[LT] Šis išradimas yra susietas su chimopapainu, pagerintomis chimopapainą turinčiomis farmacinėmis kompozicijomis, skirtomis pakenktų, išsikišusių arba turinčių kitą patologiją tarpslankstelinių spinalinių diskų gydymui, chimopapaino gavimo būdais, inhibiciniais peptidais ir afininės chromatografijos matricomis,naudojamomis tokių būdų realizavimui, o taip pat su chimopapaino antikūnų kompozicijomis.
[EN]
[0001] Šis išradimas susietas su chimopapainu, jo pagerintomis farmacinėmis kompozicijomis ir žinduolių, turinčių pakenktus, išsikišusius arba turinčius kitą patologiją tarpslankstelinius spinalinius diskus, gydymo būdas, įskaitant pagerintos kompozicijos tirpalo injekcijavimą prie šių diskų. Toliau išradimas susietas su paraiškoje pateikiamo chimopapaino gavimo būdais, peptidais ir afininės chromatografijos matricomis, naudojamomis to-kių būdų realizavime, o taip pat su chimopaino antikū-nių kompozicijomis.
[0002] Chimopapainas yra proteinazė, esanti paw-paw (Carica papaya) augale. Buvo nustatyta, kad jis gali būti naudojamas klinikinėje praktikoje, būtent, gydant išsmu-kusius arba išsikišusius diskus arba išialgiją metodu, kuris vadinamas "chemonukleozė" (L. Smith, 1964, J. Amer. Med. Assoc. 187, 137-140).
[0003] Pirmą kartą išvalyti ir identifikuoti chimopapainą pabando Jansen ir Bolls (1941, J. Biol. Chem., 137, 405-417), kurie šio fermento gavimui naudojo rūgštinio nusodinimo ir išsūdymo metodus. Vėliau valymui buvo naudojami metodai, besiremiantys jonų mainų chromatografija. Taip, pavyzdžiui, Didžiosios Britanijos patentuose Nr. 2098897 (Smith Laboratories Inc.) ir Nr. 2156821 (Simmons) aprašytas katijonitinių dervų panaudojimas chimopapaino atskyrimui nuo kitų žinomų cisteino proteinazių. Abu šiuose patentuose aprašyti metodai buvo naudojami chimopapaino gavimui pramoniniu būdu. Tačiau buvo nustatyta, kad gautos medžiagos aktyvumas yra santykinai mažesnis už chimopapaino, kuri, ga-vo Buttle ir Barret (1984, Biochem. J., 223, 81-88) nedideliais kiekiais daugiastadi j iniu būdu, i, kurį įeina būtent katijoninė chromatografija. Nors ši me-džiaga pasižymėjo aukštu aktyvumu, tačiau ji buvo gauta su labai žema išeiga, ir šis būdas nėra tinkamas naudoti pramoniniu būdu. Buttle ir kt. (Biochem. J., 1989 liepa, 261, 469-476) nustatė, kad tuo būdu gautas produktas yra užterštas neseniai išskirta ir identifikuota papajos proteinaze IV, kuri eliuuojasi kartu su chimopapainu iš katijonitinių dervų. Naudojant katijo-nitinQ chromatografiją neįmanoma atskirti chimopapaino nuo papajos proteinazės IV iki tokio laipsnio, kad ji, būtų galima naudoti chimopapaino, pratiškai neturinčio papajos proteinazės IV, gavimui.
[0004] Literatūroje taip pat yra duomenų apie būdus, kuriuose viena iš stadijų yra afininė chromatografija. Taip Biochem. Biophys. Actą 658, 262-269, 1981 aprašytas chimopapaino valymas, naudojant, šalia kitų metodų, afininę chromatografiją su gyvsidabrio-agarozės kolonėle, o Biol. Chem. Hoppe-Segler, 1988, 369, 733-740 Dubois ir kt. publikavo pranešimą apie cisteino proteinazės išskyrimą iš Carica papaya, panaudojant analogiškus metodus. Šis afininės chromatografijos tipas remiasi gyvsidabrio ligandų, surištų su inertine matrica, sąveika su ant jos užfiksuotų baltymų tiolinė-mis grupėmis. To pasekoje visi kiti baltymai, išskyrus chimopapainą, ir būtent kitos cisteino proteinazės, pavyzdžiui, papajos proteinaze IV, gali būti surišti su medžiaga, kuria yra užpildyta kolonėlė, ir po to eliuo-ti kartu su chimopapainu.
[0005] Neseniai moksliniuose straipsniuose buvo aprašytas afi-ninės chromatografijos su imobilizuotais peptidų da-riniais panaudojimas valymui atskirų baltymų, tokių kaip žmogaus katepsinas (Rich ir kt. 1986, Biochem. J. 235, 731-4) ir histolizinas iš Entamoeba histolytica (Luaces ir Barrett, Biochem. J. 250, 903-909). Iki šiol šis metodas nebuvo naudojamas chimopapaino valymui, ir chimopapaino patobulinimo valymo būdo, kuri galima būtų naudoti pramoniniu mastu, sukūrimo problema išlieka aktuali.
[0006] Kai kurie sintetiniai peptidų dariniai, kurie yra se-rino proteinazės chimotripsino inhibitoriai, aprašyti W0 84/00365 .
[0007] Šio išradimo autoriai paruošė pasižyminčio aukštu aktyvumu chimopapaino, neturinčio priemaišų, būtent kitų papajos latekse esančių cisteino proteinazių, įskaitant papajos proteinazę IV, naują valymo ir išskyrimo būdą.
[0008] Šio išradimo produktas yra praktiškai švarus chimopapainas, turintis dideli, šio fermento aktyvios formos kieki,.
[0009] Pagal ši, išradimą chimopapainas praktiškai neturi imu-nologiškai skirtingų proteinazių, aptinkamų papajos latekse, ir būtent: papaino, papajos proteinazės III (PPIII) (šios dvi proteinazės aprašytos (Buttle ir Barrett (1984), Biochem. J., 223, 81-88) ir ypatingai neseniai atrastos papajos proteinazės IV (PPIV). Todėl šiame išradime naudojamą išsireiškimą "praktiškai šva-rus" reikia suprasti kaip "praktiškai imunologiškai švarus" ir jis reiškia, kad praktiškai nėra kryžminių reakcijų tarp chimopapaino pagal ši, išradimą ir speci-finių antikūnių, indukuojamų prieš švarią PPIV, kurią išskyrė ir identifikavo Buttle ir kt. (Biochem. J., 1988 liepa, 261, 469-476) ir kuri yra trumpai aprašyta žemiau, o taip pat nėra kryžminių reakcijų su specifiniais antikūniais prieš papainą ir PPIII, kuriuos anksčiau aprašė Buttle ir Barrett (1984) (žr. aukščiau cituotą šaltini,) . Reikia atskirai pažymėti, kad taip vadinamas švarus chimopapainas, gautas pagal Buttle ir Barrett aprašytą būdą, turi, kaip tai buvo nustatyta, žymų kieki, PPIV (apie 14%) ir todėl kompozicija, turinti jo indukuotus antichimopapaininius antikūnius, pasižymi specifiškumu kaip ir išvalyto ši, išradimą atitinkančio chimopapaino, taip ir išvalytos PPIV at-žvilgiu. Pagal ši, išradimą chimopapainas turi mažiau 0,2%, geriau mažiau 0,1 %, PPIV, PPIII ir papaino.
[0010] Kryžminė reakcija tarp antigeno ir antikūnio gali būti aptikta įprastiniais žinomais metodais. Prie tokių me-todų priklauso, pavyzdžiui, lydalo raketinė imuno-elektroforezė ir dviguba imunodifuzij a (aprašyta Buttle ir Barrett (1984) aukščiau cituotame šaltinyje, vien-radialinė imuno analizė, radioimunoanalizė (RIA) ir kietafazė imunofermentinė analizė (ELISA).
[0011] Paprastai aktyvaus fermento, esančio fermentinėje kompozicijoje, kiekis yra charakterizuojamas jo specifiniu aktyvumu tam tikro substrato atžvilgiu konkrečiose ana-lizės atlikimo sąlygose. Šiame aprašyme naudojamas iš-sireiškimas "specifinis aktyvumas BAPNA atžvilgiu" reiškia proteinazini, aktyvumą pikomoliais p-nitroanilino, susidarančio per sekundę vienam mg sauso produkto (pM/s/mg), atliekant analizę standartinėse sąly-gose ir substratu naudojant N-a-benzoil-DL-arginino p-nitroanilidą (BAPNA).
[0012] Standartinės analizės sąlygos, kuriomis tiriamos ži-nomos farmacinės chimopapaino kompozicijos, detaliai aprašytos žemiau skyriuje "BAPNA analizė, I metodika" ir "Analizė Smito metodu".
[0013] Šiuo metodu nustatyti specifiniai aktyvumai yra iš-reiškiami specifinio aktyvumo vienetais BAPNA atžvilgiu (1 mM) , esant 37°C ir pH=6,0. Pagal ši, išradimą chimopapainas charakterizuojamas specifiniu aktyvumu BAPNA atžvilgiu (1 mM, esant 37°C ir pH=6,0, lygiu 800-1700, geriau 1000-1700, pavyzdžiui, 1200-1500 vnt./mg (atliekant analizę 37°C temperatūroje ir pH=6,0). Pir-menybę turinčiame išradimo realizavimo variante gaunamo chimopapaino specifinis aktyvumas BAPNA (1 mM) atžvil-giu, esant 37°C ir pH=6,0, yra mažiausiai 1300 vnt./mg.
[0014] Kadangi gausioje su chimopapainu ir kitomis cisteino proteinazėmis susietoje literatūroje proteinazinis aktyvumas labai dažnai yra išreiškiamas kaip p-nitroanilino, laisvame pavidale išsiskyrusio iš sintetinio BAPNA substrato, kiekis, tai iškyla šiuose darbuose pa-teiktų specifinio aktyvumo reikšmių betarpiško palygi-nimo problema. Tikslios reikšmės priklauso nuo eilės faktorių, konkrečiai nuo analizės atlikimo sąly-gų, pa-vyzdžiui pH, temperatūros, buferio sudėties ir naudoto substrato koncentracijos. Buttle ir Barrett (1984, aukščiau cituotas darbas) gauto chimopapaino, pagal šiame darbe pateiktus duomenis, specifinis aktyvumas BAPNA atžvilgiu yra 0,154 jj.M/min/mg arba 2567 pM/s/mg. Tačiau sąlygos, kuriomis analizę vykdė Buttle ir Barrett, skyrėsi nuo žinomos farmacinės kvalifikacijos chimopapaino sąlygų ir todėl tiesiogiai palyginti jų specifinius aktyvumus yra neįmanoma.
[0015] Kadangi laikoma, kad Buttle ir Barrett gautas chimopapainas turi didžiausią specifini, aktyvumą iš visų tuo metu žinomų medžiagų, tai pradiniame šio išradimo kūrimo etape analizė buvo atliekama nurodytame darbe aprašytomis sąlygomis.
[0016] Ši analizės atlikimo metodika toliau vadinama "BAPNA analizė, metodika Nr. 2" . Jos pagalba nustatyti specifiniai aktyvumai BAPNA atžvilgiu -2,5 mM) , esant 40°C ir pH=6,8, šios sąlygos tikrai skiriasi nuo sąlygų, kuriomis atliekama chimopapaino farmacinių kompozicijų analizė. Naudojant šią metodiką gautų rezultatų dydžiai 2-3 kartus viršija dydžius, gautus naudojant įprastą farmacinę BAPNA analizę pagal 1 metodiką, nors žiūrint iš mokslinės pusės rezultatų, gautų dviem skirtingais analizės metodais, palyginimas pasinaudojant paprastu perskaičiavimo koeficientu yra nekorektiškas. Tačiau kaip rodo rezultatai, gauti pradinėje šio išradimo realizavimo stadijoje, ši, išradimą atitinkančio chimo-
[0017] papaino specifinis aktyvumas BAPNA atžvilgiu (2,5 fiM) , esant 40°C ir pH=6,8, yra 3000-4500 ribose, pavyzdžiui, 3500-4500 vnt./mg.
[0018] Šio išradimo autoriai neseniai publikuotame (1989 m. liepa, žr. aukščiau cituojamą darbą) ir žemiau trumpai aprašytame darbe išvalė ir identifikavo anksčiau neži-nomą priemaišą chimopapaine, gautame žinomais būdais, ir būtent papajos proteinazę IV (PPIV) . PPIV yra neak-tyvi BAPNA atžvilgiu, tačiau pasižymi aktyvumu azokazeino atžvilgiu. Be to, buvo nustatyta, kad vištų cisteino koncentracijos iki 1 mM labai mažai įtakoja PPIV aktyvumą azokazeino atžvilgiu. Tačiau ši, išradimą atitinkančio chimopapaino aktyvumas azokazeino atžvil-giu, esant šioms vištų cisteino koncentracijoms, inhibuojamas mažiausiai 95 %. Šiame išradime naudojamas iš-sireiškimas "aktyvumas azokazeino atžvilgiu" reiškia proteinazinį aktyvumą, apibūdinamą kaip sauso svorio vienetui per laiko vienetą susidarantis trichloracto rūgštyje tirpių peptidų produkto kiekis, naudojant derivatizuotą baltyminį substratą azokazeiną standar-tinėmis analizės sąlygomis, aprašytomis žemiau. Ši, iš-radimą atitinkantis chimopapainas geriausiai turi aktyvumą azokazeino atžvilgiu, kuris bent 97 %, geriau 98-100 %, yra inhibuojamas vištų cisteinu, kurio koncentracija neviršija 1 (J.M.
[0019] Šio išradimo autoriai mano, kad jų pareiškiamas chimopapainas yra pirmą kartą gautas praktiškai švarus produktas, neturintis baltymų priemaišų ir turintis di-delį kiekį nurodyto fermento aktyvios formos. Šis pa-siekimas tapo įmanomu tik suprantant, kad jį užter-šiantis baltymas, naudojant žinomus būdus, buvo valomas kartu su chimopapainu, šiam tikslui panaudojant, pa-vyzdžiui, jonitines ir žinomas afinines kolonėles. Tolimesnių tyrimų pasekoje buvo išskirtas ir iden-tifikuotas šis taršalas, kaip nustatyta PPIV. PPIV ga-
[0020] vimui naudotas būdas netinka švaraus chimopapaino gavimui, tačiau PPIV gavimas leido išaiškinti du svarbius parametrus, kurių pagalba gali būti chrakterizuojamas švarus chimopapainas. Šie parametrai yra: 1) švaraus chimopapaino kryžminio reakcingumo su specifiniais PPIV antikūniais nebuvimas, 2) švaraus chimopapaino ir PPIV skirtingas aktyvumas azokazeino atžvilgiu, esant vištų cisteinui. Šie du ypatumai yra esminiai faktoriai chimopapaino valymo būdo paruošimui.
[0021] Akivaizdu, kad ši, išradimą atitinkantis chimopapainas yra beveik visais atžvilgiais pranašesnis už kitus ži-nomus produktus. Švaraus fermento kompozicijos yra svarbios tyrimams, kurių tikslas yra detalus visų fermento charakteristikų tyrimas, pavyzdžiui, jos sudėtis ir katalizinės savybės.
[0022] Toliau šio išradimo objektas yra kompozicija, turinti savo sudėtyje pareiškiamą chimopapainą. Tokioje kompozicijoje praktiškai nėra PPIV. Joje esančio chimopapaino specifinis aktyvumas BAPNA (1 mM) atžvilgiu, esant 37°C ir pH-6, yra 800-1700 vnt./mg. Siūlomos kompozicijos gali būti išleidžiamos kaip atskiros ati-tinkamo svorio dozės, pavyzdžiui, kaip alikvotiniai chimopapaino kiekiai, hermetizuoti nepatenkant drėgmei, pavyzdžiui, bonkutėse ir ampulėse su išsiurbtu oru. Be to, tokios kompozicijos gali turėti reduktorių, pa-vyzdžiui, ditiotreitolą, cisteiną laisvos bazės arba jo rūgščios konjugacinės druskos pavidale, kurių paskirtis yra užkirsti kelią fermento aktyvumo sumažėjimui dėl oksidacijos. Pagal kitą variantą siūlomos kompozicijos gali toliau turėti cisteino proteinazės grįžtamą inhi-bitorių druskos pavidale, pavyzdžiui, natrio tetra-tionatą arba gyvsidabrio chloridą. Tokie grįžtami inhibitoriai blokuoja fermento aktyvius centrus, dėka to užkertamas kelias fermento aktyvumo sumažėjimui, šiuo atveju oksiduojasi reduktorius, kuris reaktyvuoja fer-mentą. Kiti įprastiniai priedai, kurie norint gali įeiti i, kompozicijos sudėti,, yra, pavyzdžiui, konservantai, konkrečiai, natrio bisulfitas, kompleksonai, konkrečiai EDTA, ir nešėjai, konkrečiai, natrio chloridas .
[0023] Švaraus fermento kompozicijos konkrečiai turi didelę reikšmę chimopapaino klinikiniam naudojimui, pavyz-džiui, esant chemonukleozei, kadangi, kaip rodo lite-ratūriniai duomenys, naudojant ši, gydymo metodą pas 3 % pacientų gali atsirasti alerginės reakcijos. Miltelių pavidalo papajos ekstraktas plačiau naudojamas maisto pramonėje, ir laikoma, kad daugelis chemonukleozei alerginių reakcijų atsiranda dėl priešsensibilizacijos tokiomis kompozicijomis. Tačiau gerai žinoma, kad sve-timkūnių baltymų antigenų injekcija žinduoliams visada yra pavojinga dėl galimo anafilaktinio šoko. Medi-cininėje praktikoje priimta naudoti labiausiai švarius ir labiausiai aktyvius iš turimų baltyminių preparatų, tai leidžia pasiekti optimalų procedūros efektą ir iki minimumo sumažinti alerginių reakcijų riziką.
[0024] Todėl šio išradimo objektas taip pat yra farmacinė kompozicija, turinti savo sudėtyje pareiškiamą chimo-papainą. Siūlomoje kompozicijoje praktiškai nėra PPIV. Jos sudėtyje esančio chimopapaino specifinis aktyvumas BAPNA (1 mM) atžvilgiu, esant 37°C ir pH=6, yra 800-1700 vnt/mg. Siūloma farmacinė kompozicija be to geriau turi farmaciškai netoksišką reduktorių, toki, kaip cis-ternas, laisvos bazės arba rūgščios konjugacinės druskos pavidale, pavyzdžiui, L-cisteino hidrochlorido mo-nohidratą. Paprastai kompozicijoje reduktoriaus kiekis yra apie 0,5-3 mg 4000 chimopapaino vienetų, tai ati-tinka, pavyzdžiui, 15-90 svorio %, skaičiuojant chimo-papainui. Ši, išradimą atitinkančiose farmacinėse kompo-zicijose, be to, gali būti bet koks įprastinis far-maciškai priimtinas skiediklis, užpildas arba nešėjas, pavyzdžiui, konservantai, konkrečiai natrio bisulfitas, kompleksonai, konkrečiai EDTA, ir nešėjai, konkrečiai natrio chloridas.
[0025] Farmacinės kompozicijos, turinčios ši, išradimą atitinkanti, chimopapainą, gali būti naudojamos oftalmolo-gijoje, pavyzdžiui, gydant akių ligas arba chirurgiškai apdorojant audinius, pavyzdžiui, nudegimo žaizdas, opas, nekrozės pasekoje atmirusius audinius, pragulas ir kitas žaizdas su audinių atmirimu. Paprastai tokios kompozicijos yra išleidžiamos vietinio panaudojimo formoje, pavyzdžiui, sterilių tirpalų, gelių, suspensijų arba tepalų pavidale, kurie gali būti naudojami betar-piškam žaizdų apdorojimui arba užnešami ant žaizdų per jais sumirkytus raiščius.
[0026] Ši, išradimą atitinkanti, chimopapainą geriausia naudoti kompozicijų jo pagrindu paruošimui ortopediniams tiks-lams. Paprastai tokios farmacinės kompozicijos yra iš-leidžiamos vienkartinių dozių, skirtų parenteraliniam įvedimui, pavidale, pavyzdžiui, sterilių, neturinčių pirogenų, tirpalų arba suspensijų tinkamame nešėjuje pavidale, arba koncentratų, tinkamų rekonstruoti prieš vartojimą, pavidale. Atskirų dozių pavidalo kompo-zicijose, tinkamos patologinių arba pažeistų tarp-slankstelinių diskų pulpozinių branduolių ištirpinimui arba gydymui, įvedant jas i, šiuos diskus, gali turėti 500-5000 BAPNA vienetų (analizė atliekama, esant BAPNA koncentracijai 1 mM, 37°C temperatūrai ir pH=6) išra-dimą atitinkančio chimopapaino ir reduktorių, pavyz-džiui, natrio cisteinato hidrochloridą, kurie yra atskiroje ampulėje. Pirmenybę turinti vienkartinė dozė turi 2000 arba 4000 BAPNA vienetų (1 mM BAPNA, 37°C, pH=6) chimopapaino. Atskiroje dozėje gali būti, pavyz-džiui, 2-5, geriau 2,5-3,5 mg chimopapaino ir 0,2-3, geriau 1,0-2,0 natrio cisteinato hidrochlorido, esant
[0027] norui, mišinyje su tinkamu nešėju, pavyzdžiui, natrio chloridu, kurie yra atskiroje ampulėje.
[0028] Žemiau aprašytų eksperimentų eigoje buvo rasti 26 pa-vyzdžiai individualių serumų, turinčių natūraliu būdu įgytų IgE antikūnių prieš išleidžiamą chimopapaino kompoziciją Chymodiactin , kuri gaunama pagal Didžio-sios Britanijos patente Nr. 2098997 aprašytą būdą. Šiuose bandymuose eksperimentiškai parodyta, kad šiuose serumuose yra IgE antikūniai prieš išradimą atitinkanti, chimopapainą, o taip pat prieš tris kitas cisteino proteinazes, rastas papajos latekse, būtent, papainą, PPIII ir PPIV. Tačiau vidutiniai IgE kiekiai, rasti chimopapaine, PPIII ir PPIV, liudija apie tai, kad PPIII ir PPIV, kartu paėmus, yra atsakingi už 75% rasto IgE. Iš šių rezultatų nenuginčijamai seka, kad nurodyti baltymai turi esminį imonogeninį charakteri, ir gali sudaryti didžiąją dali, antigeninių determinančių, esančių šiuo metu išleidžiamose chimopapaino kompozi-cijose, ir suteikia nepaprastai plačias antigenines ga-limybes. Todėl šį išradimą atitinkančios farmacinės kompozicijos turi didelius privalumus prieš žinomas kompozicij as.
[0029] Šio išradimo chimopapainas taip pat yra skirtas che-monukleoze pažeistų, išsikišusių arba turinčių kitus susirgimus žinduolių tarpslankstelinių spinalinių diskų gydymui.
[0030] Šis išradimas taip pat susietas su chimopapaino valymo būdu, kuris apima: a) vandeninio neapdoroto chimopapaino inkubaciją su afininės chromatografijos matrica su aktyviais centrais, kuri turi pagrindą, kuris yra kovalentiškai su-rištas, esant reikalui, per speiserinę grupę su chi-mopapainą grįžtamai inhibuojančio peptido galiniu N atomu: to pasekoje nurodytas peptidas susijungia su chimopapaino molekulės aktyviu centru, ir
[0031] Neapdirbtu chimopapainu, naudojamu kaip pradinė me-džiaga chimopapaino valymui pagal ši, išradimą, gali bū-ti šviežio papajos latekso ekstraktas, tirpalas, gautas iš pramonėje gaminamo latekso po džiovinimo išpurškimu, papaino koncentratas arba iš dalies išvalytas chimopapainas, o taip pat gaminamo preparato, taip vadi-namo " švaraus % chimopapaino tirpalas'' Tačiau spe-cialistai puikiai supranta, kad turintys labai sudė-tingą sudėti papajos ekstraktai, pavyzdžiui, papajos lateksas, turi didokus kiekius kitų komponentų, kuriuos pageidautina pašalinti iš jų. Geriausiai pagrindini, tokių komponentų kieki, pašalinti iki neapdirbto chimopapaino tirpalo inkubacijos su afininės chromatografijos matrica, tam naudojamas filtravimas arba cent-rifugavimas, kurių pagalba yra pašalinama netirpi me-džiaga. Tačiau mes nustatėme, kad efektyvesnis yra rūgštinis nusodinimas, kuri, atliekant nusėda pgrindinis priemaišų kiekis.
[0032] Rūgštinio nusodinimo procedūra, kai neapdirbto chimopapaino tirpalo pH sumažina iki 2 ir duoda tirpalui pastovėti, o po to atskiria chimopapaino tirpalą, chimopapaino valymui naudojama jau 50 metų. Visai ne-tikėtai šio išradimo autoriai nustatė, kad pH reikšmė, kuri nustatoma atliekant ši, procesą, turi lemiamos įta-kos gaunamo chimopapaino tirpalo užterštumui PPIV. Kaip parodė šio proceso, i, kuri, anksčiau buvo žiūrima kaip išankstinę chimopapaino grubaus valymo stadiją, tyrimas, kruopštaus dozavimo ir kontrolės pasekoje ryš-kiai sumažėja PPIV priemaišos kiekis, baltymo, kuris, kaip dabar nustatyta, naudojant įprastus būdus yra valomas kartu su chimopapainu. Tuo budu šio išradimo objektas yra chimopapaino valymo būdas, apimantis 1. nusodinimą iš vandeninio mišinio, turinčio neap-dirbtą chimopapainą, esant pH 1,2-1,8; 2. neapdirbto chimopapaino vandeninio tirpalo atskyrimą nuo šio mišinio; ir 3. neapdirbto chimopapaino tirpalo neutralizavimą ir, esant norui, išsūdymą.
[0033] Geriausiai iš tokios kompozicijos pašalinti visas joje likusias baltymų priemaišas, įtraukiant į valymo pro-cesą bent vieną įprastos jonitinės chromatografijos stadiją, kaip tai yra aprašyta pas Buttle ir Barrett, 1984 (žr. anksčiau cituotą publikaciją). Tam tikslui geriausia naudoti, būtent paskutinei stadijai, aukštos skiriamosios galios chromatografiją, pavyzdžiui FPLCR (skystinę baltymų ekspres-chromatografiją) su tokia katijonitine derva, kaip turinčia prekybinį pavadinimą Mono-S arba S-SepharoseRHP (Pharmacia).
[0034] Pagal pirmenybę turintį variantą išradimo objektas yra chimopapaino valymo būdas, apimantis
[0035] I) nusodinimą vandeninio mišinio, turinčio neapdirbtą chimopapainą, esant pH reikšmei, žemesnei už 2,0;
[0036] II) neapdirbto chimopapaino vandeninio tirpalo at-skyrimą nuo nurodyto mišinio;
[0037] III) neapdirbto chimopapaino tirpalo neutralizavimą ir, esant norui, išsūdymą;
[0038] IV) III stadijoje gauto tirpalo inkubaciją su afininės chromatografijos matrica su aktyviais centrais, kuri turi pagrindą, kuris yra kovalentiškai surištas, esant norui per speiserinę grupę, su chimopapainą grįžtamai inhibuojančio peptido galiniu azoto atomu, to pasekoje peptidas susijungia su chimopapaino molekulės aktyviais centrais; ir
[0039] V) chimopapaino eliuavimą tinkamu eliuentu.
[0040] Specialistui akivaizdu, kad nurodytą pirmenybę turinčią katijonitinės chromatografijos stadiją galima vykdyti alternatyviai arba papildomai prieš arba afininės chromatografijos stadiją.
[0041] Vandeninis mišinys, turintis neapdirbtą chimopapainą, gali turėti savo sudėtyje, pavyzdžiui, šviežią papajos lateksą, papajos lateksą, išdžiovintą išpurškimo džio-vykloje, arba papaino koncentratą (pavyzdžiui, išpurš-kimo džiovykloje išdžiovintą lateksą, kuri, gamina firma Powell and Scholefield, Didžioji Britanija arba Siebels, JAV) suspenduotą vandenyje arba vandeniniame buferyje, pavyzdžiui, fosfatiniame arba acetatiniame. Prieš rūgštini, nusodinimą geriausia yra pašalinti mi-šinio visą joje netirpią medžiagą, tam yra naudojamas įprastas būdas, pavyzdžiui, filtravimas arba cent-rifugavimas. Tam, kad sumažinti terpės pH iki 1,0-2,0, geriau iki 1,2-1,8, dar geriau iki maždaug 1,5, ją galima parūgštinti palaipsniui pridedant organinę arba neorganinę rūgšti,, geriau vandenini, neorganinės rūgš-ties tirpalą, konkrečiai druskos rūgšties tirpalą. Nu-sodinta medžiaga gali būti pašalinta įprastu būdu, pa-vyzdžiui, filtruojant arba centrifuguoj ant. Buvo nustatyta, kad gautas rūgštus neapdirbto chimopapaino tirpalas turi žymiai mažiau PPIV, papaino ir mažiau PPIII.
[0042] Bet kuriam specialistui suprantama, kad prieš vykdant vėlesnę chromatografinio valymo stadiją, rūgštų neapdirbto chimopapaino tirpalą reikia neutralizuoti šar-miniu reagentu, pavyzdžiui, vandeniniu natrio hidroksido tirpalu, ir geriausia iš jo pašalinti druskų per-teklių, pavyzdžiui, naudojant gel-filtravimo arba dia-lizės būdus. Bet kokios tuo būdu susidariusios nuosėdos gali būti pašalintos filtruojant arba centrifuguoj ant.
[0043] Gerai žinoma, kad cisteino proteinazių aktyvumas gali būti apčiuopiamai padidintas aktyvuojant jas reduktoriumi, pavyzdžiui, ditiotreitolu arba cisteinu, o taip pat išvalant jas nuo tokių sunkiųjų metalų, kaip gyv-sidabris, pėdsakų, panaudojant kompleksonus, pavyzdžiui EDTA, arba chlatinėmis savybėmis pasižyminčias dervas, pavyzdžiui, prekybini, pavadinimą Chelex (firma Bio-Rad, Didžioji Baritanija) turinčią dervą. Tokių priemonių pagalba pavyksta pasiekti optimalų kieki, laisvų tio-lilinių grupių, kurios, kaip yra žinoma, cisteino pro-teinazių aktyvių centrų skiriamasis bruožas, o jų bu-vimas yra būtinas paskutiniųjų aktyvumo pasireiškimui. Geriausiai sunkiųjų metalų priemaišos pašalinamos dializuojant buferyje, kuriame yra EDTA. Pagal kitą va-riantą (naudojant katijonitinę chromatografiją) sun-kiųjų metalų pašalinimui galima įvykdyti chimopapaino aktyvavimą, panaudojant reduktorių. Šiuo atveju chimopapainas susijungia su katijonitine derva ir po to yra išplaunamas iš kolonėlės. Norint gauti maksimalų aktyvių centrų kieki,, neapdoroto chimopapaino tirpalą, gautą po neutralizacijos, apdorojant reduktoriumi, pa-vyzdžiui, cisteinu, ir praskiedžia iki reikiamos baltymo koncentracijos, pavyzdžiui, iki 30 g/l koncentracijos. Po to neutralizuotas neapdoroto chimopapaino tirpalas yra inkubuojamas su šiems aktyviems centrams jautria afininės chromatografijos matrica, to pasekoje chimopapainas per aktyvius centrus specifiškai susijungia su inhibuojančia matricos peptidine jung-timi. Chimopapaino tirpalą per afininės chromatografijos kolonėlę su matrica galima leisti, pavyzdžiui, 35-40 ml/val/cm greičiu. Vienas litras afininės chromatografijos matricos gali surišti maždaug 1-4 g chimopapaino.
[0044] Afininės chromatografijos matrica turi pagrindo matri-cą, pavyzdžiui, gelio arba membraninę matricą, su kuria yra kovalentiškai susijungęs, ir tuo būdu imobili-zuotas, inhibitorinis peptidas. Geriausia pagrindo matrica yra agarozės gelis, pavyzdžiui gelis, išleidžiamas prekybiniu pavadinimu Sepharose (Pharmacia), nors gali būti vartojamos ir derivatizuotos celiuliozinės membra-ninės matricos, pavyzdžiui matricos, išleidžiamos prekybiniu pavadinimu Zeta (Anachem). Peptido galinis azoto atomas gali būti susijungęs su pagrindo matrica arba betarpiškai, arba per speiserinę grupę, pavyz-džiui, speiserinę grupę iš devynių anglies atomų, kaip tai yra pirmenybę turinčios gelio matricos, kuri išleidžiama prekybiniu pavadinimu ECH Sepharose (Pharmacia) atveju. Ryšys tarp šios gelio matricos karboksilinių grupių ir inhibitorinio peptido laisvomis amino grupėmis, ko pasekoje susidaro peptidinis ryšys, gali būti gautas įprastu būdu, pavyzdžiui, konden-sacijos būdu, kuri vykdoma esant rūgštiniam katali-zatoriui, ir kurios vyksmui padeda vandenyje tirpaus karbodiimido, pavyzdžiui N-etil-N'-(3-dimetilaminopro-pil)karbodiimido hidrochlorido (EDC), priedas. Paprastai prijungimo reakcija yra vykdoma vidutiniškai mai-šant gelio matricą su inhibitorinio peptido tirpalu, esant EDC, pavyzdžiui, 24 valandas kambario tempe-ratūroje. Santykis tarp reagentų gali būti, pavyzdžiui, 3-4 g peptido 1 litrui gelio.
[0045] Afininės chromatografijos matrica gali būti įdėta kolonėlę prieš naudojimą. Tačiau naudojant gelio mat-ricą kaip chromatografijos matricą, inkubaciją galima vykdyti ir periodiniu būdu ir, esant norui, įdėti mat-ricą į kolonėlę, norint po to eliuuoti fermentą. Prieš naudojimą geriausia matricą kruopščiai praplauti vandeniniu buferiu, norint pašalinti nesurišto peptido ir katalizatoriaus pėdsakus. Vykdant procesą pramoniniu būdu, koloną su afininės chromatografijos matrica geriausia apdoroti sanitariškai in situ, pavyzdžiui, vandeniniu etanolio tirpalu, ir tuo būdu padaryti ją tinkama pakartotiniam panaudojimui.
[0046] Peptidai, grįžtamai inhibuoj antys chimopapainą, yra peptidai, kurie, būdami imobilizuoti ant pagrindo matricos, sugeba susijungti su aktyviais chimopapaino centrais stipriau, negu su kitų cisteinų, esančių neapdoroto chimopapaino preparatuose, konkrečiai PPIV, aktyviais centrais, tačiau kurie po to gali būti išstumti iš šių centrų. Tinkamiausia inhibitorinių pep-tidų grupė yra aminorūgštys su galiniais anglies atomais, turinčiais tokius aldehidinius darinius, kaip semikarbazonai, fenilalanino metoksiiminai arba oksimai, arba jo analogai. Labiausiai tinkamos aminorūgštys su galiniais anglies atomais yra tokie fenilalanino dariniai, kaip D arba L-fenilalanino semikarbazonai (PheSc), metoksiiminai (PheMo) arba oksimai (PheOx), arba tokie fenilalanino alanogų dariniai, kaip D arba L-alaninsemikarbazonai (AlaSc), D arba L-cikloheksil-alaninsemikarbazonai (ChaSc), arba D arba L-leucinse-mikarbazonai (LeuSc). Buvo nustatyta, kad kaip chimopa-painą inhibuojantys peptidai, su pasisekimu gali būti naudojami šie dipeptidai su galiniu anglies atomu: L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc, L-Phe-D-PheSC, L-Phe-L-PheSc, L-Phe-L-PheMo, L-Phe-L-PheOx, L-Tyr-L-PheSc, L-Ala-L-ChaSc ir L-Ala-L-LeuSc. Dipeptidą L-Phe-L-PheSc aprašė Luaces ir Barrett (1988), 250, 903-909. Pirme-nybę turintys peptidai yra, konkrečiai, dipeptidai, ypač L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc ir L-Phe-D-PheSc. Sa-vaime patys inhibuojantys peptidai ir naujos afininės chromatografijos matricos, turinčios šiuos peptidus, taip pat yra šio išradimo objektas.
[0047] Prieš eliuuojant chimopapainą iš afininės chromatografijos matricos, geriausia praplauti ją, norint paša-linti nespecifiškai surištą medžiagą. Praplaunama, pa-vyzdžiui, vandeniniu buferiu, pavyzdžiui, acetatiniu buferiu su pH 4-5. Buvo nustatyta, kad i plovimui arba eliuavimui naudojamą buferi, tikslinga yra pridėti rea-gentus, kurie neleidžia vykti hidrofobinėms sąveikoms ir kitoms nespecifinėms jungimosi reakcijoms tarp matricos ir neapdorotame chimopapaine esančių komponentų. Tokie reagentai yra, būtent, EDTA, izopropanolis ir etandiolis.
[0048] Po to surištas chimopapainas gali būti eliuotas iš matricos, panaudojant tinkamą eliuentą, kuris suardo ryši, tarp imobilizuoto inhibuojančio peptido ir su juo susijungusio chimopapaino, sumažindamas aktyvių centrų giminingumą inhibuojančiam peptidui, tai gali būti pa-siekta, pavyzdžiui, pakeičiant aktyvių centrų charak-teristikas, panaudojant toki, denatūruojanti, agentą, kaip izopropanoli,, arba eliuentą, kurio pH yra žemiau ar aukščiau pH intervalo, kuriame vyksta chimopapaino surišimas. Tačiau, reikia pažymėti, kad tam tikslui tinkami eliuentai yra tik tokie, kurie neiššaukia chimopapaino negrįžtamo inaktyvavimo. Pagal kitą variantą chimopapainas gali būti selektyviai išstumtas iš imobilizuoto inhibuojančio peptido panaudojant eliuentą, kuriame yra perteklius komponento, patvariai susi-jungiančio su inhibuojančių peptidu. Tuo būdu šiuo komponentu gali būti, pavyzdžiui, kita cisteino pro-teinazė.
[0049] Tačiau pagal pirmenybę turinti, šio išradimo realizavimo variantą toks eliuentas turi cisteino proteinazės grįž-tamą inhibitorių, kuris konkurentiškai susijungia su chimopapaino aktyviais centrais ir tuo būdu išstumia ji, iš imobilizuoto inhibuojančio peptido. Tinkami yra ži-nomi inhibitoriai, pavyzdžiui, tokie nedidelės mole-kulinės masės disulfidai, kaip 2,21-dipiridilsulfidas, oksietildisulfidas, metil-2-piridildisulfidas ir natrio tetrationatas, o taip pat tokie gyvsidabrio reagentai, kaip gyvsidabrio chloridas, p-chlormerkurilbenzoatas ir mersalilas. Specialistui akivaizdu, kad chimopapaino giminingumas imobilizuotam inhibitoriniam peptidui pri-klausys nuo naudojamo peptido prigimties, pH, joninės jėgos ir eliuavimui naudojamo buferio sudėties, o taip pat nuo temperatūros. Todėl, priklausomai nuo šių para-metrų, keisis chimopapaino eliuavimui naudojamos inhi-buojančios proteinazės ir prigimtis, ir koncentracija. Toliau reikia pažymėti, kad gyvsidabrio reagentų atveju pusiausvyrinė būsena su surištu chimopapainu nusistovi greičiau, negu disulfidinių reagentų atveju, ir todėl tokius inhibitorius galima naudoti eliuavimo vykdymui nepertraukiamu metodu. Naudojant inhibitorius, kurių pusiausvyros su surištu chimopapainu susidarymas yra lėtas, prieš chimopapaino eliuavimą gali prireikti matricos su inhibitoriumi, pavyzdžiui, 1-2 arba daugiau valandų inkubavimo. Tačiau baltymo kiekis ir pro-teinazės aktyvumas eliuato frakcijoje gali būti kont-roliuojamas įprastu būdu, efektyviam ir selektyviam chimopapaino išstūmimui iš matricos galima keisti jo-ninę jėgą arba eliuanto prigimti, ir matricos su inhibitoriumi inkubavimo trukmę.
[0050] Eliuento frakcijos su žemu baltymo kiekiu arba su žemu chimopapaino aktyvumu po to gali būti atmestos.
[0051] Tam, kad būtų susilpninta chimopapaino ir inhibitorinio peptido tarpusavio sąveika, eliuento pH geriau palai-kyti pakankamai žemame lygyje, pavyzdžiui, 4-5 ribose, geriausia kad pH būtų lygus 4,5. Buvo nustatyta, kad tinkami eliuentai yra, pavyzdžiui, oksietildisulfidas (100 mM) vandeniniame etandiolio (33 %) tirpale, tu-rinčiame natrio citratą (50 mM) ir EDTA (1 mM) ir kurio pH=4,5; dipirildilsulfidas (30 mM) vandeniniame etandiolio (33 %) tirpale, turinčiame natrio citratą (50 mM) ir EDTA (1 mM) ir kurio pH=4,5; metilpiridildisulfidas (30 mM) vandeniniame etandiolio (33 %) tirpale, tu-rinčiame natrio citratą (50 mM) ir EDTA (1 mM) ir kurio pH=4,5; mersalilo rūgštis (10 mM) vandeniniame etandiolio (33 %) tirpale, turinčiame natrio hidroksidą
[0052] (50 mM) ir EDTA (25 mM) ir kurio pH nustatomas acto rūgšties pagalba iki 4,5; ir gyvsidabrio chloridas (10 mM) vandeniniame etandiolio tirpale, turinčiame natrio acetatą (50 mM) ir kurio pH=4,5) . Geriausiu grįžtamu proteinazės inhibitoriumi yra gyvsidabrio chloridas.
[0053] Afininė chromatografija, naudojama pirmenybę turinčiame būdo realizavimo variante pagal ši, išradimą chimopapaino valymui, žymiai padidina chimopapaino specifini, aktyvumą, kuris nustatomas kaip aktyvumas BAPNA at-žvilgiu, arba titruojant reagentų aktyvius centrus E-64 arba jodacto rūgštimi. Aktyvi chimopapaino forma yra surišama pirmiausia ir eliuuojasi, ir tuo būdu skiriasi nuo neaktyvios formos ir kitų cisteino proteinazių, esnčių pradiniame produkte. Ši, išradimą atitinkantis šviežiai pagamintas chimopapainas, išvalytas panaudojant afininę chromatografiją, paprastai turi ne ma-žiau 70, geriau ne mažiau 80, geriausia ne mažiau 90 % aktyvaus fermento.
[0054] Paprastai išvalytą chimopapainą prieš laikymą arba naudojimą išskiria iš eliuato. Tinkamiausiu atveju eliuuotą chimopapainą papildomai valo, kad iš aktyvių fermentų centrų būtų išstumtas cisteino proteinazės inhibitorius. Inhibitorius gali būti išstumtas pridedant reduktoriaus, pavyzdžiui, cisteino, perteklių, ir po to, esant norui, pašalintas įprastais būdais, pavyzdžiui, gel-filtravimu arba dialize. Pagal kitą va-riantą inhibitorius gali būti pašalintas adsorbcijos ant tam tikros dervos būdu. Taip, pavyzdžiui, nedidelės molekulinės masės disulfidai gali adsorbuotis ant afi-ninės chromatografijos galiutationo kolonėlės, o gyvsidabrio reagentai - ant dervų, pasižyminčių komplek-sinančiomis savybėmis. Pagal pirmenybę turinti, variantą inhibitorių pašalina aktyvuojant fermentą reduktoriumi, pavyzdžiui cisteinu, kuris katijonitinėj e kolonėlėje yra surištame būvyje, ir po to išplaunant inhibitorių iš kolonėlės.
[0055] Tinkamiausiu atveju išskirtą išvalytą chimopapainą prieš laikymą liofilizuoj a, pavyzdžiui, sublimacinio džiovinimo būdu.
[0056] Šį išradimą atitinkančio chimopapaino charakteristikos gali būti nustatytos žinomais metodais. Tokiems meto-dams priklauso, pavyzdžiui, aminorūgščių analizė (ami-norūgščių su galiniu azoto atomu); aktyvių centrų titravimas reagentu E-64 (arba jodacto rūgštimi ir tuo pačiu metu inaktyvavimo greičio nustatymas; elekt-roforezė natrio dodecilsulfate arba daugiazoninė kato-dinė elektroforezė poliakrilamido gelyje, o taip pat aktyvumo nustatymas įvairių proteinazių substratų at-žvilgiu .
[0057] Šį išradimą atitinkantys nauji inhibitoriniai peptidai gali būti gauti analogiškais žinomais metodais. Taip, pavyzdžiui, dipeptidų dariniai gali būti gauti dau-giastadijinės sintezės keliu šiuo būdu: a) galinis aminorūgšties (pirmos aminorūgšties) anglies atomas, kuris po to turi tapti inhibuojančio peptido
[0058] galiniu C atomu, gali būti apsaugotas, pavyzdžiui, reaguojant su 0, N-dimetilhidroksilamino hidrochloridu, esant izobutilchloroformiatui ir N-metilmorfolinui; reakcijos pasekoje susidaro dimetilhidroksiamido darinys. Geriausia, kad pirmosios aminorūgšties galinis
[0059] atomas pradžioje butų apsaugotas, pavyzdžiui, tretiniu butoksikarbonilu.
[0060] b) apsaugota pirmoji aminorūgštis, pavyzdžiui, jos di-metilhidroksamido darinys, gali po to reaguoti su
[0061] stipria, pavyzdžiui, trifluoracto, rūgštimi, susidarant ketvirtinei amonio druskai.
[0062] c) po to apsaugota pirmosios aminorūgšties ketvirtinė amonio druska gali reaguoti su antrosios aminorūgšties
[0063] dariniu, pavyzdžiui, su N-karbobenzoksi-dariniu, susidarant dipeptido dariniui;
[0064] d) gautas dipeptido darinys gali būti suredukuotas, reaguojant jam su švelniu reduktoriumi, pavyzdžiui, diizobutilaliuminio hidridu arba ličio aliuminio hidridu, susidarant laisvai aldehidinei grupei prie dipeptido galinio anglies atomo; e) gautas aldehidas gali būti paverstas, pavyzdžiui, semikarbazoną, reaguojant su semikarbazidu, į metoksi-iminą, reaguojant su metoksiaminohidrochloridu, arba i, oksimą, reaguojant su hidroksilaminu; f) paskutinėje stadijoje nuo apsaugoto galinio azoto atomo gali būi pašalinta apsauginė grupė: pavyzdžiui,
[0065] N-karbobenzoksigrupė gali būti pašalinta, katalitiškai redukuojant su 10 % paladžiu ant aktyvuotos anglies.
[0066] Tuo atveju, jei galima, baltymo koncentraciją nustati-nėjome A280 metodu, naudojant A280 1% = 20,0 papajos latekso preparatų analizei ir A280 1% = 18,3 išvalyto arba iš dalies išvalyto chimopapaino produktų analizei
[0067] (Robinson, 1975, Biochemistry, 14, 3695-3700). Kai kurie tiolą turintys reagentai ir disulfidai pasižymi šviesos sugėrimu prie 280 nm, todėl, jei jie yra baltyme, tai baltymo koncentracijos nustatymui naudojome Bio-Rad analizę su dažo surišimu (Bio-Rad Laboratories, Didžioji Britanija). Standartais naudojami išpurškimo džiovykloje išdžiovinto papajos latekso tirpalai (A280 1 % = 20, ) ) . Šis metodas mažiau jautrus priemaišoms, negu A280. Išvalyto fermento preparatuose baltymo kiekis buvo nustatomas, skaičiuojant bendram sausos medžiagos kiekiui.
[0068] a) Aktyvumas BAPNA atžvilgiu ( Metodika Nr. 1) - analizė Smito metodu
[0069] Tiriamą bandini, supildavo i, " 1 buferi," , vandenini, natrio fosfato (0,1 M) tirpalą, kurio pH=6,0, ir kuriame yra EDTA (lmM) ir cisteino hidrochlorido mono-hidratas (10 mM), su tokiu apskaičiavimu, kad galutinis tūris būtų 1 ml. Prieš reakcijos pradžią fermentą (jei jis yra bandinyje) aktyvavo 5 min 37°C temperatūroje, pridedant 4 ml substrato N-a-benzoil-DL-arganino p-nitroanilido (BAPNA) (1,25 mM) tirpalo, prieš tai pa-šildyto iki 37°C.
[0070] Pastaba: substrato tirpalą gaminome ištirpinant 300 mg BAPNA šiltame dimetilsulfokside, po to gautą tirpalą lėtai supylėme i, 450 ml, prieš tai iki 37°C pašildyto, 1 buferio tirpalą ir pylėme 1 buferi, iki bendro 500 ml tūrio; tam, kad neiškristų i, nuosėdas BAPNA, substrato tirpalo temperatūrą palaikėme virš 30°C.
[0071] Inkubaciją 37°C temperatūroje tęsėme 30 minučių, po to reakciją nutraukdavome 1 ml acto rūgšties (4 N) pri-dėjimu i reakcijos mišini,. Išsiskyrusi, 4-nitroaniliną nustatydavome matuojant AA410. Vienas aktyvumo vienetas šiomis sąlygomis atitiko 1 pikomolio 4-nitroanilino iš-siskyrimui (£=8800 M 1. cm"1) per sekundę.
[0072] Pateiktos analizės atlikimo sąlygos atitiko sąlygas, aprašytas Didžiosios Britanijos patente Nr. 2098997, pateiktame Smith Laboratories Inc. Šiomis sąlygomis yra analizuojami chimopapaino preparatai visame pasaulyje, pavyzdžiui, chimopapainas, išleidžiamas firmos The Boots Company PLC su prekybiniu pavadinimu Chymodiactin, ir chimopapainas, išleidžiamas Pietų Korėjos firmos Sinpoong su prekybiniu pavadinimu Disken. Šie aktyvumo vienetai yra tarptautiškai pripažinti ir paprastai vadinami "Smith BAPNA Assay Units".
[0073] Tiriamą bandini, supildavo i, vandenini, buferini, natrio
[0074] fosfato tirpalą (0,10 M), kurio pH=6,8 ir kuriame yra EDTA (1 mM) ir di tiotreitolas (2 mM) arba cisteinas (4 mM) , su tokiu apskaičiavimu, kad galutinis tūris būtų 0, 975 ml. Prieš reakcijos pradžią fermentą (jei jis yra bandinyje) aktyvavo 4 0°C temperatūroje 5 minutes, pridedant 25 įj.1 N- a-benzoil-DL-arganino p-nitro-anilido (BAPNA) tirpalo (100 mM) dimetilsulfokside. In-kubaciją 40°C temperatūroje tęsė 10 min, o po to reak-ciją nutraukdavome 1 ml (0,10 M) vandeninio buferinio tirpalo, turinčio natrio chloracetatą ir natrio acetatą
[0075] (0,20 M) ir pH=4,3, pridėjimu i, reakcijos mišinį. Iš-siskyrusi, 4-nitroaniliną nustatinėj ome matuojant AA410. Vienas aktyvumo vienetas šiomis sąlygomis atitiko 1 pikomolio 4-nitroanilino išsiskyrimui (s = 8800 M L, cm *) per sekundę.
[0076] Chimopapaino aktyvumo absoliučios reikšmės, gautos pasinaudojant aprašytomis Metodikomis Nr. 1 ir Nr. 2, skiriasi viena nuo kitos, ir būtent: reikšmės, gautos pasinaudojant Metodika Nr. 2 maždaug 2-3 kartus di-desnės, už reikšmes, gautas pagal Metodiką Nr. 1 (žr.
[0077] c) Aktyvių centrų titravimas jodacto rūgštimi
[0078] Chimopapaino aktyvių centrų titravimą jodacto rūgštimi
[0079] vykdėme taip pat, kaip ir aktyvių centrų titravimą reagentu E-64, aprašytą Zucker ir kt. Biochim. Biophys. Actą (1985), 828, 196-204. Chimopapaino tirpalą skiedė-me 1 buferyje, kaip tai aprašyta aukščiau esančiame skyriuje (a), gaudami tirpalą, kuriame yra 60 [J.M baltymo (s28o = 4, 3284 x 10 4 M -1 , cm -1, paskaičiuotą iš A280, 1 % = 18,3, Robinson (1985) (žr. aukščiau cituotą dar-bą) ir MW (molekulinis svoris) = 23656, apskaičiuotas iš aminorūgščių sekos Jacąuet ir kt. (1989 gegužė), Bio. Chem. Hoppe-Seyler, 37 0, 425-434). Alikvotines, po 20 ml chimopapaino tirpalo dalis patalpinome i, tit-ravimo mėgintuvėlius ir 5 min 37°C temperatūroje inkubavome su 20 Hl 1 buferio (40 p.1 kontroliniame bandyme) Po to j, kiekvieną mėgintuvėli, pridėjome 20 ml (atitinkamai 10, 20, 30, 40, 50 ir 60 įj, M) jodacto rūgš-ties ir mišini, palaikydavome 10-20 min 37°C tempe-ratūroje, Reakciją inicijuodavome pridedant i, mišini, 4 ml BAPNA substrato tirpalo, aprašyto aukščiau esan-čiame skyriuje (a), ir iš anksto pašildyto iki 37°C. 37°C temperatūroje inkubaciją tęsėme 30 min, po to reakciją nutraukdavome, kaip tai yra aprašyta skyriuje (a) , ir išsiskyrusio 4-nitroanilino kieki, nustatydavome matuojant AA41Ū. Tuo būdu gautą aktyvaus chimopapaino molinę koncentraciją lygindavome su baltymo moline koncentracija, remiantis chimopapaino moliniu ekstinkcijos koeficientu, kuris lygus 4, 3284 104 M1 cm1. Po to aktyvaus chimopapaino koncentraciją išreikšdavome procentais nuo bendro baltymo kiekio.
[0080] Aktyvumą azokazeino atžvilgiu nustatinėj ome pagal me-todiką, aukščiau aprašytą Rowan ir kt. (1988), Arch. Biochem. Biophys. 267, 262-270, naudojant mažiau 1 (J.M fermento (priimant molekulini, svorį 2400) ir, esant reikalui, 1 piM vištų cisteino. Visos fermentų ir inhi-bitoriaus koncentracijos susijusios su aktyvių mole-kulių koncentracija.
[0081] Imunologinė analizė paprastos radialinės imunodifuzijos metodu
[0082] Paprasta radialinė imunodifuzij a remiasi Mancini ir kt. , 1965, Imunochem. 2, 235-254 metodu ir yra atliekama šiuo būdu. Agarozę (1 %), esančią vandeniniame natrio fosfato tirpale (10 mM) , turinčiame NaCl (0,14 M) ir kurio pH=7,3 bei turinčią monospecifinio IgG pre-paratą, užpildavo ant Gel BondR (FMC Corporation. Maine, JAV) ir 1,5 cm plote išpjaudavo stačiakampės formos figūras (r=l mm) . Kontrolinius pavyzdžius ir tiriamus bandinius figūrose išdėstydavo atsitiktiniu būdu tam, kad minimizuoti kraštini, efektą. Po antigeno įnešimo i, figūras, jas laikydavo 24 valandas preci-pitino žiedų susidarymui. Po to jas nuplaudavo, iš-džiovindavo ir dažydavo. Antigeno priklausomybės nuo žiedo diametro kvadrato priklausomybės gavimui naudojome švarų, saikingai karboksimetilintą antigeną. Nu-statymo intervalas buvo 25-300 ng antigeno vienai fi-gūrai .
[0083] a) Afininės kolonėlės gavimas
[0084] Butiloksikarbonil-L-Phe-p-nitrofenilo esteris (10 mM)
[0085] maišant buvo pridedamas i, a-NH2CH2CN. HC1 (20 mM) ir di-
[0086] izopropiletilamino (20 mM) mišini, dimetilformamide (20 ml). Mišinys 20°C temperatūroje buvo maišomas 2 valandas, po to praskiedžiamas etilacetatu (100 ml), 2 kartus praplaunamas vandeniu, 5 kartus vandeniniu trietilamino tirpalu, 3 kartus vandeniu, 2 kartus kalio bisulfito tirpalu, 3 kartus vandeniu, džiovinamas ir išgarinamas. Nuosėdas perkristalinome iš etilacetato ir heksano mišinio, gaudami BOC-L-Phe-NHCH2CN, lyd. temp. 134, 5-135°C. Ledu atšaldytą trifluoracto rūgšti, (10 ml) pridėjome i, Boc-L-Phe-NHCH2CN (5 mM) tirpalą dichlormetane (10 ml) . Reakcijos mišinį 30 min laikėme 20°C temperatūroje, po to tirpikli, pašalinome išgarinant 40°C temperatūroje. Liekaną tirpinome chloroforme, tir-palą išgarindavome ir aprašytą operaciją kartojome dar du kartus. Gautą neapdirbtą trifluoracetatinę druską ištirpinome diizopropiletilamino (7,5 mM) tirpale dimetilformamide (10 ml) ir pridėjome i, paruoštą Boc-Gly-p-nitrofenilo eterio (6,25 mM) ir N-hidroksibenzotri-azolo monohidrato (6,25 mM) tirpalą. Po to, p-nit-rofenolio išskyrimui (auksinė spalva) , i, mišini, lašais buvo pridedamas pakankamas kiekis diizopropiletilamino ir mišinys buvo maišomas kambario temperatūroje 2 valandas. Po to i, ši, mišini, pridėjome N,N-dietileti-lendiamino (1,5 ml) , po 15 min etilacetato (60 ml) , o po to mišini, plovėme vandeniu, vandeniniu trietilamino tirpalu, vandeniu, kalio bisulfito vandeniniu tirpalu, vandeniu, džiovinome ir išgarinome. Liekaną valėme chromatografijos ant silikagelio būdu, eliuavimas buvo atliekamas etilacetato ir heksano (20:1) mišiniu. Buvo gautas putų pavidalo Boc-L-Phe-NHCH2CN.
[0087] Boc-Gly-L-Phe-NHCH2CN (30 mg) tirpinome 1 ml trifluoracto, dichlormetano ir anizolo mišinio (25:65:10) ir tirpalą 30 min laikėme 0°C temperatūroje. Po to mi-šini, džiovinome rotaciniame garinimo aparate 34°C tem-peratūroje ir liekaną tirpinome metanolyje (1,5 ml) ir vandeniniame NaHC03 tirpale (0,1 M, pH—8,0. 1,5 ml), gaudami ligando tirpalą.
[0088] Aktyvuotą CH-SepharosR4B (Pharmacia, 3 g sauso svorio) hidratavome per nakti vandeniniame druskos rūgšties tirpale (1 mM, 75 ml) 4°C temperatūroje, po to plovėme druskos rūgštimi (mM, 600 ml), o po to vandeniniu NaHC03 tirpalu (0,1 M, pH=8, 0, 300 ml) . Geli, suspendavome vandeniniame NaHC03 tirpale (0,1 M, pH=8,0, 30 ml), pridėdami i, suspensiją iš anksto paruoštą ligando tir-palą, ir mišinį atsargiai maišėme per nakti, 20°C tem-peratūroje. Gautą geli, surinkome sukepto stiklo filtre, praplovėme vandeniniu metanolio tirpalu (50 tūrinių %, 180 ml), vandeniu ir suspendavome vandeniniame eta-nolamino tirpale (0,1 M, 30 ml) , kurio pH buvo nustatytas lygiu 9, panaudojant druskos rūgšti,. Suspen-sija buvo purtoma 4 vai 20°C temperatūroje, po to geli, surinkome, praplovėme vandeniu (500 ml) ir laikėme "darbiniame" buferyje (natrio fosfatas (50 mM) ; EDTA (1 mM); etandiolis (33 %) , pH=6,8, 4°C).
[0089] Kolonėlę, užpildytą SepharoseR-Ahx-Gly-L-Phe-NHCH2CN,
[0090] praplovėme "eliuuoj ančių" buferiu (natrio citratas (50 mM) ; etandiolis (33 %) , pH=4,5; 12 ml) ir po to darbiniu buferiu (žr. aukščiau, 12 ml).
[0091] Išpurškimo džiovykloje išdžiovintą papajos lateksą (0,5 g) ištirpinome darbiniame buferyje (10 ml) ir tirpalą filtravome per filtrą, kurio porų diametras buvo 0,22 }j.M. Baltymo koncentraciją filtrate nustatinė j ome pasinaudojant Bio-Rad dye-binding analize (Bio-Rad Laboratories, Didžioji Britanija). Į mišinį pridėjome toki, ditiotreitolo kieki,, kad jo koncentracija būtų 2 mM, ir mišini, laikėme 20 min 0°C temperatūroje. Per kolonėlę praleidome 80 mg baltymo latekso (38 ml/val/cm ) 20°C temperatūroje, o po to darbinį (8 ml) ir eliu-uojantį (8 ml) buferius. Po to pro ją praleidome 4 ml eliuuojančio buferio, turinčio oksietildisulfido (50 mM), po to tirpalų leidimą pro kolonėlę nutraukdavome ir palikdavome ją nakčiai 20°K temperatūroje. Po išlaikymo per naktį pratęsėme eliuavimą oksietildisulfidą turinčiu eliuuojančiu buferiu (10 ml) ir surinkome eliuato frakcijas (po 1 ml). Frakcijas, aktyvias BAPNA atžvilgiu, surinkome į vieną vietą ir praleidome pro kolonėlę, užpildytą Mono HR 5/5R (katijonitinė derva), kuri prieš tai buvo apdorota vandeniniu natrio aceta-to/acto rūgšties mišiniu (50 mM), kurio pH=5 ir kuriame buvo EDTA (1 mM) . Po to kolonėlę plovėme tuo pačiu buferiu (1 ml/min) iki tol, kol A280 vėl nerodė nulinės reikšmės. Po to pro kolonėlę leidome gradientą
[0092] (21,5 mMNa+/ml) iki 1 M natrio acetato (Buttle ir Barrett, 1984, aukščiau cituotas darbas) ir surinki-nėjome frakcijas po 1 ml. Eliuavome du pagrindinius baltymo pikus: pirmą piką, kurio eliuavimas vyko esant maždaug 0,17 M Na+, atitinkanti, papainui, ir antrą piką, kurio eliuavimas vyko esant maždaug 0,38 M Na+, atitinkantį PPIV. Frakcijas su piku, atitinkančiu PPIV, apjungėme, dializavome vandeniniame EDTA tirpale (1 mM) , džiovinome sublimacinio džiovinimo būdu ir laikėme - 20°C temperatūroje. Švari PPIV nepasižymėjo aktyvumu BAPNA atžvilgiu, tačiau pasižymėjo aktyvumu hidro-lizuoto azokazeino atžvilgiu, šis aktyvumas nebuvo inhibuojamas 1 mM koncentracijos vištų cisteinu.
[0093] Švarų PPIV antigeną prieš naudojimą minkštai karboksimetilinome pagal Zucker ir kt. metodą, 1985, Biochim. Biophys. Actą, 82 8, 196-204. Po to PPIV antiserumą inicijavome triušyje, darydami 360 mg karboksimetilinto baltymo pilname Freund adjuvante injekciją į raumenis, bei darydami po 2 savaičių 100 mg nepilname adjuvante
[0094] poodinę injekciją. IgG iš dalies valėme nuo serumo frakcionuoj ant su amonio sulfatu, kaip tai aprašė Heide ir Schwick (1978) Handbook of Experimental Immunology (Weir, D. M. ed.). Vol. 1, 7.1-7.11, Blackwell, Oxford, bei po to dializuojant vandeniniame natrio fosfato tirpale (10 mM) , turinčiame NaCl (0,14 M) ir kurio pH=7,3.
[0095] PPIV analizei paprastos radialinės imunodifuzijos būdu (žr. aukščiau) naudojome specifini, PPIV atžvilgiu pre-paratą IgG.
[0096] Atskiri šio išradimo aspektai nuodugniau iliustruojami žemiau pateiktų pavyzdžių pagalba, tačiau kurie yra tik išimtinai iliustracinė medžiaga ir jokiu būdu neap-riboja patentu ginamo išradimo turinio.
[0097] Panaudotų abreviatūrų reikšmės yra šios: ABTS, 2,2'-azinobis(3-etilbenztriazolino sulforūgštis); Ahx, 6-aminoheksanoilas; Ala, alaninas; BAPNA, N-a-benzoil-DL-arginino p-nitroanilidas; Boc, butiloksikarbonilas; CBZ, karbobenzoksi; Cha, cikloheksilalaninas; DMF, N,N-dimetilformamidas; E-64, L-3-karboksi-2,3-trans-epoksi-propionilleucilamido-4(-guanidino)butanas; EDC, N-etil-N'-(2-dimetilaminopropil)karbodiimido hidrochloridas; EDTA, etilendiamintetraacto rūgštis (dinatrio druska); Gly, glicinas; Leu, leucinas; Mo, metoksiiminas; OBZ, oksibenzilas; Ox, oksimas; Phe, fenilalaninas; Sc, semikarbazonas; THF, tetrahidrofuranas; ir Tyr, tirozinas.
[0098] Bio-Rad, Chelex, Chymodiactin. Ch-Sepharose 4B, Chymofast, Disken, ECH-Sepharose, Enzifitter, FPLC, Gel Bond, Mono SHR, S-Sepharose HP, Tween, Zeta ir Zetaffinity yra prekybiniai pavadinimai.
[0099] Visos stadijos, jei tai nepaminėta atskirai, buvo vyk-domos kambario temperatūroje.
[0100] 1 PAVYZDYS - L- alanil- L- fenilalanil semikarbazonas a stadija
[0101] A) Į sausą N,N-dimetilformamidą (DMF) (100 ml) maišant kambario temperatūroje pridėjome 0,N-dimetilhidroksilamino hidrochlorido. Po to i, mišinį per 5 minutes buvo pridedamas N-metilmorfolinas (10,6), palaikant tem-peratūrą žemiau 30°C. To pasekoje iškrito baltos nuo-sėdos ir mišini, atšaldėme iki 0°C. B) N-t-Boc-L-Phe (26,5 g) ištirpinome sausame tetra-hidrofurane (THF) (200 ml) ir atšaldėme tirpalą iki — 10°C, po to per 5 minutes į ji, pridėjome izobutil-chloroformatą (14,38 g), palaikant temperatūrą -10°C. Po to i, mišinį per 10 min pridėjome N-metilmorf oliną (10,6 g), palaikant mišinio temperatūrą -10°C, ir maišymą tęsėme dar 10 minučių. C) Į suspensiją B per 15 min buvo pridedama suspensi-ja A, palaikant temperatūrą -10°C. Mišiniui leidome sušilti iki kambario temperatūros ir po to maišėme ji, 3 valandas. Gautą mišini, atšaldėme iki 0°C ir per 5 min pridėjome 3-dimetilaminopropilaminą (10,2 g). Po to pridėjome vandeni, (200 ml) ir etilacetatą (200 ml) , atskyrėme viršutini, organini, sluoksnį ir nuosekliai plovėme ji, (a) vandeniu (200 ml) , (b) vandeniniu KHC03 tirpalu (5 %, 200 ml), (c) vandeniniu HC1 tirpalu (0,5 N, 200 ml) ir (d) vandeniu (3x200 ml) . Po to tirpikli, pa-šalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei 30°C temperatūrai, ir gavome N-t-Boc-L-Phe-0, N-dimetilhidroksamatą.
[0102] N-t-Boc-L-Phe-O,N-dimetilhidroksamato (2,9 g) ir trifluoracto rūgšties (8 ml) mišini, maišėme keturias valandas kambario temperatūroje. Po to trifluoracto rūgš-ties perteklių pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei 30°C temperatūrai. Prie liekanos pridėjome dietilo eteri, (30 ml) ir gavome tirpalą, po to eteri, nudistiliavome vakuume. Apdorojimą eteriu kartojome iki tol, kol prasidėjo kristalizacija. Kietą medžiagą nufiltravome, praplovėme eteriu ir džiovinome vakuume virš gavome L-Phe-0,N-dime-tildichroksamato trifluoracetato druską.
[0103] A) L-Phe-0,N-dimetilhidroksamato trifluoracetato druską (7,15 g) ištirpinome sausame DMF (30 ml) maišant kambario temperatūroje, po to i, tirpalą per 5 min pri-dėjome N-metilmorfolino (2,35 g), palaikydami žemesnę nei 30°C temperatūrą. Gautą mišini, atšaldėme iki 0°C. B) CBZ-L-Ala (4,96 g) maišant ištirpinome sausame THF (55 ml) ir mišini, atšaldėme iki -10°C. Po to i, mišini, per 5 min pridėjome izobutilchloroformiatą (3,05 g) -10°C temperatūroje, N-metilmorfoliną (2,35 g) per 10 min ir reakcijos mišini, po to dar maišėme 10 min
[0104] C) A tirpalą per 15 min pridėjome prie B tirpalo -10°C temperatūroje, po to leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros ir maišymą tęsėme dar 3 valandas. Po to mišini, atšaldėme iki 0°C, per 5 min pridėjome 3-dimetilaminopropilaminą (2,27 g) ir po to maišėme dar 5 min. Po to i, mišini, pridėjome vandeni, (50 ml) ir etilacetatą (50 ml), viršutini, organini, sluoksni, atsky-rėme ir nuosekliai plovėme ji, (a) vandeniu (50 ml) ir sočiu vandeniniu NaCl tirpalu (5 ml), (b) vandeniniu KHCO3 tirpalu (5 %, 50 ml) , (c) vandeniniu HC1 tirpalu (0,5 N, 50 ml) ir (d) vandeniu (3x50 ml) . Po to tirpikli, nugarinome vakuume rotaciniame išgarinimo aparate, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai, prie liekanos pridėjome šviežio etilacetato (50 ml) ir paša-linome ji išgarinant, gavome CBZ-L-Ala-L-Phe-0,N-dime-tilhidroksamatą.
[0105] CBZ-L-Ala-L-Phe-O,N-dimetilhidroksamatą (27,8 g) ištir-pinome sausame THF (280 ml) ir atšaldėme tirpalą iki -70°C azoto atmosferoje. Po to per 60 min, -70°C temperatūroje ir azoto atmosferoje į ši, tirpalą pri-dėjome diizobutilaliuminio hidrido tirpalo THF (1 M, 372 ml) ir maišymą tęsėme dar 60 min -70°C tempe-ratūroje. Reakcija būdavo užbaigiama maišant supilant mišini, 0°C temperatūroje ir N2 atmosferoje i, sotų vandenini, NaCl tirpalą (400 ml) ir Segneto druskos tirpalą
[0106] (600 ml) . Po to mišiniui buvo leidžiama sušilti iki kambario temperatūros ir i, ji, pridėjome etilacetatą
[0107] (600 ml) . Po to mišini, filtravome, atskyrėme vandenini, sluoksni, ir ji, ekstrahavome etilacetatu (200 ml) . Sujungtas organines fazes tris kartus plovėme vandeniu (600 ml) ir sočiu vandeniniu NaCl tirpalu (400 ml) . Tirpikli, pašalinome vakuume rotaciniame išgarinimo aparate, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Liekaną perkristalinome iš toluolo ir džiovinome vakuume virš P205. Gavome CBZ-L-Ala-L-Phe-aldehidą.
[0108] A) CBZ-L-Ala-L-Phe-aldehidą (3 g) ištirpinome techniniame metilo spirite (20 ml). Tirpalą pašildėme iki 50°C ir filtravome, norint pašalinti netirpią medžiagą. B) Semikarbazido hidrochlorido (1,3 g) tirpalą vandenyje (10 ml) pridėjome i, KHC03 (1,1 g) vandenyje (10 ml). C) Tirpalą B pridėjome į tirpalą A ir gautą mišinį maišėme 2 vai 50°C temperatūroje, po to i, ji, pridėjome etilacetatą (50 ml) ir vandeni, (100 ml) , vandenini, sluoksni, atskyrėme, ekstrahavome ji, etilacetatu (2x20 ml) ir sujungtas organines fazes nuosekliai plovėme (a) vandeniniu KHC03 tirpalu (5 %, 50 ml) , (b) vandeniniu HC1 tirpalu (0,5 N, 50 ml) ir (c) vandeniu ir sočiu vandeniniu NaCl tirpalu (50 ml/20 ml x 3) . Po to tirpikli, išgarindavome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant temperatūrai žemesnei nei 30°C. Gavome CBZ-L-Ala-L-PheSc.
[0109] CBZ-L-Ala-L-PheSc (680 mg) ištirpinome metanolyje (90 ml) ir netirpią liekaną atskyrėme filtruojant. Aparatą, kuriame buvo CBZ-L-Ala-L-PheSc metanolis tirpalas, prapū-tėme N2 ir pridėjome i, ji, katalizatorių - 10 %-ni, paladi, ant aktyvuotos anglies (100 mg) . Į uždarą sistemą 75 min leidome H2. Po to katalizatorių nufiltravome ir metanoli, pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant temperatūrai žemesnei nei 30°C. Iš liekanos stovint išsikristalindavo kristalinės nuosėdos, kurias džiovinome vakuume virš P205. Gavome L-alanil-L-fenilalanil semikarbazoną (L-Ala-L-PheSc).
[0110] 2 PAVYZDYS L- fenilalanil- L- fenilalanil semikarbazonas a ir b stadijos L-Phe-0,N-dimetilhidroksamato trifluoracetato druską sintezavome taip pat, kaip 1 pavyzdžio a ir b stadijose .
[0111] A) L-Phe-O,N-dimetilhidroksamato trifluoracetato druską (1,932 g) ištirpinome sausame DMF (8 ml) maišant kambario temperatūroje. Į gautą tirpalą per 5 min pri-dėjome N-metilmorfoliną (0,606 g), palaikant tempe-ratūrą žemiau nei 30°C, ir gautą mišinį atšaldėme iki 0°C. B) CBZ-L-Phe (1,794 g) maišant ištirpinome sausame THF (15 ml) ir mišinį atšaldėme iki -10°C, po to į mišinį per 5 min -10°C temperatūroje pridėjome izobutil-chloroformiatą (0,822 g), ir per 10 min N-metil-morfoliną (0,606 g), ir gautą reakcijos mišinį maišėme dar 10 min -10°C temperatūroje. C) Per 15 min tirpalą A pridėjome į tirpalą B -10°C temperatūroje, leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros ir maišymą tęsėme dar 3 vai. Po to mišinį atšaldėme iki 0°C, per 5 min pridėjome į jį 3-di-metilaminopropilaminą (0,612 g) ir maišymą tęsėme dar 5 min. Po to į mišinį pridėjome vandenį (20 ml) ir etilacetatą (30 ml), atskyrėme organinę fazę ir nuosekliai plovėme ją (a) vandeniniu KHC03 tirpalu (5 %, 20 ml, ) (b) vandeniniu HC1 tirpalu (0,5 N, 20 ml) ir (c) vandeniu (2x30 ml). Tirpiklį pašalinome rotaciniame džiovinimo aparate vakuume žemesnėje nei 35°C tem-peratūroje. Liekaną perkristalinome iš izopropilo spirito. Gavome CBZ-L-Phe-L-Phe-0,N-dimetilhidroksamatą.
[0112] CBZ-L-Phe-L-Phe-0,N-dimetilhidroksamatą (4,89 g) ištir-pinome sausame THF (40 ml) . Į sausą kolbą (azoto atmosferoje) įdėjome ličio-aliuminio hidridą (0,493 g) ir sausą THF (20 ml) ir maišėme gautą mišinį 10 min, o po to gautą mišinį atšaldėme iki -10°C. Po to į šitą mi-šini, N2 atmosferoje ir -50°C temperatūroje pridėjome hidroksamato tirpalą sausame THF ir maišymą tęsėme dar 20 min 0-5°C temperatūroje.
[0113] Po to reakcijos mišinį atšaldėme iki -50°C temperatūros ir azoto atmosferoje pridėjome i, ji, sotų Segneto druskos tirpalą (60 ml) . Leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros, pridėjome i ji HC1 (kone., 10 ml) ir nustatėme vandeninės fazės pH=3, netirpią dali, nufiltravome. Po to i, nufiltruotą tirpalą pridėjome etil-acetatą (50 ml) , organinę fazę atskyrėme ir nuosekliai praplovėme (a) vandeniu (50 ml) , (b) vandeniniu KHC03 tirpalu (5 %, 50 ml) , (c) vandeniniu HC1 tirpalu (0,5 N, 50 ml) ir (d) vandeniu (3x50 ml). Po to etilacetatą pa-šalinome rotacinio išgarinimo aparate vakuume žemesnėje nei 30°C temperatūroje. Liekaną palikome nakčiai, po to džiovinome vakuume virš P205 ir kristalinome iš toluolo. Gavome CBZ-L-Phe-L-Phe aldehidą.
[0114] A) CBZ-L-Phe-L-Phe aldehidą 70°C temperatūroje ištir-pinome techniniame metilo spirite (10 ml). B) Į semikarbazido hidrochlorido (0,183 g) tirpalą vandenyje (3 ml) ir technini, metilo spiritą (2 ml) pri-dėjome natrio acetato trihidratą (0,224) ir tirpalą pašildėme iki 60°C. c) Tirpalą A pridėjome i, tirpalą B, kolbą nuo A tirpalo praplovėme techniniu metilo spiritu, praplovimo skysti,
[0115] pridėjome prie mišinio ir 60-70°C temperatūroje maišėme ji, 30 min. Po to leidome mišiniui lėtai atšalti, palikome stovėti ji, ant ledo dar valandą ir po to palikome nakčiai 4°C temperatūroje. Kietą produktą at-skyrėme filtruojant, praplovėme ji, techninio metilo
[0116] spirito ir vandens mišiniu (4:1, 3 ml), išdžiovinome vakuume virš P205. Gavome CBZ-L-Phe-L-PheSc.
[0117] CBZ-L-Phe-L-PheSc (2,1 g) ištirpinome metanolyje (315 ml) 30°C temperatūroje ir netirpią liekaną pašalinome nu-filtruojant. Prietaisą, kuriame buvo metanolinis semikarbazono tirpalas, prapūtėme azotu, įdėjome katali-zatorių - 10 %-ni, paladi, ant aktyvuotos anglies (0,35 g) ir i, uždarą sistemą 30 min leidome vandenį. Po to katalizatorių nufiltravome ir tirpikli, pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Liekaną išdžiovinome vakuume virš P205. Gavome L-fenilalanil-L-fenilalanil semikarbazoną
[0118] 3 PAVYZDYS L- fenilalanil- L- fenilalanil metoksiiminas a- d stadijos
[0119] CBZ-L-Phe-L-Phe aldehidą sintezavome taip pat, kaip tai aprašyta 2 pavyzdžio a-d stadijose.
[0120] A) CBZ-L-Phe-L-Phe aldehidą (0,645 g) ištirpinome techniniame metanolyje (35 ml) 60-65°C temperatūroje ir ne-tirpią liekaną nufiltravome. B) Į metoksilamino hidrochlorido (0,138 g) tirpalą vandenyje 60°C temperatūroje pridėjome natrio acetato trihidratą (0,224 g). C) Į tirpalą A pridėjome tirpalą B, B medžiagos kolbą praplovėme 60°C vandeniu (10 ml) , praplovimo vandeni, apjungėme su mišiniu ir ji, kaitinome pusę valandos 60°C temperatūroje, po to palikome 2 valandas atvėsti iki kambario temperatūros. Kietą produktą nufiltravome, praplovėme techninio metanolio mišiniu su vandeniu (1:1, 6 ml) ir džiovinome vakuume virš P205. Gavome CBZ-L-Phe-L-Phe metoksiiminą.
[0121] CBZ-L-Phe-L-Phe metoksiiminą (550 mg) ištirpinome metanolyje ir netirpią liekaną nufiltravome. Prietaisą, kuriame buvo metanolinis metoksiimino tirpalas, pra-pūtėme azotu, įdėjome katalizatorių - 10 %-ni, paladi, ant aktyvuotos anglies (100 mg) . Po to i, hermetizuotą indą pūtėme vandenilį, esant reikalui, pūtimą tęsėme 4,5 valandos. Po to katalizatorių nufiltravome ir tirpikli, pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant ne didesnei nei 30°C temperatūrai. Gavome L-feni1-alani1-L-fenilaianil-metoksiiminą (L-Phe-L-PheMo) .
[0122] 4 PAVYZDYS L- fenilalanil- D- fenilalanil semikarbazonas a stadija A) O,N-dimetilhidroksilamino hidrochloridą (3,891 g) suspendavome sausame DMF (40 ml) kambario temperatū-roje. Į paruoštą suspensiją per 5 min pridėjome N-metilmorfoliną (4,032 g), mišinio temperatūrą palaikant žemiau 30°C, po to mišini, maišant atšaldėme iki 0°C. B) N-t-Boc-D-Phe (10,08 g) ištirpinome sausame THF (80 ml) ir gautą tirpalą atšaldėme iki -10°C. Po to i, ji,, palaikant tą pačią temperatūrą, per 5 min pridėjome izo-butilchloroformatą (5,47 g) . Po to palaikant tą pačią temperatūrą per 10 min pridėjome N-metilmorfoliną
[0123] C) Per 15 min esant -10°C temperatūrai, suspensiją A pridėjome į suspensiją B, leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros, o po to maišėme ji dar 3 valandas. Po to mišinį atšaldėme iki 0°C, per 5 min pri-dėjome 3-dimetilaminopropilamino (3,88 g) ir maišymą tęsėme dar 5 min. Po to i, mišinį pridėjome vandeni (60 ml) ir etilacetatą (60 ml), organini sluoksnį at-skyrėme ir nuosekliai praplovėme (a) vandeniu (60 ml), (b) vandeniniu KHC03 tirpalu (5 %, 60 ml), (c) vandeniniu HC1 tirpalu (0,5 M, 60 ml) ir (d) vandeniu (3 x 60 ml) . Tirpikli, pašalinome rotaciniame išgarinimo prietaise vakuume, esant žemesnei nei 30"C tempera-tūrai. Gavome N-t-Boc-D-Phe-0,N-dimetilhidroksamatą.
[0124] N-t-Boc-D-Phe-O,N-dimetilhidroksamatą (11,3 g) atšal-dėme ledu, pridėjome i ji, trifluoracto rūgštį (30 ml) ir mišinį maišėme kambario temperatūroje 3 valandas. Trifluoracto rūgšties perteklių pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai, liekaną ištirpinome dietilo eteryje (100 ml) . Tirpiklį nudistiliavome vakuume ir operaciją kartojome tol, kol prasidėjo kristalizacija. Kietą nuo-sėdą nufiltravome, praplovėme dietilo eteryje ir džio-vinome vakuume virš P205. Gavome D-Phe-0,N-dimetilhid-roksamato trifluoracetato druską.
[0125] A) D-Phe-0,N-dimetilhidroksamato trifluoracto druską (10,1 g) maišant ištirpinome sausame DMF kambario temperatūroje. Į gautą tirpalą per 5 min pridėjome N-metilmorfoliną (3,155 g) , palaikant temperatūrą žemiau nei 30°C, po to mišinį atšaldėme iki 0°C. B) CBZ-L-Phe (9,4 g), maišant ištirpinome sausame THF (80 ml) ir tirpalą atšaldėme iki -10°C. Po to į tirpalą -10°C temperatūroje pridėjome per 5 min izobutil-chloroformiatą (4,307 g), per 10 min N-metilmorfoliną (3,155 g) ir reakcijos mišinį maišėme dar 10 min -10°C temperatūroj e. C) Per 15 min i, tirpalą B pridėjome A tirpalą -10°C temperatūroje, po to leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros ir maišymą tęsėme 3 valandas. Mišinį atšaldėme iki 0°C, per 5 min pridėjome d, jį 3-dimetilaminopropilamino (3,20 g) ir maišymą tęsėme dar 5 min, po to į jį pridėjome vandenį (60 ml) ir etil-acetatą (60 ml) , atskyrėme organinę fazę ir nuosekliai plovėme ją (a) vandeniu (60 ml) ir sočiu NaCl tirpalu (60 ml) , (b) vandeniniu KHC03 tirpalu (5 %, 60 ml), (c) vandeniniu HC1 tirpalu (0,5 N, 60 ml) ir (d) vandeniu (3x60 ml) . Tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo prietaise vakuume, esant žemesnei nei 30°C tempera-tūrai. Prie liekanos pridėjome šviežią etilacetatą ir po to jį pašalinome išgarinant. Liekaną perkristalinome iš izopropanolio. Gavome CBZ-L-Phe-D-Phe-O,N-dimetil-hidroksamatą.
[0126] l azotu prapūstą kolbą įdėjome diizobutilaliuminio hid-ridą dichlormetane (1 M, 10 ml) . Kolbą pašildėme iki 50°C, kol pasišalino visas dichlormetanas, ir visą vėl prapūtėme azotu. Po to į kolbą pridėjome sausą THF (10 ml) ir mišinį atšaldėme iki -70°C. CBZ-L-Phe-D-Phe-0,N-dimetilhidroksamatą (0,978 g) ištirpinome sausame THF (10 ml) ir paruoštą tirpalą per 10 min -70°C tem-peratūroje pridėjome į diizobutiloaliuminio hidratą, po to maišymą tęsėme dar 10 min -70°C temperatūroje. Po to reakcijos mišinį išpylėme į metanolio (30 ml) ir sočios Segneto druskos (30 ml) tirpalą -60°C temperatūroje,
[0127] reakcijos mišiniui leidome sušilti iki kambario tem-peratūros, po to i ji, pridėjome vandenį (50 ml) ir etilacetatą (50 ml) , atskyrėme organinę fazę, o van-deninę fazę ekstrahavome etilacetatu (50 ml). Apjungtas organines fazes praplovėme vandeniu (2x200 ml) ir nufiltravome. Organinę fazę atskyrėme ir tirpikli pa-šalinome rotaciniame išgarinimo prietaise vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Gavome CBZ-L-Phe-D-Phe aldehidą.
[0128] A) CBZ-L-Phe-D-Phe aldehidą ištirpinome metilo spirite (10 ml) 60°C temperatūroje. B) Natrio acetato trihidrato (0,298 g) tirpalą vandenyje (3 ml) pridėjome prie semikarbazido hidrochlorido (0,244 g) tirpalo vandenyje (3 ml) 60°C tempe-ratūroj e. C) Sumaišėme A ir B tirpalus ir gautą mišinį maišėme 5 vai 60°C temperatūroje, po to jį palikome nakčiai 4°C temperatūroje. Iškritusias kietas nuosėdas nufiltravome ir džiovinome vakuume virš P20s- Gavome CBZ-L-Phe-D-PheSc.
[0129] CBZ-L-Phe-D-PheSc (600 mg) ištirpinome metanolyje (90 ml) ir netirpią liekaną nufiltravome. Prietaisą, kuriame buvo metanolinis semikarbazono tirpalas, prapūtėme azotu ir į jį įdėjome katalizatorių - 10 % paladį ant aktyvuotos anglies (100 mg) . į hermetizuotą indą 2 vai leidome vandenilį, po to katalizatorių nufiltravome ir metanolį pašalinome rotaciniame išgarinimo prietaise vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Gavome L-fenilalanil-D-fenilalanil semikarbazoną (L-Phe-D-PheSc).
[0130] 5 PAVYZDYS L- fenilalanil- L- fenilalanil oksimas a- d stadijos
[0131] CBC-L-Phe-L-Phe aldehidas buvo sintezuojamas kaip tai aprašyta 2 pavyzdžio a-d stadijose.
[0132] A) CBZ-L-Phe-L-Phe aldehidą (0,645 g), gautą aukščiau aprašytu būdu, ištirpinome techniniame metilo spirite (35 ml) 60-65°C temperatūroje ir netirpios liekanos pašalinimui tirpalą filtravome. B) Į hidroksilamino hidrochlorido (0,144 g) tirpalą vandenyje (25 ml) 60°C temperatūroje pridėjome natrio acetato trihidratą (0,244 g). C) Tirpalą B pridėjome į tirpalą A ir kolbą B tirpalo praplovėme vandeniu (10 ml), kuri, pridėjome prie mi-šinio, mišinį maišėme 3-4 vai 60-65°C temperatūroje, po to atšaldėme iki 4°C ir šioje temperatūroje laikėme 3-4 vai. Iškritusias kietas nuosėdas nufiltravome ir pra-plovėme techninio metilo spirito ir vandens mišiniu (1:1; 5 ml) , išdžiovinome vakuume virš P205. Gavome CBZ-L-Phe-L-PheOx sin- ir anti-izomerų mišini,.
[0133] CBZ-L-Phe-L-PheOx (500 mg) ištirpinome metanolyje (130 ml) ir kietą netirpią nuosėdą atskyrėme filtruojant. Prie-taisą, kuriame buvo metanolinis oksimo tirpalas, pra-pūtėme azotu ir i, ji, įdėjome katalizatorių - 10 % paladi, ant aktyvuotos anglies (83 mg) . Po to i, her-metizuotą indą 30 min leidome vandenilį, vėliau kata-lizatorių nufiltravome ir tirpikli pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, žemesnėje nei 30°C temperatūroje. Tirpiklio liekanas pašalinome siurblio sudarytame aukštame vakuume. Liekaną džiovinome vakuume virš P205. Gavome L-fenilalanil-L-fenilalanil oksimą (L-Phe-L-PheOx).
[0134] 6 PAVYZDYS. L- alanil- D- fenilalanil semikarbazonas a ir b stadijos D-Phe-O,N-dimetilhidroksamato trifluoracetatinė druska buvo sintezuojama taip pat, kaip tai nurodyta 4 pavyzdyje (a ir b stadijos).
[0135] A) D-Phe-O,N-dimetilhidroksamato trifluoracetatinę drus-ką (5,000 g) ištirpinome sausame THF (20 ml). Į gautą tir-palą lėtai pridėjome N-metilmorfoliną (1,578 g), palaikant žemesnę nei 30°C temperatūrą, gautą mišinį at-šaldėme iki 0°C. B) CBZ-L-Ala (3,463 g) maišant ištirpinome sausame THF (40 ml) ir tirpalą atšaldėme iki -10°C, po to i, ji, pridėjome per 5 min -10°C temperatūroje izobutilchlo-roformiatą (2,158 g), per 10 min N-metilmorfoliną (1.578 g) ir reakcijos mišinį -10°C temperatūroje mai-šėme dar 10 min. C) — 10°C temperatūroje per 10 min sumaišėme A ir B tirpalus, po to leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros ir maišymą tęsėme dar 3 vai. Po to mišinį atšaldėme iki 0°C, pridėjome į jį 3-dimetilaminopro-pilaminą (1,585 g) ir baigėme reakciją pridėdami van-denį (50 ml) . Po to į reakcijos mišinį pridėjome etil-acetatą (50 ml) , atskyrėme organinę fazę ir vandenini, sluoksnį ekstrahavome etilacetatu (2x30 ml) . Organinius sluoksnius apjungėme ir nuosekliai praplovėme (a) vandeniu (50 ml) ir sočiu NaCl tirpalu (10 ml) , (b) vandeniniu KHC03 tirpalu (5 %, 50 ml) , (c) vandeniniu HC1 tirpalu (0,5 N, 50 ml) ir (d) vandeniu (3x50 ml) . Tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume ir esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Kietą liekaną perkristalinome iš etilacetato. Gavome CBZ-L-Ala-D-Phe-O,N-dimetilhidroksamatą.
[0136] CBZ-L-Ala-D-Phe-O,N-dimetilhidroksamatą (2,9 g) ištir-pinome sausame THF (25 ml) ir tirpalą atšaldėme azoto atmosferoje iki -70°C. Po to i, ji, per 10 min -70°C temperatūroje pridėjome diizobutilaliuminio hidrido tirpalą (1 M, 37 ml) ir maišymą tęsėme dar 10 min.
[0137] Reakciją nutraukėme pildami mišinį i, sotų Segneto druskos (125 ml) ir THF (125 ml) mišinį, prapučiant azotą ir maišant -30°C temperatūroje, po to leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros. Pridėjome etilacetatą (100 ml) ir organini, sluoksnį atskyrėme. Vandenini sluoksnį ekstrahavome etilacetatu (2x30 ml), organinius sluoksnius apjungėme ir praplovėme vandeniu (3x30 ml). Reakcijos mišinį filtravome ir tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Pridėjome šviežią etilacetatą ir po to vėl jį pašalinome. Gavome CBZ-L-Ala-D-Phe aldehidą.
[0138] A) CBZ-L-Ala-D-Phe aldehidą (1,2 g) ištirpinome THF (20 ml) ir techniniame metilo spirite (20 ml) , tirpalą pašildėme iki 50°C. B) Karštą semikarbazono hidrochlorido (1,8 g) tirpalą vandenyje (15 ml) pridėjome d, karštą KHC03 (1,5 g) tirpalą vandenyje (15 ml). C) Tirpalą B maišant pridėjome i, tirpalą A ir gautą mišinį maišėme 4 vai 50°C temperatūroje. Po to tirpikli, pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Prie liekanos pridėjome vandeni, (50 ml) , kietą produktą nufiltravome, praplovėme vandens ir techninio metilo spirito mišiniu (1:1) ir išdžiovinome vakuume virš P2O5. Gavome CBZ-L-Ala-D-PheSc.
[0139] CBZ-L-Ala-D-PheSc (750 mg) ištirpinome metanolyje (50 ml) ir netirpią liekaną nufiltravome. Prietaisą su metanoliniu tirpalu prapūtėme azotu ir įdėjome ji, katalizatorių - 10 % paladi, ant aktyvuotos anglies (100 mg) . Į hermetizuotą sistemą 90 min leidome vandenili,. Po to katalizatorių nufiltravome ir tirpikli, pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Liekaną džio-vinome vakuume virš P205. Gavome L-alanil-D-fenilalanil semikarbazoną (L-Ala-D-PheSc).
[0140] 7 PAVYZDYS L- tirozinil- L- fenilalanil semikarbazonas a ir b stadijos L-Phe-0,N-dimetilhidroksamato trifluoracetato druską sintezavome taip pat, kaip ir 4 pavyzdyje (a ir b stadijos).
[0141] A) L-Phe-0,N-dimetilhidroksamato trifluoracetato druską
[0142] (7.95 g) maišant kambario temperatūroje ištirpinome DMF (30 ml) , po to i tirpalą per 5 min pridėjome N-metilmorfoliną (2,49 g), palaikant žemesnę nei 30°C temperatūrą, ir mišinį atšaldėme iki 0°C.
[0143] B) CBZ-OBZ-L-Tyr (10 g) maišant ištirpinome sausame DMF (60 ml) ir tirpalą atšaldėme iki -10°C, po to, per 5 min toje pat temperatūroje pridėjome izobutilchloro-formiatą (3,39 g). Po to per 10 min į mišinį pridėjome N-dimetilmorf oliną (2,49 g) ir maišėme ji, dar 10 min
[0144] C) Per 15 min tirpalą A pridėjome i tirpalą B -10°C temperatūroje, po to leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros ir maišymą tęsėme 3 vai. Po to mišinį atšaldėme iki 0°C ir per 5 min pridėjome i, ji, 3-dimetilaminopropilaminą (2,52 g). Į gautą mišinį pri-dėjome vandenį (50 ml) ir etilacetatą (50 ml) , vir-šutinį organinį sluoksnį atskyrėme ir nuosekliai pra-plovėme jį (a) vandeniu (50 ml) , (b) vandeniniu KHC03 tirpalu (5 %, 50 ml), (c) vandeniniu HC1 tirpalu (0,5 M, 50 ml) ir (d) vandeniu (3x30 ml) . Tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai, ir liekaną perkristalinome iš izopropilo spirito. Gavome CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe-O,N-di-metilhidroksamatą.
[0145] CBZ-OBZ-Tyr-L-Phe-O,N-dimetilhidroksamatą (1,012 g) iš-tirpinome sausame THF (10 ml) . Į gautą tirpalą per 10 min, esant -70°C, azoto atmosferoje pridėjome diizobutilaliuminio hidrido tirpalą THF (1 M, 8,5 ml) ir maišymą tęsėme dar 10 min.
[0146] Tęsdami reakciją, maišant, esant -60°C temperatūrai, azoto atmosferoje mišinį pylėme i metanoli, (20 ml) ir Segneto druskos tirpalą (30 ml) ir leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros. Po to i, jį pridėjome vandenį (50 ml) ir etilacetatą (50 ml) , organinę fazę atskyrėme ir praplovėme ją vandeniu (200 ml) . Po to reakcijos mišinį filtravome ir tirpiklį iš jo paša-linome rotaciniame aparate vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Po to pridėjome šviežią etilacetatą ir vėl jį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate. Kietą liekaną išdžiovinome vakuume virš P205 ir gavome CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe aldehidą.
[0147] A) CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe aldehidą (400 mg) ištirpinome techniniame metilo spirite (20 ml) ir THF (1 ml) ir tirpalą pašildėme iki 60°C. B) Karštą semikarbazono hidrochlorido (600 mg) tirpalą vandenyje (5 ml) pridėjome į karštą KHC03 (500 mg) tir-palą vandenyje (5 ml). C) B tirpalą pridėjome į A tirpalą ir mišinį maišėme 2 valandas 60°C temperatūroje, po to tirpiklį pašali-nome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant že-mesnei nei 30°C temperatūrai, liekaną užpylėme vandeniu. Kietą medžiagą nufiltravome, praplovėme vandeniu ir techniniu metilo spiritu ir išdžiovinome vakuume virš P205. Gavome CBZ-OBZ-L-Tyr-L-PheSc.
[0148] CBZ-OBZ-L-Tyr-PheSc (770 mg) ištirpinome sausame THF (70 ml) , tirpalą filtravome ir į filtratą pridėjome metanolį (20 ml) . Prietaisą su semikarbazono tirpalu prapūtėme azotu ir į jį įdėjome katalizatorių - 10 % paladi, ant aktyvuotos anglies (100 mg). Į hermetizuotą sistemą kelias valandas leidome vandenili,, po to ka-talizatorių nufiltravome ir tirpikli, išgarinome. Gavome L-tironizil-L-fenilalanil semikarbazoną (L-Tyr-L-PheSc).
[0149] 8 PAVYZDYS. L- alanil- L- cikloheksilalanil semikarbazonas a stadija
[0150] A) 1 sausą DM F (75 ml) maišant pridėjome 0,N-dimetilhidroksilamino hidrochloridą (8,51 g), o po to per 5 min N-metilformaliną, palaikant žemesnę nei 30°C tem-peratūrą. Iškritusias baltas nuosėdas ir mišini, atšal-dėme iki 0°C. B) N-t-Boc-L-Cha (22,5 g) ištirpinome sausame THF (200 ml) ir tirpalą atšaldėme iki -10°C. Po to per 5 min, palaikydami — 10°C temperatūrą, i, ji, pridėjome izobutil-chloroformiatą (11,94 g), o po to per 10 min toje pat temperatūroje pridėjome N-metilmorfoliną ir maišymą tę-sėme dar 10 min. C) Per 15 min, esant -10°C, suspensiją A pridėjome i, suspensiją B, leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros ir maišėme ji, 4 vai. Po to mišini, atšal-dėme iki 0°C ir per 5 min pridėjome 3-dimetilamino-propilaminą (8,6 g) ir maišymą tęsėme dar 5 min. Po to pridėjome vandeni, (200 ml) ir etilacetatą (100 ml) , vandenini, sluoksni, atskyrėme ir ekstrahavome ji, etilacetatu (2x100 ml) . Apjungtas organines fazes nuosekliai praplovėme (a) vandeniu (100 ml) ir sočiu NaCl tirpalu (20 ml) , (b) vandeniniu KHC03 tirpalu (5 %, 100 ml) , (c) vandeniniu HC1 tirpalu (0,5 N, 100 ml) ir (d) vandeniniu (3x100 ml) . Tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Gavome N-t-Boc-L-Cha-O,N-dimetilhidroksa-matą.
[0151] 5 min 0°C temperatūroje maišėme N-t-Boc-L-Cha-O,N-di-metilhidroksamato (26 g) ir trifluoracto rūgšties (65 ml) mišini,, po to leidome jam sušilti iki kambario temperatūros ir maišymą tęsėme 3 vai. Trifluoracto rūgšties perteklių pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Prie liekanos pridėjome dietilo eteri, ir iš gauto tirpalo vakuume nudistiliavome eteri,. Eterini, apdirbimą kartojome, kol gavome aliejinio skysčio pavidalo L-Cha-N,O-dimetilhidroksamato trifluoracetatinę druską.
[0152] A) L-Cha-O,N-hidroksamato trifluoracetatinę druską (17 g) ištirpinome sausame THF (50 ml) . Į gautą tirpalą per 5 min pridėjome N-metilmorfoliną (3,95 g), palaikant temperatūrą žemiau nei 30°C, ir po to mišini, atšaldėme iki 0°C. B) CBZ-L-Ala (9,25 g) maišant ištirpinome sausame THF (100 ml) ir tirpalą atšaldėme iki -10°C. Po to per 5 min, esant -10°C temperatūrai, pridėjome i, ji, izobu-tilchlorof ormiatą (5,85 g), ir per 10 min N-metilmor-foliną (3,95 g) ir po to reakcijos mišini, maišėme dar 10 min -10°C temperatūroje. C) Per 15 min -10°C temperatūroje tirpalą A pridėjome i, tirpalą B, leidome mišiniui sušilti iki kambario tem-peratūros ir maišymą tęsėme 3 vai. Po to mišini, atšal-dėme iki 0°C per 5 min, pridėjome i, ji, 3-dimetil-aminopropilaminą (3,98 g) ir maišymą tęsėme dar 5 min. Po to pridėjome vandeni, (150 ml) ir etilacetatą
[0153] (150 ml), atskyrėme vandeninę fazę ir ekstrahavome ją etilacetatu (2x75 ml) . Apjungtas organines fazes nuosekliai praplovėme (a) vandeniu (125 ml), (b) vande-
[0154] niniu KHC03 tirpalu (5 %, 125 ml) , (c) vandeniniu HC1 tirpalu (0,5 N, 125 ml) ir (d) vandeniu (3x125 ml). Tirpikli pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Pridėjome šviežią etilacetatą ir po to jį nudistiliavome. Gavome CBZ-L-Ala-L-Cha-O,N-dimetilhidroksamatą.
[0155] CBZ-L-Ala-L-Cha-0,N-dimetilhidroksamatą (7,22 g) ištir-pinome azoto atmosferoje sausame THF (160 ml) ir tirpalą atšaldėme iki -70°C, po to per 20 min azoto atmosferoje ir -70°C temperatūroje i, ji, pridėjome diizobutilaliuminio hidrato tirpalą THF (1 M, 86 ml) ir mai-šymą tęsėme dar 20 min.
[0156] Reakciją baigėme 0°C temperatūroje ir azote atmosferoje supildami maišant i Segneto druskos tirpalą (400 ml), po to leidome mišiniui sušilti iki kambario tempe-ratūros. Po to į jį pridėjome etilacetatą ir maišėme 5 min bei filtravome, atskyrėme organini, sluoksnį ir vandeninę fazę ekstrahavome etilacetatu (2x50 ml) . Apjungtas organines fazes plovėme vandeniu (3x200 ml), paskutiniame praplovime pridėjome sotų NaCl tirpalą. Tirpiklį pašalinome rotaciniame išdžiovinimo aparate, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Gavome CBZ-L-Ala-L-Cha aldehidą.
[0157] A) CBZ-L-Ala-L-Cha aldehidą (8 g) ištirpinome techniniame metilo spirite (50 ml) ir tirpalą pašildėme iki 50°C. B) Į karštą tirpalą KHC03 (2,67 g) tirpalą vandenyje pridėjome karštą semikarbazido hidrochlorido (3,0 g) tirpalą vandenyje (25 ml) . C) Tirpalą B pridėjome į tirpalą A ir 50°C tem-peratūroje mišinį maišėme 3 vai, po to mišinį atšaldėme ir palikome stovėti per naktį 4°C temperatūroje. Di-džiąją dalį techninio metilo spirito pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai, ir prie liekanos pridėjome etilacetatą
[0158] (50 ml). Organinę fazę atskyrėme ir praplovėme ją nuosekliai (a) vandeniu, (b) vandeniniu KHC03 tirpalu (5 %, 30 ml), (c) vandeniniu HC1 tirpalu (0,5 N, 30 ml) ir (d) vandeniu (2x50 ml) , esant reikalui, pridedant sotaus NaCl tirpalo fazių atskyrimo palengvinimui. Tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Kietą liekaną perkristalinome iš izopropanollo. Gavome CBZ-L-Ala-L-ChaSc.
[0159] CBZ-L-Ala-L-ChaSc (900 mg) azoto atmosferoje ištir-pinome metanolyje (30 ml) ir į tirpalą pridėjome kata-lizatorių - 10 %-nį paladį ant aktyvuotos anglies. Į hermetizuotą sistemą 6 vai leidome vandenilį, po to katalizatorių nufiltravome, tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate, esant žemesnei nei 30°C tem-peratūrai, o kietą liekaną praplovėme eteriu ir iš-džiovinome vakuume virš P205. Gavome L-alanil-L-cikloheksilalanil semikarbazoną (L-Ala-L-ChaSc).
[0160] 9 PAVYZDYS. L- alanil- L- leucinil semikarbazonas a stadija
[0161] A) O,N-dlmetilhidroksilamino hidrochloridą (9,17 g) maišant kambario temperatūroje pridėjome į sausą DMF (110 ml) , po to per 5 min, palaikydami žemesnę nei 30°C temperatūrą, į mišinį pridėjome N-metilmorfoliną (9,51 g). Susidariusias nuosėdas ir mišinį atšaldėme iki 0°C. B) N-t-Boc-L-Leu (23,3) ištirpinome sausame THF (220 ml) ir atšaldėme tirpalą iki -10°C, po to per 5 min, palaikant mišinio temperatūrą -10°C, pridėjome izo-butilchloroformiatą. Po to per 10 min, palaikant -10°C temperatūrą, pridėjome N-metilmorfoliną, ir maišymą tęsėme dar 10 min. C) Per 15 min -10°C temperatūroje suspensiją A pri-dėjome i suspensiją B. Mišiniui leidome sušilti iki kambario temperatūros ir maišėme ji, 3 vai, po to at-šaldėme iki 0°C ir per 5 min pridėjome 3-dimetilami-nopropanaminą (9,13 g) ir maišymą tęsėme dar 5 min. Po to i, mišinį pridėjome etilacetatą (110 ml) ir vandeni, (110 ml) , organini, sluoksni, atskyrėme ir nuosekliai praplovėme (a) vandeniu (2x100 ml), (b) vandeniniu KHC03 tirpalu (5 %, 100 ml) , (c) vandeniniu HC1 tirpalu (0,5 N, 100 ml) ir (d) vandeniu (3x100 ml) . Tirpikli, pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate, esant že-mesnei nei 30°C temperatūrai. Gavome N-t-Boc-L-Leu-O,N-dimetilhidroksamatą.
[0162] N-t-Boc-L-Leu-0,N-hidroksamato (23,4 g) ir trifluoracto rūgšties (165 ml, atšaldyta iki 0°C) mišinį 18 vai maišėme kambario temperatūroje. Trifluoracto rūgšties perteklių pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai, prie liekanos pridėjome dietilo eteri, ir eteri, iš gauto tirpalo pa-šalinome vakuume. Šią operaciją kartojome tol, kol pra-sidėjo kristalizacija 4°C temperatūroje. Gavome L-Leu-0,N-dimetilhidroksamato trifluoracetatinę druską.
[0163] A) L-Leu-O,N-dimetilhidroksamatą (1,8 g) maišant kambario temperatūroje ištirpinome sausame THF (10 ml) . Po
[0164] to mišinį atšaldėme iki 0°C ir per 5 min i, ji, pridėjome N- metilmorfoliną ( 0, 695 g). B) CBZ- L- Ala ( 1, 40 g) ištirpinome sausame THF ( 20 ml) ir gautą tirpalą atšaldėme iki - 10°C, po to toje pa-čioje temperatūroje per 5 min i jį pridėjome izo-butilchloroformiatą ( 0, 869 g), per 10 min N- metil-morfoliną ( 0, 635 g) ir toje pat temperatūroje mišinį maišėme dar 10 min. C) Per 15 min, - 10°C temperatūroje tirpalą A pridėjome į tirpalą B, po to leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros ir maišymą tęsėme dar 18 vai. Po to mišinį atšaldėme iki 0°C, pridėjome į jį 3- dime-tilaminopropilaminą ( 0, 64 g) ir reakciją baigėme pri-dėdami vandenį ( 25 ml) ir etilacetatą ( 25 ml) . Van-deninę fazę atskyrėme ir ekstrahavome ją etilacetatu ( 2x25 ml). Apjungtas organines fazes nuosekliai praplo-vėme ( a) vandeniu ( 50 ml) ir sočiu vandeniniu NaCl tirpalu ( perskyrimo palengvinimui), ( b) vandeniniu KHC03 tirpalu ( 5 %, 30 ml) , ( c) vandeniniu HC1 tirpalu ( 0, 5 N, 30 ml) ir ( d) vandeniu ( 3x30 ml) . Tirpiklį pašalinome rotaciniame aparate, esant žemesnei nei 30°C tempe-ratūrai, ir kietą liekaną džiovinome vakuume virš P205. Gavome CBZ- L- Ala- L- Leu- 0, N- dimetilhidroksamatą.
[0165] CBZ- L- Ala- L- Leu- O, N- dimetilhidroksamatą ( 1, 9 g) azoto atmosferoje ištirpinome sausame THF ( 40 ml) ir gautą tirpalą atšaldėme iki - 70°C, po to, taip pat azoto atmosferoje ir - 70°C temperatūroje, per 10 min į jį pridėjome diizobutilaliuminio hidrido tirpalą THF ( 1 M, 29, 5 ml) ir maišymą tęsėme dar 10 min.
[0166] Reakciją užbaigėme, maišant - 60°C temperatūroje ir azoto atmosferoje, pridedant metanolį ( 50 ml) ir Segneto druskos tirpalą (50 ml) . Mišiniui leidome sušilti iki kambario temperatūros, pridėjome i, ji, vandeni, (50 ml) ir etilacetatą (50 ml), nufiltravome, atskyrėme vandenini, sluoksni, ir ekstrahavome ji, etilacetatu (2x50 ml) . Apjungtas organines fazes praplovėme vandeniu (3x100 ml) ir sočiu NaCl tirpalu (atskyrimo palengvinimui). Po to tirpikli pašalinome rotaciniame išgarinimo prietaise, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai, pridėjome šviežią etilacetatą ir ji, pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate. Gavome CBZ-L-Ala-L-Leu aldehidą.
[0167] A) CBZ-L-Ala-L-Leu aldehidą (6,7 g) ištirpinome techniniame metilo spirite (50 ml) ir pašildėme iki 50°C. B) Į karštą semikarbazido hidrochlorido (10,8 g) tir-palą vandenyje (30 ml) pridėjome karštą KHC03 tirpalą
[0168] C) Tirpalą B pridėjome i, tirpalą A ir mišini, maišėme 50°C temperatūroje 3 vai, po to ji, palikome nakčiai kambario temperatūroje. Po to kietas iškritusias nuo-sėdas nufiltravome, praplovėme techninio metilo spirito ir vandens mišiniu (1:1) ir džiovinome vakuume virš P205. Gavome CBZ-L-Ala-L-LeuSc.
[0169] CBZ-L-Ala-L-LeuSc (950 mg) ištirpinome metanolyje (100 ml) ir netirpią liekaną nufiltravome. Į tirpalą pridėjome dar 50 ml metanolio ir prietaisą prapūtėme azotu, po to azoto atmosferoje i, ji, įdėjome katalizatorių - 10 %-ni, paladi, ant aktyvuotos anglies (100 mg) ir i, herme-tizuotą sistemą 135 min leidome vandenili,. Po to ka-talizatorių nufiltravome ir tirpikli, pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate, esant žemesnei nei 30°C esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Kietą liekaną išdžiovinome vakuume virš P205. Gavome L-alanil-L-leucinil semikarbazoną (L-Ala-L-LeuSc) .
[0170] 10 PAVYZDYS. Afininės chromatografijos matricos ECH-Sepharose 4B su aktyviais L- Ala- L- PheSc centrais gavimas
[0171] ECH-Sepharose KAB (3 g drėgno svorio) sukepto stiklo filtre praplovėme vandeniniu NaCl tirpalu (0,5 M, 240 ml) ir po to vandeniu (120 ml) . Paruošėme 0, 1 M N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil) karbodiimido hidrochlorido (EDC) tirpalą vandenyje ir, pridėdami i, ji, druskos rūgšti, arba kietą natrio acetatą, nustatėme jo pH=4,5. L-Ala-L-PheSc (10 mg), gautą pagal 1 pavyzdžio aprašymą, ištirpinome metanolyje (400 ml), ir paruoštą tirpalą, kartu su vandeniniu EDC tirpalu (0,1 M, 2,4 ml) pridėjome i, praplautą geli. Mišini, 20°C temperatūroje atsargiai maišėme vieną valandą, esant reikalui, koregavome pH reikšmę iki aukščiau nurodyto dydžio ir maišymą tęsėme dar 23 vai 20°C temperatūroje. Po to i, ji, pridėjome L-gliciną iki 1 M galutinės koncentracijos ir maišymą tęsėme dar 3 vai. Gautą afininės chromatografijos geli, nuosekliai praplovėme vandeniniu metanolio tirpalu (50 %, 60 ml) , vandeniu (60 ml) ir darbiniu buferiu (60 ml) ir iki naudojimo laikėme 4°C temperatūroj e.
[0172] 11- 18 PAVYZDŽIAI. Afininės chromatografijos matricos gavimas
[0173] Kiekvieną iš dipeptidų darinių, gautų pagal 2-9 pa-vyzdžius, jungėme su gelio matrica tuo pačiu būdu, kaip tai aprašyta 10 pavyzdyje. Gavome afininės chromatografijos gelius (atitinkamai 11-18 pavyzdžiai).
[0174] Išpurškimo džiovintuve išdžiovintą papajos lateksą
[0175] (0,03 g baltymo) (firma Powel and Scholefield, Didžioji Britanija) "darbiniame" buferyje (natrio fosfatas (50 mM): EDTA (1 mM) ; etandiolis (33 %) , pH=6,8) su ditiotreitolo (2 mM) arba cisteino (4 mM) (1,5 ml) priedais praleidome pro afininės chromatografijos matricos ko-lonėles (1 ml) , atitinkančias 10-18 pavyzdi,. Naudojome bent vieną iš žemiau pateiktų penkių eliuentų: Eliuentas A = hidroksietildisulfidas (100 mM) vandeniniame etandiolio (33 %) tirpale, turin-čiame natrio citratą (50 mM) ir EDTA (1 mM) , pH=4,5; nakti, prieš eliuavimą ko-lonėlę pervesdavome į pusiausvyrini, būvi,.
[0176] Eliuentas B = 2, 2'-dipiridildisulfidas (30 mM) vandeniniame etandiolio (33 %) tirpale, turin-čiame natrio citratą (50 mM) ir EDTA (1 mM) , ph=4,5; nakti, prieš eliuavimą ko-lonėlę pervesdavome i, pusiausvyrini, būvi,.
[0177] Eliuentas C = metilpiridildisulfidas (30 mM) vandeniniame etandiolio (33 %) tirpale, turin-čiame natrio citratą (50 mM) ir EDTA (1 mM) , pH=4,5; nakti, prieš eliuavimą ko-lonėlę pervesdavome i, pusiausvyrini, būvi,.
[0178] Eliuentas D = mersalilo rūgštis (10 mM) vandeniniame etandiolio (33 %) tirpale, turinčiame natrio hidroksidą (50 mM) ir EDTA (25 mM) , pH=4,5, nustatomas acto rūgštimi; nepertraukiamas eliuavimas.
[0179] Eliuentas E = HgCl2 ( 10 mM) vandeniniame etandiolio ( 33 %)
[0180] tirpale, turinčiame natrio acetatą ( 50 mM), pH=4, 5; nepertraukiamas eliuavimas.
[0181] Eliuavimą kiekvienu eliuentu tikrinome nustatant A2so pėdsakus eliuate po standartinės ir Mono S ( Pharmacia) chromatografijos. Rezultatai pateikti žemiau pateiktoje 1 lentelėje.
[0182] (I) Prekyboje esanti, išpurškimo džiovintuve išdžiovintą Carica papaya lateksą (1 g) (gaminamą firmos Powell and Scholefield, Didžioji Britanija) vieną valandą maišėme su distiliuotu vandeniu (5 ml). Neištirpusią liekaną atskyrėme centrifuguoj ant 30 min esant 9000 x g ir 4°C. Virš nuosėdų buvusio skysčio pH=l,8 reikšmę nustatėme per 20 min pridėdami druskos rūgšti, (1 M) . Maišymą 4°C temperatūroje tęsėme dar 60 min ir, esant reikalui, koregavome pH dydi, iki nurodytos reikšmės. (II) Mišini, centrifugavome 30 min, esant 9000xg ir 4°C, ir granules atmetėme. (III) (a) Virš nuosėdų buvusio skysčio pH=6,8 nustatėme per 10 min pridėdami lašais i, ji, NaOH (5 M) . Tirpalas nusidažydavo mėlynai-violetine spalva. (b) Gautą mėlynai-violetini, tirpalą dializavome su 10 tū-rių "darbinio" buferio (natrio fosfatas (50 mM) ; EDTA (1 mM); etandiolis (33%), pH=6,8, triskart keisdami buferi,. Dializatą centri f ugavome 10 min, esant 4000 x g, nudekantavus virš nuosėdų buvusi, skysti,, turinti, chi-mopapainą, jame nustatėme baltymų kieki, apie 30 mg/l. Chimopapaino tirpalą aktyvavome pridėdami i, ji, cisteiną iki 4 mM koncentracijos ir palikome stovėti 15 min 0°C temperatūroje. (IV) Aktyvuotą chimopapaino tirpalą praleidome pro 8 ml kolonėlę su ECH-Sepharose , kuri buvo surišta su L-Ala-L-PheSc, kuri buvo gauta, kaip tai aprašyta 10 pavyzdyje); kolonėlė prieš tai buvo pervesta i, pusiausvyrini, bu— vi, su darbiniu buferiu, greitis 36 ml/cm 2/vai. Po to kolonėlę nuosekliai praplovėme darbiniu buferiu (jo kiekis buvo lygus dvigubam gelio tūriui kolo-nėlėje) , vandeniniu natrio citrato (50 mM) tirpalu etandiolyje (33%), pH=4,5 (kiekis buvo lygus dvigubam gelio kiekiui kolonėlėje) ir vandeniniu natrio acetato (50 mM) , EDTA (25 mM), mersalilo (10 mM) tirpalu etan-diole (33%), pH=4,5 (kiekis buvo lygus dvigubam gelio tūriui kolonėlėje) ir po to laikėme 2 vai kambario temperatūroje . (V) Chimopapainą eliuavome vandeniniu natrio acetato (50 mM) tirpalu, turinčiu mersalilą (10 mM) (kiekis lygus trigubam gelio tūriui kolonėlėje), atrinkome frakcijas po 4 ml, fermentinį aktyvumą atrinktose eliuato frakcijose nustatinėjome matuojant išdžiovintų pavyz-džių specifini, aktyvumą BAPNA atžvilgiu.
[0183] Aktyvias frakcijas apjungėme ir toliau valėme kati jo-nitinės chromatografijos pagalba kolonėlėje, kuri buvo užpildyta Mono-S HRr 10/10 (Pharmacia). Eliuavimą atlikome panaudodami "pradini," fosfatinį buferi, (Na (50 mM) ; EDTA (1 mM) , NaN3 (0,01%), pH=7,2, ir "galutini," fosfa-tini, buferi, (Na+ (800 mM) , EDTA (1 mM) , NaN3 (0,01%) ir pH=7,2) . Eliuavimą vykdėme esant druskos gradientui 2,7 mM/ml ir tekėjimo greičiui 2 ml/min. Atrinkome frakcijas po 4 ml ir baltymų koncentraciją jose nu-statėme pagal sugėrimą prie 280 nm, o fermentinį ak-tyvumą - pagal BAPNA hidrolizę.
[0184] Frakcijas, turinčias chimopapainą, apjungėme ir dializavome distiliuotame ir dejonizuotame vandenyje arba vandeniniame EDTA tirpale (1 mM) . Po to atlikome sub-limacinį džiovinimą ir produktą laikėme tokiame pavidale .
[0185] 21 PAVYZDYS. Chimopapaino valymas - BAPNA analizės rezultatai (I) Prekyboje esantį išpurškimo džiovintuve išdžiovintą Carica papaya (1 g) lateksą (gaminamą formos Powell and
[0186] Scholefield, Didžioji Britanija) 60 min maišėme su vandeniu (5 ml) . Neištirpusią liekaną atskyrėme centrifuguojant 30 min, esant 900 x g ir 4°C, ir atmetėme. Virš nuosėdų buvusio skysčio pH=l,8, nustatėme per 20 min pridėdami druskos rūgšti (1 M) . Maišymą 4°C tempe-ratūroje tęsėme 15 min, kas 5 min tikrindami pH reikšmę ir, esant reikalui, ją koreguodami. (II) Iškritusias nuosėdas atskyrėme centrifuguojant 30 min, esant 9000 x g ir 4°C. (III) (a) Virš nuosėdų buvusio skysčio pH=7,0 nustatėme maišant ir lašais pridedant vandenini, natrio hidroksido tirpalą (5 M). Iškritusias nuosėdas atskyrėme centrifuguojant 30 min, esant 9000 x g ir 4°C. (b) Virš nuosėdų buvusi, skysti, praleidome pro kolonėlę, užpildytą katijonitine derva Mono S HR 10/10 (Pharmacia) , kuri prieš tai buvo pervesta i, pusiausvyrini, būvi, vandeniniu Na2HP0i!/NaH2P04 (50 mM Na") tirpalu, turinčiu EDTA (1 mM) , kurio pH=7,2 (buferis A). Po to kolonėlę plovėme buferiu A (tekėjimo greitis 2 ml/min) iki tol, kol A280 dydis pasidarė lygus 0. Po to pro kolonėlę praleidome Na2HP04/NaH2P04 iki 0,80 M Na+ koncentracijos, esant gradientui 2,7 mM Na+/ml ir atrinkome frakcijas po 4 ml. Buvo tikrinamas frakcijų aktyvumas BAPNA at-žvilgiu. Didysis chimopapaino pikas, nustatytas imuno-logiškai, eliuavosi esant 0,17-0,28 Na+. Aktyvias BAPNA atžvilgiu frakcijas atrinkome ir apjungėme bei pri-dėjome toki, etandiolio kieki,, kad jo koncentracija būtų 33 tūrio %. Visas kitas frakcijas, įskaitant aktyvias BAPNA atžvilgiu, kurios buvo surinktos paskutinėse eliuavimo stadijose (0,47-0,59 M Na+) su proteinazės III piku, atmetėme. (IV) Kolonėlę (sluoksnio tūris 15 ml) su ECH-SepharoseR, kuri buvo sujungta su L-Ala-L-PheSc (kai buvo gauta, kaip tai aprašyta 10 pavyzdyje) praplovėme vandeniniu NaH2P04/Na2HP04 tirpalu, turinčiu EDTA (1 mM) etandiolyje (33 tūrio %), kurio pH=6,8 (darbinis buferis). Tekėjimo greitis buvo 39 ml/val/cm2. Apjungtas chimopapainą turinčias (žr. aukščiau) frakcijas aktyvavome pridėdami cisteiną laisvos bazės formoje (ga-lutinė koncentracija 4 mM) ir palikome stovėti 15 min 0°C temperatūroje. Po to tirpalą praleidome pro ko-lonėlę, o vėliau pro kolonėlę praleidome 60 ml darbinio buferio. (V) Po to pro kolonėlę praleidome natrio acetato buferi, (50 mM) , pH=4,5, turinti, HgCl2 (10 mM, 45 ml) . Atrinkome frakcijas po 5 ml. Atrinktose frakcijose nu-statėme aktyvumą BAPNA atžvilgiu.
[0187] Frakcijas su aktyvumo piku, kurios buvo sulaikomos kolonėlėje ir eliuuojamos su buferiu, turinčiu HgCl2, apjungėme ir vėl praleidome pro Mono-S užpildytą kolonėlę. Po to kolonėlę praplovėme buferiu A, po to pro ją praleidome buferi. A, turinti, cisteiną laisvos bazės formoje (4 mM) (tūris buvo lygus septyngubam smalos sluoksnio tūriui). Praleidimą nutraukėme 30 min, kad susidarytų sąlygos išstumti gyvsidabri, iš fermento. Po to praleidimą tęsėme ir dar kartą praplovėme buferiu A (prieš tai pro kolonėlę praleidome NaH2P04/Na2HP04 gra-dientą iki 0,80 M Na+, kaip tai aprašyta aukščiau) . Aktyvias BAPNA atžvilgiu frakcijas apjungėme, pridėjome jas cisteiną laisvos bazės formoje (galutinė koncentracija 4 mM) ir palikome stovėti 15 min 0°C tempe-ratūroje .
[0188] Į kolonėlę įdėjome Chelex smalą (Bio-Rad, Didžioji Britanija; 0,5 g) ir praplovėme ją buferiu A. Apjungtas chimopapainą turinčias frakcijas praleidome pro Chelex užpildytą kolonėlę ir iš kolonėlės išėjusi, tirpalą
[0189] dializavome vandeniniame EDTA (1 mM) tirpale. Džio-vinome sublimacinio džiovinimo būdu.
[0190] Chimopapaino išvalymo efektyvumą iliustruoja 2 lentelės duomenys.
[0191] 22 PAVYZDYS. Specifinių chimopapaino atžvilgiu IgG an-tikūnų, inicijuotų triušiuose, gavimas
[0192] Švarų chimopapainą, gautą pagal 21 pavyzdžio aprašymą, prieš jo panaudojimą metode, aprašytame Zucker ir kt.
[0193] (1985) (žr. aukščiau cituotą darbą), karboksimetilinome švelniomis sąlygomis. Chimopapaino antiserumą triušyje inicijavome įvesdami i, raumenis 360 p.g karbometilinto baltymo pilname Freund'o adjuvante, dvi savaitės prieš tai po oda buvome įvedę 100 |ig nepilname adjuvante. IgG iš dalies valėme nuo serumo frakcionuoj ant su amonio sulfatu, kaip tai aprašyta Heide ir Schwick (1978) (žr. aukščiau cituotą darbą), o po to dializavome vandeniniame natrio fosfato tirpale (10 mM), turinčiame NaCl (0, 14 M), pH=7,3. 23 PAVYZDYS. Chimopapaino valymas ir kiekybinė imuno-loginė chimopapaino ir PPIV analizė (I-III) Prekyboje esantį išpurškimo džiovykloje iš-džiovintą Carica Papaya lateksą (gaminamą firmos Powell and Scholefield, Didžioji Britanija) gaminome ir apdir-bome prie pH=l,8 pagal 21 pavyzdžio aprašymą (I-IIIa). (IV) Kolonėlę (sluoksnio tūris 15 ml) , užpildytą ECH-SepharoseR, kuri surišta su L-Ala-L-PheSc (paruošta pagal 10 pavyzdyje aprašytą metodiką) praplovėme pagal 21 pavyzdžio aprašymą (IV). Po apdirbimo prie pH=l,8 virš nuosėdų gautą skysti, dializavome vandeniniame NaH2P04/Na2HP04 (50 mM Na+) tirpale, turinčiame EDTA (1 mM) etandiolyje (33 tūrio %), kurio pH=6,8 (darbinis buferis), 10 min centrifugavome, esant 4000x g) ir aktyvavome per 20 min pridėdami ditiotreitolą (galutinė koncentracija 2 mM) 20°C temperatūroje. Po to praleidome pro afininės chromatografijos kolonėlę (39 ml/val/cm ) ir vėliau praleidome dar 60 ml darbinio buferio. Po to pro kolo-nėlę praleidome natrio citrato buferi, (50 mM) , kurio pH=4,5 ir kuris turi EDTA (1 mM) ir metilpiridilsulfidą (30 mM, 15 ml) (gautą pagal metodiką, kuri aprašyta Salih ir kt. Biochem. J. (1987), 247, 181-193). Tirpalo praleidimą sustabdėme ir disulfidą turintis buferis bu-vo paliktas kolonėlėje per naktį (18 vai) 20 °C tem-peratūroje . (V) Praleidimą pro kolonėlę tęsėme, leisdami pro ją 45 ml to paties buferio, turinčio metilpiridildisulfidą, o po to 30 ml darbinio buferio, atrinkdami frakcijas po 5 ml.
[0194] Analizavome atrinktų frakcijų aktyvumą BAPNA atžvilgiu. Frakcija su aktyvumo piku, kurios sulaikomos kolonėlėje ir eliuuojamos metilpiridildisulfidą turinčių buferiu, apjungėme ir praleidome pro Sephadex' LH-20 (Pharmacia) kolonėlę (40 ml/val/cm ), kuri prieš tai buvo pervesta i, pusiausvyrinį būvi, vandeniniu EDTA (1 mM) tirpalu etandiolyje (33 tūrio %). Chromatograf i n i, perskyrimą tęsėme leisdami pro kolonėlę 300 ml to paties buferio, atrinkdami frakcijas po 8 ml, kurias kontroliavome pagal AA271 ir nustatinėj ome jų aktyvumą BAPNA at-žvilgiu .
[0195] Frakcijas, turinčias aktyvumo piką BAPNA atžvilgiu (po kurio eina dar vienas pikas su A271) , apjungėme ir praleidome pro katijonitinę kolonėlę, užpildytą Mono S HR 10/10 derva, tolesni, apdirbimą atlikome taip pat, kaip tai aprašyta 21 pavyzdyje (III b) . Frakcijas, pasižy-mėjusias aktyvumu BAPNA atžvilgiu, apjungėme.
[0196] Išpurškimo džiovykloje išdžiovintą lateksą ir medžiagą, gautą po apdirbimo prie pH=l,8 bei afininės chromatografijos ir katijonitinės chromatografijos, analizavome, norėdami nustatyti PPIV buvimą, paprastos ra-dialinės imunodifuzijos metodu (žr. aukščiau). Tą pati, metodą naudojome nustatant chimopapainą monospecifi-niuose chimopapaino atžvilgiu antikūniuose, inicijuo-tuose triušiuose, kurie buvo gauti pagal 22 pavyzdyje - aprašytą metodiką. Kalibracinio grafiko sudarymui naudojome chimopapainą, išvalytą pagal aukščiau aprašytus metodus ir neturinti, (pagal paprastos radialinės imunodifuzijos duomenis) PPIV ir PPIII. Gauti rezultatai pateikti 3 lentelėje.
[0197] Iš 3M Diagnostic Systems, JAV gavome 4 0 žmogaus serumo pavyzdžių, su kuriais buvo atlikti komerciniai bandy-mai, žinomi Chymofost pavadinimu, su IgE, norint nustatyti prekyboje esančios chimopapaino formos Chymodiactin poveikį. Iš 40 pavyzdžių, išbandytų šiuo metodu, 20 buvo teigiami, o 20 - neigiami. Visi gauti pavyzdžiai buvo "akli" ir išbandyti natūralaus IgG antikūnio prieš ChymodiactinR, PPIII, PPIV ir išvalytą chimopapainą įgavimo atžvilgiu (chimopapainas buvo iš-valytas šiame išradime aprašytu būdu ir, pagal paprastos radialinės imunodifuzijos duomenis, neturėjo PPIV ir PPIII). Išbandymą atlikome modifikuotos kieta-fazės imunofermentinės analizės metodu (ELISA), panaudojant šios schemos biotino-avidino sistemą:
[0198] Ant mikrotitravimo plokštelių figūrų užnešėme bandomo antigeno dangą, tai buvo atliekama inkubuojant kiek-vieną figūrą su 100 jai antigeno (10 mg/ml) ir natrio karbonato buferiu (0,05 M, pH=9,6). Nespecifinio su-rišimo sumažinimui vėlesnėse stadijose naudojome dono-rini, arklių serumą (4%). Po 4 vai inkubacijos 37°C tem-peratūroje su tiriamu serumo tirpalu (skiedimas 1/20) ir PBS (0,1% Tween, 2% arklių serumo, 10 mM EDTA, 50 (ag/ml heparino, pH=7,2 (100 jj.1 /figūrai) , figūras laikėme dar 3 vai 37°C temperatūroje su monokloniniu žmogaus IgE (gautu pagal metodiką, aprašytą Kemeny and Richards, J. Immunol. Methods (1988), 108, 105; 1 Įig/ml, 100 ( il/figūrai) , o po to per naktį kambario tem-peratūroje su biotilintu triušių antipelių imuno-globulinu (išleidžiamu firmos Dakopatts, Danija; 1 fig/ml, 100 (j.1 /figūrai) . Po to figūras inkubavome 30 min 37°C temperatūroje su avidinperoksidaze (10 p.l/ml, 100 Įil/fi-gūrai), pridėjome /2, 2'-azinobis(3-etilbenztiazolino sulfoninės rūgšties)/, ABTS, 0,5 mg/ml/ buferyje (100 mM citrinos rūgšties, 200 mM Na2HP04, pH=4,2, aktyvavimas 1 fil/ml H20) ir 30 min laikėme kambario temperatūroje. Reakciją baigėme pridėdami 100 ^il/figūrai 100 mM citrinos rūgšties, 0,01% NaN03. Matavome kiekvienos fi-gūros absorbciją prie 410 nm, pasinaudodami Micro ELISA reader (Dynatech) . Tuo pat metu analizavome IgE stan-dartus 0,075-4,8 ng/ml koncentraciją intervale (2,4 ng IgE koncentracija ekvivalentiška tarptautiniam IgE vienetui) . IgE koncentracijų kiekvienos iš keturių anti-geninių kompozicijų (ChimodiactinR, PPIII, PPIV ir chimopapainas, gautas pagal 23 pavyzdžio būdą) atžvilgiu skaičiavimui naudojome Enzfitter programą (Leatherbarrow, R.J., 1985, Enzfitter for IBM PC, Elsevier-Biosift, 68 Hills Road, Cambrige CB2. 1LA, Didžioji Britanija). 26 iš 40 išbandytų serumo pavyzdžių turėjo IgE Chi-modiactinR antikūnius. Reikšmės, gautos 12 pavyzdžių su PPIII, PPIV ir chimopapainu, kurie pasižymėjo di-džiausiu aktyvumu ChymodiactinR atžvilgiu, pateiktos 4 lentelėje. Vidutinės reikšmės ir standartinės paklai-dos apskaičiuotos 9 nustatymams.
[0199] Iš pateiktų duomenų matome, kad tik dviejuose iš šių 12 pavyzdžių, turinčių chimopapaino antikūnių, chimopapainas duoda pagrindinę IgE reakciją, ir kad PPIII ir PPIV antikūniai yra atsakingi už maždaug 75% rasto IgE.
[0200] 25 PAVYZDYS. Chimopapaino ir PPIII mišinių inhibavimas vištų cistatinu
[0201] Chimopapainą valėme 23 pavyzdyje aprašytu būdu ir standartizavome titruodami aktyvius centrus reagentu E-64, substratu naudodami BAPNA (Zucker ir kt. , 1985, Biochem. Biophys. Actą, 828, 196-204). Aukščiau ap-rašytu būdu valytą PPIV taip pat titravome reagentu E-64 (pagal modifikuotą metodiką, naudojant substratu azokazeiną). 2 formos vištų cisteiną valeme pagal metodiką, aprašytą Anastasi ir kt. , 1983, Biochem. J., 211, 129-138, ir standartizavome titruojant papainu, kuri, prieš tai nufiltravome reagentu E-64.
[0202] Azokazeino hidrolizės analizę vykdėme Rowan ir kt. , 1988 (žr. aukščiau cituotą darbą) metodu su tuo skir-tumu, kad, prieš pridėdami fermento substratą ir inhi-bitorių, tirpalą 15 min laikėme 40°C temperatūroje.
[0203] Ėmėme dvi serijas mėgintuvėlių, po 9 mėgintuvėlius kiekvienoje serijoje, ir i, kiekvieną mėgintuvėli, pri-dėjome po 125 įj.1 0,40 M fosfatinio buferio, turinčio 4 mM EDTA ir 16 mM cisteino laisvos bazės formoje, kurio pH=6,8. Po to į mėgintuvėlius pridėjome įvairiais santykiais chimopapainą ir PPIV tokiu kiekiu, kad galų gale proteinazės koncentracija būtų 100 nM. Į vienos serijos mėgintuvėlius dėjome vištų cistatiną iki 1 jjM koncentracijos, o i, kitos serijos mėgintuvėlius - toki, pati, tūri, vandens. Po to mėgintuvėlius inkubavome ir analizavome juose azokazeino hidrolizės rezultatus.
[0204] Vištų cistatino įtaką azokazeino hidrolizei, kurią su-kelia nurodytų fermentų mišiniai, išreiškėme aktyvumo mhibavimo procentais, lyginant su tų pačių fermentų mišinių aktyvumu nesant cisteinui. Gauti rezultatai pateikti 5 lentelėje.
[0205] Iš pateiktų rezultatų matome, kad inhibavimo vištų cistatinu laipsnis yra atvirkščiai proporcingas PPIV koncentracijai.
[0206] 26 PAVYZDYS. Chimopapaino valymas rūgštinio nusodinimo prie pH 2, 2- 1, 2 būdu
[0207] I) Komercini, džiovinimo išpurškiant būdu išdžiovintą Carica papaya lateksą (išleidžiamą firmos Powell and Scholfield, Didžioji Britanija) skiedėme distiliuotu vandeniu iki 20 svorio % koncentracijos ir maišėme valandą. Netirpią liekaną pašalinome centrifuguojant 30 min 4°C temperatūroje, esant 9000 x g, o virš nuosėdų buvusio skysčio pH mažinome 4°C temperatūroje maišant ir lašais pridedant druskos rūgštį (1 M), pridėjimo greitis - 40 (0.1/min/ml. Mišinio pH nepertraukiamai se-kėme su kombinuotu elektrodu (tipas GK 2401C), kuris buvo nukalibruotas su standartiniais buferiniais tirpalais, kurių pH=4, 01 ir 1,09 (Radiometer, 25°C) . Nuo pH=2,2 iki pH=l,2 kas 0,2 pH vienetus rūgšties pri-dėjimą nutraukdavome ir atitinkamą pH reikšmę 4°C tem-peratūroje palaikydavome pastovia, tęsdami maišymą. Alikvotinę tirpalo dali, (ekvivalentiškų 10 ml pradinio tirpalo) paimdavome ir laikydavome atskirai, o i, liku-sią tirpalo dali, pridėdavome rūgšti, iki sekančios pH reikšmės sumažėjimo.
[0208] II) Visus atrinktus bandymus 30 min centrifugavome 4°C temperatūroje, esant 9000 x g, ir netirpią liekaną atmesdavome.
[0209] III) Visų virš nuosėdų buvusių skysčių pH reikšmes nu-statėme lygias 6,8, lašais pridėdami i, šiuos bandinius NaOH tirpalą (1 M), greitis 400 jil/min. Nuosėdų paša-linimui visus bandinius vėl 30 min centrifugavome, esant 9000 x g.
[0210] Kitame bandyme rūgštinį nusodinimą prie pH=l,8 atlikome 25°C temperatūroje.
[0211] Galų gale gautus virš nuosėdų buvusio skysčio bandinius analizavome, norėdami nustatyti aktyvumą BAPNA at-žvilgiu bei PPIV ir ši, išradimą atitinkančio chimopapaino kiekius aukščiau aprašytu paprastos radialinės imunodifuzijos metodu). 6 lentelėje pateikti duomenys liudija, kad rūgštinis nusodinimas prie pH=l,8 ir 4°C temperatūroje leidžia sumažinti PPIV kieki, iki mažiau nei 0, 1% nuo bendro baltymo kiekio, o nusodinimas prie pH=l,8 ir 25°C temperatūroje - iki mažiau nei 0,5%.
[0212] 27 PAVYZDYS. Monospecifinių IgG antikūnų, inicijuotų avyse, gavimas
[0213] Švarų chimopapainą, gautą pagal 21 pavyzdyje aprašytą metodą, prieš naudojimą karboksimetilinome švelniomis sąlygomis pagal metodą, aprašytą Zucker ir kt., 1985 (žr. aukščiau cituotą darbą) ir dializavome vandeniniame natrio fosfato (10 mM) tirpale, kurio pH=7,3 ir kuriame buvo NaCl (0,14 M). Chimopapaino antiserumą avyje inicijavome atlikdami 100 p.g karboksimetilinto baltymo pilname Freund adjuvante injekciją i, raumenis, ir po to po mėnesio atlikdami tokią pačią 50 (ag injekciją. IgG iš dalies valėme frakcionuodami su amonio sulfatu, kaip tai aprašė Heide ir Schwick (1978)
[0214] (žr. aukščiau cituotą darbą), o po to dializuodami vandeniniame natrio fosfato tirpale (10 mM), turinčiame NaCl (0,14 M), pH=7,3.
[0215] Papaino (papajos), proteinazės III, ir papajos protei-nazės IV IgG antikūnius ruošėme tokiu pačiu būdu.
[0216] Kiekvieną atskirą individualų karboksimetilintą anti-geną imobilizavome pagal pridedamas instrukcijas ko-lonėlėse, kurias su Zetaffiniti pavadinimu išleidžia firma Anachem. Prieš tai kolonėlės buvo pervestos i, pu-siausvyrinę padėti, apdorojant vandeniniu natrio fosfato tirpalu ( 10 mM) , turinčiu NaCl ( 0, 14 M), pH=7, 3.
[0217] Gavome chimopapaino, PPIII, PPIV ir papaino monospe-cifinius IgG preparatus, kuriuos galima naudoti kieky-biniam kiekvieno antigeno nustatymui aukščiau aprašytu paprastos radialinės imunodifuzijos metodu.
[0218] 28 PAVYZDYS. Chimopapaino valymas rūgštiniu nusodinimu prie pH=l, 5
[0219] I) Komercini, džiovinimo išpurškimu metodu išdžiovintą Carica papaya lateksą (20 g) , kuri, išleidžia firma Siebels, JAV, 0°C temperatūroje 60 min maišėme dejonizuotame vandenyje (prieš tai atšaldytame iki 4°C; 250 ml). 10 fj.l/min/ml greičiu pridėdami HC1 (1 N) nustatėme pH reikšmę, lygią 1,5. pH reikšmę nepertraukiamai kontroliavome kombinuotu Radiometer elektrodu (tipas GK 2401C), kuris buvo nukalibruotas standartiniais buferiniais tirpalais pH=4,01 ir pH=l,09 (Radiometer, 25°C). Pasiekus pH=l,5, tirpalą laikėme 10 min, norėdami sta-bilizuoti pH, ir, esant reikalui, koreguodami jo reikšmę.
[0220] II) 4°C temperatūroje mišinį centrifugavome 30 min, esant 12000xg, ir liekaną atmetėme.
[0221] III) (a) 10 fil/min/ml greičiu pridėdami NaOH tirpalą (1 M) nustatėme virš nuosėdų buvusio tirpalo pH=7,0, pH reikš-mę nepertraukiamai kontroliavome Radiometer elektrodu, nukalibruotu su standartiniu buferiu pH=7,01 (Radiometer, 25°C) . Tirpalo pH reikšmei pasiekus 7, tirpalą laikėme dar 10 min stabilizavimuisi, esant reikalui, koregavome jo reikšmę. Po to 30 min 4°C temperatūroje centrifugavome, esant 12000 x g, ir nuosėdas atmesdavome. b) Virš nuosėdų buvusi tirpalą 4°C temperatūroje dializavome su 30 tūrių dejonizuoto ir distiliuoto vandens, kuri, du kartus keitėme kas 12 valandų.
[0222] Dializatą valėme katijonitinės chromatografijos būdu su aukštos skiriamosios galios S-Sepharose 35/100 kolo-nėlėje (Pharmacia). Per vieną kartą naudojome ne daugiau 3 g baltymo (A280 analizė). Prieš tai kolonėlę pervesdavome į pusiausvyrini, būvi, 4°C temperatūroje vandeniniu EDTA (1 mM) tirpalu. Praleidus bandini, pro ko-lonėlę, ją plovėme vandeniniu EDTA tirpalu (1 mM) iki tol, kol A280 pasidarydavo vėl lygi 0.
[0223] Po to pro kolonėlę praleidome tirpalą su K+ gradientu nuo 0,175 mM iki 0,5 M atrinkdami frakcijas po 25 ml. Frakcija su sugėrimo piku analizavome BAPNA aktyvumo atžvilgiu.
[0224] Frakcijas, turinčias chimopapainą su maksimaliu specifiniu aktyvumu BAPNA atžvilgiu (besieliuuojančias esant 0,17-0,22 MK+ koncentracijai) apjungėme. Apjungtas frakcijas 4°C temperatūroje dializavome su dejoni-zuotu ir distiliuotu vandeniu, kurią keitėme 5 kartus kas 12 valandų. Dializatą džiovinome sublimacinio džio-vinimo būdu ir laikėme -20°C temperatūroje.
[0225] Aprašytą valymo procedūrą kartojome keletą kartų. Ši išradimą atitinkančio chimopapaino, PPIII, PPIV kieki, nustatinėj ome aukščiau aprašytu paprastos radialinės imunodifuzijos metodu, o avyse pasigaminusių antikūnių - kaip tai aprašyta 27 pavyzdyje. Aktyvumą BAPNA atžvil-giu ir aktyvių centrų titravimą jodacto rūgštimi atlikome pagal BAPNA Metodiką Nr. 1. Išvalymo efektyvumą iliustruoja vidutinės reikšmės, pateiktos 7 lentelėje.
[0226] 29 PAVYZDYS. Chimopapaino valymas rūgštinio nusodinimo prie pH=l, 5 ir afininės chromatografijos metodais
[0227] I-III) Komercini, džiovinimo išpurškimu metodu išdžio-vintą Carica papaya lateksą (50 g) , išleidžiamą firmos Siebels, JAV, preparavome ir apdorojome rūgštimi prie pH=l,5 tuo pačiu būdu, kuris aprašytas 23 pavyzdyje (I-III). Virš nuosėdų likusį skystį 4°C temperatūroje dializavome su 30 tūrių dejonizuoto ir distiliuoto vandens, kurį du kartus keitėme kas 12 valandų.
[0228] IV) Kolonėlę (sluoksnio tūris 350 ml), užpildytą ECH-SepharoseR, kuri surišta su L-Ala-L-PheSc (kuri pa-ruošta pagal 10 pavyzdžio aprašymą), pervedėme į pu-siausvyrinį būvį apdorojant per naktį vandeniniu etandiolio (33 tūrio %) tirpalu, turinčiu natrio acetatą
[0229] (50 mM) , ir kurio pH=4,5, o po to vandeniniu NaH2P04/Na2HP04 tirpalu (50 mM Na+) , turinčiu EDTA (1 mM) etandiolyje (33 tūrio %), ir kurio pH=6,8 (darbinis buferis) .
[0230] Dializuotą virš nuosėdų buvusį tirpalą (žr. aukščiau) filtravome per filtrą su porų diamatru 0,2 fim ir į filtrą pridėjome etandiolį iki 33 tūrio % koncentracijos. Tikrinome tirpalo pH ir, esant reikalui, jo reikšmę nustatėme lygią 7. Po to į jį pridėjome šviežiai pagamintą L-cisteino tirpalą (200 mM) iki 4 mM koncentracijos, gerai sumaišėme, 4°C temperatūroje lai-kėme 15 min ir 4°C temperatūroje praleidome pro afi-ninės chromatografijos kolonėlę 40 ml/val/cm greičiu. Kolonėlę praplovėme darbiniu buferiu, jo kiekis buvo lygus dešimteriopam adsorbento sluoksnio tūriui.
[0231] V) Chimopapainą eliuavome vandeniniu HgCl2 (10 mM) tirpalu etandiolyje (33 tūrio %), kuriame buvo natrio ace-tatas (50 mM) ir pH=4. Tirpalo tūris buvo lygus trigubam adsorbento sluoksnio tūriui. Rinkome frakcijas po 25 ml, frakcijas, pasižyminčias aktyvumu BAPNA at-žvilgiu, apjungėme ir toliau valėme katijonitinės chromatografijos būdu su 35/100 kolonėle, kuri buvo užpil-dyta didelės skiriamosios galios S-Sepharose (Pharmacia).
[0232] Kolonėlę iš anksto apdorojome 4°C temperatūroje EDTA tirpalu (1 mM), po to pro ją praleidome tiriamą bandini ir 10 ml/min greičiu plovėme vandeniniu EDTA tirpalu (1 mM) iki tol, kol A280 reikšmė vėl pasidarė lygi 0. Po to pro kolonėlę praleidome vandenini, K2HP04/KH2P04 tirpalą (50 mM K"), pH=7,2, kuriame buvo EDTA (1 mM) ir L-cisteinas (500 mM). Tirpalo tūris buvo lygus trigubam adsorbento sluoksnio tūriui. Tirpalo praleidimą nu-traukėme 30 min, po to pro kolonėlę praleidome tokį pati kieki, šviežiai pagaminto cisteininio buferio ir praleidimą nutraukėme 30 min. Po to kolonėlę praplovėme cisteininiu buferiu (jo tūris buvo lygus šešiagubam adsorbento sluoksnio tūriui). Po to kolonėlę pervedėme i pusiausvyrini būvi,, apdorodami ją vandeniniu K2HP04/KH2P04 tirpalu (50 mM K+) , pH=7,2, kuriame buvo EDTA (1 mM).
[0233] Po to pro kolonėlę praleidome tirpalą su K+ kon-centracijų gradientu nuo 0,175 mM iki 0,5 M ir surinkome frakcijas po 25 ml. Frakcijas su chroma-tografiniu piku analizavome norėdami nustatyti aktyvumą BAPNA atžvilgiu. Pirmas pikas, pasirodantis esant K+ koncentracijai eliuente 0,2-0,25 M, atitiko chimopa-painą. Antras pikas, pasirodantis esant K+ koncentracijai eliuente apie 0,45 M, atitiko papajos pro-teinazę III.
[0234] Frakcijas, turinčias chimopapainą su maksimaliu specifiniu aktyvumu, apjungėme ir 4°C temperatūroje dializavome su 50 tūrių dejonizuoto ir distiliuoto vandens, kuri, keitėme 5 kartus kas 12 valandų. Chimopapainą, eliuotą iš katijonitinės kolonėlės, aktyvavome cisteininiu buferiu, ir todėl jis pasidarė jautrus inaktyvacij ai oksidacijos pasekoje. Norėdami išvengti arba sumažinti aktyvaus fermento inaktyvacijos oksidacijos pasekoje tikimybę, ji turinčias frakcijas supylėme i, mėgintuvėlius su natrio tetrationato su-spensija (200 mM) tokiu būdu, kad galutinė Na2S406 koncentracija frakcijoje būtų 5 mM. Pagal kitą va-riantą, apjungtas chimopapainą turinčias frakcijas dializavome vandenyje azoto atmosferoje. Vanduo nuo de-guonies buvo išvalytas 30 min 0,1 1/min greičiu lei-džiant pro ji, azotą.
[0235] Gautą dializatą džiovinome sublimacinio džiovinimo būdu ir laikėme -20°C temperatūroje.
[0236] Aprašytą valymo procedūrą kartojome kelis kartus. Iš-valymo efektyvumą kontroliavome vykdydami analizę, kuri buvo atliekama pagal 28 pavyzdžio aprašymą. Išvalymo efektyvumą iliustruoja vidutinės reikšmės, pateiktos 8 lentelėje.
[0237] 30 PAVYZDYS. Chimopapaino valymas rūgštinio nusodinimo prie pH=l, 5 ir afininės chromatografijos metodais
[0238] I-III) Komercini, džiovinimo išpurškimu metodu iš-džiovintą Carica papaya lateksą, gaminamą firmos Siebels, JAV, preparavome, apdorojome rūgštimi prie pH=l,5, dializavome ir apdorojome katijonitinės chromatografijos su S-SepharoseR metodu tokiu pat būdu, kaip tai yra aprašyta 28 pavyzdyje.
[0239] V) Chimopapainą eliuavome vandeniniu HgCl2 tirpalu (10 mM) etandiolyje (33 tūrio %) , pH=4,5, turinčiame natrio acetatą (50 mM) . Tirpalo tūris buvo lygus trigubam adsorbento tūriui. Rinkome frakcijas po 25 ml. Frakcijas, pasižyminčias aktyvumu BAPNA atžvilgiu, apjungėme ir 4°C temperatūroje dializavome su 30 tūrių dejonizuoto ir distiliuoto vandens, kuri keitėme 5 kartus kas 12 valandų. Dializatą džiovinome sublimacinio džiovini-mo būdu ir laikėme -20°C temperatūroje.
[0240] Du ši išradimą atitinkančio chimopapaino preparatus analizavome pasinaudodami BAPNA analize pagal Metodikas Nr. 1 ir Nr. 2. Baltymo kieki, nustatinė j ome iš bendro sauso bandinio svorio. Chimopapaino A preparatas buvo gautas valant pagal 28 pavyzdžio metodiką. Chimopapaino B preparatas buvo gautas valant pagal 29 pavyzdžio me-todiką (paskutinės frakcijos surinktos natrio tetra-tionate) . Kiekvieną nustatymą kartojome 3 kartus. Gauti rezultatai pateikti 10 lentelėje.
[0241] Chimopapainą, išvalytą pagal 29 pavyzdžio aprašymą ir dializuotą azoto atmosferoje aukščiau aprašytu būdu, džiovinome sublimacinio džiovinimo metodu ir laikėme - 20°C temperatūroje.
[0242] Tuo būdu pagaminto chimopapaino specifinis aktyvumas BAPNA (1 mM) atžvilgiu, esant 37°C ir pH=6, buvo 1345 vienetai miligramui.
[0243] Norėdami paruošti 100 buteliukų su chimopapainą tu-rinčia kompozicija, žemiau aprašytu būdu ruošėme 43,75 g pradinio tirpalo. Dirbant su šiuo tirpalu jo tempera-tūrą palaikėme 4-12°C ribose. L-(+)-cisteino hidrochloridą (166 mg) pridėjome i, maždaug 30 g vandens, skirto injekcijoms taip, kad gautume 22 mM koncentraciją. Pasinaudodami NaOH (1 M) arba HC1 (0,1 M) nustatėme tirpalo pH reikšmę 5-5,5. Pa-ruoštą cisteino tirpalą pridėjome prie išvalyto chimopapaino (358 mg) taip, kad galų gale gautume 10000 vie-netų/ml koncentraciją. Pasinaudodami NaOH (1 M) arba HC1 (0,1 M) nustatėme maišomo tirpalo pH reikšmę 5,9-6,1 ir vandeniu, skirtu injekcijoms, praskiedėme iki 43,75 g. Paruoštą tirpalą sterilizavome, nuosekliai praleisdami ji, pro du filtrus, kurių porų diametrai buvo 0,2 |im. Į 100 5ml tūrio stiklinių buteliukų i,py-lėme po 0,4 g tirpalo. Buteliukus užkimšome kamščiais, vandeni, pašalinome sublimacinio džiovinimo sumažintame slėgyje būdu, ir buteliukus su liofilizuotu produktu hermetizavome vakuume.
[0244] Kiekviename buteliuke buvo balti amorfiniai milteliai, turintys 3,27 mg chimopapaino ir 1,52 mg natrio cisteinato hidrochlorido (nominalus aktyvumas 4000 vie-netų, atitinkamai 8 jam, leidžiamas 10 % viršijimas). Betarpiškai prieš naudojimą i, kompoziciją, esančią buteliuke, pridėjome 2 ml vandens, skirto injekcijoms. Gavome paruoštą injekcijoms tirpalą, nominaliai turintį 4000 vienetų chimopapaino ir 4 mM L-cisteino.
1 . Chimopapainas, besiskiriantis tuo, kad jo aktyvumas N-a-benzoil-DL-arginino p-nitroani1ido (BAPNA) (1 mM) atžvilgiu 37°C temperatūroje ir esant pH 6,0, yra 800-1700 vienetų miligrame ir turi mažiau nei 0.2 % kiekvieno iš šių komponentų: papajos proteinazės III (PPIII), papaino ir papajos proteinazės IV (PPIV).
2. Chimopapainas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad jo specifinis aktyvumas BAPNA (1 mM) atžvilgiu 37"C temperatūroje ir esant pH 6,0 yra 1000-1700 vienetų miligrame.
3. Chimopapainas, besiskiriantis tuo, kad jo specifinis aktyvumas BAPNA (2,5 mM) atžvilgiu 40°C temperatūroje ir esant pH 6,8, yra 3000-4500 vienetų miligrame, ir turi mažiau nei 0,2 % kiekvieno iš šių komponentų: PPIII, papaino ir PPIV.
4. Chimopapainas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad jo specifinis aktyvumas BAPNA (2,5 mM) atžvilgiu 40°C temperatūroje ir esant pH 6,8, yra 3500-4500 vienetų miligrame.
5. Chimopapainas pagal vieną iš prieš tai buvusių punktų, besiskiriantis tuo, kad jis yra aktyvus azokazeino atžvilgiu, ir jį bent 95 % inhibuoja mažesnės nei 1 įhM vištų cistatino koncentracijos.
6. Chimopapainas pagal vieną iš prieš tai buvusių punk-tų, besiskiriantis tuo, kad jis turi bent 70 % aktyvaus fermento.
7. Kompozicija, besiskirianti tuo, kad i, ją 1,eina chimopapainas pagal vieną iš prieš tai buvusių punktų.
8. Kompozicija pagal 7 punktą, besiskirianti tuo, kad į ją įeina dar ir nešiklis.
9. Kompozicija pagal 7 arba 8 punktą, besiskirianti tuo, kad ji yra hermetiškai išfasuota nepatenkant drėgmei i atskirus buteliukus arba ampules.
10. Kompozicija pagal 9 punktą, besiskirianti tuo, kad i ją įeina dar ir reduktorius.
11. Kompozicija pagal vieną iš 7-10 punktų, besiskirianti tuo, kad i ją ieina dar ir cisteino proteinazės grįžtamas inhibitorius.
12. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad i ją įeina chimcpapainas pagal vieną iš 1-6 punktų.
13. Farmacinė kompozicija pagal 12 punktą, besiskirianti tuo, kad į ją įeina dar ir far-maciškai priimtinas skiediklis, užpildas arba nešiklis.
14. Farmacinė kompozicija pagal 12 arba 13 punktą, besiskirianti tuo, kad ji yra hermetiškai išfasuota nepatenkant drėgmei į atskirus buteliukus arba ampules.
15. Farmacinė kompozicija pagal 14 punktą, besiskirianti tuo, kad į ją įeina dar ir far-maciškai priimtinas reduktorius.
16. Farmacinė kompozicija pagal vieną iš 12-15 punktų, besiskirianti tuo, kad ji yra pagaminta kaip vienkartinė dozė, skirta parenteriniam vartojimui.
17. Chimopapainas pagal vieną iš 1-6 punktų, besiskiriantis tuo, kad jis yra skirtas naudoti, esant chimonukleozei.
18. Chimopapainas pagal viena iš 1-6 punktų, besiskiriantis tuo, kad jis yra skirtas me-dikamento, naudojamo esant chimonukleozei, gavimui.
19. Chimopapainas pagal vieną iš 1-6 punktų, besiskiriantis tuo, kad jis yra skirtas chi-monukleozės pakenktų, išsikišusių arba kitą patologiją turinčių žinduolių tarps lanksteimių spinalinių diskų gydymui.
20. Chimopapaino valymo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis apima:a)vandeninio neapdoroto chimopapaino tirpalo inkubavimą su selektyvius centrus turinčia afininės chromatografijos matrica, turinčia matricą-pagrindą, kovalen-tiškai surištą (esant reikalui, per speiserinę grupę) su chimopapainą grižtamai inhibuojančio peptido galiniu azoto atomu, to išdavoje nurodytas peptidas susijungia su chimopapaino molekulės aktyviu centru, irb)chimopapaino eliuavimą tinkamu eliuentu.
a)vandeninio neapdoroto chimopapaino tirpalo inkubavimą su selektyvius centrus turinčia afininės chromatografijos matrica, turinčia matricą-pagrindą, kovalen-tiškai surištą (esant reikalui, per speiserinę grupę) su chimopapainą grižtamai inhibuojančio peptido galiniu azoto atomu, to išdavoje nurodytas peptidas susijungia su chimopapaino molekulės aktyviu centru, irb)chimopapaino eliuavimą tinkamu eliuentu.21. Chimopapaino valymo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis apima:1)vandeninio mišinio, turinčio neapdorotą chimopapainą,nusodinimą, esant pH 1,2-1,8;2)neapdoroto chimopapaino vandeninio tirpalo išskyrimąiš nurodyto mišinio;3)neapdoroto chimopapaino tirpalo neutralizavimą ir,esant reikalui, nudruskinimą.22. Chimopapaino valymo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis apima:I) vandeninio mišinio, turinčio neapdorotą chimopa-painą, nusodinimą, esant žemesniems pH nei 2,0;II) neapdoroto chimopapaino vandeninio tirpalo išsky-rimą iš nurodyto mišinio;III) neapdoroto chimopapaino tirpalo neutralizavimą ir, esant reikalui, nudruskinimą;IV) IlI-je stadijoje gauto tirpalo inkubavimą su selektyvius centrus turinčia afininės chromatografijos matrica, turinčia matricą-pagrindą, kova-lentiškai surištą, esant reikalui per speiserinę grupę, su chimopapainą grįžtamai inhibuojančio peptido galiniu azoto atomu, to išdavoje nurodytas peptidas susijungia su chimopapaino molekulės aktyviu centru, irV) chimopapaino eliuavimą tinkamu eliuentu.23. Būdas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad rūgštini, nusodinimą atlieka esant pH 1,2-1,8.24. Būdas pagal vieną iš 20-23 punktų, besiskiriantis tuo, kad jame yra bent viena katijoninės chromatografijos stadija.25. Chimopapainą grįžtamai inhibuoj antis peptidas, besiskiriantis tuo, kad ji, pasirenka iš L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc, L-Phe-D-PheSc, L-Phe-L-PheMo, L-Phe-L-PheOx, L-Tyr-L-PheSc, L-Ala-L-ChaSc ir L-Ala-L-LeuSc.26. Chimopapainą grįžtamai inhibuoj antis peptidas pagal 25 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra dipeptidas, pasirinktas iš L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc, L-Phe-D-PheSc, L-Phe-L-PheMo, L-Phe-L-PheOx, L-Tyr-L-PheSc, L-Ala-L-ChaSc ir L-Ala-L-LeuSc.27. Afininės chromatografijos matrica su chimopapaino atžvilgiu aktyviais centrais, besiskirianti tuo, kad ji turi matricą-pagrindą, kovalentiškai su-rištą, esant reikalui per speiserinę grupę, su galiniu azoto atomu chimopapainą grįžtamai inhibuojančio peptido, turinčio fenilalanino darinius su galiniais anglies atomais arba fenilalanino analogų darinius, su sąlyga, kad tokiu inhibuojančių peptidu negali būti L-fenilalanil-L-fenilalanino semikarbazonas.28. Afininės chromatografijos matrica su chimopapaino atžvilgiu aktyviais centrais pagal 27 punktą, besiskirianti tuo, kad inhibuojantį peptidą pasirenka iš L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc, L-Phe-D-PheSc, L-Phe-L-PheMo, L-Phe-PheOx, L-Tyr-L-PheSc, L-Ala-L-ChaSc ir L-Ala-L-LeuSc.
1)vandeninio mišinio, turinčio neapdorotą chimopapainą,nusodinimą, esant pH 1,2-1,8;2)neapdoroto chimopapaino vandeninio tirpalo išskyrimąiš nurodyto mišinio;3)neapdoroto chimopapaino tirpalo neutralizavimą ir,esant reikalui, nudruskinimą.22. Chimopapaino valymo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis apima:I) vandeninio mišinio, turinčio neapdorotą chimopa-painą, nusodinimą, esant žemesniems pH nei 2,0;II) neapdoroto chimopapaino vandeninio tirpalo išsky-rimą iš nurodyto mišinio;III) neapdoroto chimopapaino tirpalo neutralizavimą ir, esant reikalui, nudruskinimą;IV) IlI-je stadijoje gauto tirpalo inkubavimą su selektyvius centrus turinčia afininės chromatografijos matrica, turinčia matricą-pagrindą, kova-lentiškai surištą, esant reikalui per speiserinę grupę, su chimopapainą grįžtamai inhibuojančio peptido galiniu azoto atomu, to išdavoje nurodytas peptidas susijungia su chimopapaino molekulės aktyviu centru, irV) chimopapaino eliuavimą tinkamu eliuentu.I) vandeninio mišinio, turinčio neapdorotą chimopa-painą, nusodinimą, esant žemesniems pH nei 2,0;II) neapdoroto chimopapaino vandeninio tirpalo išsky-rimą iš nurodyto mišinio;III) neapdoroto chimopapaino tirpalo neutralizavimą ir, esant reikalui, nudruskinimą;IV) IlI-je stadijoje gauto tirpalo inkubavimą su selektyvius centrus turinčia afininės chromatografijos matrica, turinčia matricą-pagrindą, kova-lentiškai surištą, esant reikalui per speiserinę grupę, su chimopapainą grįžtamai inhibuojančio peptido galiniu azoto atomu, to išdavoje nurodytas peptidas susijungia su chimopapaino molekulės aktyviu centru, irV) chimopapaino eliuavimą tinkamu eliuentu.23. Būdas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad rūgštini, nusodinimą atlieka esant pH 1,2-1,8.24. Būdas pagal vieną iš 20-23 punktų, besiskiriantis tuo, kad jame yra bent viena katijoninės chromatografijos stadija.25. Chimopapainą grįžtamai inhibuoj antis peptidas, besiskiriantis tuo, kad ji, pasirenka iš L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc, L-Phe-D-PheSc, L-Phe-L-PheMo, L-Phe-L-PheOx, L-Tyr-L-PheSc, L-Ala-L-ChaSc ir L-Ala-L-LeuSc.26. Chimopapainą grįžtamai inhibuoj antis peptidas pagal 25 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra dipeptidas, pasirinktas iš L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc, L-Phe-D-PheSc, L-Phe-L-PheMo, L-Phe-L-PheOx, L-Tyr-L-PheSc, L-Ala-L-ChaSc ir L-Ala-L-LeuSc.27. Afininės chromatografijos matrica su chimopapaino atžvilgiu aktyviais centrais, besiskirianti tuo, kad ji turi matricą-pagrindą, kovalentiškai su-rištą, esant reikalui per speiserinę grupę, su galiniu azoto atomu chimopapainą grįžtamai inhibuojančio peptido, turinčio fenilalanino darinius su galiniais anglies atomais arba fenilalanino analogų darinius, su sąlyga, kad tokiu inhibuojančių peptidu negali būti L-fenilalanil-L-fenilalanino semikarbazonas.28. Afininės chromatografijos matrica su chimopapaino atžvilgiu aktyviais centrais pagal 27 punktą, besiskirianti tuo, kad inhibuojantį peptidą pasirenka iš L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc, L-Phe-D-PheSc, L-Phe-L-PheMo, L-Phe-PheOx, L-Tyr-L-PheSc, L-Ala-L-ChaSc ir L-Ala-L-LeuSc.