LT3909B

NAUJI ANTIKŪNIO-SUPERANTIGENO KONJUGATAI, JŲ GAVIMO BŪDAS, LĄSTELĖS-TAIKINIO LIZAVIMO BŪDAS IR KONJUGATŲ PANAUDOJIMAS FARMACINĖSE KOMPOZICIJOSE

NEW ANTIBODY-SUPERANTIGEN CONJUGATES, PROCESS FOR PREPARING THEREOF, PROCESS FOR TARGET CELL LYSIS AND USE OF CONJUGATES IN PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS

Referatas

[LT] Tirpstantis antikūno konjugatas, turintis antikūną, sujungtą su struktūra, kurią atpažįsta T-ląstelės, sugebančia nukreipti T-ląstelės ląstelių-taikinių, atpažįstamų antikūnu, lizavimui. Konjugatas pasižymi tuo, kad nurodyta struktūra yra superantigenas. Svarbiu aspektu yra ląstelių-taikinių lizavimo būdas, pagal kurį ląstelės-taikiniai kontaktuoja su efektyviu ląstelių-taikinių lizavimui konjugato kiekiu. Lizavimo būdas yra efektyvus vėžio, autoimuninių susirgimų, užkrėtimų parazitais ir infekcijų, sukeltų grybeliais, virusais ir bakterijomis gydymo režimo dalis. Aprašyme pateikiami taip pattokie aspektai, kaip konjugato sintezė, farmacinės kompozicijos ir jų paruošimas.

[EN]

Aprašymas

[0001] Šis išradimas skirtas antikūnų konjugatams, kurie gali aktyvinti... citotoksines T- iąsteles ( CTL) . Konjugatai naudojami suardymui nepageidaujamų ląstelių, susijusių su įvairiomis vėžio formomis, autoimuniniais procesais, parazitiniais užkrėtimais ir bakterinėmis, virusinėmis ir grybelinėmis infekcijomis.

[0002] Žinomi bandymai panaudoti antikūnus derinyje su agen-tais, darančiais tiesiogini, toksini, poveiki, ląstelėms-taikiniams ( citotoksiniai agentai, citotoksinai), užtik-rinant selektyvini, ląstelių- taikinių paveikimą ir užker-tant kelią bei sumažinant nespecifini, poveikį kitoms ląstelėms. Pasiūlytos kombinacijos apima sriti, nuo ko-valentiškai sujungtų kompleksų, panaudojant molekules-tiltelius, ir nekovalentiškai sujungtų kompleksų iki paprastų mišinių ( pvz., Ghose et al., J. Nate. Cancer Inst. 61 ( 1979) 657- 676; Karlsson et al., Biotechnology 7( 1989) 567- 73). Žinomi tokie citotoksinai, kaip difte-rijos toksinas, ricinas, ricino domenas A, geloninas ir Pseudomonas aeruginoso egzotoksinas A ( Takada Chemical Ind., EP- A- 336405 ir Pastan ir kt., WC)- A- 38/ 00703; abu šaltiniai pacituoti ryšium su prioritetine paraiška SE-9002479).

[0003] Pasirodžius hibridomų technologijai ir ją lydintiems monokloniniams antikūnams tapo galimu panaudoti komp-leksus, sudarytus iš antikūnų ir citotoksinių junginių tam, kad specifiškiau nukreipti citotoksinius agentus i, reikalingą ląstelių- taikinių populiaciją.

[0004] Kadangi žinomas citotoksinių ląstelių pažeidžiantis poveikis kitoms ląstelėms, besiskiriančioms nuo ląstelių-taikinių, pasiūlyta citotoksinius agentus pakeisti imu-nostimuliatoriais, stimuliuojančiais T- limfocitus ir aktyvuojančiais CTL. Konkretūs pasiūlymai lietė anti-kūnus, konjuguotus su:

[0005] (i) antikūnais, nukreiptais prieš T-ląstelių recepto-rius, arba junginiais, sugebančiais jungtis su T-ląstelių receptoriais (Mass. Inst. Techn., EP-AI-180171); (ii) junginiais, tokiais kaip antigenai, mitogenai, kiti svetimi baltymai ir peptidai, kurie aktyvina citotoksines T-ląsteles (Noereks Korp., EP-AI-334300); (iii) Pagrindinio audinių suderinamumo komplekso antigenais (PASKA) (Begringverco AG EP-AI-352761); (iv) antigenais, prieš kuriuos gydomasis asmuo turi imunitetą (Med. Ros. Counc. WO-A-90/II779 (skelbt. 1990.10.18)); ir (v) nei,vardintu bakteriniu enterotoksinu (Ochi ir Wake, Simpoziumas UCLA: Ląstelinis imunitetas ir vėžio terapija, 1990 m. sausio 27-vasario 30 d.d., pranešimo CE 515 tezės, 109 psl.).

[0006] Tačiau iki šiol pasiūlyti imunostimuliatoriai savo vei-kimu buvo arba labai specifiški, arba labai bendri. Pvz. , klasikiniai antigenai aktyvina tik apie I iš 10⁵ T-ląstelių, tuo tarpu kai mitogenai potencialiai gali aktyvinti daugumą iš jų.

[0007] Buvo nustatyta, kad kai kurie agentai aktyvina T-ląs-teles saikingai, t.y. jie aktyvina T-ląsteles gana aukštu dažnumu, tačiau toli gražu ne 100%. /Fleisher et al., J. Exp. Med., 157 (1988) 1697-1707; Wait et al., Cell, 56(1989)27-35; abu straipsniai įtraukti i, ši, ap-rašymą kaip nuorodos/. Šio tipo agentai yra efektyvesni aktyvintoj ai, negu klasikiniai antigenai, ir todėl jie gavo pavadinimą superantigenai/apžvalgai žr.: Keccler ir Marrac, Science 248:705, (1990)/. Toliau, buvo parodyta/Doglsten et al., Immunol. 71(1990)96-100; Chedlund et al., Cell Immunol. 129(1990) 426-34/, kad ži-nomi superantigenai gali ant ląstelių-taikinių susijungti su pagrindinio audinių suderinamumo komplekso (PASK) II Klasės molekulėmis ir aktyvinti citotoksines T-ląs-teles, turinčias T-ląstelės receptoriaus variabilios zonos beta-grandinę. Paskelbti duomenys rodo, kad jun-gimasis su PASK yra būtina išankstinė sąlyga tam, kad i,vyktų T-ląstelių surišimas ir aktyvacija. Negalima atmesti ir tai, kad ateityje bus rasti superantigenai, veikiantys per T-ląstelės receptoriaus variabilios zonos alfa-grandinę, arba per kitas paviršiaus struk-tūras, esančias T-ląstelių subpopuliacijose.

[0008] Superantigeno- Staphylococcus enterotoksino A imunomodu-liuojantis poveikis taip pat buvo aprašytas Platsokus et al., /Cell Immunol., 97(1986)371-85/.

[0009] Daugumai dabar žinomų superantigenų anksčiau buvo nustatyta, kad jie yra toksinai ir yra mikrobinės kilmės. Stafilokokų enterotoksinai, pvz., yra enterotoksiški ir aktyvina T-ląsteles, ir šie du efektai skiriasi vienas nuo kito/Fleisher et al., Cell Immunol., 118(1989)92-101; Alber et al., J. Immunol., 144(1990)₄501-06; ir Infact. Immun. 59(1991)2126-34/.

[0010] Anksčiau buvo pasiūlyta panaudoti superantigenus tam, kad nukreipti CTL vykdomą lizavimą ląstelių, turinčių II Klasės pagrindinio audinių suderinamumo komplekso antigenus (PASKA), (Farmacia AB, WO-A-91/04053, pa-skelb. 1991.04.04). WC)-A-91/04053 apima superantigenus, bet nemini įjungtų i, kovalentinius imunokonjugatus. Ląstelės, neturinčios II Klasės PASK baltymų, arba eks-presuojančios šių baltymų slenkstinius kiekius, nesu-riša pakankamų superantigenų kiekių, kad efektyviai nu-kreiptų jų lizę CTL. Tokiu būdu, dėl didelio bendro kiekio ląstelių, nešančių II Klasės PASKA ir dėl mažo kiekio II Klasės PASKA ant daugumos vėžinių ląstelių, superantigenai neturi turėti didelės vertės tokių ne-pageidaujamų ląstelių specifinio sunaikinimo požiūriu.

[0011] Tačiau, mūsų buvo aptikta, kad ląstelių naikinimo, vyk-domo CTL, specifinis efektas gali būti pasiektas super-antigenų pagalba, jeigu jie kovalentiškai sujungti su antikūnu prieš epitopą, kuris yra specifinis naiki-namą jai ląstelei. Imuninės sistemos aktyvacija gali iš-šaukti II Klasės PASKA ekspresiją ląstelėmis-taikiniais, neturinčiomis šių antigenų, kas, savo ruožtu, gali padaryti galimu pageidaujamą lizuojanti, efektą.

[0012] Šis išradimas apima (i) naujus antikūnų konjugatus, tu-rinčius (I) antikūną prieš ląsteles-taikinius, ir (2) su-perantigeną. t.y. struktūrą, kuri atpažįsta (sąveikauja ir/arba susijungia) ir aktyvina T-ląsteles, ypatingai

[0013] CTL; (ii) ląstelių-taikinių suardymo būdus, ypatingai ryšium su terapiniais žinduolių gydymo metodais, ir T-ląs- . telių, tokių kaip CTL, specifinio aktyvumo būdus;

[0014] (iv) turinčias konjugatus farmacines kompozicijas ir šių kompozicijų paruošimo būdus.

[0015] Ląstelių-taikinių sunaikinimo būdai apima terapinio vė-žio, virusinių, bakterinių, grybelinių infekcijų, para-zitinių užkrėtimų ir kitų susirgimų gydymo metodus, kuriuose pagrindinis tikslas yra tam tikrų ląstelių sunaikinimas, pasiekiant aukštą tikslumo laipsni,. Sutinkamai su šiuo išradimu, konjugatai gali būti pa-naudojami gaunant farmacines kompozicijas, skirtas ląs-telių-taikinių, susijusių su aukščiau paminėtais su-sirgimais, suardymui. Gydymo objektai yra žinduoliai, pirmoje eilėje žmonės.

[0016] Nauji antikūnų konjugatai pasižymi struktūra, kurią at-pažįsta T-ląstelės, kadangi ji yra superantigenas. Paprastai konjugatai tirpsta prie fiziologinių pH reikš-mių, o ir vitro jie tirpsta serume.

[0017] Geriausiu atveju superantigenus renka iš stafilokokų enterotoksinų (SE) grupės, tokius, kaip SEA, SEB, SEC, SED, ir SEE, toksoidų, jų aktyvių fragmentų arba pep-tidų, ir kitų junginių, pasižyminčių iš esmės tokiu pat veikimo charakteriu CTL aktyvinime. Į superantigenus gali įeiti kiti mikrobiniai produktai (bakteriniai ir virusiniai) , tokie, kaip produktai iš stafilokokinių štamų, pvz., toksinio šoko sindromo toksinai (TSST-I) iš Strept. okocci, pvz., pirogeninis egzotoksinas A, ir bakteriniai ekzoproteinai ir baltymai, gaminami pleuro-pneumonioidinių mikroorganizmų, turinčių panašų suge-bėjimą sąveikauti su T-ląstelėmis taip, kaip sąveikauja su jomis superantigenai. Superantigenai gali būti gau-nami auginant jų gamtinius gamintojus arba ląsteles, gautas geninės inžinerijos metodais (rekombinantiniais metodais), ir potencialiai - taip pat peptidine sin-teze. Superantigenas, naudojamas šio išradimo rėmuose, bandant jį ant pateikiamo šiame aprašyme eksperimen-tinio modelio, turi parodyti veikimą, analogišką tam, kuris pristatytas šio aprašymo eksperimentinėje dalyje.

[0018] Optimalūs superantigenai turi potencialų sugebėjimą susijungti su T-ląstelių paviršiaus 1-40 % izoformų poli-morfinio baltymo, susijusio su CTL aktyvacija, opti-maliausia - su T-ląstelės receptoriaus variabilios zonos beta-grandine.

[0019] Antikūnas geriausiu atveju yra monokloninis antikūnas (monAK), nors gali būti panaudoti ir polikloniniai antikūnai, jei jie turi pakankamai siaurą specifiškumo intervalą. Terminas "antikūnas" yra taikomas antikūnams visumoje, ir, tokiu būdu, apima antikūnų aktyvuosius fragmentus ir kitas molekules, imituojančias antikūnų surišamąja, sugebėjimą, su sąlyga, kad jie pasižymi atitinkamu specifiškumu, aviditetu ir giminingumu duo-tos ląstelės-taikinio atžvilgiu. Į čia įeina genų inži-nerijos metodais (rekombinantiniais metodais) gauti an-tikūnai, antikūnų dariniai, ir kitos struktūros su pa-našiu surišimo sugebėjimu. Viename išradimo realizavimo variante antikūnas yra specifinis vėžinių ląstelių antigeninei determinantei, pvz., determinantei, susi-jusiai su storosios žarnos vėžiu (epitopas, struktūra). Taip pat suprantama, kad antikūnas gali būti specifinis antigeninei determinantei ant atsakingų už autoimuninę reakciją ląstelių, ląstelių, užkrėstų virusu, bakte-rijų, parazitų, grybelių arba kitų nepageidaujamų ląs-telių. Priklausomai nuo konjugato efektyvumo, antikūnas gali būti nukreiptas prieš antigeną, internalizuojanti antikūną po sujungimo, nors ir yra požiūris, kad tokie specifiniai antikūnai nėra optimaliausi.

[0020] Ryšium su šiuo išradimu, ištirtais monokloniniais an-tikūnais yra antikūnas C215 prieš GA-733 šeimos anti-geną /žr. pvz., EP-A-376746 ir cituotas šiame šaltinyje nuorodas, ir Larsson et al., Int. J. Canc. 42(1988)877-82/, antikūnas C242 /Larsson et al. Int. J. Canc. 42(1988)877-82/ ir antikūnas Thy-1.2 /monAK C, Opitz et al., Immunobiol. 160(1982)438-/. Suprantama, kad gali būti panaudoti monokloniniai AK, specifiški kitoms ląs-telių-taikinių paviršinėms struktūroms. Paruošimas mo-nokloninių antikūnų prieš epitopus, unikalių pasirink-toms ląstelėms-taikiniams, gerai žinomas. Žiūrėk, pvz., anksčiau minėtas publikacijas. Tokie išsireiškimai, kaip " monokloniniai antikūnai prieš C242- epito_ pą arba " C215- epitopą", apima antikūnus, reaguojančius su kryž-mai reaguojančiais epitopais.

[0021] Iš trijų išbandytų monokloninių antikūnų C125- konjugatai, pagal viską, mažiausiai įdomūs, kadangi jie reaguoja su epitopu vėžio antigene, kuris labai dažnai ekspresuojasi normaliose ląstelėse. C242- konjugatai, išeinant iš specifiškumo duomenų, atrodo labiau pers-pektyvūs, nors mūsų rezultatai rodo, kad jie gali pa-reikalauti didesnių dozių. MonAK C prieš Thy- 1. 2, gal-būt, nebus vertingi kovoje su žmogaus vėžinėmis ląste-lėmis, kadangi antigenas Thy- 1. 2 yra specifiškas ne žmogaus, o kitų žinduolių vėžio ląstelėms.

[0022] Linija hibridomos ląstelių, gaminančių monoklonini, an-tikūną C242, buvo padėta saugoti į Europos Gyvulinių ląstelių kultūrų kolekciją, Porton Down, Selisberi, Wilts, England, 1990. 01. 26, Nr. ECACC 90012601.

[0023] Struktūra, sujungianti superantigeną su antikūnu

[0024] Sutinkamai su šiuo išradimu, tinkamame konjugate superantigenas kovalentiškai sujungtas su antikūnu per kova-lentinę jungtį- tiltelį (- B-) . Svarbu, kad konjugatas nesuirtų panaudojant ji, prieš ląsteles, skirtas sunaikinimui, pvz., įvedant gyvuliui. Todėl tiltelis turi būti metaboliškai atsparus gana ilgą laiką, kad būtų pasiektas efektas. Be to, reikia, kad pats tiltelis ne-sukeltų imunologinių reakcijų. Bendrai, tiltelis turi būti inertinis ta prasme, kad konjugatas išsaugotų aukš- tą specifiškumą susirišant su ląstelėmis- taikiniais ( priešvėžini,, priešvirusinį ir 1. 1.) ir didelį suge-bėjimą aktyvinti citotoksines T- ląsteles.

[0025] Mokslinėje ir patentinėje literatūroje buvo pasiūlyta keletas funkcinių grupių, galinčių atlikti tiltelių vaidmend, imunokonjugatuose. Atitinkamai, tiltelis -B-siūlomuose naujuose konjugatuose gali turėti struk-tūras, pasirinktas iš grupės, sudarytos iš: (i) amidų ir hidrazidų (amidai -CONR_j arba -NR_jCO-, kur kiekvienas iš laisvų valentingumų sujungtas su sočiuoju anglies atomu, o R_} gali būti vandenilis ar alkilas, toks, kaip žemesnioji alkilo grupė (C_į.g) arba gamtinės alfa-ami-norūgšties alfa-N-pakaitas, geriausiai, hidrofilinės aminorūgšties; ir hidrazidai -CONHNH- arba -NHNHOC-, kur kiekvienas iš laisvų valentingumų sujungtas su so-čiuoju anglies atomu;

[0026] (ii) tioeterių ir disulfidų (-Sr-, kur kiekvienas iš laisvų valentingumų betarpiškai sujungtas su sočiuoju anglies atomu, S yra sieros atomas, ir r yra sveikas skaičius, lygus 1 arba 2); (iii) nešakotų, šakotų arba ciklinių angliavandenilių, kurie yra sotūs ir gali turėti vieną ar keletą hidroksilo ar aminogrupės pakaitų; (iv) eterių (-0-, kur kiekvienas laisvas valentingumas betarpiškai sujungtas su sočiuoju anglies atomu); ir (v) pirminių aminų arba dipakeistų hidrazinų (-NH- arba -NH-NH-, atitinkamai, kur kiekvienas iš laisvų valen-tingumų betarpiškai sujungtas su sočiuoju anglies atomu) .

[0027] Tiltelio ilgis yra ribose, naudojamose šioje srityje, tai yra mažiau, negu 180 atomų, pvz., mažiau negu 100 atomų, bet turi būti daugiau negu 3-6, geriausia, daugiau, negu 16 atomų.

[0028] Tinkamesnis tiltelis yra hidrofilinis ir jame neturi būti kokių nors aromatinių ciklų. Tinkamesnėmis hid-rofilinėmis struktūromis, kurios gali sudaryti tiltelio - B- dali,, yra: ( i) gamtinių hidrofilinių alfa- ami-norūgščių polipeptidinės grandinės ( pvz., asparagino rūgšties ir jos amido, gliutamino rūgšties ir jos amido, lizino, arginino, glicino, treonino, serino, ir, gal būt, taip pat histidino) ; ( ii) oksialkileninės gran-dinės, tokios kaip /- O ( CH2) n/ n< , kur n yra sveikas skai-čius nuo 2 iki 5, geriau 2 arba 3, ir n' gali būti sveikas skaičius nuo I iki 20; ir ( iii) - S- ( tio-eteriai), - O- ( eteriai) ir nepakeisti amidai (- CONH-) , kiekvienas iš kurių sujungtas su trumpomis nepakeis-tomis angliavandenilinėmis grandinėmis ( C^,,) , geriau, turinčiomis I ar 2 anglies atomus.

[0029] Hidrofilinės aminorūgštys gali būti hidrofilinėse tipo / F-( 02o) n/ mF struktūrose, kur F yra aminorūgščių seka, geriau, iš 4- 8 liekanų, kur kiekviena aminorūgštis pa-sirenkama iš serino, glicino ir treonino, m yra sveikas skaičius nuo 1 iki 4, ir n yra sveikas skaičius nuo 4 iki 8 ( Cetus Corp., WO- A- 85/ 03508).

[0030] Tiltelis - B- gali būti pritvirtintas arba konkrečiose vietose antigeno ar superantigeno dalyse konjugate, ar-ba atsitiktinėse vietose. Potencialios vietos yra amino galas, karboksilo galas ir lizino liekana ( omega- ami-nogrupė). Jei antikūne ar superantigene yra merkapto grupė arba disulfido grupė ( cistinas arba cisteinas, atitinkamai) , tai šios grupės taip pat gali būti naudojamos kovalentiniam sujungimui, jei tik jos nevaidina esminio vaidmens aktyvių konjugato dalių darbe. Anglia-vandenių struktūros, jei jos yra, gali būti oksiduotos iki aldehidų grupių, kurios, savo ruožtu, gali būti panaudotos sujungimui su kita konjugato dalimi ( Cetus Corp., EP- A- 240200).

[0031] Konjugate, siūlomame šiame išradime, neturi būti daug esterinių ir labilių amidinių jungčių, ypač sudaromų tirozinų ir histidinų liekanų, atitinkamai. Jei sinte-zuojant susidarė tokios jungtys, jas reikia pašalinti naudojant hidroksilaminą /Endo et al., Cancer Res. 48(1988)3330-3335/. Konjugate esančių superantigeninių fragmentų, tenkančių vienam aktyviam AK fragmentui, skaičius, paprastai sudaro 1-5, dažniausiai 1 arba 2.

[0032] Gerame variante konjugatas turi būti iš esmės vientisas superantigenas/antikūnas proporcijos atžvilgiu, ir/arba panaudotų surišimo vietų superantigene ir antikūne, atitinkamai, ir/arba tiltelio -B- atžvilgiu, ir pan. Kitaip sakant, visos atskiros konjugato molekulės, su-darančios konjugatą kaip medžiagą, turi būti vienodos šių besikeičiančių charakteristikų atžvilgiu.

[0033] Medžiaga turi būti iš esmės laisva nuo nesurištų anti-kūnų arba superantigenų.

[0034] Tikslus santykis superantigenas/antikūnas, tiltelio struktūra ir pan., optimaliame konjugate priklauso nuo pasirinkto monokloninio antikūno (įskaitant klasę, poklasį, produkuojantį kloną, specifiškumą) ir pasirinkto superantigeno. Pateikti šiame aprašyme ekspe-rimentiniai modeliai leidžia atrinkti pagal optimalius parametrus taip pat ir kitus superantigenus ir anti-kūnus .

[0035] Pagal išradimo realizavimo variantą, labiausiai ištirtą iki paraiškos padavimo datos, tiltelis -B- turi struk-tūrą :

[0036] Laisvi valentingumai formulėje I sujungti su aktyviomis dalimis, atitinkamai. Tai yra betarpiškai, arba per kitas dvivalentes inertines strukturas, esančias til-telyje -B-.

[0037] n yra sveikas skaičius didesnis už O, pvz., 1-20, geriau 2 arba daugiau 2, ir daugeliu atvejų mažiau 10. m lygus 1 arba 2.

[0038] S yra sieros atomas, ir kiekvienu savo valentingumu sujungtas betarpiškai su anglies atomu (-Sr- yra tio-eteris ar disulfidas), r lygus 1 ar 2.

[0039] Y yra -NH-, -NHNH-, arba -NHN=CH- grupės, kurios savo kairiaisiais galais surištos su CO grupe, pavaizduota dešiniojo I formulės galo dalyje, o savo dešiniuoju galu - su sočiu anglies atomu arba su karboksilo grupe (tiktai, jeigu Y yra -NHNH-).

[0040] R, geriau, yra alkileno grupė (turinti nuo 1 iki 4 anglies atomų, dažniausiai, 1 ar 2 anglies atomus), kuri gali būti pakeista viena ar keliomis (1-3, tin-kamiausiu atveju mažiau negu 2) hidroksilo grupėmis.

[0041] Sutinkamai su šiuo išradimu antikūnų konjugatai gali būti gauti prisotinimo keliu ir jų išskyrimo iš produ-kuojančių juos ląstelių kultivavimo terpės, arba iš kitų terpių, kuriose jie buvo susintetinti.

[0042] Naujų konjugatų sintezė gali būti įvykdyta žinomais šioje srityje metodais, pvz., genų inžinerijos metodais (rekombinantiniais metodais) arba iš atitinkamo anti-kūno ir antigeno, klasikinių kondensacijos reakcijų pagal tinkamas funkcines grupes pagalba. Baltymuose yra ir paprastai naudojamos šios funkcinės grupės: ( i) Angliavandenių struktūros. Ši struktūra gali būti oksiduota iki aldehidų grupių, kurios, savo ruožtu, reaguoja su junginiais, turinčiais H₂NNH- grupę, susidarant - C=NH- NH- grupei.

[0043] ( ii) Merkapto grupė ( HS-). Merkapto grupė gali reaguoti su junginiu, turinčiu grupę, galinčią sąveikauti su merkapto grupe, susidarant tioeterio grupei arba disulfido grupei. Laisvos merkapto grupės yra baltymuose cistinų liekanose, ir gali būti įvestos i, baltymus tio-linant arba suskaldant disulfidus gamtinių cisteinų liekanose.

[0044] ( iii) Laisvos aminogrupės ( H2N-) aminorūgščių liekanose. Aminogrupės gali reaguoti su junginiais, turinčiais elektrofilinę grupę, tokią kaip aktyvuota karboksilo grupė, susidarant amido grupei. Geriau, laisva ami-nogrupė yra lizino liekanos galinė aminogrupė arba omega- aminogrupė.

[0045] ( iv) Laisvos karboksilų grupės aminorūgščių liekanose. Karboksilo grupė gali būti paversta aktyvuota karboksilo grupe, kuri po to reaguoja su junginiu, turinčiu aminogrupę, susidarant amido grupei. Tačiau turi būti imtasi atsargumo priemonių, kad minimaliai susidarytų amidų su aminogrupėmis, kurios yra greta karboksilo grupių tame pačiame baltyme. Dažnai laisva karboksilo grupė yra galinė karboksilo grupė arba karboksilo grupė dvibazinėje alfa- aminorūgštyje.

[0046] Junginiai, turintys H₂NNH- grupę, galinčią reaguoti su merkapto grupe, aktyvuota karboksilo grupe ar amino-grupė, gali būti bifunkciniu kondensacijos reagentu, arba antikūnu, ar superantigenu. Grupės sujungiamos be-tarpiškai su sočiu anglies atomu, išskyrus H₂NNH- gru-pę, kuri, kaip alternatyva, gali būti sujungta su karbonilo anglies atomu. Grupės gali buti įvestos i, anti-kūną arba superantigeną paprasto pakeitimo pagalba.

[0047] Rekombinantiniai metodai yra efektyvios priemonės gavi-mui konjugatų, kuriuose dalys specifiškai sujungtos viena su kita jungtimi tarp galinės karboksilo grupės vienoje dalyje su galine aminogrupe kitoje dalyje. Taip pat gali būti įvesta jungiančioji struktūra, suderinama su naudojamu metodu.

[0048] Naudojami reagentai parenkami tokiu būdu, kad gautų apibūdintą anksčiau tiltelį -B-. Įprasti bifunkciniai reagentai turi formulę Z -B'-Z', kur Z ir Z' yra funk-cinės grupės, suderinamos viena su kita, įgalinančios realizuoti kovalentinį sujungimą su funkcine grupe, esančia baltyme. Žr. aukščiau, B yra inertinis tiltelis, kuris gali turėti tas pačias struktūras, kaip ir anksčiau paminėtas tilteliui -B-. Konkrečiai, Z ir Z¹ gali būti vienodi ar skirtingi ir parenkami iš merkapto grupės, grupės, galinčios reaguoti su merkapto grupe, aktyvuotos karboksilo grupės, -CONHNH₂, ir 1.1. Šių grupių apibūdinimą žr. toliau, poskyriuje "Nauji reagentai" .

[0049] Į mūsų vartojamų konjugatų, naudotų eksperimentinėje dalyje, gavimo būdą įeina:

[0050] (i) antikūno ir superantigeno reakcija su organiniu reagentu, turinčiu grupę, galinčią reaguoti su merkapto grupe, ir grupę, galinčią reaguoti su aminogrupe, gaunant antikūną arba superantigeną, turintį grupę, galin-čią reaguoti su merkapto grupe, ir (ii) superantigeno ir antikūno likusios dalies reakcija su organiniu reagentu, turinčiu merkapto grupę, ir gru-pę, galinčią reaguoti su amino grupe, gaunant super-antigeną arba antikūną, turinti, merkapto grupę arba blokuotą merkapto grupę, po ko (iii) stadijose (i) ir (ii) gauti produktai sąveikauja vienas su kitu, susidarant konjugatui, kuriame superantigenas sujungtas su antikūnu disulfidine ar tioeterine jungtimi.

[0051] Kondensacijos sąlygos kiekvienai grupei baltymų che-mijoje žinomos. Kondensacija gali vykti stadijomis arba vienoje stadijoje, susidarant tarpinėms funkcinėms gru-pėms, kurios gali būti prijungtos prie pradinių medžia-gų inertiniais speiseriais. Bendru atveju, sąlygos, kuriose vykdoma sintezė ir valymas/konjugato išskyrimas, visuomet yra tokios, kad nesukeltų naudojamų baltymų denatūracijos. Paprastai tai yra vandeninės terpės, pH reikšmių diapazonas - nuo 3 iki 10, ir temperatūra - nuo 0 iki 50°C. Konkrečios sąlygos priklauso nuo to, kokios grupės reaguoja ir koki, konjugatą reikia iš-skirti. Detaliau žr. poskyryje "Nauji reagentai".

[0052] Nauji reagentai ( sukurti ryšium su šiuo išradimu)

[0053] Konjugatų, turinčių -B- tilteli,, cheminei sintezei buvo sukurtas naujas heterobifunkcinis reagentas, turintis bendrą formulę II:

[0054]

[0055] ( ii) aktyvuota merkapto grupė, geriau, taip vadinamas reaktingas disulfidas (- SSR^ , sujungtas su sočiuoju anglies atomu;

[0056] Reaktingo disulfido apibūdinimas, žr. pvz., EP- A- 125885, duotas šiame aprašyme nuorodoje.

[0057] Z ' x yra aktyvuota karboksilo grupė, tai yra, elektro-filinė grupė. Pavyzdžiais yra karboksirūgščių halogen-anhįdridai (- C0C1, - COBr ir - COJ), karboksirūgščių miš-rūs anhidridai (- COGCRJ , reaktingi esteriai, tokie kaip N- sukcinimidiloksi karbonilas, - C( =NH)- OR2, 4- nit-rofenilkarboksilatas (- C0- 0C6H4N02) ir 1. 1. R_x ir R₂ gali būti žemesnieji alkilo radikalai ( C^- Cg) ; be to, R₂ gali būti taip pat benzilo grupė.

[0058] Vienas iš naujų reagentų pranašumų yra tai, kad jie įgalina gauti vienalytį konjuguotą junginį sveiko skai-čiaus n reikšmių struktūroje ( OCH2CH2) n atžvilgiu, t. y. n yra vienodas kiekvienai atskirai duoto konjuguoto junginio molekulei.

[0059] Funkcinės grupės, reaguojančios su Z ' x ir Zx gali būti gamtinėse antikūnų ir superantigenų molekulėse, arba jos gali būti i, jas įvestos. Po to galinės Z ' x ir Zx grupės gali selektyviai reaguoti su atitinkamais anti-kūnu ar superantigenu būdais, žinomais šių tipų gru-pėms .

[0060] Į žinomas metodikas įeina grandinės, kurią pradeda nuo naujo reagento, arba nuo junginių, kuriuos reikia kon-

[0061] juguoti, liginimas. Grandinės liginimas, panaudojant naują reagentą, gali duoti konjugatą, kuriame -B- yra:

[0062]

[0063] R, R' ir R" yra alkileno grupės, parenkamos kaip ir R formulėje (I) . r turi tokias pat reikšmes, kaip išvar-dinta anksčiau.

[0064] Reagentą (formulė II) galima gauti, panaudojant jun-ginius, turinčius formulę III:

[0065] kur m yra 1 arba 2, n yra sveikas skaičius nuo 1 iki 20, pavyzdžiui, 2-20 arba 3-9.

[0066] Kai kurių junginių, turinčių formulę III, kur m = 1 ir 2, ir n = 1-10, sintezė buvo aprašyta anksčiau„/Juljen et al., Tetrahedron Letters, 29(1988)3803-06; Hougton, Saubi, Synth. Commun. 19(18) (1989)3199-3209; ir EP-A-410280 (atsp. 20.1.91) ir Šlama and Rando, Carbohydrate Research 88(1981)213-221 ir Biochemistry 19(1980)4595-4600).

[0067] Naujuosius reagentus, turinčius formulę II, galima gauti reaguojant junginiui, turinčiam formulę III, su bifunkciniais reagentais, turinčiais formulę Z-B'-Z¹, kur Z=Z₁, B¹ =R", turintiems tas pačias reikšmes, kaip ir anksčiau aprašytosios R ir R', ir Z' yra aktyvuota karboksilo grupė pagal anksčiau duotą apibūdinimą. Po reakcijos -COOH grupė tampa aktyvuota karboksilo grupe, pvz., Z'n - aktyvuotas esteris, toks kaip N-sukcinimi-diloksikarbonilas, 4-nitrofeniloksikarbonilas, 2,4-di-nitrofeniloksikarbonilas, 2,4-dinitrofeniloksikarboni-las, ir t.t.

[0068] Nauji junginiai, turintys formulę (III) ir jų naujieji dariniai, yra polieteriai, turintys bendrą formulę

[0069]

[0070] kur n yra sveikas skaičius nuo 2 iki 20, geriau, 3-20 arba 3-9; X yra NH₂ - grupė, įskaitant jos protonuotą formą (+H3N-) , arba pakeista -NH₂ grupė, iš kurios gali būti gauta -NH₂ grupė, geriau, hidrolizės ar redukcijos būdu. Pavyzdžiais yra nepakeista aminogrupė (H2N-) , nitrogrupė, amido (karbamido) grupė, tokia kaip že-mesniojo alkilamido grupė (formilamido) acetilamido... heksanoilamido), įskaitant ir acilamido grupes, tu-rinčias elektronoakceptorinius pakaitus prie anglies alfa-atomo acilinėje dalyje, ypač CF₃CONH-, CH₃COCH₂CONH-, ir 1.1.; ftalimidoilo grupė, kuri gali turėti pakaitą žiede; karbamato grupė (ypač R'_jOCONH- ir

[0071] (R'į - OCO) (R'₂ -OCO)N- taip pat N-(tret-butiloksikar-bonil)-amino (Bok), N-(benziloksikarbonil)amino ir di(N-benziloksikarbonil)-amino (Z ir di Z, atitinkamai) , kurie turi pakaitus žiede; alkilamino grupė, kurioje anglies atomas, sujungtas su azoto atomu, yra alfa-padėtyje aromatinės sistemos atžvilgiu, tokia kaip N-monobenzilamino, N,N-dibenzilamino, N-tritilamino (trifenilmetilamino) ir 1.1., įskaitant ir analogiškas grupes, kuriose metilo anglies atomas (įskaitant benzilo anglies atomą) pakeistas silicio atomu (Si), tokie kaip N,N-di(tret-butilsilil) amino; ir 4-okso-l,3,5-triazin-l-ilas, įskaitant turinčius žemesniuosius alkilo pakaitus 3 ir/arba 5 padėtyje.

[0072] Anksčiau ir toliau R₂ ir R₂ yra žemesniojo alkilo grupė, ypač antrinio ir tretinio alkilo grupė, ir metilo grupė, pakeista 1-3 fenilo grupėmis, kurios, savo ruožtu, gali būti pakeistos. Žemesniojo alkilo Ir žemesniojo acilo grupė turi 1-6 anglies atomus.

[0073] Y yra karboksilo grupė (-COOH, įskaitant -C00-), arba grupė, kurią galima paversti į karboksilą, geriau hid-rolizinant arba oksiduojant. Svarbiausiomis grupėmis yra esterinės grupės, kuriose karbonilo anglies atomas arba atitinkamas atomas ortoesteriuose sujungtas su metilo grupe dešiniajame formulę (I) turinčio junginio gale. Pavyzdžiais yra alkilesterinės grupės (-COOR'_:); ortoeterinės grupės (-C(OR'₃)₃) r reaktingos esterinės grupės pagal anksčiau pateiktą apibūdinimą. R'₃turi tas pačias reikšmes, kurios buvo apibrėžtos anksčiau R'j.

[0074] Kitomis grupėmis yra -CHO, -CN, -CONH₂, -CONR₁R₂, kur R_į ir R₂ turi tas pačias reikšmes, kaip ir anksčiau.

[0075] Formulę IV turintį junginį galima susintetinti panau-dojus žinomas pradines medžiagas, žinomų būdų kombi-nacijų pagalba. Tinkamais sintezės būdais yra:

[0076] C) Simetrinio poliesterio transformacija i, nesimetrini eteri,. D) Bisimetrinės grandinės suskaidymas i, du vienodus

[0077] Tinkami pradiniai junginiai, turintys besikartojančią grandį -OCH₂CH₂-, yra komerciškai prieinami. Pavyzdžiais gali būti oligoetilenglikoliai, turintys nuo 2 iki 6 pasikartojančių grandžių. Kitais tinkamais junginiais su vienodomis galinėmis grupėmis yra atitinkamos dikar-boninės rūgštys ir diaminai.

[0078] Tinkamomis pradinėmis medžiagomis, turinčiomis skir-tingas galines grupes, yra omega-hidroksimonokarbok-sirūgštys, kuriose galinės grupės perskirtos grynu polietilenoksidiniu tilteliu. Tokie junginiai, turintys iki 5 pasikartojančių grandžių, buvo aprašyti anksčiau /_Nakadzui, Kavamura, Okahara, Synthesis (1981), p. 42 /.

[0079] Pagal ši, išradimą farmacinės kompozicijos sudarytos iš receptūrų, žinomų šioje srityje, bet jose yra mūsų nauji konjugatai. Kompozicijos gali būti liofilizuotų dalelių pavidalo, sterilių ar aseptiškai paruoštų tirpalų pavidalu, tabletės, ampulės ir 1.1. Jose gali būti nešėjai, tokie kaip vanduo (geriau buferis, fi-ziologinių pH reikšmių, pavyzdžiui, fosfatinis druskų buferis (FDB)), arba kita inertinė kieta ar skysta me-džiaga .

[0080] Bendrais bruožais, kompozicija ruošiama maišant, tir-pinant, surišant arba kokiu tai kitu būdu kombinuojant konjugatą su vienu ar keletu vandenyje netirpiais ar vandenyje tirpiais, vandeniniais ar nevandeniniais ne-šėjais, ir, jei reikia, su tinkamais priedais ir ad-juvantais. Būtina, kad nešėjai ir sąlygos neturėtų neigiamos įtakos konjugato aktyvumui. Pats vanduo taip pat yra nešėjų tarpe.

[0081] Paprastai konjugatai yra kieti ir naudojami iš anksto paruoštomis dozėmis, kiekvienoje kurių yra efektyvus konjugato kiekis, kuris, remiantis pateiktais rezul-tatais, yra nuo 10 jxg iki 50 mg. Tiksli dozė keičiasi nuo vieno atvejo iki kito, ir priklauso nuo paciento svorio ir amžiaus, vartojimo būdo, susirgimo pobūdžio, antikūno, superantigeno, tiltelio (-B-), ir t.t.

[0082] Vartojimo būdas atitinka žinomiems paminėtoje srityje, t.y. efektyvus ląstelei-taikiniui lizuoti. Konjugato kiekis arba terapiškai efektyvus konjugato kiekis pagal šį išradimą kontaktuoja su ląstelėmis-taikiniais. Anks-čiau paminėtuose atvejuose tai dažniausiai reiškia parenteralinį vartojimo būdą, toki, kaip injekcija arba įšvirkštimas (po oda, į veną, į arteriją, į raumenis) į žinduolio, pvz., žmogaus, organizmą. Konjugatas gali būti įvestas gydymo objektui lokaliai ar sistemiškai.

[0083] "Efektyviu ląstelių-taikinių lizavimui kiekiu" supran-tamas toksai kiekis, kuris efektyviai aktyvuoja ir nukreipia CTL ląstelių-taikinių sunaikinimui.

[0084] Išradimas iliustruojamas keletu realizavimo variantų, kurie jokiu būdu neapriboja šį išradimą. Eksperi-mentinės dalies I skyriuje parodyta konjugatų cheminė sintezė, o II skyriuje - T-ląstelių aktyvacija 4 kon-jugatų pavyzdžiu ląstelių-taikinių lizavimui.

[0085] Omega- amino- DEG- karboksirūgšties gavimas Izopropil- 8- hidroksi- 3, 6- dioksa- oktanoatas ( I)

[0086] Į dietilenglikold, (500 ml) azoto atmosferoje dedamas porcijomis natris drožlių pavidalu (23 g, 1,0 mol). Po to, kai natris pilnai sureaguoja, mišinys atšaldomas iki kambario temperatūros, ir maišant pridedama bromacto rūgštis (76 g, 0,5 mol). Reakcija vykdoma 18 va-landų 100°C temperatūroje, po to dietilenglikolio perteklius nudistiliuo jamas apie 4 mm Hg stulpelio slė-gyje. Po to pridedamas izopropilo alkoholis (400 ml) ir porcijomis - acetilchloridas (51 g, 0,65 mol). Maišoma 16 vai. 65°C temperatūroje, po to atšaldoma iki kambario temperatūros ir neutralizuojama natrio acetatu (3,5 g, 0,15 mol). Mišinys filtruojamas, filtratas nugarinamas sausai, ir liekana tirpinama vandenyje (200 ml). Vandens fazė ekstrahuojama 1,1,1-trichloretanu (3 kartus po 50 ml) . Gautosios organinės fazės praplaunamos vandeniu (20 ml) . Produktas ekstrahuojamas iš apjungtų vandeninių fazių dichlormetanu (50 ml) , kuri, išgarinus lieka alyva (55 g).

[0087] Į trietilenglikolį (700 ml) azoto atmosferoje porcijomis dedamas natrio (23 g, 1,0 mol) drožlių pavidalu. Po to, kai natris pilnai sureaguoja, mišinys atšaldomas iki kambario temperatūros ir maišant pridedama bromacto rūgšties (76 g, 0,5 mol). Reakcija vykdoma 18 vai. 100°C temperatūroje, po to trietilenglikolio perteklius nugarinamas distiliuojant apie 4 mm Hg stulpelio slė-

[0088] gyje. Po to pripilamas izopropiloalkoholis (400 ml) ir porcijomis acetilchloridas (51 g, 0,65 mol). Po 18 vai. maišymo 65°C temperatūroje mišinys ataušinamas iki kambario temperatūros ir neutralizuojamas natrio acetatu (3,5 g, 0,15 mol). Mišinys filtruojamas, filtratas nugarinamas beveik sausai, ir liekana tirpinama vandenyje (200 ml) . Vandeninė fazė ekstrahuojama 1,1,1-trichloretanu (3 kartus po 50 ml) . Gautos organinės fazės praplaunamos vandeniu (20 ml) . Produktas ekstrahuojamas iš apjungtų vandens fazių dichlormetanu (50 ml) , kuri, nugarinus gaunama alyva.

[0089] ¹H-BMR (CDC1₃), 6 (m.d.): 1,25 (d, 6H) ; 3,07 (s, 2H) ; 3,6-3,8 (m, 12H); 4,11 (s, 2H); 5,09 (m, 1H).

[0090] 8-( N- ftalimidoil)- 3, 6- dioksa- oktanolis ( 3)

[0091] 8-chlor-3,6-dioksa-oktanolis (365 g, 2,2 mol, gautas iš trietilenglikolio ir S0C1₂) tirpinamas dimetilformamide (400 ml) ir maišant pridedamas kalio ftalimidas (370 g, 2,0 mol) . Po 16 vai maišymo 110°C temperatūroje di-metilformamidas nugarinamas, esant sumažintam slėgiui. Liekana suspenduojama toluene (1,5 1) 40-50°C tempe-ratūroje ir nufiltruojamas kalio chloridas. Produktas kristalinamas šaldant (-10°C) . Antra frakcija gaunama iš nuovarvų, jas koncentruojant ir kartojant krista-linimo procedūrą.

[0092] ?H BMR (CDC13) , 6 (m.d.): 2,90 (s, 1H) ; 3,51-3,58 (m, 2H); 3, 60-3,68 (m, 6H) ; 3,73-3,78 (t, 2H) ; 3,89-3,94 (t, 2H); 7,70-7,89 (m, 4H).

[0093] Izopropil- 17-( N- ftalimidoil)- 3, 6, 9, 12, 15- pentaoksa-heptadekanoatas. ( 4)

[0094] Į 8-(N-ftalimidoil)-3,6-dioksa-oktanolio (3) (8,5 g, 36 mmol) ir trifluormetano sulforūgšties anhidrido (10,2 g, 36 mmol)

[0095] tirpalą dichlormetane prilašinamas, maišant apie -5°C temperatūroje, piridinas (2,8 ml, 35 mmol) dichlormetane (30 ml) . Maždaug po 30 min organinė fazė praplaunama 0,5 M druskos rūgštimi ir vandeniu. Po džiovinimo natrio sulfatu ir filtravimo pridedamas izopropil-8-hidroksi-3,6-dioksa-oktanoatas (I) (12 g, 48 mmol) ir Na₂HP0₄ (6,5 g, 46 mmol), ir mišinys in-tensyviai maišomas kambario temperatūroje 20 valandų. Reakcijos mišinys filtruojamas, ir filtratas nugarinamas. Liekana paskirstoma tarp 1,1,1-trichloretano ir vandens. Nugarinus organinę fazę, gaunama alyva (13 g).

[0096] ?H BMR (CDC13) , 8 (m.d.): 1,26 (d, 6H) ; 3, 58-3,76 (m, 18H) ; 3,90 (t, 2H) ; 4,11 (s, 2H) ; 5,09 (m, 1H) ; 7,70-7, 89 (m, 4H) .

[0097] 17-( N- ftalimidoil)- 3, 6, 9, 12, 15- pentaoksa- heptadekano rūgštis ( 5)

[0098] Izopropil-17-(N-ftalimidoil)-3,6,9,12,15-pentaoksa-heptadekanoatas (4) (13 g) tirpinamas tetrahidrofurane (50 ml) ir druskos rūgštyje (kone., 50 ml) . Reakcija vykdoma 16 valandų kambario temperatūroje, po to tirpalas praskiedžiamas vandeniu (200 ml), ir tetra-hidrofuranas nugarinamas sumažintame slėgyje. Vandeninė fazė praplaunama toluenu (1 kartą) ir ekstrahuojama dichlormetanu (2 kartus). Džiovinama natrio sulfatu ir, nugarinus organinę fazę, gaunamas alyvos pavidalo produktas (8,5 g).

[0099] ¹H BMR (CDCI3) , 5 (m.d.): 3, 57 - 3,75 (m, 18H) ; 3,91 (t, 2H); 4,11 (s, 2H); 4,8 (pl.p, 2H); 7,65 - 7,90 (m, 4H).

[0100] Izopropil- 17- amino- 3, 6, 9, 12, 15- pentaoksa- heptadekanoa-tas ( 6) 17- (N-ftalimidoil) -3, 6, 9,12, 15-pentaoksa-heptadekano rūgštis (5) (8,5 g) ištirpinama 150 ml etanolio ir 3 ml hidrazino hidrato. Tirpalas maišomas 16 vai kambario temperatūroje, po to pripilama HC1 (100 ml, 3 M) , ir tirpalas kaitinamas 3 vai su grįžtamuoju šaldytuvu. Atšaldžius iki kambario temperatūros ir nufiltravus, pašarminama iki pH 9, pridėjus NaOH, ir filtratas nugarinamas beveik sausai, po to parūgštinama HC1 iki pH 4 ir nugarinama sausai. Produktas apdorojamas izo-propanoliu (100 ml) ir acetilchloridu (2 ml) esant kambario temperatūrai visą naktį, ir tirpalas nugarinamas. Liekana tirpinama vandenyje ir ekstrahuojama dichlormetanu esant šarminiam pH (7-11). Nugarinus, gaunamas produktas (3,3 g).

[0101] ^XH BMR (CDC13) , 5 (m.d.): 1,26 (d, 6H) ; 3,17 (t, 2H) ; 3, 65-3, 80 (m, 18H) ; 4,16 (s, 2H) ; 6,07 (m, 1H) .

[0102]

[0103] 1 Pavyzdys 17-jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekano rūgšties N-hidroksisukcinimidinio esterio gavimas

[0104] A. 17- jodacetilamino- 3, 6, 9, 12, 15- pentaoksaheptano rūgš-ties ( A) gavimas

[0105]

[0106] Izopropil-17-amino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoatas (žr. Eksperimentinės dalies I skyrių) (1,1 g, 3,2 mmol) ištirpinamas 3 ml 1 M natrio hidroksido tirpalo, ir paliekama kambario temperatūroje 30 minučių. Pripilama 1,6 ml 8 M druskos rūgšties, ir mišinys nugarinamas sausai. Liekana tirpinama dichlormetanu ir filtruojama, ir, nugarinus tirpikli,, gaunama 545 mg 17-amino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekano rūgšties. 460 mg (1,39 mmol) šio junginio ištirpinama 10 ml boratinio buferio, pH 8,4. Tirpalo deaeracija atliekama dujiniu azotu. Per 1 minutę sulašinamas 432 mg (1,52 mmol) N-sukcinimidil-2-jodacetato tirpalas 5 ml dioksano, palaikant pH 8,4, pridedant 5 M NaOH. Reakcijos mišinys maišomas 15 minučių, leidžiant azotą. Plonasluoksnės chromato-grafijos duomenimis (eliuentas : CH₂Cl₂-MeOH, 50:35) reakcija baigiasi per keletą minučių. Po 15 minučių parūgštinama iki pH₃, tirpalas užšaldomas ir lio-filizuojamas. Reakcijos mišinys frakcionuoj amas kolo-nėlėje su reversinėmis fazėmis PHP-RPC HP 30/26 (Farmacia, Biosystems AB) , naudojant acetonitrilo gra-dientą nuo 0 iki 13 %, esant 0,1 % trifluoracto rūgšties, su vėlesniu padalinimu 13 % acetonitrilo, 0,1 % TFAR (trifluoracto rūgštis) . Reikiamo piko frakcijos apjungiamos ir liofilizuojamos, gaunama 351 mg 17-jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekano rūgšties (A). Išeiga: 76 %.

[0107] Produkto struktūra nustatyta BMR spektroskopijos metodu. ¹H BMR spektre (D₂0) buvo gautos šios 8 (m. d.) reikšmės:

[0108]

[0109] Reakcijos ampulėje sveriamas hidroksisukcinimidas (4,5 mg, 39 Įimol) . 17-jodacetilamino-3, 6, 9,12,15-pentaoksaheptadekano rūgštis (A) (18,3 mg, 39 pnol) tirpinama 0,55 ml sauso dioksano ir supilama d, ampulę. Ampulė deaeruojama dujiniu azotu, po to d, ją lašinamas 0,8 mg (39 |^mol) dicikloheksilkarbodiimidas 0,15 ml sauso dioksano. Am-pulė užpildoma dujiniu azotu, užkemšama ir patalpinama tamsoje. Reakcijos mišinys maišomas 3,5 valandos, su-sidariusios nuosėdos pašalinamos filtruojant. BMR-ana-lizė parodė, kad filtrate gautasis produktas B sudaro 89 %.

[0110] 2 Pavyzdys (17-jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksahep-tadekamoilamino)-imunoglobulino (C) gavimas A. Monokloninis antikūnas monAK C215

[0111]

[0112] n = 4, 7, 9, 12, 14, 18

[0113] Į ampulę pridedamas imunoglobulino klasės Ig62a monokloninis antikūnas (monAK C215) (34 mg, 0,218 (amol) , ištirpintas 17,7 ml 0,1 M boratinio buferio, pH 8,1, kuriame yra 0,9 % natrio chlorido. Į buferini, tirpalą pripilama 146 jai dioksano tirpalo, turinčio 3,6 mg (6,4 |imol) 17-jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekano rūgšties N-hidroksisukcinimidinio esterio (B) ir reakcija vykdoma iki užbaigimo maišant kambario tem-peratūroje 25 minutes. Reakcijos ampulė uždengiama fol-ga, kad nepatektų šviesa. Reagento B perteklius paša-linamas frakcionuojant kolonėlėje su Sephadex G 25 K 26/40, naudojant eliuentu 0,1 fosfatini, buferį, pH 7,5, turintį 0,9 % NaCl. Surenkamos ir apjungiamos frakcijos, kuriose yra reikiamas produktas C. Tirpalas (22 ml) koncentruojamas Amicon gardelėje per YM 30 filtrą iki 8 ml tūrio. Koncentracija ir pakeitimo laipsnis nustatomas aminorūgščių analize. Jie sudaro 4,7 mg/ml ir

[0114] Pagal metodiką, aprašytą 2A Pavyzdyje reakcija atliekama imunoglobulininio Ig GI klasės monokloninio anti-kūno (monAK C242) su 15-, 20- ir 22-kartiniu 17-jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekano rūgšties N-hidroksisukcinimidinio esterio (B) molių pertekliais, gaunant nona-, dodeka-, ir tetradeka(17-jodacetilamino-3, 6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilamino)-monAK C242, atitinkamai (C) .

[0115] Pagal metodiką, aprašytą 2A Pavyzdyje, imunoglobulinų klasės Ig G 2a monokloninis antikūnas (monAK C) veikiamas 17-jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekano rūgšties N-hidroksisukcinimidinio esterio 14- ir 18-kartiniu molių pertekliais, gaunant tetra- ir hep-ta (17-j odacetilamino-3, 6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoil-amino)-monAK C, atitinkamai, (C).

[0116] 3 Pavyzdys Stafilokokų enterotoksino A (SEA), žymėto 2-merkaptopropionilamino-Eu³⁺ gavimas

[0117]

[0118] SEA (liofilizuotas produktas, gautas Toksin technology inc.) (2 mg, 72 nmol) ištirpinamas 722 įo.1 vandens ir patalpinamas i, 15 ml izopropileno vamzdeli,. Pridedama 100 |xl 0,1 M boratinio buferio, pH 5,6, o po to 2160 nmol Eu³⁺ komplekso su chelatais (Farmacia Vallac Oi) 178 (ii milli-Q. Reakcija pilnai i,vyksta per nakti, kambario temperatūroje. Reagentų perteklius pašalinamas frakcionuoj ant reakcijos mišinį kolonėlėje su Sephadex G 25 PD 10 (Farmacia Biosystems AB), naudojant eliuentu 0,1 M fosfatini, buferi,, pH 8,0. Frakcijos, turinčios norimą produktą D, apjungiamos. Tirpalas (3 ml) koncentruojamas Amicon gardelėje per YM5 filtrą iki 0,8 ml tūrio. Koncentracija, nustatyta aminorūgščių analizės būdu, sudarė 1,7 mg/ml. Pakeitimo laipsnis, nustatytas ly-ginant su standartiniu EuC1₃ tirpalu, sudarė 0,8 Eu³⁺/SEA.

[0119] BI. 3-(2-piridiltio) propionilamino-Eu3+-žymėto SEA (E) ir 3-merkaptopropionilamino-Eu^3+-žymėto SEA (F_:) gavimas

[0120]

[0121] Į anksčiau paminėtąjį reakcijos mišinį pridedama 20 p.1 0,2 M Eu³⁺ citrato tirpalo ir 50 p.1 2 M acto rūgšties, kad nustatytų pH iki 5,0. Po to pripilama 3,1 mg ditiotrentolo (Merk) 0,1 ml-tre 0,9%-nio natrio chlorido tirpalo, ir reakcijos mišinys maišomas 20 min kambario temperatūroje. Po to bendras tūris padaromas iki 1 ml pridedant 50 fil 0,9 % natrio chlorido tirpalo. Reakcijos tirpalas patalpinamas i kolonėlę (1 ml), užpildytą Sephadex G25 NAP 10 (Farmacia Biosystems AB) ir norimas produktas F_j išplaunamas 1,5 ml 0,1 M fosfatiniu buferiu pH 7,5, turinčiu 0,9 % natrio chloridą. Išskirtas

[0122] produktas F! surenkamas 15 ml izopropileno vamzdelyje ir tuoj pat panaudojamas produkto G sintezei, kad iš-vengtų disulfidinio produkto oksidacijos.

[0123] B2. 2-merkaptopropionilaminostafilokokų enterotoksino A (SEA) (F₂) gavimas

[0124]

[0125] Gamtinis SEA (liofilizuotas produktas, Toksin Technology Inc.), ar gautas rekombinantiniais metodais SEA (rSEA) veikiami N-sukcinimidil-3-(2-piridiltio)propionato dvigubu molių pertekliumi pagal metodiką, aprašytą 3BI pavyzdyje.

[0126] Pakeitimo laipsnis, nustatytas UV analizės metodu pagal Karlsson ir kt. /Biochem. J. 173(1978)723-737/ yra 1,9 merkaptopropionilo grupių vienai SEA molekulei.

[0127] 4 Pavyzdys SEA monokloninio antikūno konjugato (G_j arba G₂) gavimas

[0128]

[0129] Į tirpalą 4-merkaptopropionilamino-Eu^3+-žymėto SEA (F) , aprašyto 3B pavyzdyje, pripilama oktadeka (17-jodo-acetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilamino)monAK C215 (C) (4 mg) 1,2 ml 0,1 M fosfatinio buferio, tu-

[0130] rinčio 0,9 % natrio chlorido, pH 7,5. Reakcija pasi-baigia per naktį kambario temperatūroje. Nesurea-gavusios jodoalkilo grupės blokuojamos pridedant 5 įj.1 (1,2 _Įimol) merkaptoetanolio tirpalo, gauto ištirpinus 20 (al viename ml vandens. Reakcijos tirpalas paliekamas 4 valandoms kambario temperatūroje, po ko filtruojama. Filtratas frakcionuoj amas kolonėlėje, užpildyta Superos 12 HR 16/50 (Farmacia Biosystems AB), naudojant eliuentu 0, 002 M fosfatinį buferį, pH 7,5, turintį 0,9 % natrio chlorido. Frakcijos, kuriose yra galutinis produktas G, apjungiamos ir analizuojamos. Pagal amino-rūgščių analizės duomenis baltymo kiekis sudaro 0,22 mg/ml. Pakeitimo laipsnis, nustatytas pagal Eu³⁺ kiekį, yra viena SEA molekulė vienai IgG molekulei. Produktas buvo tirtas, kad nustatytų imunostimuliuo-jančias savybes ir antikūno sujungimo gebą.

[0131] Didinant junginio (F) kiekį junginio (C) kiekio atžvil-giu, gaunamas didesnis pakeitimo laipsnis.

[0132]

[0133] Oktadeka (17-jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksahepta-dekanoilamino)monAK C215 (C) veikiamas 2-merkaptopropionilamino-rSEA (F₂) 1,8-gubu molių pertekliumi, pagal metodiką, aprašytą 4A pavyzdyje. Konjugato sudėtis analizuojama elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje, esant natrio dodecilsulfatui (DSN-PAGE), esant Phast-Gel TM gradientui 4-15, ir juostos, skanuojamos Phast IMAGE pagalba (Pharmacia Biosystems AB) . Gautas konjugatas yra sudarytas iš 6 % monAK C215 su 3 SEA, 15 % su dviem SEA, 28 % su vienu SEA ir 51 % nepakeisto monAK C215.

[0134] Kitame bandyme naudojamas 2,7-gubas F₂ molinis perteklius, gaunant šios sudėties konjugatą: 15 % monAK C215 su trim SEA, 25 % su dviem SEA, 34 % su vienu SEA ir 26 % nepakeisto monAK C215.

[0135] Pagal metodiką, aprašytą 4A pavyzdyje, tetradeka (17-jodoacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilami-no)monAK C242 (C) veikiamas 3,2-gubu 2-merkaptopropionilamino-rSEA (F₂) molių pertekliumi. Konjugato su-dėtis analizuojama, kaip aprašyta 4B pavyzdyje, gaunant šiuos rezultatus: 4 % monAK C242 su keturiais SEA, 12 % su trim SEA, 28 % su dviem SEA, 36 % su vienu SEA ir 20 % nepakeisto monAK C242.

[0136] Vykdoma tokia pat reakcija, tik prieš frakcionuoj ant kolonėlėje, produktas 4 valandas apdorojamas 0,2 M hidroksilamino nestabilių jungčių tarp monAK C242 ir speiserio ir tarp SEA ir merkaptopropionilo grupės paša-linimui. Gautas konjugatas yra šios sudėties: 1 % monAK C242 su keturiais SEA, 12 % su trim SEA, 27 % su dviem SEA, 36 % su vienu SEA ir 24 % nepakeisto monAK.

[0137] C2. Pagal metodiką, aprašytą 4A pavyzdyje, dodeka (17-jodoacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilami-no)monAK C242 veikiamas trigubu 2-merkaptopropionilamino-rSEA (F₂) molių pertekliumi. Gautas konjugatas yra šios sudėties: 6 % monAK C242 su trim SEA, 26 % su dviem SEA, 36 % su vienu SEA ir 31% nepakeistas monAK C242 .

[0138] C3. Pagal metodiką, aprašytą 4A pavyzdyje, nona(17-jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilami-no)monAK C242 (C) veikiamas trigubu 2-merkaptopropionilamino-rSEA (F₂) molių pertekliumi. Gautas konjugatas yra šios sudėties: 15 % monAK C242 su dviem SEA, 39 % su vienu SEA ir 46 % nepakeisto monAK C242.

[0139] DI. Pagal metodiką, aprašytą 4A pavyzdyje, hepta(17-jodo-acetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilami-no)monAK veikiamas 2-merkaptopropionilamino-rSEA (F₂) 5,4-kartiniu molių pertekliumi. Konjugato sudėtis analizuojama, kaip aprašyta 4B pavyzdyje, gaunant šiuos rezultatus: 15 % su keturiais SEA, 24 % su trim SEA, 29 % su dviem SEA, 19 % su vienu SEA, 3 % nepakeisto monAK C ir 10 % dimero.

[0140] Ta pati reakcija vykdoma esant 0,2 M hidroksilamino nestabilioms jungtims tarp monAK C ir speiserio ir tarp rSEA ir merkaptopropionilo grupės pašalinimui. Gautas konjugatas yra šios sudėties: 11 % monAK C su trim SEA, 24 % su dviem SEA, 30 % su vienu SEA, 18 % nepakeisto monAK C ir 17 % dimero.

[0141] D2. Pagal metodiką, aprašytą 4B pavyzdyje, tetra (17-jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilami-no)monAK C veikiamas 2-merkaptopropionilamino-rSEA (F₂) 5,7-kartiniu molių pertekliumi. Konjugatas yra šios sudėties: 8% monAK C su keturiais SEA, 18 % su trim SEA, 30 % su dviem SEA, 26 % su vienu SEA, 5% nepakeisto monAK C ir 12 % dimero.

[0142] 5 Pavyzdys. /17-(3-merkaptopropionilamino)-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilamino/-rSEA (H) gavimas

[0143] A. 17-/ 3-( 2- piridiltio) propionilamino/- 3, 6, 9, 12, 15- pen-taoksaheptadekanoilamino- rSEA ( H) gavimas

[0144]

[0145] 17-/3-(2-piridiltio)propionilamino/-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekano rūgšties N-hidroksisukcinimidinio esterio (0,53 mg, 896 nmol) tirpalas 43 (il dioksano įpilamas i, 3,65 mg (128 nmol) rSEA tirpalo viename ml 0,1 M fosfatinio buferio, pH 7,5, turinčio 0,9 % natrio chlorido. Reakcija baigiasi per 30 min kambario tem-peratūroje. Paimama 100 (il pakeitimo laipsnio analizei. Likusioji dalis saugoma užšaldyta iki jos redukavimo i, produktą.

[0146] Pakeitimo laipsnis nustatomas pašalinus druskas iš 100 ja.1 reakcijos mišinio kolonėlėje, turinčioje Sephadex G50 NICK (Farmacia Biosystems AB) ir analizuojant eliuatą UV-spektroskopijos metodu pagal Karlsson ir kt. /Biochem. J., 173(1978)723-737/. Su rSEA sujungta 2,7 speiserio.

[0147] B. / 17-( 3- merkaptopropionilamino)- 3, 6, 9, 12, 15- pentaok-saheptadekanoilamino/- rSEA ( I) gavimas

[0148]

[0149] Reakcijos tirpalas, turintis produktą H (0,9 ml) pa-rūgštinamas iki pH 4,4 2 M HC1, ir pridedama 2,9 mg ditiotrentolo, ištirpinto 75 (al 0,9%-nio natrio chlorido tirpalo. Redukcija įvyksta per 30 min. Reakcijos mišinys tiekiamas i, kolonėle su Sephadex G 25 NAP 10 (Farmacia, Biosystems AB) ir išplaunamas 1,5 ml 0,1 M fosfatinio buferio, pH 7,5, turinčio 0,9 % natrio chlorido, po to tuoj pat naudojamas produkto J sintezei pavyzdyje II.

[0150] 6 Pavyzdys. SEA-monokloninio antikūno konjugato J su dvigubu speiseriu gavimas

[0151]

[0152] Dodeka (17-jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptade-kanoilamino)monAK C242 (B) (4,2 mg, 27 mmol, 0,1 ml 0,1 M fosfatinio buferio, pH 7,5, turinčio 0,9 % natrio chlorido) 43 valandas tamsoje reaguoja azoto atmosferoje su /17 —(3-merkaptopropionilamino)-3,6,9,12,15-pentaoksoheptadekanoilamino/-rSEA (I) (1,17 mg 42 nmol I ml anksčiau nurodyto buferio). Po to pridedama 1,14 jxmol merkaptoetanolio. Dar po 1 vai reakcijos mišinys skirstomas kolonėlėje Superdex 200 HR 16/55. Produktas išplaunamas 2 mM fosfatiniu buferiu, pH 7,5, turinčiu 0,9 % natrio chlorido. Frakcijos, turinčios galutini, produktą J, apjungiamos ir analizuojamos, kaip aprašyta 4B pavyzdyje. Konjugatas susideda iš 9% monAK C242 su dviem SEA, 25 % su vienu SEA ir 60 % nepakeisto monAK C242.

[0153] Superantigenas- antikūnas konjugatų poveikis ląstelėms

[0154] Sekančiuose eksperimentuose bakteriniu toksinu buvo pa-naudotas Staphylococcus A enterotoksinas (SEA), gautas iš Toksin Technology ( Viskonsin, JAV), arba pagamintas kaip rekombinantinis baltymas E . coli ląstelėse.

[0155] Antikūnais buvo C215, C242 ir Thy- 1. 2 monAK. C215 yra Ig G2a monAK prieš žmogaus storosios žarnos vėžio ląs-telių liniją ir ant kai kurių žmogaus storosios žarnos ląstelių linijų reaguoja su baltyminiu antigenu, tu-rinčiu 37 kD masę. Nuorodos šiems monAK buvo pateiktos anksčiau. Konjugatų paruošimas aprašytas pirmame skyriuje.

[0156] Iki paraiškos įteikimo datos ( prioriteto datos) buvo tik atlikti tyrimai su Eu³⁺ - žymėtais konjugatais SEA-C215 monAK. Sekančiais metais buvo patvirtinti rezultatai nežymėtiems konjugatams SEA- 215, SEA- 242 ir SEA-Thy- 1. 2 monAK. Čia pateikti rezultatai gauti su nežy-mėtais konjugatais.

[0157] Nustatymui citotoksiškumo, indukuojamo konjugatu SEA-C215 monAK ir nekonjuguotais SEA ir C215 monAK, atžvilgiu storosios žarnos vėžio ląstelių, neekspre-suojančių II Klasės PASKA, arba ekspresuoj ančių mažus ir nedetektuojamus II Klasės PASKA kiekius, mes pa-naudojome įvairias žmogaus T- ląstelių linijas, paveiktas SEA, kaip efektorines ląsteles, ir storosios žarnos ląstelių sluoksnį ir Raji ląsteles, ekspre-suojančias II Klasės PASKA ( II+ Klasės PASKA), kaip ląsteles- taikinius. Storosios žarnos vėžio ląstelių linijos Colo 205, SW 620 ir WiDr II Klasės PASKA neekspresuoja, kas buvo nustatyta dažymo monAK prieš HLA- DR, HLA- DP ir HLA- DQ ir aktyvuojamos fluorescencija ląstelių analizės pagalba. T- ląstelių linijos, apdorotos SEA, buvo gaunamos iš periferinio kraujo pagalba savaitinių restimuliacijų paveiktomis mitomicinu C II⁺ PASKA limfomos BSM ląstelėmis, iš anksto padengtomis SEA, Dalyvaujant rekombinantiniam IL- 2 ( 20 vienetų/ ml). Šios T- ląstelių linijos pasižymėjo dideliu citotok-siškumu atžvilgiu Raj i arba BSM ląstelių, padengtų SEA, bet ne atžvilgiu neturinčių padengimo, arba ląstelių, padengtų stafilokokų enterotoksinu B (SEB). Šis indukuojamas SEA sunaikinimas priklauso nuo SEA sąveikos ant ląstelės-taikinio su II Klasės PASKA, kaip nustatyta panaudojant blokuojančius antikūnus HLA-DR, mu-tantines Raji ląsteles, neekspresuojančias II Klasės PASKA (II" Klasės PASKA) ir L-ląsteles, transfektuotas HLA-DR /Doglsten et al., Immunology 71(1990)96-100/. Šias T-ląstelių linijas pasirodė galima aktyvinti konjugatu C215-SEA, storosios žarnos vėžio C215+II"Klasės _PASKA ląstelių sunaikinimui. Priešingai, nekonjuguoti SEA ir C215 monAK pasirodė nesugebantys iššaukti daugiau negu marginalini, sunaikinimą T-ląstelėmis storosios žarnos vėžio C215+II Klasės PASKA ląstelių. Indu-kuotas ląstelėmis citotoksiškumas, priklausomas nuo stafilokoko enterotoksin-antikūnas konjugato, priklauso nuo konjugato SEA-C215 monAK surišimo su C215⁺vėžinėmis ląstelėmis. Šio surišimo specifiškumas buvo pademonst-ruotas tuo, jog perteklius nekonjuguoto monAK C215, bet ne C242 ir W8/32 monAK, inhibuoja storosios žarnos vė-žio ląstelių lizę. T-ląstelės CD4⁺ ir CD8⁺ naikina storosios žarnos vėžio C215⁺ ląsteles, paveiktas SEA-C215, bet nelizuoja ląstelių, paveiktų SEA. Matomai, T-ląs-telių sąveika su konjugatu SEA-C215 monAK, surištu su navikinės ląstelės Il'Klasės PASKA, apima sąveiką su T-ląstelės receptoriaus variabilios dalies beta-grandinės specifinėmis sekomis būdu, analogišku anksčiau demonst-ruotam SEA iššaukiamam II⁺Klasės PASKA ląstelių sunaikinimui. Tai buvo parodyta SEA-specifinės, bet ne auto-loginės SEB-specifinės T-ląstelių linijos sąveikos su C215-SEA konjugatu pagalba. Konjugatai C242 monAK ir Thy-1.2 monAK rodo aktyvumą, analogišką konjugato C215 monAK aktyvumui.

[0158] Žymėjimas chromu ir ląstelių- taikinių inkubavimas su

[0159] SEA

[0160] 0, 75 x 10⁶ ląstelių-taikinių ir 150 |aCi ⁵¹Cr (American Corp., Arlington Heits, Anglija) inkubavo 100 jj.1 tūryje 45 minutes. Ląsteles laikė pilnoje terpėje, turinčioje RPMI-1640 terpę (Gibko, Peizli, Didžioji Britanija), papildytoje 2,8 % (tūris/tūris) 7,5 NaHC0₃, 1 % natrio piruvato, 2 % 200 mM 1 - glutamino, 1 % Hepes, 1 % 10 mg/ml gentamicino ir 10 % veršelio embriono serumo (VES, Gibko, Peizli, Didžioji Britanija). Po inkubavimo ląstelės buvo vieną kartą praplautos pilnoje terpėje be VES, inkubuotos prie 37°C 60 min, praplautos ir resu-spenduotos pilnoje terpėje, turinčioje 10 % VES. Į kiekvieną iš lizdelių, 96 lizdelių mikrolitrinėse lėkš-telėse U pavidalo dugnu (Costar, Cambridg, JAV) buvo pridėta po 5xl0³ ląstelių-taikinių.

[0161] Į lizdelius buvo pridėta įvairiais santykiais ląstelės-efektoriai/ląstelės-taikiniai efektorinių ląstelių. Kiekviename lizdelyje galinis tūris sudarė 200 |al. Kiekvieną išbandymą kartojo tris kartus. Lėkšteles inkubavo 37°C temperatūroje 4 vai, po to buvo surinktas išsiskyręs chromas. ⁵¹Cr kiekis buvo nustatytas gama-skaitliuku (Cobra, Auto-gamma, Paccard). Citotoksiškumo procentas buvo nustatinėjamas pagal formulę:

[0162]

[0163] X reiškia chromo išsiskyrimą (imp/min vienetais) , gautą bandomajam pavyzdyje, M reiškia spontanini chromo iš-skyrimą ląstelėmis-taikiniais, inkubuotomis su terpe, ir T reiškia pilną chromo išsiskyrimą, gautą inku-buojant ląsteles-taikinius su 1 % natrio dodecil-sulfatu.

[0164] Konjugatai SEA-C242, SEA-C215 ir SEA-anti-Thy-1.2 monAK susiriša su ląstelėmis, ekspresuojančiomis atitinkamus monokloninių antikūnų epitopus, atitinkamai, ir su II⁺ Klasės PASKA ląstelėmis. Iš kitos pusės, nekonjuguotas SEA susiriša tiktai su II⁺ Klasės PASKA ląstelėmis. Ne-konj uguoti monokloniniai antikūnai C215, C242 ir Thy-1.2 susiriša su ląstelėmis, ekspresuojančiomis atitinkamus epitopus, tačiau ne su Raj i ląstelėmis ( 1 Lent.).

[0165] Žmogaus T-ląstelių linijos lizuoja linijų SW620, Colo 205 ir WiDr II" Klasės PASKA ląsteles, esant konjugatui SEA-C215 monAK, bet nelizuoja esant nekonjuguotiems SEA ir C215 monAK (I pav.). Storosios žarnos vėžio ląstelių lizė vyko prie 10-100 ng/ml SEA-C215 monAK konjugato koncentracijų. Aukšti ližės rodikliai įvairiuose efek-torius/taikinys santykiuose buvo stebėti SEA-215 monAK santykyje su SW620 (I pav.). Atvirkščiai, nekonjuguoti SEA arba C215 monAK neindukuoja citotoksiškumo SW620 ląstelių atžvilgiu visuose bandytuose efektorius-tai-kinys santykiuose. Šitas rodo, jog sugebėjimas lizuoti Colo 205 linijos II" Klasės PASKA ląsteles yra susijęs su konjugatu ir neiššaukiamas nekonjuguotais SEA ir C215 monAK. SEA ir konjugatas SEA-C215 monAK, bet ne C215 monAK indukuoja II⁺ Klasės PASKA Raji ląstelių ir paveiktų interferonu Colo 205 linijos II⁺Klasės PASKA ląstelių sunaikinimą T-ląstelėmis.

[0166] Tam, kad parodyti, jog i, indukuojamą SEA-C215 monAK konjugatu lizę įjungiamas specifinis konjugato suri-šimas su C215 monAK molekule ant ląstelės-taikinio, pravestas inhibavimo tyrimas su nekonjuguotų C215 monAK ir C242 monAK pertekliumi, kuris susijungia su paša-liniu antigenu ant storosios žarnos vėžio ląstelių

[0167] (C215 monAK surišimo atžvilgiu). monAK C215 pridėjimas stipriai inhibuoja citotoksiškumą, tuo tarpu kai C242

[0168] monAK nerodo jokio poveikio (Fig. 2). Analogiškai, lizė SEA-C242 monAK konjugatu specifiškai inhibuojama pertekliumi nekonjuguoto C242 monAK, bet ne C215 monAK.

[0169] SEA-C215 monAK konjugato sugebėjimas iššaukti pri-klausomą nuo T-ląstelių storosios žarnos vėžio SW620 linijos II Klasės PASKA ląstelių lizę buvo stebimas ir CD4⁺ ir CD8⁺ T-ląstelių populiacijoms. SEA neaktyvina nei vieno iš šių T-ląstelių poklasio, ir neindukuoja SW620 linijos ląstelių sunaikinimo, bet lizuoja II⁺Kla-sės PASKA Raji ląsteles (2 Lentelė).

[0170] Konjugatas SEA-C215 monAK sukelia SW620 ir Raji ląs-telių lizę linija T-ląstelių, paveiktų SEA, bet ne linija T-ląstelių, paveiktų SEB (Fig. 3) . SEA- ir SEB-linijų selektyvumą rodo jų selektyvinis atsakas atitinkamai, X SEA ir SEB, kontaktuojant su Raji ląs-telėmis (Fig. 4) . Tai rodo, jog SEA-C215 monAK konjugatas išsaugo specifiškumą T-ląstelės receptoriaus variabilios dalies beta-grandinės atžvilgiu, analogišką specifiškumui nekonjuguoto SEA.

[0171] 1 fig. SEA-C215 monAK konjugatas nukreipia CTL prieš storosios žarnos vėžio Il'Klasės PASKA ląsteles. Kai-riajame viršutiniame grafike parodytas CTL, jautrių SEA, poveikis SW620 ląstelėms, esant įvairiems efek-torius/taikinys santykiams, nedalyvaujant (-) arba dalyvaujant SEA-C215 monAK konjugatui, SEA, C215 ir mišiniui C215 ir SEA (C215+SEA) ■, esant kiekvieno priedo 1 |J.g/ml koncentracijai. Kituose grafikuose parodytas SEA-C215 monAK konjugato ir SEA sugebėjimas nukreipti SEA jautrias CTL prieš storosios žarnos vėžio SW620, Colo205 ir WiDr linijų Il'Klasės C215⁺PASKA ląsteles, paveiktas interferonu Colo 205 II⁺Klasės PASKA C215⁺ląs-telės ir Raji II⁺Klasės PASKA C215" ląsteles. Efek-

[0172] torius/taikinys santykis lygus 30:1. Pridėjimas nekonjuguoto C215 monAK kai kuriose koncentracijose nenu-kreipia CTL prieš šių linijų ląsteles. Aktyvuojama fluorescencija ląstelių analizė, naudojama SW620, Colo 205 ir WiDr ląstelėms, panaudojant monAK prieš HLA-DR, -DP, -DQ, neaptiko kokios nors paviršinės II Klasės PASKA ekspresijos, tuo tarpu kai buvo stebima gausi HLA-DR-,-DP, ir -DQ ekspresija ant Raji ląstelių, ir HLA-DR ir -DP ant paveiktų interferonu Colo 205 ląs-telių. Colo 205 ląstelės prieš panaudojant CTL-teste, 48 valandų laikotarpyje buvo veiktos 1000 vnt/ml re-kombinantiniu gama-interferonu. 2 fig. Indukuojamo SEA-C215 monAK ir SEA-C242 monAK konjugatais CTL nukreipimo prieš storosios žarnos vėžio ląsteles priklausomybė nuo antigeninio monAK selekty-vumo. Colo 205 ląstelių, jautrių SEA CTL, lizė, esant SEA-C215 monAK ir SEA-C242 monAK (3 |J.g/ml) konjugatams inhibuojama pridėjus atitinkamai nekonjuguotų C215 ir C242 monAK (30 |xg/ml) . Nekonjuguoti monAK arba kontro-linė terpė (-) buvo pridedama ląstelėms-taikiniams 10 min iki konjugatų. 3 fig. Lizė storosios žarnos vėžio ląstelių, padengtų konjugatu SEA-C215 monAK, indukuojama CTL, duodančių atsaką i, SEA, bet ne X SEB. Buvo panaudotos autologinės T-ląstelių SEA-ir SEB- selektyvios linijos, efek-torius/taikinys santykiu, lygiu 10:1, prieš ląsteles-taikinius SW620 ir Raji, nedalyvaujant (kontrolė) ir dalyvaujant SEA-C215 monAK konjugatui, o t.p. mišiniui nekonjuguotų C215 monAK ir SEA (C215+SEA) ir nekon-juguotų C215 monAK ir SEA (C215+SEB) , esant kiekvieno priedo koncentracijai 1 fig/ml. 4 fig. Citotoksiškumas, indukuojamas SEA-C242 monAK ir SEA-anti-Thy-1.2 monAK konjugatais, prieš ląsteles-taikinius (navikines ląsteles Colo 205 ir navikines ląsteles EL-4, atitinkamai).

[0173] Ląstelės buvo inkubuotos su įvairiais priedais prie kontrolės (jaučių serumo albuminas) 30 min ant ledo, praplautos ir apdorotos, kaip aprašyta anksčiau. C215 monAK ir C242 monAK, surištų su Colo205, nudažymą nustatinėjo, panaudojant FITC - žymėtą triušių I g prieš pelių antigenus. SEA sujungto su Raji ląstelėmis nudažymą nustatinėjo panaudojant triušių antiserumus prieš SEA, o po to - FITC-žymėtą kiaulių I g prieš triūsių antigenus. SEA-C215 monAK konjugato, surišto su Colo205 ir Raji ląstelėmis nudažymą nustatinėjo, panaudojant procedūras, aprašytas anksčiau dėl C215 monAK ir SEA. Aktyvuojama fluorescencija analizė buvo atliekama su firmos "Becton and Diccinson" prietaisu. Fono nustatymui buvo naudojamas nudažymas antrai ir trečiai stadijai.

Apibrėžtis

1. Tirpus antikūno konjugatas, apimantis antikūną ir superantigeną, besiskiriantis tuo, kad (i) nurodytas antikūnas yra specifinis susijusios su susirgimu ląstelės-taikinio paviršinei struktūrai, ir (ii) nurodytas superantigenas atpažįstamas T-ląstelėmis ir sugeba aktyvinti citotoksines T-ląsteles (CTL), ir, dažniausiai, sugeba sąveikauti su T-ląstelės receptoriaus variabilios zonos beta-grandine.

2. Konjugatas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad ląstelė-taikinys, susijusi su susirgimu, parinktu iš grupės tokių susirgimų kaip vėžys, auto-imuniniai susirgimai, parazitiniai užkrėtimai ir mikro-binės infekcijos, tokios kaip virusinė, grybelinė ir bakterinė infekcija, ir antikūnas, specifiškai nukreiptas prieš antigeninę determinantę, esančią ant nurodytos ląstelės-taikinio.

3. Konjugatas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad susirgimas yra vėžys, ir anti-kūnas nukreiptas prieš antogeninę determinantę (epi-topą), esančią ant navikinės ląstelės, tokios kaip ląstelė, susijusi su storosios žarnos vėžiu.

4. Konjugatas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad antikūnas specifiškai nukreiptas prieš epitopą C242.

5. Konjugatas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad antikūnas specifiškai nukreiptas prieš epitopą baltyme, priklausančiam GA-733, būtent prieš epitopą C215.

6. Konjugatas pagal bet kuri, iš 1-5 punktų, besiskiriantis tuo, kad vienam antikūnui tenka mažiausiai 1-5, geriausiu atveju 1-3 superantigenai.

7. Konjugatas pagal bet kurį iš 1-6 punktų, besiskiriantis tuo, kad kaip antikūną panaudoja monokloninį antikūną.

8. Konjugatas pagal bet kuri, iš 1-7 punktų, besiskiriantis tuo, kad superantigenas yra bakterinės kilmės, ir parenkamas iš grupės, suside-dančios iš stafilokokų enterotoksinų.

9. Konjugatas pagal bet kuri, iš 1-8 punktų, besiskiriantis tuo, kad kaip superantigeną naudoja stafilokokų enterotoksinus SEA.

10. Konjugatas pagal bet kuri, iš 1-9 punktų, besiskiriantis tuo, kad superantigenas ir antikūnas sujungti vienas su kitu kovalentiniu organiniu tilteliu -B-, kuris, geriausia, turi mažiausiai vieną amidinę struktūrą ir kuris yra hidrofilinis, turintis grandinę, sudarytą iš mažiausiai 6 atomų.

11. Konjugatas pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad tiltelis -B- turi šią struktūrą:

12. Konjugatas pagal bet kuri, iš 1-10 punktų, besiskiriantis tuo, kad jis yra naudojamas lizavimui ląstelių-taikinių, turinčių paviršiaus struk-tūrą, prieš kurią nukreiptas konjugato antikūnas.

13. Ląstelės-taikinio lizavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad ląstelėms-taikiniams leidžia kontaktuoti su ląstelių-taikinių lizavimui reikalingu efektyviu antikūno tirpaus konjugato kiekiu, turinčiu antikūną, surištą su superantigenu, priedo, nurodytas antikūnas yra specifinis ląstelėms-taikiniams, ir nurodytas superantigenas atpažįstamas T-ląstelių ir sugeba aktyvinti citotoksines T-ląsteles (CTL).

14. Lizavimo būdas pagal 13 punktą, besiskiriantis tuo, kad superantigenas, antikūnas ir sujungiantis antikūną su superantigenu tiltelis atitinka apibūdinimams, duotiems bet kuriame iš 1-12 punktų.

15. Konjugato gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad antikūną ir/arba superantigeną sujungia ma-žiausiai per vieną struktūrą, parenkamą iš (a) ang-liavandenių ir (b) funkcinių grupių: merkapto grupių, disulfido grupių, karboksilo grupių ir aminogrupių; toliau išskiria iš terpės gautąjį konjugatą.

16. Konjugato gavimo būdas pagal 15 punktą, besiskiriantis tuo, kad kondensacijos reakcijoje dalyvauja aminogrupė, esanti superantigene ir/arba an-tikūne .

17. Konjugato gavimo būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo, kad i, kondensaci j os reakciją įeina šios stadijos:(i) antikūno ar superantigeno reakcija su organiniais reagentais, turinčiais grupę, galinčią reaguoti su merkaptogrupe, ir grupę, galinčią reaguoti su aminogrupe, gaunant antikūną ar superantigeną, turinti, grupę, galinčią reaguoti su merkaptogrupe, ir(ii) likusios superantigeno ar antikūno dalies reakcijos su organiniais reagentais, turinčiais mer-kaptogrupę ar blokuotą merkaptogrupę, arba grupę, galinčią reaguoti su aminogrupe, gaunant super-antigeną arba antikūną, turinti, merkaptogrupę arba blokuotą merkaptogrupę; po to(iii) produktai, gauti (i) ir (ii) stadijose, atitinkamai, reaguoja vienas su kitu, susidarant konjugatui, kuriame superantigenas sujungtas su antikūnu per disulfidinę ar tioeterinę grupę.

18. Konjugato gavimo būdas pagal 17 punktą, besiskiriantis tuo, kad junginys, galinti sąveikauti su aminogrupe, ir turintis grupę, galinčią sąveikauti su merkaptogrupe, yra alfa-halogenacetil-halogenidas, ir junginys, turintis merkaptogrupę arba blokuotą merkaptogrupę, yra bifunkcinis sujungiantis reagentas, turintis formulę II:

19. Konjugato gavimo būdas pagal bet kuri, iš 15-18 punktų, besiskiriantis tuo, kad nurodyti superantigenas ir antikūnas atitinka apibū-dinimams, duotiems bet kuriame iš 1-9 punktų.

20. Konjugatas pagal bet kurį iš 1-11 punktų, skirtas gamybai medikamentų žinduolių, tame tarpe ir žmogaus, sergančių susirgimu, parinktu iš grupės, susidedančios iš vėžio, autoimuninių susirgimų, infekcijų, sukeltų virusų, bakterijų ar grybelių, ir užkrėtimo parazitais, gydymui.

21. Konjugato pagal bet kurį iš 1-11 punktų panaudojimas pagaminimui farmacinės kompozicijos, skirtos vėžio, autoimuninių susirgimų, infekcijų, sukeltų viru-sų, bakterijų ir grybelių, arba užkrėtimo parazitais, gydymui.

Brėžiniai