ir aktyvumui. Analogiškai, tam tikros DNR dalys, tokios kaip dalys, kurios koduoja citoplazminius ir/arba transmembraninius domenus, gali būti iškirptos taip, kad tiktai vienas baltymo fragmentas, toks kaip tirpus ekstraląstelinis domenas, bus ekspresuojamas. Žmogaus FSH receptorius, FSH-surišimo fragmentas ar mutantas gali taip pat būti ekspresuojamas kaip sulietas baltymas. Toks sulietas baltymas, įjungus polipeptidą C-gale, suteiks savybes, įgalinančias palengvinti baltymo gryninimą ar išgryninto baltymo imobilizaciją ant kieto substrato, naudojamo FSH tyrimuose ar FSH gryninimo metodikoje. Kitas toks sulietas baltymas, įjungus nuskeltą polipeptidą N-gale, palengvins ekspresiją.
[0013] Pagal šį išradimą produkuojamas žmogaus FSH receptorius yra iš principo neaktyvuotas, turint galvoje, kad jis yra visiškai laisvas nuo papildomų biologinių agentų normaliai susijusių su FSH receptoriumi, išskirtu iš natūralių šaltinių, tokių kaip pavyzdžiui: bakterijų, virusų ir kitų baltymų. Receptorius gali būti įjungtas į farmacines kompozicijas, sumaišant su atitinkamais farmaciškai priimtinais nešikliais.
[0014] Paprastai, vaistinės kompozicijos gali būti paruošiamos įvesti oraliniu, parenteraliniu (įskaitant poodines, į raumenis ir intravenines injekcijas), vaginaliniu ir rektaliniu, transbukaliniu (įskaitant poliežuvinį), transdermaliniu ar intranazaliniu būdais. Kompozicijos, įvedamos parenteraliniu būdu, paprastai būna skysto tirpalo, dispersinės suspensijos ar emulsijos, geriau kai būna izotoninės; vaginaliniam ar rektaliniam naudojimui - kremo ar žvakutės pavidalo; oraliniam ar transbukaliniam naudojimui - kaip tabletės ar kapsulės; ir intranazaliniam įvedimui - miltelių, nosies lašų ar aerozolių pavidalo. Gali būti naudojamos įvairios lėto išsiskirstymo, implantuoto depo ar injekcinės dozinės formos. Siekiant kontroliuoti preparato išnešiojimą po organizmą, aktyvusis komponentas gali būti taip pat inkorporuotos į polimerų matricas, liposomas ir mikrorutuliukus.
[0015] Šios kompozicijos gali būti suformuotos patogiomis vienetinėmis dozėmis ir taip pat gali būti paruoštos bet kokiu metodu, gerai žinomu farmakologijoje. Vaistinėse formose parenteraliniam įvedimui paprastu užpildu gali būti sterilus vanduo ar fiziologinis tirpalas, alkileno glikoliai -pvz. propileno glikolis, polialkilenglikoliai - pvz. polietileno glikolis, augalinės kilmės aliejus, hidrintas naftalenas ir pan. Vaistinės formos, skirtos vaginaliniam ar rektaliniam įvedimui, pvz. žvakutės, gali turėti užpildu pvz. poliakilenglikolius, vazeliną, kakao riebalus, ir pan. Vaistinės formos skirtos nazaliniam naudojimui gali būti miltelių pavidalo ir turėti tokius užpildus, pvz. laktozę ar dekstraną, taip pat gali būti vandeniniai ar aliejiniai tirpalai nosies lašų ar dozuojančių aerozolių pavidalo. Transbukaliniam naudojimui, tipiški užpildai apjungia cukrų, kalcio stearatą, apdorotą krakmolą ir pan. Į tirpalą ar miltelių pavidalo vaistinę formą gali būti pridedama viena ar daugiau paviršiaus aktyvių medžiagų rūgščių ar druskų. Atitinkamos farmaciškai priimtinos paviršiaus aktyvių medžiagų druskos bus tokios, kurios išlaiko savybę padidinti peptidų absorbciją, kaip junginio, į kurį jos įjungiamos, savybę ir kurios nėra žalingos organizmui ar kaip kitaip kontraindukuojančios.
[0016] Įvedamo aktyvaus ingradiento dozė pagal įvedimo būdą ir dažnį, akivaizdžiai priklauso nuo paciento gydymo poreikio ir sąlygų, norimo pasiekti terapinio efektyvumo ir gydytojo sprendimų gydymo metu.
[0017] Farmacinės kompozicijos, į kurias įeina žmogaus FSH receptorius, FSH-surišantys fragmentai ar mutantai, gali būti įvedami pacientui terapiškai efektyviomis dozėmis tam, kad susirištų su endogeniniu organizme cirkuliuojančiu FSH ir tokiu būdu kontroliuoti esamą bioaktyvaus FSH kiekį. Taigi, pateikiamo išradimo farmakologinės kompozicijos yra efektyviai naudojamos sumažinti endogeninio FSH bioaktyvumui. Pacientėms moterims toks gydymo būdas gali būti efektyviai naudojamas sutrukdant folikulo augimą ir subrendimą, tuo būdu sutrukdant nėštumui. Pacientams vyrams toks gydymas gali būti efektyvus norint sutrukdyti spermatogenezę. Iš dalies, atitinkamos farmakologinės kompozicijos aukščiau aprašytiems tikslams turi žmogaus FSH receptoriaus fragmentą, kuris talpina N-galo ekstraląstelinį domeną ar paprastą dalį su įprastomis tokiomis pačiomis FSH-surišančiomis savybėmis.
[0018] Iš esmės grynas žmogaus FSH receptorius gali būti taip pat naudingai pritaikomas tradiciniuose FSH receptoriaus tyrimuose, tokiuose kaip pvz. Reichert, Endocrinology 94:483, 1974. Pagal pateikiamą išradimą, gauto gryno receptoriaus ar fragmento, surišančio FSH, pakeitimas žymiai pagerins tokių tyrimų lygį ir išdirbimą. Fragmentas, turintis N-galo ekstraląstelinį domeną ar FSH-surišantj fragmentą ir/arba sulietą baltymą gali taip pat imobilizuotis afiniškai siekiant išvalyti FSH iš skysčių, ekstraktų ir t.t.
[0019] Receptorius gali būti įkomponuotas į stabilių ląstelių liniją, geriau tam tikslui panaudojant eukariotinių ląstelių linijas, dar geriau - žinduolių ląstelių linijas, kurios stimuliuojamos receptoriaus, sugeba produkuoti išmatuojamą biologinį atsaką. Ląstelės atsako, esant FSH, išmatavimas tyrimo metu (pvz. testuojant serumą, plazmą, kultūrinę terpę, audinių homogenatą, ir t.t.) įgalins bioaktyvumo indikaciją ir tuo būdu suteiks galimybę naudoti labai patogų diagnostinį metodą. Tokios ląstelių linijos taip pat gali būti panaudojamos rūšiuojant chemines bibliotekas substancijoms, kurios gali sąveikauti su FSH receptoriumi ar testuojant peptidus ar mažus baltymus pagal jų sugebėjimą susirišti su FSH receptoriumi greitoje ekspresskryningo sistemoje. Kaip pavyzdys tokios sistemos yra tokia sistema, kur surištas ligandas rekombinantiniam FSH receptoriui, sąlygoja gamybą ar matuojamo produkto, tokio kaip cAMP ar progesterono, gamybos blokavimą. Tokia sistema gali būti toliau stiprinama efektyviai surišančiu ir lengvai išmatuojamu žymės elementu, pasižyminčiu bioliuminescencija (pvz.liuciferazės genas) atsakančiu į receptoriaus signalą transdukcijos keliu (pvz. naudojant cAMP atsako elementą).
[0020] Iš esmės grynas žmogaus FSH receptorius, FSH-surišantys fragmentai ar mutantai taip pat gali būti panaudojami rentgeno spindulių kristalografinėje analizėje vystant molekulių modelius. Tokie modeliai naudojami nustatant tretinę
[0021] žmogaus FSH receptoriaus hormono-surišimo domeno struktūrą. Ši informacija įgalina pažvelgti į kontakto tarp FSH ir jo receptoriaus rūpimų sričių struktūrą, turint tikslą sukonstruoti peptidus, turinčius FSH agonistinį ar antagonistinį aktyvumą.
[0022] Siūloma rekombinantinė technika tinkanti pateikiamo išradimo baltymų ir DNR produkavimui, įskaitant identifikacinę atitinkamų mutacijų techniką, vektorius, recipijento ląsteles, kultivavimo sąlygas ir t.t., yra gerai žinomas kvalifikuotas būdas ir yra adekvačiai aprašyta pvz. US 4,761, 371 ir WO 88/09818, kurių ištraukomis čia remiamasi. Eksperimentų metodikos, kultivavimo terpė bakterijoms ir bakteriofagams, cheminiai tirpalai naudojami žemiau pateiktuose pavyzdžiuose, yra detaliai aprašyti Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2 red., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, jeigu atskirai nenurodyta.
[0023] 1 pavyzdys. Žmogaus FSH receptoriaus kDNR klonu izoliavimas ir charakterizavimas
[0024] Žiurkių FSH receptoriaus kDNR klonas panašus į tą, kuris aprašytas Sprengel'io, Mol. Endocrinol. 4:525, 1990, buvo gautas iš dr. William'o Moyle, Medicinos ir Stomotologijos Universiteto New Jersey Robert Wood Johnson Medicinos Mokyklos. Šis kDNR klonas buvo įterptas į SV40 vėlyvosios ekspresijos vektorių pSVL (Pharmacia LKB, produkto numeris 27-4509-01) ir pavadintas pSVLFSHR. 2.1 kb DNR fragmentas, turintis regioną, atitinkantį pilną FSH receptoriaus baltymą koduojantį regioną, buvo iškirptas iš plazmidės naudojant restrikcinių endonukleazių saitus Xbal ir BamHl. Iškirpta DNR buvo frakcionuota pagal dydį gel-elektroforezės metodu, o 2.1 kb žiurkių FSH receptoriaus fragmentas elektroeliujuotas iš gelio. Šiuo išgrynintu DNR fragmento bandiniu atrinktos bibliotekos identifikuojant žmogaus FSH receptoriaus kDNR klonus.
[0025] X gtll kDNR biblioteka, sukonstruota iš ekstrahuotos iš žmogaus sėklidžių RNR, buvo nupirkta iš Clontech, Palo Alto, CA (katalogo numeris HLIOlOb) ir buvo amplifikuota prieš panaudojant. Dvidešimt amplifikuotos bibliotekos alikvotų, ekvivalenčių maždaug 7.5 x 10^ ližės vienetams (plaque forming units - pfu), buvo adsorbuota į 0.5 ml E. coli Y1088 kamieno suspensijos gazoną. Suspensija buvo paruošta, auginant per naktį Y1088 kultūrą 37°C NZYM arba LB, kuri papildyta 0.2% maltozės ir 10 mM MgSC>4, surenkant ląsteles ir po to suspenduojant jas 10 mM MgSC>4 iki O.D.gooO-S- Apie 6.5 ml išlydytos NZYM agarozės (0,7%), esant 48°C, buvo pridėta į kiekvieną fago/ląstelės suspensiją, ir gautas mišinys supiltas ant vienos iš dvidešimties 150 mm NZYM agaro lėkštelių (pašildytos iki 42°C). Bendras fagų, užneštų pirminiam atrinkimui, kiekis buvo apie 1.5 x 10^. Inkubuojama 4 vai. 42°C, po to kelias vai. atšaldoma 4°C, ir kiekvienos lėkštelės kopija buvo padaryta ant nitroceliuliozinio filtro (Millipore) pagal Benton'o ir Davies'o procedūras (Science, 196:180, 1977). Feinberg'o ir Vogelstein'o atsitiktinių oligonukleotidų-pradmenų procedūra (Anai. Biochem. 137:266, 1983) buvo panaudota generuoti nuo žiurkių FSH receptoriaus DNR fragmento šablono, aprašyto ankstesniame paragrafe, 32p pažymėtą bandinį, kurio specifinis aktyvumas 1-2 x 10^ cpm/(a.g. Fago dublikatų ant nitroceliuliozės filtro prehibridizacija atlikta 37°C, apie 6 vai. buferyje, kuriame yra 50% formamido, 5x SSC (1 x SCC yra 0.15 M natrio chloridas, 0.015 M natrio citratas), 20 mM natrio fosfato buferio, pH 7.2, 10xDenhardt'o reagento (50xDenhardt'o reagentas yra 1% Fikolo, 1% polivinilpirololidono ir 1% BSA) ir 100 ng/ml tRNR. Filtrų hibridizacija atlikta tame pačiame buferyje, išskyrus tai, kad buvo pridėta žiurkių FSH receptoriaus DNR bandinio iki maždaug 3x10^ cpm/ml koncentracijos.
[0026] Denatūruota plazmidinė DNR buvo neutralizuota ir išsodinta etanoliu, pridedant 7.5 įiI 7.5 M amonio acetato ir 110 |.il 100 % etanolio ir atšaldant mišinį skystame azote. Išsodinta DNR buvo surinkta centrifuguojant mikrofugoje 10 min. DNR nuosėdos plautos 70 % etanoliu ir išdžiovintos. Sekvenavimo reakcijos atliktos su DNR polimeraze - Sekvenaze T7 (United States Biochemical), remiantis gamintojų instrukcijomis. Preliminarios sekvenavimo reakcijos atliktos su pUC18 polilinkerinio regiono tiesioginiais ir atvirkštiniais praimeriais (Pharmacia LKB). Gauti duomenys naudojami žmogaus FSH receptoriaus specifiniams sekvenavimo praimeriams sukurti. Praimeriai buvo sintezuoti arba 391 Applied Biosystems modelio DNR sintezatoriumi, arba užsakyti iš National Biosciensces, Inc., Hamel, MN. Keletas DNR sekvenavimo duomenų buvo gauti, sublokuojant pirminių klonų mažesnius restrikcinės endonukleazės fragmentus į pUC18 ir pakartojant sekvenavimo reakcijas su tiesioginiais ir atvirkštiniais praimeriais.
[0027] Preliminaraus sekvenavimo duomenys parodė, kad nė viena iš penkių izoliuotų kDNR neišreiškia pilno ilgio žmogaus FSH receptoriaus baltymą koduojančio regiono, bet, kombinuojant klonų sekvenavimo duomenis, padaroma išvada apie pilną baltymo seką. Penkių klonų giminingų vietų, lyginant su pilna žmogaus FSH receptoriaus kDNR seka, schematinė diagrama parodyta Fig.l. Pilna žmogaus FSH receptoriaus kDNR seka, gauta kombinuojant klonų persidengiančias sekas, panaudojus Genetics Computer Group (GCG) fragmentų apjungimo kompiuterinę programą, yra atvaizduota kaip seka ID Nr:l, o iš jos gauta aminorūgščių seka kaip ID Nr:2. Išanalizavus žmogaus FSH receptoriaus DNR seką, identifikuojamas ilgas atviras skaitymo rėmelis (ORF) iš 2085 nukleotidų, kurie koduoja 695 aminorūgščių baltymą. Taigi žmogaus FSH receptorius yra 3 am.r. ilgesnis negu žiurkės. Bendras procentinis identiškumas tarp žiurkės ir žmogaus FSH receptoriaus DNR ir baltymo sekų buvo nustatytas, panaudojus GCG Bestfit programą, ir yra 87% bei 90% atitinkamai. Ekstraląstelinė žmogaus FSH receptoriaus N-galo hidrofilinė dalis yra 349 am.r. ilgio ir yra 87% identiška su atitinkamu žiurkės FSH receptoriaus regionu. Dviejų rūšių septyni membraniniai regionai, sujungti trimis ekstraląstelinėmis ir trimis viduląstelinėmis kilpomis, yra identiški 95%, o C-galo viduląsteliniai regionai yra identiški 81%. Nepilna aminorūgščių seka publikuota Parmentier, Science 246: 1620 - 1622, 1989, atitinka sekos ID Nr:2 aminorūgštis nuo 399 iki 525.
[0028] 5-10 klono variante už T nukleotido, 448 pozicijoje, ID Nr:l sekoje yra 0.25 kb intarpas. Jo DNR seka nebuvo panaši į kurią nors žiurkės arba žmogaus FSH
[0029] receptoriaus DNR dalį, o taip pat nebuvo panaši į kurią nors žinomą seką, esančią Genbank arba EMBL DNR sekų duomenų bazėse. Atitinkamas 11-11 klono regionas neturėjo šio intarpo. LII receptoriaus kDNR klonai, izoliuoti iš žmogaus skydliaukės kDNR bibliotekos, turi panašius atvejus (Frazier, Mol. Endocrinol. 4:1264-1276, 1990). Šie atvejai, matyt yra kilę iš nepilnai ir/arba neteisingai sujungtų iRNR molekulių. 3' sujungimo pastovi seka (CAG'G) intarpo 5-10 gale akivaizdžiai patvirtina šį paaiškinimą.
[0030] pUC18 plazmidės, turinčios 11-11 (pavadintas pHFSHRll-11), 15-6 (pavadintas pHFSHR15-6) ir 5-10 (pavadintas pHFSHR5-10) kDNR intarpus, buvo deponuotos American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, 1 kovo, 1991 ir gavo papildomus numerius ATCC68538, ATCC68540 ir ATCC68539 atitinkamai. Deponavimas buvo atliktas pagal visus Budapešto Sutarties reikalavimus.
[0031] 2 pavyzdys. Vektorių, ekspresuojančiu pilna žmogaus FSH receptorių žinduoliu ląstelėse, konstravimas
[0032] Žmogaus FSH receptoriaus DNR, kuri ekspresuojasi žinduolių ląstelėse, konstravimo strategija parodyta Fig. 2A ir 2B. Atsižvelgiant į Fig. 2A, 5' 691 bazių porų (bp) Nsil-BamHl fragmentas, kurio pradžia ATG, buvo išgrynintas iš pHFSHRll-11 ir subklonuotas į pUC18, kuri restriktuota su Pstl ir BamHl. Gauta plazmidė pHFSHRll-llnb buvo linearizuota su Sph'l. Galai užbukinti, veikiant DNR polimerazės 1 Klenovo fragmentu (New England Biolabs, Beverly, MA).Ligavus Xhol linkerius (New England Biolabs, Beverly, MA) su užbukintais galais, mišinys buvo restriktuotas su Xhol bei BamHl ir maždaug 700 bp žmogaus FSH receptoriaus 5' fragmentas buvo išgrynintas gelfiltruojant. Fragmentas iš žmogaus FSH receptoriaus kDNR regiono vidurio buvo izoliuotas iš pHFSHRll-11, iškerpant su BamHl bei Sphl ir išgryninant gelfiltracija atitinkamą 734 bp fragmentą. 3' žmogaus FSH receptoriaus fragmentas, turintis iš TAA stop kodoną, buvo izoliuotas iš pHFSFIR15-6, pirmiausia, kerpant plazmidę Dra3, po to užbukinant galus DNR polimeraze T4. Xhol linkeriai buvo liguoti su užbukintais
[0033] galais ir gautas mišinys restriktuotas Sphl bei Xhol, o 3' 690 bp (maždaug) Sphl-Xhol fragmentas izoliuotas ir išgrynintas.
[0034] Atsižvelgiant j Fig. 2B, 5' 700 bp Xhol-BamH'l ir vidurinis 734 bp BamHl-Sphl žmogaus FSH receptoriaus kDNR fragmentai buvo subklonuoti į pUC18-Xhol (sukurtas šioje laboratorijoje, pakeitus pUC18 polilinkeryje Smal saitą į Xhol su Xhol linkeriais), kuri kirpta su Xhol ir Sphl. Gauta pHFSHRl. 4xs plazmidė buvo kirpta su Xhol ir Sphl. Sukarpyta DNR buvo elektroforetiškai frakcionuota pagal fragmentų dydį 5-6% poliakrilamidiniame gelyje, ir maždaug 1400 bp fragmentas, turintis 5' ir vidurinį žmogaus FSH receptoriaus DNR regionus, buvo išpjautas ir išgrynintas elektroeliujuojant. 3'Sphl-Xhol fragmentas, turintis TAA stop kodoną, buvo subklonuotas į pUC18-Xhol, kuri kirpta su Xhol ir Sphl. Gauta pHFSHRl.4xs plazmidė buvo kirpta su Xhol ir Sphl. Sukarpyta DNR buvo frakcionuota 5-6% poliakrilamidiniame gelyje, o maždaug 700 bp turintis gabalas išpjautas ir išgrynintas elektroeliujuojant. Pilnas žmogaus FSH receptorių koduojantis regionas buvo surinktas, kombinuojant 5' 1400 bp Xhol-Sphl fragmentą su 3'700 bp Sphl-EcoRl fragmentu bei liguojant su pUC18-Xhol, kuri kirpta su Xhol ir EcoRl. Teisingas konstrukcijos, pavadintos pHFSHRX, surinkimas patikrintas, kerpant endonukleaze bei sekvenuojant DNR. Pilnai sukonstruotas žmogaus FSH receptoriaus 2.1 kb Xhol fragmentas, dar turintis maždaug 18 bp 5' ir 12 bp 3' nekoduojančias sekas, buvo iškirptas iš pHFSHRX su Xhol. Sukarpyta DNR buvo frakcionuota pagal dydį elektroforetiškai 0.7% agaroziniame gelyje. 2.1 kb Xhol fragmentas buvo išpjautas iš gelio, išgrynintas elektroeliujuojant Little Blue Tankr (ISCO), panaudojus gamintojų rekomenduojamą procedūrą, ir įterptas į Xhol klonavimo saitus žinduolių ląstelių ekspresinėse vektorinėse plazmidėse. Plazmidės, turinčios tinkamos orientacijos intarpą žmogaus FSH receptoriaus iRNR transkripcijai, buvo atrinktos pagal restrikcinės endonukleazės fragmentų analizę. Prieš įvedant į žinduolių ląsteles, ekspresijos vektoriaus plazmidės DNR buvo išgryninta arba dviem vienas po kito sekančiais centrifugavimais cezio chlorido tankio gradiente, arba panaudojus rinkinį plazmid maxi kit (Qiagen Chatsworth, CA) remiantis gamintojų protokolu.
[0035] Bet kuris tinkamas žinduolių ląstelėse besiekspresuojantis vektorius gali būti panaudotas žmogaus FSH receptoriaus ekspresijai. Vektorinės plazmidės būtini komponentai apima: eukariotinį promotorių, pavyzdžiui, pelės metalotioneino 1 (MMT-1) promotorių, Rauso Sarkomos Viruso promotorių arba SV40 ankstyvąjį ar vėlyvąjį promotorius, kuriais valdoma žmogaus FSH receptoriaus iRNR transkripcija; markerinį geną, pavyzdžiui, atsparumo neomicinui geną (Neo), dihidrofolatreduktazės (DHFR) geną arba daugybinio atsparumo (multidrug resistance) geną (MDR), kurių pagalba atrenkamos transfekuotos ląstelės; poliadenilinimo signalą (poly A), pavyzdžiui, ankstyvąjį SV40 poliadenilinimo regioną, skirtą receptoriaus RNR transkripto brandinimui; ir bakterinę replikacijos pradžią bei atsparumo antibiotikui geną, pavyzdžiui pBR322 ori ir atsparumo ampicilinui geną, įgalinančius vektorinės plazmidės augimą ir dauginimąsi tinkančiame E. coli kamiene. Keletui ląstelių linijų gali būti svarbus intronas, kuris yra regione transkribuotame į žmogaus FSH receptorių koduojančią RNR. Pageidautina, kad intronas būtų tarp promotoriaus ir žmogaus FSH receptoriaus kDNR intarpo, dėl to jis yra 5" netransliuojamame žmogaus FSH receptoriaus RNR transkripto regione. Gali būti panaudotas bet kuris tinkamas intronas. Mūsų eksperimentuose naudotas intronas buvo žmogaus glikoproteino geno a subvieneto 2 kb Xbal-Pstl introno A dalis (Fiddes, J. Mol. Appl. Genet. 1:13, 1981) Ekspresijos vektoriuose jis įterptas tarp MMT-1 promotoriaus regiono ir žmogaus FSH receptoriaus kDNR fragmento. Sutrumpintas intronas išlaikė endogeninę jungtį, bet jungties donoras buvo kompensuotas sintetiniu oligonukleotidu.
[0036] Žmogaus FSH receptoriaus ekspresinio vektoriaus, panudoto CHO ląstelėms transfekuoti pDctHFSHRx (žmogaus FSH receptorius, esantis CLH3AXSV2DHFRhaIVS), diagrama parodyta Fig. 3, o žmogaus FSH receptoriaus ekspresijos vektoriaus, panaudoto stabilizuoti transfekuotas Y1 ląsteles pNaHFSHRx (žmogaus FSH receptorius, esantis CLH3AXSV2NEOhaIVS),
[0037] diagrama parodyta Fig. 4 MMT-1 geno sekos (nukleotidai 4542-7514 Fig. 3, nukleotidai 5192-8164 Fig. 4), kurios turi promotorinį regioną, yra tokios pat kaip konstrukcijos CLH3X 5' kryptimi Xhol saite (Reddy, DNA 6:461 1987). Žmogaus glikoproteino geno a suhvieneto geno introno A fragmentas, aprašytas ankstesniame paragrafe, yra tarp nukleotidų 7514 bei 9514 Fig. 3 ir tarp nukleotidų 8164 bei 10164 Fig. 4 3' kryptimi. Nuo Xhol saito MM-1 intronai ir poliadenilinimo signalo sekos buvo pašalintos ir pakeistos ankstyvuoju SV40 poliadenilinimo regionu (nukleotidai 11614-11857 Fig. 3, nukleotidai 12264-12508 Fig. 4). pML regione (Lusky, Nature 293:79, 1981) yra bakterijos replikacijos pradžia ir atsparumo ampicilinui genas iš pBR322 (nukleotidai 1925-4542 Fig.3, nukleotidai 2575-5192
[0038] Fig.4. DHFR geno transkripcijos vienetas (nukleotidai nuo 1 iki 1925 Fig.3), kuris turi pelės DHFR kDNR ir SV40 ankstyvojo promotoriaus regioną, mažąjį T introną ir poliadenilinimo ankstyvojo regiono sekas, priklauso PvuII-BamHl fragmentui, kuris yra pSV2DHFR (Subramani, Mol. Cell. Biol. 1:854, 1981). PvuII saitas buvo pakeistas BamHl saitu, prieš įterpaint fragmentą į ekspresinio vektoriaus plazmidę. Neo geno transkripcijos vienetas (nukleotidai 1-2575 Fig. 4) buvo surinktas, pakeičiant DHFR kDNR (nukleotidai 342-1077 Fig. 3) 1385 bp HindlH-Smal fragmentu iš pSV2-neo (Southern, J. Mol. Appl. Genet. 1:327, 1982). SmaI
[0039] saitas buvo pakeistas į BamHl saitą, prieš įterpiant fragmentą į ekspresijos vektoriaus plazmidę.
[0040] pNahFSHRX plazmidė gali būti panaudota ilgiau besidauginančių žinduolių ląstelių transfekcijai, ir buvo deponuota su ATCC lapkričio 19, 1991, su papildomu numeriu ATTC68833. Deponavimas buvo atliktas pagal visus Budapešto Sutarties reikalavimus. pDcchFSHRX plazmidė labiausiai tinka transfekuoti ląstelių linijas, kurios nepasižymi dihidrofolatreduktaziniu (DHFR) aktyvumu.
[0041] DNR klonavimo ir kostravimo technikos gali būti panaudotos žmogaus FSH receptoriaus DNR ekspresinės konstrukcijos modifikavime, taip kad FSH-surišantys fragmentai yra koduojami. Šie modifikuoti DNR fragmentai gali būti įterpti į ekspresijos vektorius, pavyzdžiui, aprašytus čia ir naudotus žinduolių ląstelių trasfekcijai. Išaugusios linijos sekretuotų tirpius žmogaus FSH-surišančio receptoriaus fragmentus, tokius kaip amino-galinį ekstraląstelinį domeną arba jo FSH-surišantį fragmentą.
[0042] 3 pavyzdys. Žinduoliu ląstelių linijų išvystymas, kurios stabiliai ekspresuoia funkcionalu žmogaus rekombinantini FSH receptorių arba jo FSH surišanti fragmentą, kuris gali būti ir pakitęs
[0043] Tinkamos žinduolių ląstelių linijos, kurios galėtų ekspresuoti rekombinantinj žmogaus FSH ir jo darinius, apima kinietiško žiurkėno kiaušidės (CHO), pelės adenokarcinomą Yl, žiurkės hipofizę GH3, žmogaus pieno liaukos karcinomą MCF7 ir žmogaus embriono inkstą 293. Yl ir CHO ląstelių panaudojimas yra aprašytas šiame pavyzdyje.
[0044] Y1 ląstelės yra klonalinis steroidus sekretuojantis ląstelių kamienas, paimtas iš pelės antinksčio žievės auglio (Yasumura, Cancer Res. 26:529-536, 1966). Šios ląstelės buvo gautos iš ATCC ląstelių banko (ATCC CCL 79) ir panaudotos kaip kultūra, auginant Ham'o F10 terpėje, papildytoje 15 % arklio serumu (HS), 2,5% FBS ir 1% L-glutaminu (Yl auginimo terpė).
[0045] CHO-DUKX yra CHO ląstelių kloninis mutantas, neturintis dihidrofolatreduktazinio aktyvumo (Urlaub G. and Chasin, L.A. PNAS 77: 4216-4220, 1980). Ląstelės buvo augintos minimalioje terpėje Alpha (MEM-a), papildytoje 10% FBS ir 1% L-glutaminu (Yl auginimo terpė).
[0046] Visos ląstelės augintos 37°C, 5% CO2, sudrėkintoje atmosferoje.
[0047] Panaudotas trasfekcijos protokolas buvo jau publikuoto metodo (Graham, Virology 52:456, 1973) modifikacija. Maždaug 24 vai. prieš transfekciją ląstelės buvo patalpintos į 100 mm diametro lėkšteles: tankis 7x10^ ląstelių/lėkštelei (CHO-DUKX) arba 1x10^ ląstelių/lėkštelei (Yl).
[0048] Atliekant transfekciją, 10 (.ig vektorinės plazmidinės DNR (pDaHFSHRX CHO-DUKX ląstelėms, pNaHFSHRX Yl ląstelėms) buvo pridėta į 0.5 ml. transfekcijos buferio. Transfekcijos buferis buvo paruoštas, maišant 4 g NaCl, 0.185 g Kcl 0.05 g Na2PC>4, 0.5 g dekstrozės ir 2.5 g HEPES steriliame, distiliuotame vandenyje ir pridedant tūrį iki 500 ml, o pH iki 7.5. Į DNR/transfekcijos buferio mišinį buvo pridėta 31 (.il 2 M CaCl2. Tirpalas buvo sumaišytas ir paliktas kambario temperatūroje 45 min., tam kad susidarytų DNR nuosėdos, kurios buvo užsluoksniuotos ant ląstelių, pašalinus kultūrinę terpę. Po 20 min., esant kambario temperatūrai, buvo pridėta 5 ml atitinkamos auginimo terpės ir ląstelės kultivuotos 6 valandas. Terpė pašalinama, o ląstelės purtomos 3.5 min. 34 ml trasnsfekcijos buferio, kuriame yra 15% glicerolio. Ląstelės dukart plaunamos PBS buferiu prieš pridedant 10 ml auginimo terpės. Maždaug 48 vai. po transfekcijos CHO-DUKX ląstelės buvo kultivuotos iki 1:10 paviršiaus ploto, o po to pridedama selektyvi terpė. Y1 ląstelės augo 72 vai. po transfekcijos iki 1:5 užimamo ploto, prieš pridedant selektyvios terpės. CHO-DUKX ląstelių selektyvią terpę sudaro MEM-a be ribonukleozidų ir dezoksiribonukleozidų, papildyta 10% dializuotu FBS, 1% L-glutaminu bei 0.02 į.iM metotreksatu (MTX). Y1 ląstelių selektyvią terpę sudaro Y1 auginimo terpė su 80 fig/ml G418. MTX-atsparios CHO-DUKX ląstelių kolonijos bei Ci-418-atsparios Y1 ląstelių kolonijos susiformavusios maždaug po 2-3 savaičių, buvo individualiai atrinktos ir kultivuotos iki tokio ląstelių kiekio, kuris buvo pakankamas konservuoti užsaldant bei testuoti hormoninį atsaką.
[0049] Žmogaus rekombinantinio FSH receptoriaus bioktyvumo stabiliose trasfekuotose CHO ląstelėse demonstravimas
[0050] Siekiant nustatyti, ar sukonstruota kDNR koduojanti receptorių gali produkuoti baltymą, kuris būtų biologiškai aktyvus stabiliose trasfekuotose CHO ląstelėse, MTX-atsparios CHO ląstelių kolonijos buvo paveiktos žmogaus rekombinantiniu FSH ir buvo išmatuotas viduląstelinis cAMP. Tiriant cAMP, ląstelės buvo kultivuojamos CHO ląstelių selekcinėje terpėje, 12-os šulinėlių plokštelėse su 2.5x10^ ląstelių/šulinėlyje koncentracija. Po 72 kultivavimo valandų, kiekvienas šulinėlis buvo praplautas 1.5 ml šilta auginimo terpe. Į kiekvieną praplautą šulinėlį buvo pridėta 300 jai auginimo terpės be serumo, kurioje yra 0. 1 mM 3- izobutil- l metilksantino ( Sigma). Po 15 min. inkubavimo, žmogaus rekombinantinis FSH buvo pridėtas j terpę kiekviename šulinėlyje taip, kad galutinė koncentracija apytiksliai buvo 335 ng ( 2413 mIU/ ml). po 30 min. inkubavimo, bandymas buvo nutrauktas ląsteles paveikiant keturiais greito sušaldymo- atšildymo ciklais. 50 įiI alikvoto iš kiekvienų ląstelių lizato pernešta j 1, 5 ml mėgintuvėlius norint nustatyti baltymo kiekį. Šaltas etanolis ( 300 ^. 1) buvo pridėtas | kiekvieno lizato pavyzdį prieš pernešant į 1. 5 ml centrifugavimo mėgintuvėlius. Visi lizatų pavyzdžiai buvo centrifuguoti 13, 000xg 15 min. tam, kad atskirti ląstelių nuolaužas. Bendras ištirpusių baltymų kiekis buvo nustatomas naudojant baltymų nustatymo rinkinį Bio- Rad ( katalogo Nr 500- 0002) pagal gamintojo metodiką. Etanoliu apdoroti lizato pavyzdžiai buvo liofilizuoti alikvotomis po 5- 100 į. i1, ir suspenduojami 100 f. il matavimo buferinio tirpalo iš Dupont/ NEN Medical Products cAMP matavimo rinkinio ( katalogo Nr. NEK- 033). cAMP kiekis suspenduoto lizato pavyzdžiuose buvo nustatytas naudojant radioimuninę metodiką pateiktą kartu su rinkiniu. Pavyzdžiai tyrimui nebuvo praskiesti. Daugumoje žmogaus FSH receptoriaus- transfekuotų CHO ląstelių linijų, aukšti viduląstelinio cAMP lygiai buvo išmatuoti po FSH stimuliacijos, lyginant su kontrole ( netransfekuotos CHO-DUKX ląstelės transfekuotos su CLH3AXSV2DHFRhaIVS). Vidutinis atsakas buvo apie 16- kartų didesnis, negu kontrolėse.
[0051] Viena neklonuota ląstelių linija CHOHFSHR4Q- 13, buvo parinkta hormono atsako, priklausomai nuo dozės, analizei. Procedūra buvo panaudota ta pati, kaip ankstesniame paragrafe, išskyrus tai, kad ląstelės buvo apdorotos žmogaus rekombinantiniu FSH ar LH, 0- 10, 000 mIU/ ml koncentracija. Kiekviena dozė buvo analizuojama po tris pakartojimus. Produkuojamo viduląstelinio cAMP kiekis buvo išreikštas nanomoliais/ miligrame ( n mol/ mg) tirpaus baltymo ir nubraižytas grafikas prieš FSH ar LH kocentraciją, norint gauti atsako priklausomybės nuo dozės, kreivę. Atsako nuo FSH ir LH dozės kreivės parodytos Fig. 5. Pagal rezultatus matyti, kad CHOHFSHR4Q- 131ąstelių linija demonstruoja didžiulį išaugimą viduląstelinio cAMP, kaip atsako į stimuliaciją FSH, bet ne į LH. Pusiau maksimali stimuliacija FSH (ED50) vyksta esant FSH dozei 144 mIU/ml. Žmogaus FSH receptoriaus kDNR gali būti naudojama produkuoti biologinį funkcionalų žmogaus FSH receptoriaus baltymą CHO ląstelėse, įgalinantį ląsteles tarpininkauti specifiniam cAMP atsakui į FSH, bet ne į LH.
[0052] Žmogaus FSH receptoriaus kiekis CHOHFSHR4Q-13 linijoje, ar panašioje linijoje, kuri produkuoja žmogaus rekombinantinį FSH receptorių ar FSH-surišančius fragmentus ar mutantus, gali didėti, veikiant ląsteles palaipsniui didėjančia MTX koncentracija. Tas įtakoja amplifikaciją DHFR kDNR kopijų skaičiaus išilgai prisijungimo sekos, kuri turi žmogaus FSH receptoriaus kDNR ir tiesiogiai didina koduojamo baltymo sintezę. Tai galima atlikti, jeigu reikalinga, norint padidinti tyrimo jautrumą. Taip pat žinduolių ląstelės, kurios ekspresuoja aukštą žmogaus FSH receptoriaus, FSH-surišančių fragmentų ar mutantų lygį, gali būti naudojamos žmogaus FSH receptoriaus baltymo gamybai, terapiniams ar radioimuniniams tyrimams.
[0053] CHOHFSHR40-13, ar panaši linija, gali taip pat būti panaudojama tyrimuose įvertinant in vitro farmacinių preparatų, turinčių FSH, ar į FSH panašias substancijas, bioaktyvumą. Minėtas genas toks kaip liuciferazė, gali būti efektyviai surištas su cAMP ir cAMP lygio padidėjimas gali būti tiesiogiai išmatuojamas neradioaktyviu metodu, tokiu kaip bioliuminescencija, kuri suteikia galimybę išmatuoti FSH bioaktyvumą.
[0054] CHOHFSHR4Q-13 linija buvo deponuota su ATCC 1991 lapkričio 19, kaip papildomas numeris ATCC CRL 10921. Deponavimas buvo atliktas pagal visus Budapešto Sutarties reikalavimus.
[0055] Rekombinantinio žmogaus FSH receptoriaus bioaktyvumo stabiliose transfekuotose pelės antinksčiu Y1 ląstelėse demonstravimas
[0056] Norint nustatyti, ar sukonstruota žmogaus FSH receptoriaus kDNR konstrukcija gali produkuoti baltymą, kuris būtų biologiškai aktyvus stabiliose transfekuotose Y1 ląstelėse, G418-atsparios Y1 ląstelių kolonijos buvo paveiktos žmogaus rekombinantiniu FSH ir kultivuotos kultūrinėje terpėje, siekiant nustatyti progesterono kiekį. Progesterono nustatymui, ląstelės buvo kultivuojamos 6 šulinėlių plokštelėse (35 mm diametro šulinėlis), esant 4x10^ ląst/šulinėlyje tankiui, Y1 selekcinėje terpėje. Po dviejų dienų kultivavimo, Y1 ląstelių terpė buvo pašalinta ir pakeista 3 ml Ham'o F10 terpe, kurioje yra 5% arklio serumo, 0.8% jaučio serumo, 1% L-glutamino ir 80(.ig/ml G418. Po vienos dienos inkubacijos, terpė buvo pašalinta ir ląstelės du kartus praplautos 2ml Ham'o F10 terpe su 1 mg/ml BSA (V frakcija), 1% L-glutamino ir 80^g/ml G418 (tyrimo terpe). Šiame etape vidutinis ląstelių skaičius šulinėlyje buvo nustatomas kiekvienai ląstelių linijai, pašalinant ir suskaičiuojant ląsteles iš trijų testuojamų šulinėlių. Ląstelės po to buvo kultivuojamos 4 vai. su 1 ml tiriamosios terpės, turinčios 100 IU/ml žmogaus rekombinantinio FSH. Po inkubacijos, kultivavimo lėkštelės patalpinamos j ledą, iki to laiko, kol kultūrinė terpė iš kiekvieno šulinėlio buvo pernešta į stiklinius 12x75 centrifugavimo mėgintuvėlius. Mėgintuvėliai su kultūrine terpe buvo patalpinti į verdančio vandens vonią 10 min., po to centrifuguoti 1100xg, 4°C temperatūroje. Supernatantai pernešti į švarius 12x75 stiklinius mėgintuvėlius ir laikomi -20°C per naktį. Progesterono lygis išmatuotas naudojant Serono Diagnostics Progesterone MAIA, produkto Nrl2274, platinamas Ciba Corning, Medfield, MA. Tyrimai buvo atlikti pagal gamintojo pateiktas instrukcijas, išskyrus tai, kad kultūrinės terpės pavyzdžiai ir progesteronas standartinei kreivei buvo skiedžiami PBS, turinčiu 0.1% BSA ir 0.6% natrio azido, vietoje skiesto buferio, kuris būna rinkinyje. Progesteronas standartinei kreivei buvo gautas iš CalBiochem (kat Nr 5341) ir prieš naudojimą buvo skiestas 100% etanoliu iki 15 f.ig/ml koncentracijos. Išeiginis tirpalas buvo laikomas -70°C temp. Progesterono standartinės kreivės praskiedimų galutinės koncentracijos buvo tokios pačios, kokios rekomenduojamos rinkinyje. Po praskiedimo progesterono standartiniai tirpalai išliko stabilūs, laikant vieną savaitę 4°C.
[0057] Keletas FSH apdorotų Y1 linijų, stabiliai trasfekuotų žmogaus FSH receptoriumi, sekretavo padidintą progesterono kiekį, lyginant su kontrole (ta pati linija neapdorota FSH, netransfekuotos Y1 ląstelės bei Y1 ląstelės transfekuotos su CLH3AXSV2NEOhaIVS). Viena neklonuota linija Y1HFSHR4-38 buvo parinkta hormono dozės atsako analizei. Naudojama procedūra buvo tokia pati, kaip aprašyta ankstesniame paragrafe, išskyrus tai, kad ląstelės buvo apdorotos FSH, kurio koncentracijos buvo nuo 0-100 mIU/ml. Kiekvienos dozės tyrimas buvo atliktas su pakartojimu. Progresterono kiekis, kurį produkavo FSH stimuliuotos Y1 ląstelės buvo normalizuotas iki 1x10^ ląstelių ir nubraižytas priklausomybės nuo FSH koncentracijos grafikas, norint gauti atsako pagal dozę kreivę. Atsako pagal dozę kreivė parodyta Fig. 6. Šiame daliniame eksperimente 25 kartus išaugęs progesterono aktyvumas buvo stebimas esant 20mIU/ml žmogaus rekombinantinio FSH dozės. Ribos buvo nuo 2.5 iki 20mIU/ml ir ED50 buvo 6.4mIU/ml FSH. Šie rezultatai, rodantys kad nuo FSH dozės priklauso progesterono sekrecijos išaugimas, buvo stebimi stabiliose Y1 ląstelėse transfekuotose žmogaus rekombinantiniu FSH receptoriumi. Žmogaus FSH receptorius yra funkciškai aktyvus, kai išskirtas pelių antinksčių Y1 ląstelėse.
[0058] Ląstelių populiacijos gautos iš CHOHFSHR4Q-13 arba Y1HFSHR4-38 ląstelių linijų, ar panašių ląstelių linijų, gali būti naudojamos FSH ar panašioms medžiagoms į FSH, biotyrimų in vitro jautrumo nustatymui. Kiti FSH in vitro tyrimai, kurie yra šiuo metu naudojami, tokie kaip granuliacinių ląstelių biotyrimai ir Sertoli ląstelių biotyrimai reikalauja žiurkių pirminės ląstelių kultūros padarymo kiekvieną kartą, kai tyrimai yra atliekami. Naujiems Y1 ląstelių ir CHO ląstelių biotyrimams yra naudojama stabilių transformuotų nepertraukiamų ląstelių linija. Tai įgalina biotyrimų in vitro metodų pranašumą praktikoje, lyginant su dabartiniais metodais, nes jie yra paprasti, tikslūs ir pastovūs.
[0059]
1. Išgrynintas žmogaus folikulą stimuliuojančio hormono (FSH) receptorius, jo fragmentas ar mutantas, kuris susiriša su FSH.
2. FSH receptorius pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi aminorūgščių seką nuo 1 iki 678, parodytą ID Nr:2, o seka ID Nr2 yra šios apibrėžties dalis.
3. FSH receptorius pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad FSH receptoriaus citoplazminis domenas yra pašalintas.
4. FSH receptorius pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad FSH receptoriaus tansmembraninis domenas yra pašalintas.
5. FSH receptorius pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad FSH receptorius turi aminorūgščių seką nuo 1 iki 678, parodytą sekoje ID Nr:2, ar jos esminę dalį su iš esmės tokiomis pačiomis FSH surišančiomis savybėmis, o seka ID Nr.2. yra šios apibrėžties dalis.
6. Išskirta DNR, koduojanti žmogaus FSH receptorių, jo fragmentą ar mutantą, surišantį FSH.
7. Išskirta DNR pagal 6 punktą, besiskirianti tuo, kad išskirta DNR turi nukleotidų seką, atvaizduotą sekoje ID Nr.l, o seka ID Nr.l yra šios apibrėžties dalis.
8. DNR seka pagal 7 punktą, besiskirianti tuo, kad išskirtos DNR nukleotidų seka, koduojanti FSH receptoriaus citoplazminį domeną, yra pašalinta.
9. DNR seka pagal 8 punktą, besiskirianti tuo, kad išskirtos DNR nukleotidų seka, koduojanti FSH receptoriaus transmembraninį domeną, yra pašalinta.
10. Išskirta DNR pagal 6 punktą, besiskirianti tuo, kad jos nukleotidų seka, koduoja aminorūgščių seką nuo 1 iki 349, parodytą sekoje ID Nr.2, ar jos esminę dalį su iš esmės tokiomis pačiomis FSH surišančiomis savybėmis, o seka ED Nr.2 yra šios apibrėžties dalis.
11. Rekombinantinis ekspresijos vektorius, apimantis DNR pagal 6, 7, 8, 9 ir 10 punktus.
12. Ląstelės, besiskiriančios tuo, kad yra transfekuotos ekspresijos vektoriumi pagal 11 punktą.
13. Ląstelės pagal 12 punktą, besiskiriančios tuo, kad yra žinduolių ląstelės.
14. Žmogaus FSH receptoriaus, jo fragmento ar mutanto, kurie suriša FSH, gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad apima ląstelių pagal 12 punktą kultivavimą mitybinėje terpėje it receptoriaus išgavimą.
15. Būdas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad ląstelės yra žinduolių ląstelės.
16. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad apima žmogaus FSH receptorių, jo fragmentą ar mutantą, kurie suriša FSH, bei farmakologiškai priimtiną nešiklį.
17. Kompozicija pagal 16 punktą, turinti žmogaus FSH fragmentą, besiskirianti tuo, kad minėtas fragmentas apima žmogaus FSH receptoriaus N-galo ekstraląstelinį domeną ar jo esminę dalį su iš esmės tokiomis pačiomis FSH surišančiomis savybėmis.
18. Žmogaus FSH nustatymo, naudojant FSH receptorių, pagerintas būdas, besiskiriantis tuo, kad minėtas FSH receptorius yra išgrynintas žmogaus FSH receptorius, jo fragmentas ar mutantas, surišantis FSH.
19. Būdas pagal 18 punktą, besiskiriantis tuo, kad yra naudojamas žmogaus FSH receptoriaus fragmentas, ir šis fragmentas apima žmogaus FSII receptoriaus N-galo ekstraląstelinį domeną ar jo esminę dalį su iš esmės tokiomis pačiomis FSH surišančiomis savybėmis.
20. Išgrynintas žmogaus FSH receptorius, jo fragmentas ar mutantas, skirtas endogeninio FSH bioaktyvumo paciento organizme sumažinimui.
21. Išgryninto žmogaus FSII receptoriaus, jo fragmento ar mutanto, surišančių FSH, panaudojimas medikamentų, skirtų folikulo augimo ir subrendimo moters organizme sustabdymui, gamyboje.
22.Išgryninto žmogaus FSH receptoriaus, jo fragmento ar mutanto, surišančių FSII, panaudojimas medikamentų, skirtų spermatogenezės vyro organizme sutrukdymui, gamyboje.
23. Panaudojimas pagal 21 ir 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad kaip FSH receptoriaus fragmentą minėtų medikamentų gamyboje naudoja žmogaus FSH receptoriaus N-galo ekstraląstelinį domeną ar jo esminę dalį su iš esmės tokiomis pačiomis FSH surišančiomis savybėmis.
24. Substancijų, turinčių FSH bioaktyvumą, pavyzdžio tyrimo būdas, besiskiriantis tuo, kad įjungia rekombinantinių ląstelių linijos, esant minėtam pavyzdžiui, kultivavimą, kai minėta rekombinantinių ląstelių linija yra pritaikyta išskirti žmogaus FSH receptorių bei produkuoti nustatomą biologinį atsaką, esant FSH, o taip pat apima bet kokio biologinio atsako išmatavimą.