[LT] Pasiūlyti nauji proteolitiniai su pagerintomis savybėmis, tinkami naudoti plovikliuose, ypač skalbimui naudojamuose plovikliuose. Šie fermentai gaunami ekspresija geno, koduojančio proteolitinį fermentą su aminorūgščių seka, kuri skiriasi mažiausiai viena aminorūgštimi nuo laukinio tipo fermento. Siūlomi fermentai priklauso serino proteazėms, gautoms iš naujų Bacillus PB92 rūšies mutantų.
[EN]
[0001] Šis išradimas susijęs su naujų proteolitinių fermentų, naudojamų plovikliuose, savybių pagerinimu. Šios savy-bės apima geresni, nešvarumų šalinimą skalbimo kompozicijose, padidintą stabilumą laikant skalbimo milteliuose ir padidintą stabilumą paruoštose ploviklių muilo putose.
[0002] Fermentinių priedų, konkrečiai proteolitinių fermentų, panaudojimas ploviklių kompozicijose, padaręs įmanomą baltyminių nešvarumų šalinimą, yra pakankamai dokumen-tuotas. Pavyzdžiui, žr. publikuotas Europos patentų pa-raiškas ( EP- A-) 0220921 ir 0232269, JAV patentus Nr. Nr. 4 480 037 ir Re 30 602, straipsni, " Production of Microbial Enzymes" ( Mikrobinių fermentų gamyba), Microbial Technology, 1 ( 1979) 281- 311, Academic Press.
[0003] Ploviklių mišiniai gali būti miltelių, skysčio ir pas-tos pavidalu. Jų aktyviąja medžiaga gali būti vienas ar daugelis anijoninių, nejoninių, katijoninių, cviterjo-ninių ar amfoterinių junginių. Tokie junginiai yra plačiai aprašyti Schwartz, Perry ir Berch " Surface Active Agents", 11, Interscience Publishers ( 1958). Be to, juose gali būti granuliuojančių, stabilizuojančių, aromatizuojančių junginių ir atskirais atvejais oksi-dantų, paprastai vadinamų balinimo medžiagomis. Plovik-lių mišiniai yra naudojami kietų paviršių valymui, tualetų tvarkymui, indų plovimui ( rankomis ir automa-tuose) ir skalbimui.
[0004] Skalbimui naudojami plovikliai dažniausiai yra dviejų pagrindinių tipų, skysti ar milteliai. Skystuose plovikliuose gana didelė paviršiaus aktyvių medžiagų koncentracija, neutralus arba šiek tiek šarminis pH, daž-niausiai be balinimo medžiagų. Miltelių pavidalo plovikliai dažniausiai yra stipriai šarmiški ( putų pH 9- 11), juose yra inhibitorių, tokių kaip natrio trifosfatas ir, priklausomai nuo taikomo skalbimo būdo tose šalyse, kur jie parduodami, gali būti su balinimo priemonėmis ar be jų.
[0005] Šiuo metu X skalbimo kompozicijas fermentai dedami skystų suspensijų, žolių arba granulių pavidalu. Pa-vyzdžiui, miltelių tipo detergentuose proteolitiniai fermentai paprastai yra kapsulių (granulių) formoje (pavyzdžiui, Maxatase R ir Maxacal R) arba granuliatų formoje (pvz., Savinase R ir Alcalase R). Maksatazę ir Maksakoli, išleidžia firma International Bio- Synthetic B.V. Rijswijk, Olandija), Savinazę ir Alkalazę - firma NOVO Industry A/S (Bagsvaerd, Danija). Skystuose plovikliuose fermentai dažniausiai yra ištirpę.
[0006] Proteolitiniai fermentai, kaip taisyklė, blogai deri-nasi su skalbimo kompozicijomis. Fermentai turi būti stabilūs ir neprarasti aktyvumo skalbiant, pavyzdžiui, šalinant baltymų dėmes 10 -60°C intervale ir aukš-tesnėje temperatūroje. Be to jie turi likti stabilūs skalbimo produkte ilgai juos laikant. Atitinkamai, fermentai turi būti stabilūs ir funkcionalūs ir tuo atveju, kai didelis šarmingumas, o kai kada, esant balinimo priemonėms ir aukštoje temperatūroje.
[0007] Kadangi nėra universalių ploviklių, kaip nėra ir uni-versalių skalbimo sąlygų (pH, temperatūra, tirpalo koncentracija, vandens kietumas) visame pasaulyje, rei-kalavimai fermentams skiriasi, priklausomai nuo ploviklio, su kuriuo jie panaudojami, ir skalbimo sąlygų.
[0008] Sąlygos, turinčios įtakos fermentų stabilumui miltelių pavidalo plovikliuose, kaip taisyklė, nėra optimalios. Pavyzdžiui, laikant miltelių ploviklius, kuriuose yra fermento, nežiūrint tariamo fermento ir ploviklio kom-ponentų fizinio atsiribojimo fermento kapsulinės formos dėka, ploviklio oksidantai veikia proteazę, mžindami jos aktyvumą. Kita fermento nestabilumo ploviklio milteliuose priežastis ta, kad fermentas laikant hidro-lizuoja pats save, ypač esant didelei drėgmei.
[0009] Dar daugiau, ploviklio milteliuose esančių oksidintojų trūkumas, kuris turi įtakos dėmių pašalinimo efek-tyvumui skalbiant skalbyklose, yra tas, kad baltymų dė-mės fiksuojamos audiniuose. Be oksidintojų ir kiti ploviklio komponentai, inhibitoriai, sumažina proteazės efektyvumą, šalinant dėmes.
[0010] Skystų ploviklių atveju, susiduriame su tokia svarbia problema, kaip sparti fermento inaktyvacij a, ypač aukš-tose temperatūrose. Kadangi fermentai tokiuose plovikliuose tirpioje būklėje, dezaktyvacija vyksta jau laikant, to pasėkoje fermento aktyvumas žymiai krenta dar iki ploviklio panaudojimo. Anijoninės paviršiaus aktyvios medžiagos, tokios kaip alkilsulfatai kartu su vandeniu ir kitais komponentais ypač linkę negrįžtamai denatūruoti fermentą, padarydami jį neaktyvų ir ne-tinkamą atlikti proteolotinį skaldymą.
[0011] Iš dalies fermento stabilumo skystuose mišiniuose prob-lemą išsprendžia mišinio modifikavimas, pavyzdžiui, stabilizatorių, mžianančių fermento inaktyvavimą, prie-dai. Žr. Europos patentų paraiškas Nr. 0126505 ir 0199405, JAV patentą Nr. 4318818 ir Didžiosios Britanijos patento paraišką Nr. 2178055A.
[0012] Kitas būdas stabilizuoti fermentą skystuose plovikliuose pateiktas Europos patento 0238216 paraiškoje, kurioje fermento molekulės ir skysta agresyvi ploviklio matrica atskiriamos ypatingos mišinio paruošimo technologijos dėka. Ploviklių milteliams gaminti siūlomi alternatyvūs kapsuliavimo variantai (pvz., žr. Europos patento paraišką Nr. 0170360).
[0013] Tuo, kas pasakyta, susumuotos sąlygos, kurias reikia sukurti, norint, kad proteolitinis fermentas optimaliai funkcionuotų ploviklyje, taip pat susumuoti apribojimai šiuo metu skalbimo kompozicijose naudojamiems fermentams. Nežiūrint visų pastangų apsaugoti fermentą skalbimo kompozicijose, vis tiek daug jo aktyvumo pra-randama laikant ir naudojant Įprastose sąlygose.
[0014] Naujų fermentų identifikavimas ir skyrimas, norint juos panaudoti apibrėžtose srityse, pavyzdžiui ploviklių gamybai, turi būti vykdomi keliais būdais. Vienas šių būdų - tai parinkimas organizmų ar mikroorganizmų, pa-sižyminčių norimu fermentiniu aktyvumu, (mikro)organiz-mo arba skystos (mikro)organizmo kultūros paruošimas, fermento skyrimas ir gryninimas, o taip pat fermento biocheminių savybių nustatymas ir tikrinimas, ar šios biocheminės savybės atitiks panaudojimo reikalavimus. Kai tokio fermento ar ji, produkuojančio mikroorganizmo neįmanoma išskirti, gali būti taikoma genų inžinerijos technologija, fermentą koduojančio geno skyrimas, geno ekspresija kitame organizme, išryškinto fermento iš-skyrimas ir gryninimas ir jo tinkamumo numatytoje srityje tyrimas.
[0015] Kitas būdas gauti naujiems fermentams, tinkamiems panaudoti numatytoje srityje - tai egzistuojančių fermen-tų modifikavimas, kas tarp kitų, gali būti pasiekta cheminiais metodais (žr. I.Svendsen, Carsberg Res. Comm. 44, (1976) 237-291) . Kaip taisyklė, tokie metodai visai nespecifiški, tai išryškėja modifikuojant visas prieinamas liekanas Įprastose šoninėse grandinėse arba tada, kai modifikacija priklauso nuo modifikacijai tin-kamų aminorūgščių buvimo, be to dažnai neįmanoma modifikuoti sunkiai prieinamų aminorūgščių, neišskleidus fermento molekulės. Tokiu būdu, reikia manyti, kad fermento modifikacijos būdas, taikant koduojančio geno mutagenezę yra perspektyvesnis.
[0016] Mutagenezė gali būti atsitiktinė arba sait-specifinė. Atsitiktinė mutagenezė, veikiant visą mikroorganizmą cheminiu mutagenu arba mutagenezę iššaukiančiu spin-duliavimu, savaime suprantama, gali modifikuoti ir fer-mentą. Tuo atveju reikia turėti labai efektyvų atrankos metodą, įgalinanti, išryškinti nepaprastai retus mutantus su pasirinktomis savybėmis. Didelis mutantinių fermentų išskyrimo patikimumas atsitiktinės mutagenezės būdu gali būti pasiektas, klonuojant koduojanti, geną, atliekant jo mutagenezę in vitro arba in vivo ir koduoto fermento ekspresiją, pakartotinai klonuojant koduojanti, geną tinkamoje ląstelėje-šeimininke. Ir šiuo atveju turi būti taikomi efektyvūs biologinės atrankos būdai, turint tikslą atrinkti reikalingus mutantinius fermentus (žr. Tarptautinę patento paraišką W0 87/05050), šiais biologinės atrankos būdais nebūtinai bus gauti fermentai, tinkami naudoti plovikliuose.
[0017] Specifiškesnis modifikuotų fermentų gavimo būdas yra sait-specifinė mutagenezė, leidžianti specifiškai pakeisti vieną ar kelias aminorūgštis bet kuria kita amino rūgštimi. Europos patento Nr. 0130756 paraiškoje pateiktas tokios technologijos pavyzdys, kai ekspre-savus mutantinės protezės genus, vėliau buvo gauti modifikuoti proteolitiniai fermentai.
[0018] Neseniai sait-specifinės mutagenezės galimybės buvo pademonstruotos, panaudojant mutageninius oligonukleo-tidus, susintetintus iš įvairių bazių keliose norimose padėtyse. Tuo pasiekiama eilė įvairių mutacijų, kurios įterpiamos į specifinę DNR sekos dalį, pritaikant vieną sintetinį oligonukleotido preparatą, tai parodyta šiuose darbuose: Hui ir kiti, EMBO J. 3 (1984) 623-629; Matteucci ir kt., Nucl. Acids. Res., 11, (1983) 3113-3121; Murphy ir kt., Nukl. Acids. Res. 11 (1983) 7695-7700); Wells ir kt., Gene, 34 (1985) 315-323; Hutchinson ir kt., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 710-714 ir F.M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988. Greene Publichers Association and Willey, Interscience, 1987.
[0019] Jau Stauffer su bendr., (J.Biol. Chem. 244 (1969) 5333-5338) aptiko, kad veikiant vandenilio peroksidu, Carlsberg subtilizino metioninas 221 padėtyje oksiduojasi i, sul-foksidimetioniną ir yra atsakingas už žymų aktyvumo su-mažėj imą.
[0020] Dviejų būdų mutagenezės, atsitiktinės ir sait-speci-finės, rezultate, iš Bacillus amyloliquefaciens serino protezės, kuri dar vadinama "BPN1 subtilizinu", buvo išskirti ir charakterizuoti modifikuoti mutantiniai fermentai. Patente WO 87/05050 aprašytas termostabiles-nis BPN' subtilizino mutantas. Europos patento paraiš-koje Nr. 0150756 pasakyta, kad sait-specifinė visų 19-kos BPN' subtilizino aminorūgščių mutagenezė metionino 222 padėtyje, panaudojant "kasetins mutagenezės" me-todą, gali duoti fermentus, atsparius vandenilio pe-roksidui. Tačiau pastaruoju atveju daugumos mutantų proteolitinis aktyvumas yra žemas. Rasta, kad geriausi mutantai yra M222A ir M222S, kurių specifinis aktyvumas buvo atitinkamai 53% ir 35% palyginus su natyvaus BPN subtilizino aktyvumu (žr. Estell ir kt. J. Biol. Chem. 260, (1985) 6518-6521).
[0021] Ankstesniame darbe, kuriant modifikuotas proteazes, parodyta, kad galima gauti BPN' subtilizino mutantus su pakitusiu stabilumu ir pakitusiomis kinetinėmis charak-teristikomis (žr. ankstesnes nuorodas, ir kitas, pvz., Rao ir kt., Nature, 328 (1987) 551-554. Bryan ir kt. Proteins, 1 (1986) 326-334. Cunningham ir Wells. Protein Engineering, 1 (1987) 319-325. Russel ir kt. J. Mol. Biol. 193 (1987) 803-819. Katz ir Kossiakoff. J. Biol. Chem. 261 (1986) 15480-15485, o taip pat apžvalgas Shaw, Biochem. J. 246 (1987) 1-17 ir Gait ir kt. Protein Engineering, 1 (1987) 267-274. Tačiau nė vienas iš šių šaltinių nepaskatino geresnių ir,plovikliuose stabilesnių proteolitinių fermentų pramoninės gamybos. Nė vienu iš proteazių modifikavimo atvejų ne-įvertinti jų komercinė reikšmė kai ir pranašumas prieš šiuo metu plovikliams apibrėžtose sąlygose panaudojamus fermentus.
[0022] Vienas iš šio išradimo objektų yra nauji mutantiniai proteolitiniai fermentai, gauti ekspresuojant genus, koduojančius šių fermentų aminorūgščių sekas, besi-skiriančias mažiausiai viena aminorūgštimi nuo atitinkamo laukinio tipo fermentų. Šie mutantiniai fermentai pasižymi geresnėmis savybėmis, naudojant juos plovikliuose, ypač skalbimo detergentuose. rekomenduojama išradimą realizuoti PB92 serino proteazėse.
[0023] Kitas išradimo objektas yra nauji fermentiniai plovikliai su proteolitiniu fermentiniu produktu, kuriame yra mažiausiai vienas iš tokių naujų mutantinių pro-teolitinių fermentų.
[0024] Dar vienas šio išradimo objektas yra efektyvus mu-tantinių proteolitinių fermentų atrankos būdas, iš viso tuzino fermentų atrenkant labiausiai tinkamus naudoti plovikliuose. Tokie fermentai gaunami mutagenizuotos proteazės genų ekspresijos būdu.
[0025] Fig. l A pavaizduota mutacijos vektoriaus, turinčio PB92
[0026] Fig. l B schematiškai pavaizduota naudojama mutacijos procedūra. Fig. l C parodyta ekspresijos vektoriaus, turinčio mu-tantinį PB92 proteazės geną konstrukciją. Fig. 2 A, 2 B ir 3 pavaizduota skalbimo efektyvumo pri-klausomybė nuo įvairių PB92 proteazės mutantų specifinio proteolitinio aktyvumo įvairiose skalbimo sąlygose. Fig. 4 parodyta PB92 proteazės geno nukleotidų seka
[0027] ir koduoto fermento pirmtako aminorūgščių seka.
[0028] Išsireiškimas "pasižymintis geresnėmis savybėmis", kuris šiame aprašyme vartojamas aptariant, "mutantinius proteolitinius fermentus", suprantamas, kaip proteolitiniai fermentai, kurių plovimo galia arba stabilumas, išsaugant plovimo galią, yra padidinti, lyginant juos su atitinkama laukinio tipo proteaze.
[0029] Šiame aprašyme terminas mutantinio proteolitinio fermento "plovimo galia" suprantamas, kaip mutantinio proteolitinio fermento papildomas indėlis į skalbimo pro-cesą, lyginant su plovimo kompozicijos veikimu be fermento, atitinkamose skalbimo sąlygose.
[0030] Išsireiškimas "atitinkamos skalbimo sąlygos" vartojamas pažymėti sąlygoms, kaip antai: skalbimo temperatūra, trukmė, skalbimo mechanizmai, tirpalo koncentracija, ploviklio tipas ir vandens kietumas, kurie realiai būna namų sąlygomis naudojant pramoninius ploviklius (de-tergentus) .
[0031] Terminas "padidinta plovimo galia" vartojamas, norint pažymėti geresnį galinį rezultatą, šalinant dėmes "atitinkamose skalbimo sąlygose", arba kad sunaudojama ma-žiau mutantinio proteolitinio fermento masės, tam pa-čiam rezultatui gauti, negu naudojant laukinio tipo fermentą.
[0032] Išsireiškimas "išsaugota plovimo galia" vartojamas, nurodant, mutantinio proteolitinio fermento plovimo ga-lią, paskaičiuotą jo masei, kuri sudaro ne mažiau 80% laukinio tipo proteazės plovimo galios "atitinkamose skalbimo sąlygose".
[0033] Terminas "padidintas stabilumas" pavartotas, nurodant didesni, mutantinių proteolitinių fermentų stabilumą plovikliuose ir juos laikant, ir/arba jų stabilumą putose, ir ši sąvoka apima atsparumą oksidantų, inhibi-torių poveikiui, autolizei, paviršiaus aktyvių medžiagų ir šarminės aplinkos veikimui, lyginant su atitinkamu laukinio tipo fermentu.
[0034] Biocheminės savybės, nustatytos aprobuotose labaratori-nėse sąlygose, nėra labai patikimi rodikliai, norint atspėti konkrečios ploviklio proteazės elgesį užsi-duotose sąlygose. Šios pastabos taikomos ir kinetiniams rodikliams, gautiems panaudojant griežtai apibrėžtus baltyminius substratus, tokius kaip kazeinas, dimetil-kazeinas ir hemoglobinas arba oligonukleotidiniai subs-tratai, pavyzdžiui, SAAPFpNA (sukcinil- L-alanil-L-alanil- L-prolil- L-fenilalanil- para-nitroanalidas) . Be abejo, kiti proteazių požymiai apsprendžia jų, kaip skalbimo detergentų, efektyvumą.
[0035] Šis išradimas paremtas išsiaiškinimu to, kad, nežiūrint egzistuojančių baltymų aminorūgščių modifikacijos me-todų, kurie gali sukelti esminius jų biocheminių rodik-lių pakitimus, vis dar labai menkai galima numatyti specifinės mutacijos įtaką realiose taikymo sąlygose, jeigu tai aplamai įmanoma.
[0036] Sutinkamai su šiuo išradimu, po intensyvių tyrimų ir eksperimentavimo buvo rastas mutantinių proteazių gavimo būdas, kuriame mutantinių proteazių paruošimas sude-rintas su efektyvia proteazių atrankos pagal jų veikimą metodika. Visai netikėta buvo tai, kad šiuo būdu pagal jų veikimą gali būti atrinktas palyginti didelis fer-mentų skaičius.
[0037] Išradimo test- sistema paremta proteazėms jautrių dėmių pašalinimu iš audinių pavyzdžių, panaudojant prietaisą, kuriuo nustatomas audinio atsparumas skalbimo arba temperatūros poveikiui, imituojant atitinkamas skalbimo sąlygas. Kai tinkami testai gali būti panaudoti firmos EMPA ( Eidgenossische Material Prufungs und Versuch Anstalt, St. Gallen, Šveicarija) komercinių audinių ga-balėliai dirbtinai sutepti baltyminėmis dėmėmis. Kitos dėmės, kuriomis buvo suteršti audinių pavyzdžiai pro-teazėms tirti - tai kraujas, žolė, šokoladas ir kt.
[0038] Be to, tokioje test- sistemoje kiti atitinkami fakto-riai, tokie kaip: ploviklio sudėtis, putų koncentracija, vandens kietumas, skalbimo mechanizmai, trukmė, pH ir temperatūra turi būti reguliuojami taip, kad pakar-totų tipiškas namų ūkio arba tam tikros rinkos sferos sąlygas.
[0039] Proteazių plovimo galią paprastai nustato pagal jų gebėjimą pašalinti tam tikras charakteringas dėmes atitinkamose tyrimo sąlygose. Šis sugebėjimas gali būti nustatytas atspindžio matavimais, audinio gabalėlius išskalbus su fermentu ar be jo, prietaise audinių atsparumui matuoti arba tergotometre. Laboratorinė išra-dimo test- sistema turi pliusų imituotose namų ūkio są-lygose tiriant DNR mutagenezės būdu modifikuotų pro-teolitinių fermentų panaudojimą.
[0040] Atitinkamai išradimas leidžia testuoti daugeli, įvairių fermentų ir atrinkti tuos iš jų tuos, kurie, labiau tinka naudojamo ploviklio tipui. Tokiu keliu gali būti atrinkti "pagaminti pagal užsakymą" fermentai, skirti panaudoti ypatingose sąlygose.
[0041] Kai kurias bakterines serino proteazes vadina subtili-zinais. Subtilizinai - tai Bacillus subtilis, Bacillus amyloliguefaciens ("BPN1 subtilizinai") ir Bacillus licneniformis (Carlsberg'o subtilizinas). Žr. apžvalgą Markland ir Smith (1971) "The Enzymes" (Bayer ed.), 3t., 561-608, Academic Press, New-York. Kai kurie alka-lofiliniai Bacillus kamienai produkuoja kitokias proteazes. Pastarųjų pavyzdžiu gali būti Maksakalio serino proteazės, toliau žymimos kaip PB92 proteazės (iš naujos rūšies PB92 Baccilus genties) ir anksčiau minėta Savinazė.
[0042] PB92 proteazės aminorūgščių seka parodyta Fig. 4. Pilna proteazė susideda iš 269 amino rūgščių, jos molekulinė masė apie 27000 D, jos izoelektrinis taškas sutampa su aukšto šarmingumo reikšmėmis. Proteazės PB92 aktyvumas baltyminio substrato atžvilgiu išreiškiamas šarmingumo Delta vienetais (ŠDV). Aktyvumas ŠDV nustatomas pagal metodiką, pateiktą Didžiosios Britanijos patente Nr.1353317, išskyrus tai, kad vietoje pH 8,5, matuojama prie pH 10. Grynintos PB92 proteazės aktyvumas 21000 ŠDV. Katalitinė konstanta (kcat) , matuojant su kazeinu, yra 90 sek-1.
[0043] Gryninto Karlsbergo subtilizino specifinis aktyvumas (Delange ir Smith. J. Biol. Chem. 243 (1968) 2184) yra 10000 ŠDV/mg. BPN' subtilizino (Matsubora ir kt., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1125) - iki 7000 SDV/mg. Be to-kių rodiklių, kaip specifinis aktyvumas ir KcatPB pro-teazė skiriasi nuo Karlsbergo subtilizino, BPN' subtilizino ir kitų tipų proteazių, panaudojamų plovikliuose
[0044] (pvz., Maksatazėje ir Alkalazėje) , tuo, kad turi dideli, teigiamą krūvį, kas gali būti vizualiai nustatyta, atliekant natūralaus baltymo gel-elektroforezę (žr. eks-perimentinę dalį 4) .
[0045] Kadangi PB92 proteazė aktyviai šalina dėmes šarminėje aplinkoje, ją paprastai naudoja kaip priedą plovikliuose kartu su kitais jų komponentais, tokiais kaip: paviršiaus aktyvios medžiagos, struktūrikliai ir oksidantai. Pastarieji komponentai dažniausiai naudojami miltelių pavidalu. Šalinant dėmes, PB92 proteazė pasižymi didesniu aktyvumu, negu kiti anksčiau minėti subtilizinai. Tai reiškia, kad PB92 proteazės reikės mažiau, norint gauti tą pati, skalbimo efektą.
[0046] PB92 proteazės, kaip ir kitų žinomų plovikliuose nau-dojamų serino proteazių, didelis trūkumas yra polinkis oksiduotis (žr. Stauffer ir kt.., J. Biol. Chem., 244
[0047] (1969) 5333-5338; Estell ir kt. J. Biol. Chem. 263
[0048] (1985) 6518-6521). PB92 proteazės oksidacija vandenilio peroksidu arba perrūgštimis, susidarančiomis aktyvato-riaus sistemoje, kurioje yra perborato tetrahidratas, sumažina fermento aktyvumą atitinkamai iki 50% ir 10%
[0049] (ŠDV), palyginus su neoksiduota PB92 proteaze (žr. Eksperimentinę dali,, 1 ir 7 pavyzdžius) .
[0050] Šio išradimo būdu labai sėkmingai gali būti gaunami ir atrenkami mutantiniai proteolitiniai fermentai, kilę iš natūraliomis sąlygomis bakterijų produkuojamų serino proteazių. Tokių mutantų pavyzdžiu gali būti mutantai, koduojami geno, gauto iš laukinio tipo alkalofilinio Bacillus kamieno, geriausiai PB92, geno. Taip pat tinka ir mutantai, gauti iš šarminės serino proteazės Savi-nazės ( Bacillus) . Be to šis būdas gali būti sėkmingai panaudotas atrenkant modifikuotas proteazes iš pro-teazių, besiskiriančių nuo alkalofilinių Bacillus PB92 kamienų serino proteazių. Pavyzdžiui, yra žinomi genai,
[0051] koduojantys Bacillus suotilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis serino proteazes, ir jie gali būti panaudoti kaip mutagenezės objektai. Akivaizdu, kad norint įvykdyti efektyvią proteazės geno mutaciją, gali būti panaudota tiek sait- specifinė mutagenezė, da-lyvaujant oligonukleotidui, tiek ir nukreipta į visą sritį atsitiktinė mutagenezė, arba bet kuri kita muta-genezės rūšis.
[0052] Mutantinių proteolitinių fermentų atrankos būdas ( api-mantis mutantų gavimą ir atskyrimą) susideda iš šių stadijų; mutagenezė klonuoto geno, koduojančio norimą gauti proteolitinį fermentą ar jo fragmentą; gauto mutantinio proteazės geno ar genų išskyrimas; mutantinio proteazės geno ar genų įvedimas į atitinkamą kamieną-šeimininką, geriausiai pasinaudojant tinkamu vektoriumi, ekspresijai ir fermento gaminimui; gautos mutanti-nės proteazės išskyrimas ir pagerintų savybių mutanti-nės proteazės, tinkamos panaudoti plovikliuose, identi-fikacija .
[0053] Mutantinių proteazių produkavimui tinkami kamienai- šei-mininkai - tai linkę trnsformuotis mikroorganizmai, kuriuose gali būti gauta proteazių ekspresija. Ypač tam tinka tos pačios genties ir rūšies kamienai- šeiminikai, iš kurių proteazės yra išskirtos, tarp jų yra ir Bacillus kamienai, bet labiausiai pageidaujamas nauja Bacillus PB92 rūšis ir jos mutantai, turintys iš esmės tas pačias savybes. Rekomenduojami taip pat kamienai iš B. subtilis, B. licheniformis ir B. amyloliquefaciens. Kiti tinkami ir rekomenduojami kamienai- šeimininkai, tai tie kamienai, kurie iš esmės nesugebėjo produkuoti neląstelinių proteolitinių fermentų prieš transforma-ciją mutantiniu genu. Ypatingai dėmesio verti Bacillus kamienai- šeiminikai, pasižymintys proteazės deficitu, tokie kaip nauja Bacillus PB92 rūšis. Proteazės ekspresija pasiekiama panaudojant ekspresijos signalus, iš-ryškėjančius pasirinkatame kamiene- šeiminike. Ekspresijos signalai įjungia DNR sekas, reguliuojančias pro-teazės genų transkripciją ir transliaciją. Tinkami vek-toriai sugeba replikuotis, sudarydami pakankamai dideli, kopijų skaičių pasirinktame kamiene- šeimininke, arba proteazės genas patvariai įsitvirtina kamiene- šeimi-ninke, įvykus chromosominei integracijai.
[0054] Pagal šį išradimą mutantiniai proteolitiniai fermentai gali būti gauti, kultivuojant atitinkamose fermentacijos sąlygose transformuotą kamieną- šeimininką, turintį pageidaujamą mutantinį proteolitinį geną arba genus, vėliau išskiriant gautus fermentus.
[0055] Rekomenduojama, kad ekspresuotos proteazės būtų sek-retuojamos į kultūrinę terpę, kas palengvintų jų išsky-rimą, arba gram- teigiamų bakterijų kamienų- šeimininkų atveju, susikauptų periplazmoje. Sekretavimui naudojama aminorūgščių signalinė seka, geriausiai tam tinka sig-nalinė seka, koduojama inicijuojančio geno, jeigu jis funkcionalus pasirinktame kamiene- šeimininke.
[0056] Sutinkamai su vienu iš išradimo aspektų, gali būti sukurti plovimo galios tyrimo metodai, kai pakartojamos bet kokios namų skalbimo sąlygos, atitinkančios rinkos siūlymus. Pavyzdžiui, sukurtas metodas tirti Europos rinkos padiktuotomis griežtomis sąlygomis naudojamus skalbimo miltelius, kuriuose panaudojami miltelių komponentai su balinimo medžiagomis arba be jų, kai ploviklio koncentracija tirpale 1- 10 g/ l, vandens kietumas 10- 20°KL ( kietumo laipsniai) ir temperatūra 25- 80°C. Konkrečiau, ploviklis susideda iš miltelių komponentų, jame taip pat yra T AE D ir perboratas, ploviklio koncentracija tirpale 4, 7 ar 10g/ l, temperatūra 15°C ir 4 0°C.
[0057] Be to, pateikiami bandymo metodai, imituojantys skal-bimą skystais plovikliais. Tokių ploviklių koncentracija paprastai būna 1,5-5 g/l tirpalo, esant 5-10°KL, temperatūros intervalas 15-40°C. Konkrečiau, panaudojamos skystos skalbimo kompozicijos be balinimo prie-monių, esant ploviklio koncentracijai 1,5 g/l tirpalo, 5°KL ir 25-40°C, kas atitinka sąlygas, taikomas Europoje skystiems plovikliams.
[0058] Gali būti sukurti ir kiti plovimo galios išbandymo bū-dai, atitinką kitas rinkos diktuojamas sąlygas. Tiriant kokią specialią skalbimo yptybę, panaudojami audinių pavyzdžiai. Konkrečiai, pavyzdžiai iš EMPA 116 ir 117, ištepti dėmėmis, kurias gali veikti proteazė, iš dalies audiniai, ištepti krauju, žole, šokoladu arba baltyminiais produktais.
[0059] Gamtoje randamų arba patyrusių natūralią mutaciją pro-teazių savybė gali būti sustiprintos, sukialiant fer-mente eilę mutacijų. Dažniausiai mutacijos yra pava-duojamo pobūdžio, kaip konservatyvaus, taip ir nekon-servatyvaus tipo, tačiau taip pat gali būti delecijos ir intarpai.
[0060] Konservatyviems pakeitimams gauti galima pasinaudoti lentele:
[0061] kur bet kuri aminorūgštis gali būti pakeista kita tos pačios kategorijos aminorūgštimi, tarp jų ir .esančia toje pačioje eilutėje. Be to, poliarinės aminorūgštys N, Q gali pakeisti arba būti pakeistos turinčiomis krūvi, aminorūgštimis. Šio išradimo tikslams ypatingai įdomūs pakeitimai, sustiprinantys proteazės anijonine prigimti,, ypač su aktyviais centrais nesusijusiose vie-tose .
[0062] Mutacijoms ypač svarbios tos aminorūgštys, kurios lo-kalizuotos srityje, per 4A nutolusioje nuo inhibito-riaus molekulės Eglin C, kai Eglin C susirišęs su akty-viu saitu.
[0063] Žemiau pateikta numeracija, pasiremiant PB92 proteazės struktūra, tačiau tie samprotavimai tinka ir kitoms homologiškoms serino proteazėms, iš dalies proteazėms, kurių homologiškumas viršija 70%, o ypač, kai viršija 90%. Šios padėtys - tai: 32, 33, 48-54, 58-62, 94-107, 116, 123-133, 150, 152-156, 158-161, 164, 169, 175-186, 197, 198, 203-216, ir pagrindinė nurodytų padėčių dalis turi būti prieinama betarpiškam kontaktui su baltyminiu substratu. Paprastai, 32, 62, 153 ir 215 padėtyse ne-siekiama daryti pakeitimų, kadangi mutacijos šiuose saituose sumažina plovimo galią.
[0064] Ypatingą reikšme pakeitimio prasme turi šios padėtys: 60, 62, 94, 97, 102, 105, 116, 123-128, 150, 152, 153, 160, 183, 203, 211, 212 ir 213-216-. Kai kuriose padėtys turės tendenciją pakeisti neatsparią oksidinimui amino-rūgšti,, pavyzdžiui metioniną, atsparesne, pavyzdžiui treoninu, tuo pačiu išsaugant šioje padėtyje bendrą konformaciją ir aminorūgšties tūri,. Kaip buvo pastebėta kitose situacijose, gamtinės aminorūgšties pakeitimas bet kuria kita aminorūgštimi gali pagerinti rezultatus, ypač, pakeičiant hidroksilintas aminorūgštis S ir T poliarine, nepoliarine arba netgi aromatine aminorugš-timi.
[0065] A166 turinti krūvį, ypač anijoninė aminorūgštis M169 neutrali alifatinė, geriau nepoliarine aminorūgštis N122 anijoninė aminorūgštis
[0066] Netikėta buvo tai, kad tuo metu, kai daugelis mutacijų sumažina specifini, proteazės aktyvumą įprastų substratų atžvilgiu, jų plovimo galia lieka tokia pat arba pa-didėja, palyginus su natyviais fermentais, daugeliu at-vejų padidėja stabilumas laikant.
[0067] Kai kurių PB92 proteazės mutantų plovimo galia, iš-reiškus ją kaip atvirkščią dydį santykiniam fermento kiekiui, kuris būtinas norint pasiekti tą patį efektą kaip ir natyvinių proteazių atveju, padidėja iki 120%, kai kuriais atvejais - iki 180%.
[0068] Dar vienas išradimo aspektas - tai, kad gaunami PB92 proteazės mutantai, kurie, palyginus su natyvia PB92 proteaze, yra stabilesni, laikant miltelių pavidalo skalbimo kompozicijoje su balinimo priemone, o jų plovimo galia nepakinta. Tokių mutantų pavyzdžiu gali būti M216S ir M216Q, kurie turi ne mažiau vienos iš nu-rodytųjų mutacijų šalia mutacijų kituose saituose.
[0069] Dar vienas išradimo aspektas yra tas, kad netikėtai pastebėta, kad skystoje skalbimo kompozicijoje , ( be ok-sidintojo) PB92 proteazės mutantai M216S, M216Q, S160D ir N212D išsaugo savo aktyvumą geriau negu PB92 pro-teazė. Iš paminėtų mutantų M216S ir M216Q išsaugo plovimo galią, o S160D ir N212D ją dar pagerina. Laikant nurodytame skystame ploviklyje, stabilumas ypač padi-dėja turint S160D ir M216Q mutantus. Taip pat galima derinti kelias mutacijas, didinant proteazės stabilumą skalbimo kompozicijose. Kelios mutacijos, teigiamai veikiančios vienos ir tos pačios proteazės plovimo ga-lią, gali susijungti viename mutavusios proteazės gene, tuo atveju gali būti gautos dar geresnės proteazės, pa-vyzdžiui [ S126M, P127A, S128G, S160D] ir [ G116V, S126N, P127S, S128A, S160D] . Nauji proteazės mutantai gali bū-ti gauti, derinant gerą jų plovimo galią, pavyzdžiui, dėka N212D ir S160D mutacijų, su geresniu stabilumu dėl M216S ir M216Q mutacijų. Pavyzdžiui, mutantai [ S160D, M216S] pasižymi stipresne plovimo galia ir didesniu stabilumu laikant.
[0070] Vertingi mutantai gali būti gauti, derinant bet kurią mutaciją su eile šiame skyriuje aprašytų mutacijų. Be to galima derinti aprašytas mutacijas su mutacijomis kituose saituose, rezultate jos gali iš esmės pakeisti fermento savybes arba jų nepakeisti.
[0071] Rekomenduojami šio išradimo realizacijos variantai PB92 proteazėje gali būti tokie: [ M216S] ; [ M216Q] ; [ N212D] ; [ S160D] ; [ S160G, N212D] ; [ S160D, M216Q] ; [ S160D, M216S] ; [ A166D, M169I] ; [ G116V, S126V, P127E, S128K] ; t G116V, S126G, P127Q, S128I] ; [ G116V, S126L, P127N, S128V] ; [ G116V, S126L, P127Q, S128A] ; [ G116V, S126V, P127M] ; [ G116V, S126H, P127Y] ; [ G116V, S126R, P127S, S128P] ; [ G116V, S126F, P127Q] ; [ G116V, S126F, P127L, S128T] ; [ S126M, P127A, S128G] ; [ S126M, P127A, S128G, S160D] ir [ G116V, S126N, P127S, S128A, S160D] .
[0072] Norint pailiustruoti šiame išradime panaudoto naujų plovikliams tinkamų proteazių gavimo būdo svarbą, t. y. išbandymą tipiškose skalbimo sąlygose, naudojant kaip pirminės atrankos kriterijų, PB92 proteazės mutantų plovimo galios tyrimo rezultatai buvo lyginami su bio-cheminiais rodikliais, dažniausiai nustatomais bioche-miniuose ir enzimologiniuose baltymų tyrimuose. Paly-ginimo rezultatai leidžia padaryti išvadą apie tai, kad nėra jokio ryšio tarp plovimo galios ir rodiklių, le-miančių giminingumą pasirinktiems substratams bei pro-teolitinių reakcijų kinetiką (žr. 1 lentelę, 1 pavyzdyje) .
[0073] Tokiu būdu, savaime aišku, galima apjungti du ar daugiau mutantus su skirtingomis savybėmis viename fermen-tiniame produkte arba tame pačiame skalbimo procese. Toks derinimas gali turėti arba neturėti sinergetinio poveikio.
[0074] Išradimas taip pat apima vieno ar kelių proteolitinių mutantinių fermentų panaudojimą skalbimo kompozicijoje arba skalbimo procese.
[0075] Ir pagaliau aišku, kad delecija arba aminorūgščių intarpai proteazės polipeptidų grandinėje, įterpti dirb-tiniu būdu mutagenezės pagalba arba atsiradę natūraliai proteazėse, homologiškose PB92 proteazei, gali pakeisti aminorūgščių numeraciją. Tačiau būtina paaiškinti, kad padėtys, homologiškos padėtims PB92 proteazėje, taip pat įeina į teisių turini,.
[0076] Išradimo iliustravimui siūlome šiuos pavyzdžius, tačiau be išradimo apribojimų.
[0077] Bazinė konstrukcija, nuo kurios pradedama mutagenezė, pažymėta kaip pM58 ir detaliai aprašyta Europos patento paraiškoje Nr.0283075.
[0078] 1. c. Vektoriaus pM58 Eco konstravimas ir mutacinio DNR fragmento subklonavimas šiame vektoriuje.
[0079] Bazinė konstrukcija pM58 surenkama restrikcijos fer-mentų Hpal ir Bali pagalba. Fragmentas iš 1400 bazių porų, turintis PB92 proteazės geną, gryninamas žemos lydymosi temperatūros agarozėje (Maniatis, Molecular cloning. Laboratory manual, Cold Spring Harbor, 1982) .
[0080] Vektorius M13MP11 (Messing ir kt., Nukl. Acids Res. 9,
[0081] (1981)303-321) sukonstruojamas, panaudojant Smal. Anks-čiau gautas DNR fragmentas iš 1400 bazių porų Įstatomas į ši, vektorių ir transformuojamas i, E. coli JM101 pagal metodiką, aprašytą Cohen su bendr. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, (1972) 2110-2114.
[0082] Po faginio padauginimo E. coli JM101, išskiriamas ssDNR fragmentas, (Heidecker ir kt., Gene 10, (1980) 69-73., intarpas ir jo orientacija kontroliuojami DNR sekvena-vimu (Sanger ir kt. Proc. Natl. Acad. Acad. Sci. USA 74
[0083] (1977) 6463.
[0084] Rezultate gaunamas mutagenezei atlikti tinkamas vektorius, kuris pažymėtas M13M1. Aprašyta procedūra schema-tiškai pavaizduota Fig.lA.
[0085] Mutagenezė atliekama panaudojant M13M1, su šio vektoriaus ssDNR ir M13mpl9 su dsDNR (Messing ir kt., Nucleic Acids Res. 9, (1988)303-321), po to pastarasis vektorius pritaikomas restrikcijos fermentais EcoRI ir Hind III, vėliau išgryninat didįjį fragmentą žemos lydymosi temperatūros agarozėje.
[0086] Mutagenezė atliekama pagal Kramer ir kt. metodiką: Nucl. Acids Res., 12 (1984) 9441-9456, pakeitus joje tai, kad mutantų atrankai vietoje E. coli WK 30-3 panaudojama E. coli JM105.
[0087] Specifinių mutacijų sukūrimui naudojami oligonukleo-tidai susideda iš 22 nukleotidų. Specifinės mutacijos sritis, kuri panaudojama kelių mutacijų sukūrimui vienu metu specifinėje DNR sekoje, gaunama, panaudojant 40 nukleotidų preparatą turintį visus keturis nukleotidus netvarkingai įterptus į saitus, atitinkančius pasirink-tą mutacijai aminorūgštį ar rūgštis.
[0088] Po mutagenezės kiekviena potencialių mutantų mutacija buvo tikrinama, sekvenuojant didezoksi metodu (Sanger, žr. aukščiau). Visas vienos grandinės fragmentas (žr. Fig.l B buvo sekvenuojamas, norint patikrinti, ar nėra antrinių mutacijų. Metodika schematiškai parodyta Fig.l B. Išdėstyta procedūra gali būti panaudota, norint sukurti DNR fragmentus su mutacijomis proteazės geno .3 * gale (aminorūgštys 154-269).
[0089] Norint sukurti DNR fragmentus su mutacija proteazės geno 5V gale Bacillus vektoriuje, gali būti panaudoti alternatyvūs restrikcijos fermentai ir gali būti sukonstruoti modifikuoti PB92 proteazės genai pagal metodiką, analogišką metodikai, parodytai Fig.l A. 1. c. Vektoriaus pM588Eco konstravimas ir mutacinių DNR fragmentų subklonavimas šiame vektoriuje ( Fig. 1 C).
[0090] Norint sukonstruoti pM58 8 Eco, pM58 buvo skaldomas restrikcijos fermentu Eco RI ir praskiedimo sąlygose liguojamas su T4 ligaze. Gautas ligavimo mišinys buvo panaudotas B. subtilis 1-A40 ( Bacillus genetinių kamie-nų centras, Ohio) transformacijai pagal Spizizen ir kt., J. Bacteriol. 81 (1961) 741-746.
[0091] Ląstelės iš transformacijos mišinio buvo perkeltos minimalias lėkšteles su 20 jig/ml neomicino, kaip apra-šyta Europos patento Nr.0283075 1 pavyzdyje.
[0092] Plazmidinės DNR transformantai išskiriami pagal Birnboim ir Doly, Nucleic Acids Res. 7 (1979) 1513-1523, ir charakterizuoti analizuojant restrikcijos fermentais. Tokiu būdu buvo išskirtas pM585 Eco (žr. Fig.l c).
[0093] Norint gauti mutantini fermentą, DNR fragmentai M13M1, turintys pageidaujamas mutacijas, sukauptas, kaip apra-šyta 1 b skyriuje, buvo subklonuoti į pM588Eco. M13M1 dsDNR (aprašyta aukščiau) buvo skaldoma su EcoRI ir liguojama i, pM58 Eco saitą EcoRI. Ligavimo mišinys panaudojamas transformuoti B. subtilis DB104, Doi, J. Bacteriol. (1984) 160, 442-444, panaudota Spizizen ir kt. metodą (žr. aukščiau).
[0094] Ląstelės iš transformacijos mišinio perkeliamos i, minimalias lėkšteles su 20 |xg/ml neomicino ir 0,4%_kazeino (Europos patentas Nr. 0283075). Proteazės, produkuojan-čios transformantus, DNR buvo išskirta pagal metodą, aprašytą Birnboim ir Doly, (žr. aukščiau) ir charakte-rizuota, analizuojant restrikcijos fermentų pagalba.
[0095] Transformantais DB104, kuriuose aptiktas vektorius su mutaciniu proteazės genu, užsėjama 10 ml triptono - sojos buljono (TSB) , i, kuri, pridėta 20 ml Įig/ml neomicino, ir inkubuojama 24 vai. 37°C temperatūroje. Kultū-ros mėginiais (0,1 ml) užsėjamos 500 ml tūrio kratyk-linės kolbos su 100 ml terpės proteazei gaminti: 12,5 g/l mielių ekstrakto (Difco) , 0,97 g/l CaCl2.6HO, 2,25 g/l MgCl2.6H20, 20 mg/l MnS04.4H20, lmg/1 CoCl2.6H20, 0,5 g/l citrato, 0,5 ml/1 putų gesintojo 5693, 6% (svor./tūr.) maltozės, 0,2 M fosfatinio buferio pH 6,8 su 20 fj./ml neomicino.
[0096] Po 65 vai. inkubavimo, pastoviai maišant, matuojamas proteazės aktyvumas pagal Lin ir bendr. metodiką, (J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793) su substratu dimetilka-zeinu. Norint gauti didelius kiekius laukinio tipo PB92 proteazės ir mutantinės PB92 proteazės, tuos pačius ka-mienus augina 37°C temperatūroje aeruojamuose 10 1 talpos ir didesniuose fermentatoriuose su tokia pat terpe, kaip ir kratyklinėse kolbose.
[0097] Gauti kultūriniai skysčiai naudojami proteazei išskirti.
[0098] 3. PB92 laukinio tipo proteazės ir jos mutantų gryninimas ir koncentravimas
[0099] Mutantinė ar natyvi pB92 proteazė, gauta iš Bacillus subtilis DB104 kratyklinėse kolbose arba 10 1 talpos fermentatoriuose, gryninama katijonų mainų chromatografijos būdu, panudojant diskus Zeta-PrepR arba .PS tipo (LKB) patronus. Fermentacijos mišinys centrifūguojamas (3000 x g, 10 min.), skystis atskiriamas ir 10 kartų praskiedžiamas lOmM natrio fosfato buferiu (pH 5,5) po to perkialiamas d, kolonėlę su sorbentu. Patronas plau-namas keliais tūriais fosfatinio buferio, proteazė eliuojama 0,4 m NaCl. Aktyvios frakcijos koncentruo-jamos ultrafiltracijos būdu Amicon aparate, filtras PM-10. Natrio chlorido koncentracija sumažinama iki 50 mM praskiedžiant proteazės tirpalą fosfatiniu buferiu ir sukoncentruojant. Laikoma -30°C temperatūroje esant baltymo koncentracijai 1-10 mg/ml.
[0100] Arba PB92 proteazės mutantai iš didelių suspensijos tū-rių išskiriami, pridedant CaCl (1% sv./sv.) i, acetoną
[0101] (30% sv./sv.) po filtracijos ląstelių masė atskiriama, proteazė išsodinama iš gauto filtrato, pridedant 0,2-2%
[0102] (sv./sv.%) CaCl2.2H20 ir dar pridedant acetono iki jo galinės koncentracijos > 60,0% (sv.%). Nuosėdas filt-ruoja, apšlaksto acetonu ir išdžiovinę gauna pradinio fermento miltelius (PFM).
[0103] Proteazės laikomos grynos, jeigu elektrforezėje arba HPLC chromatografijos metodais gaunama viena juosta ar-ba pikas.
[0104] Elektroforezė poliakrilamido gelyje (PAGE) su natrio dodecilsulfatu (NaDS) atliekama pagal Laemmli, Nature, 227 (1970) 680-685. Norint išvengti fermento denatūra-vimosi NaDS, 100°c temperatūroje ir jo autodegradavimo, reikia proteazę inaktyvuoti, inkubuojant ją su fenil-metilsulfonilfluoridu (FMSF) (1 mM, 30 min. kambario temperatūroje) arba išsodinti trichloracto rūgštimi (TChA, 8%, 30 min., lede). PAGE atliekama prie pH 7,45
[0105] (gėlio buferis, susideda iš 20 raM histidino (His) ir 50 mM 3-/N-morfolino/propansulforūgšties (MOPS) 5% poĮiakril-amido gelyje (akrilamido: bioakrilamido santykis 20:1). Baltymo pavyzdžiai užnešami viršutinėje gėlio plokš-telės dalyje ir elektroforeze nukreipiami katodo link. Tas pats His/MOPS buferis naudojamas atliekant elekt-roforezę rezervuare, tačiau prie pH 6,3. Po elekt-roforezės 1,5-2 vai., 350 V) baltymai fiksuojami gelyje 8% acto rūgštimi, nudažomi Coomassie brilliant mėly-nuoju R250 ir išplaunami pagal standartinę metodiką.
[0106] Grynumas tikrinamas HPLC chromatografija katijonitų ko-lonėlėse (MonoS-Pharmacia Fine Chemicals) ir gel-filt-racija kolonėlėse (TSK 2000 SW-LKB). Chromatografijai naudojamas 10 mM natrio fosfato buferis pH 5,5, pro-teazės eliucija atliekama linijiniu 10-300 mM natrio fosfato buferio (pH 5,5) gradientu. Gel filtracijos kolonėlėse naudojamas 0,25 M natrio acetatas (pH 5,5).
[0107] Baltymo koncentracija gryninto fermento tirpale nustatoma: 1. matuojant absorbciją ties 280 nm, pasinaudojant pa-skaičiuotu ekstinkcijos koeficientu (eM) ir
[0108] Ekctinkcijos koeficientas skaičiuojamas, remiantis trip-tofanų (eM = 5600 M^cm1) ir tirozinų (eM = 1330 M-1.cm-1) skaičiais, tenkančiais proteazės molekulei. PB92 proteazei eH = 26100 M 1cm 1. (3 Trp, 7 Tyr liekanų), kas ek-vivalentiška koeficientui E^cm, išmatuotam ties 280 nm = 9,7 (Mr = 26729 Da) . Turint mutantus su skirtingu Tyr ir Trp kiekiu, padaromos atitinkamos pataisos.
[0109] Aktyvių fermento molekulių skaičius nustatomas, titruojant aktyvų saitą. Kadangi plačiai naudojamas N-trans-cinamoiloimidazolo metodas (M.L. Bendor ir kt., J. Am. Chem. Soc. 88 (1966) 5890-5931 neduoda patenkinamų re-zultatų PB92 proteazės atveju, mes sukūrėme metodą su FMSF. Pagal ši, metodą žinomos koncentracijos (matuojant absorbciją 280 nm) proteazės tirpalas sumaišomas atitinkamai su 0,25, 0,5, 0,75, 1, 0 arba 1,25 ekviva-lentais FMSF ir paliekama 1 vai. kambario temperatūroje 10 mM natrio fosfate (pH 6,5). Fermento koncentracija turi būti ne mažiau 50 pM.
[0110] Liekamasis aktyvumas išmatuojamas spektrofotometru, kaip substratą panaudojanti sukcinil- L-alanil- L alanil-L-prolil- L-fenil-alanil-paranitroanilidą (sAAPFpNA), (žr. žemiau).
[0111] FMFS grynumas, o (tuo pačiu ir koncentracija) nustatoma BMR-spektroskopijos pagalba, tiriamieji tirpalai ruo-šiami izopropanolyje. Rezultatai, gauti titruojant ak-tyvią fermento zoną, sutampa su HPLC rezultatais.
[0112] 6. Laukinio tipo ir mutantinių proteazių kinetinių pa-rametrų nustatymas
[0113] 1°. Aktyvumai su baltyminiais substratais (kazeinu) matuojami prie pH 10 pagal Didžiosios Britanijos patentą Nr. 1353317 (išreiškiamas šarminiais Delfta vienetais,
[0114] 2°. Efektyvumas, matuojant su kazeino substratu, nustatomas pH-statu. Į reakcijos kamerą (Radiometer, Kopenhaga) įpilama 10 ml 0,1 M KCL, kuriame ištirpinta 50 mg kazeino (Hammerstein) Merck). Protonai, išsiskyrę po kazeino hidrolizės proteaze, titruojami 10 mM NaOH, palaikant pH 10 (40°C azoto dujų srovėje).
[0115] 3°. Aktyvumai sintetinių peptidų atžvilgiu matuojami, panaudojant sAAPFpNA. Susidaręs (geltonas) par-anitro-anilidas (pNA) matuojamas spektrofometru UVIKON 860 (KONTRON) ties 410 nm: eM = 8480 M-1. cm-1 (E. G. Delmar ir kt. Anai. Biochem. 94 (1979) 316-320) šešių kiuvečių termostatuotoje kasetėje. Kinetinės konstantos kcat ir K,,, gaunamos, matuojant pradini, reakcijos greitį įvairiose substrato koncentracijose (PB92 proteazei 0,1-6,0 mM) , priartindami gautus duomenis prie hiperbolinės funk-cijos nelinijinės regresijos būdu. Paskaičiuojamos spe-cifiškumo konstantos (kcat/'Km) . Matuojama 25°C tempera-tūroje 1 ml tūryje, kuriame yra 0,1 m Tris-HCl + 0,1 M NaCl, pH 8,6. Natrio chloridas būtinas, kadangi be jo PB92 proteazei negaunama Linweaver-Burck'o kreivių linijinės priklausomybės dėl inhibicijos substratu. Substratas pradžioje gaminamas 200 mM koncentracijos, po to praskiedžiamas iki 20 mM 0,1 M Tris-HCl (pH 8,6) buferiu (matuojama spektrofotometru ties 315 nm; eM = 14000 M1, cm"1). Jokios korekcijos dėl kintančios tir-piklio koncentracijos (0,05-3% t./t.) nereikia.
[0116] PB92 proteazės jautrumas oksidacijai H202 tiriamas Estell metodika ( J. Biol. Chem. 260 (1985) 6518-652) išskyrus tai, kad:
[0117] 2) kaip papildomas oksidintojas naudojamas 20 mM natrio perborato tirpalas su 10 mm TAED.
[0118] PB92 proteazės mutantai tiriami specialiai sukurtame skalbimo eksperimente panaudojant medvilnės arba poli-esterio-medvilnės gabalėlius, išteptus pienu, krauju ir rašalu (pažymėti 116 ir 117 numeriais, 5, 0x5,0 cm, gauti iš EMPA, St. Gallen, Šveicarija).
[0119] Bandymai atliekami firmos Atlas prietaisu LEF-FC, kuriuo matuojamas audinių atsparumas skalbimui. Prietaiso komplekte skalbimo indai iš nerūdijančio plieno, kiekvienas iš jų užpildomas nurodyta skalbimo kompozicija, pridedant tiriamą proteazę (PB92 proteazės mutantai arba PB92 proteazė) . Jeigu nėra atskirų nurodymų, ban-dymas trunka 30 min užsiduotoje temperatūroje. Po skalbimo audinių pavyzdžiai džiovinami oru ir Photovolt fotometru (modelis 577) su žaliu filtru, 680 nm matuojama bandomų audinių atspindžio galia. Duomenys, gauti audinio gabaliukus išskalbus plovikliais, kuriuose yra atitinkami PB92 proteazės mutantai, paly-ginami su serija matavimų, kai panaudoti plovikliai su PB92 proteaze. Mutantinių proteazių plovimo galia ap-skaičiuojama dalijant PB92 proteazės baltymo kieki, (mg) iš mutantinės PB92 proteazės baltymo kiekio (mg), kurio prireikė tai pačiai atspindžio galiai pasiekti, x 100%.
[0120] A. Įvairių PB92 proteazės mutantų plovimo galia Europos skalbimo milteliuose nustatoma aukščiau išdėstytu metodu .
[0121] Į bandymui naudojamus nerūdijančio plieno indus, su nurodytu kiekiu skalbimo miltelių IES, ištirpintų 250 ml vandens (KL 15°) , įmerkiama po du medvilnės ir poli-esterio/medvilnės audinio pavyzdžius. Skalbimo miltelių IEC sudėtis:
[0122]
[0123] B. Plovimo galios tyrimų matavimai pakartojami 25°C temperatūroje su tais pačiais plovikliais ir su tais pačiais PB92 proteazės mutantais. Kontrolei naudojama ta pati PB92 proteazė. Kitos tyrimo sąlygos tos pačios, kaip aprašyta. Gauti rezultatai pateikti 2 lentelėje.
[0124] Bandymus atlieka prietaisu audinių atsparumui tirti, skalbiant 25° ir 40° temperatūroje. Ir šiuo atveju palyginimui naudoja PB92 proteazę. Kitos bandymo są-lygos atitinka anksčiau aprašytąsias. Gauti rezultatai parodyti 3 lentelėje.
[0125] Buvo tiriamas PB92 proteazės mutanto stabilumas, laikant skalbimo milteliuose IEC, kaip ir 1 pavyzdyje. Stabilumas laikant tiriamas klimatiniuose stenduose 30°C temperatūroje, santykinis drėgnumas (SD) 80%. Pro-teazė šiems bandymams buvo kapsuliuojama tokiu būdu: paruošiamas mišinys, kuriame (sv./sv.): 2% grynintos proteazės, 50% nejoninio (etoksilinto C14-C18 alkoholio su 50-80 E.O. vienetų), 5% Ti02, 3-10% CaS04.2H20, Na2SO iki 100%. Mišinys šildomas iki 65-90°C ir ataušinamas iki kambario temperatūros. Gautos 0,5-1 mm dalelės atskiriamos sijojant ir panaudojamos tirti stabilumui plovikliuose.
[0126] Skalbimo milteliai IEC (3,5 g), i, kuriuos pridėtas 6140 ŠDV/g skalbimo miltelių mutantas M216S, buvo laikomi 18 ml talpos kolbutėse. Palyginimui tose pačiose sąlygose buvo laikoma PB92 proteazė. Po 2, 4, 5 ir 6 sa-vaičių buvo nustatomas išlikęs proteazės aktyvumas.
[0127] Gauti rezultatai parodyti 4 lentelėje.
[0128] Buvo tiriamas PB92 proteazės ir įvairių jos mutantų stabilumas, laikant skalbimo milteliuose. Stabilumo tyrimuose buvo naudojama kapsuliuota proteazė.
[0129] Proteazės produktai buvo gaminami, sumaišant šiuos kom-ponentus 80°C temperatūroje:
[0130] Gautas mišinys kapsuliuojamas granuliuojant sukietinimo būdu, kaip aprašyta Didžiosios Britanijos patente Nr. 1603640. Dalelių frakcija tarp 0,3 ir 0,8 mm panaudojama nustatyti proteazių stabilumui laikant. Kapsuliuota proteazė (140 mg) buvo sumaišyta su ALLR baze (6,4 g) ir natrio perborato tetrahidratu (0,6 g). /ALL užregistruotas firmos Unilever N.V. prekinis ženklas/. ALL bazėje nėra fermentų ir balinimo priemonių.
[0131] Fermento-ploviklio-natrio perborato tetrahidrato milte-lių mišinys inkubuojamas 30°C temperatūroje, esant 80% SD. 5-je lentelėje pateiktas liekamasis aktyvumas, išlai-kius nurodytą periodą.
[0132] PB92 proteazė ir įvairūs jos mutantai buvo kapsuliuo-jami tuo pačiu metodu, kaip 3 pavyzdyje. Tačiau šiame pavyzdyje apie 70 mg kapsuliuotos proteazės, kurios da-lelių dydis 0,3-0,9 mm, buvo sumaišomos su 3,2 g ALL ir 0,3 g natrio perborato tetrahidrato. Pavyzdžiai buvo laikomi 30°C temperatūroje 18 ml kolbutėse vakuum eksi-katoriuje. Pirmas tris dienas buvo palaikomas 25 mm Hg vakuumas.
[0133] Vakuume vandens garų pernešimo greitis didėja ,todėl 80% SD pusiausvyra tokioje sistemoje buvo pasiekiama greičiau, negu sistemoje be vakuumo. 80% SD buvo pa-laikoma prisotintu kalio bromido tirpalu.
[0134] 6 lentelėje parodytas liekamasis aktyvumas, praėjus nu-rodytam laikui (savaitės)
[0135]
[0136] 5 PAVYZDYS
[0137] Buvo paruoštas tokios sudėties skystas ploviklis:
[0138] Į nurodytą kompoziciją prideda toki, kiekį PB92 pro-teazės ir įvairių jos mutantų, kad pradinė proteazės koncentracija būtų 0, 13 % ( sv. sv.).
[0139] Proteazės stabilumas ( liekamasis aktyvumas, %) buvo nustatomas, išlaikius ją kompozicijoje 37°C temperatūroje nurodytą dienų skaičių. Gauti rezultatai parodyti 7 lentelėje.
[0140] Su PB92 proteaze ir kai kuriais jos mutantais buvo gaminami tokios sudėties mišiniai:
[0141] Iš šio mišinio gaminami granuliatai naudojanti metodika, kaip 5 pavyzdyje pagal JAV patentą Nr.4242219, išskyrus tai, kad: 1° - pavyzdyje nurodytas mišinys pakeičiamas aukščiau
[0142] pateiktuoj u;
[0143] 2° - naudoja ne 1 mm diametro angas, bet 0,7 mm;
[0144] Gautos granulės (140 mg) sumaišomos su ALL baze (6,4 g) ir natrio perborato tetrahidratu (0,6 g), po to supila-mos i 36 ml talpos kolbutes.
[0145] Matuojamas proteazės stabilumas (liekamojo aktyvumo %), išlaikius šias kolbutes 30°C temperatūroje, esant 80% SD, nustatytą savaičių skaičių. Gauti rezultatai parodyti 8 lentelėje.
[0146] 7 PAVYZDYS
[0147] Pagaminamos PB92 proteazės ir kai kurių jos mutantų granulės ir sumaišomos su plovikliu ir balinimo priemone, kaip aprašyta 3 pavyzdyje.
[0148] Šių pavyzdžių stabilumas laikant (liekamojo aktyvumo %) buvo nustatomas 30°C temperatūroje, esant 60/80% SD (pakaitom 60% SD 12 valnadų ir 80% SD 12 valandų) . Rezultatai pateikti 9 lentelėje.
[0149]
[0150] Pagaminamos granulės su PB92 proteaze arba kai kuriais jos mutanatais ir sumaišomas su plovikliu ir balinimo priemone, kaip aprašyta 6 pavyzdyje.
[0151] Šių pavyzdžių stabilumas laikant (% liekamojo aktyvumo) buvo matuojamas po inkubacijos nustatytą laiką 30°C temperatūroje ir esant 60/80% SD, kuris pakaitom 12 vai
[0152] buvo palaikomas 60% ir 12 vai. 80%. Rezultatai pateikti
[0153] 10 lentelėje.
[0154] Buvo tiriamas PB92 proteazės ir kai kurių jos mutantų stabilumas laikant skalbimo milteliuose su balinimo priemone 30°C temperatūroje, esant 80% SD. Šiame eksperimente buvo naudojamos kapsuliuotos proteazės. Kiekviena proteazė kapsuliuojama tokiu būdu:
[0155] 80°C temperatūroje buvo pagamintas tokios sudėties mi-šinys :
[0156] Nejoninis = C14-C18 alkoholpolietoksilatas (50-80 EO gru-pės) EO grupės-etoksi-grupės.
[0157] Gautas mišinys aušinamas iki kambario temperatūros. Su-kietėjusi masė susmulkinama i, smulkias daleles.. Išsi jo-jamos dalelės 0,3-0,8 mm ir panaudojamos stabilumo eks-perimentams .
[0158] Stabilumo bandymuose 140 mg kiekvienos kapsuliuotos proteazės buvo sumaišoma su 6,4 g bazinių ALL skalbimo miltelių ir 0,6 g natrio perborato tetrahidrato. Pa-grindiniuose ALL milteliuose nėra nei fermento nei natrio perborato. ALL-proteazės-natrio perborato tetrahidrato mišinys buvo inkubuojamas 30°C temperatūroje, esant 80% SD.
[0159] Išlaikius 0, 1, 2 ar 4 savaites, nustatomas kiekvienos proteazės stabilumas (liekamasis aktyvumas, %) . Rezultatai pateikti 11 lentelėje.
[0160] PB92 proteazės mutantai buvo tiriami iš esmės tokiose pačiose kaip 1 pavyzdyje sąlygose, išskyrus tai, kad Launderometre (prietaise audinių atsparumui tirti) i, 250 ml vandens 5°KL, buvo dedama 0,375 g skysto ploviklio, kurio sudėtis:
[0161]
[0162] PB92 proteazės mutantų plovimo galia buvo nustatoma statistiniuose tyrimuose įprastoje skalbimo mšinoje TNO, Delft, Olandija (Švaros palaikymo technikos tyrimo institutas). Mutantų plovimo galia buvo lyginama su PB92 proteaze.
[0163] Visos proteazės buvo dozuojamos i, IEC plovikli,, remiantis baltymo kiekiu ( 0, 007% sv./ sv.) . Šios __ dozės, išreiškus aktyvumu:
[0164] Su kiekviena proteazės- ploviklio kompozicija buvo atliekami 8 skalbimo eksperimentai 40°C temmperatūroje identiškose 2 režimų AEG Turnamat skalbimo mašinose. Kiekvienoje skalbimo mašinoje buvo sunaudojama 170 g. ploviklio. Bandymo eigoje tiriamas ploviklis buvo panaudojamas tokiu būdu, kad kiekvieni milteliai patyrė toki, pati, skalbimo ciklų skaičių kiekvienoje mašinoje.
[0165] Visuose bandymuose buvo naudojamas normalus Delfto miesto vandentiekio vanduo, kurio rodikliai:
[0166] Purvo pašalinimas iš tiriamų audinių
[0167] Kiekvienoje bandymų serijoje 6 gabaliukai trijų tipų EMPA medvilnės audinio ( no. 111, 116 ir 117), buvo skalbiami kartu su nešvariais skalbiniais.
[0168] Dėmių ir purvo pašalinimo aktyvumas iš suteptų testuo-jamų gabaliukų buvo nustatomas praleidžiant trikom-ponentinę mėlyną šviesą statmenai audinio gabalėliui. Matuojamas šviesos kiekis atspindėtas nuo testuojamo gabalėlio 45°C kampu. Sutinkamai su IEC publikaci-ja 456, magnio oksido remisijos dydis prilyginamas 100. Kuo didesnė remisija, tuo labiau tinkamas skalbimo procesas konkrečiai užterštumo rūšiai.
[0169] Į skalbimo mašiną buvo sukrauta 4,75 kg tiriamų audinių ir kitokių skalbinių, kurie susiteršė, vartojant na-muose .
[0170] 6 virtuvės rankšluosčių 4 apatinių baltinių 4 paklodžių
[0171] Jeigu trūksta svorio, pridedama švarių paklodžių ar užvalkalų.
[0172] Kiekvienam skalbimui skalbiniai rūpestingai parenkami. Kiekvienas audinio gabalas skirtas vienai mašinai, turi savo analogą, skalbiamą kitoje mašinoje. Rezultate - nešvarumų kiekis mašinose buvo vienodas.
[0173]
[0174] 5 skalavimai, keikvienas po 17 1 šalto vandens
[0175] Vidutinė remisijos reikšmė (V) ir santykis (R) buvo nu-statomi po 8 skalbimo testų. Dviejų nepriklausomų eks-perimentų rezultatai pateikti 14 A ir 14 B lentelėse.
[0176]
[0177] Mutantinių proteazių R/ R' reikšmės, artimos 1, 00, pa-rodo, kad yra koreliacija tarp bandymų įprasto tipo skalbimo mašinose ir prietaisuose audinių atsparumui tirti ( Launderometro testų).
[0178] Fig. 2A ir Fig. 2B pavaizduota įvairių PB92 proteazės mutantų, esančių 4 g IEC/ 1, plovimo galia, gauta tyrimuose, aprašytuose 1 pavyzdyje, lyginant su natyvia PB92 proteaze, kaip jų specifinio aktyvumo funkcija. Skaičiai diagramoje atitinka šias proteazes:
[0179]
[0180] Fig. 3 pavaizduota įvairių PB92 proteazės mutantų, esančių 7 g IEC/1, plovimo galia, nustatyta, kaip ap-rašyta 1 pavyzdyje, lyginant su natyvia PB92 proteaze, kaip jos specifinio aktyvumo funkcija. Skaičiai diagramoje atitinka tas pačias mutantines proteazes, kaip ir Fig. 2A ir 2B.
[0181] Visos publikacijos (taip pat ir patentinės paraiškos), paminėtos šiame aprašyme, informatyvios tik paruoštam specialistui tos srities, kuriai skirtas šis išradimas. Visos publikacijos pateiktos nuorodų pavidalu tokiu bū-du, lyg kiekviena iš jų būtų specialiai duodama kaip nuoroda.
[0182] Nors šis išradimas pakankamai iliustruotas ir pateikti pavyzdžiai jam paaiškinti, specialistui akivaizdu, kad čia galimi ivairūs pakeitimai ir modifikacijos, nenu-tolstant nuo išradimo apibrėžties dvasios ir turinio.
1. Fermentinis produktas, besiskirianti tuo, kad susideda iš mutantinio proteolitinio fermento, gauto ekspresuo jant geną, koduojanti, ši, fermentą su aminorūgščių seka, besiskiriančia bent viena aminorūgš-timi nuo laukinio tipo fermento, be to, šis mutantinis fermentas pasižymi tuo, kad jo savybės daro ji, labiau tinkamą panaudoti plovikliuose.
2. Fermentinis produktas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad mutantinis proteolitinis fermentas pasižymi didesne plovimo galia skalbimo detergentuose.
3. Fermentinis produktas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad mutantinis proteolitinis fermentas pasižymi didesniu stabilumu laikant skalbimo detergentuose, išsaugodamas plovimo galią.
4. Fermentinis produktas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo,kad mutantinis proteolitinis fermentas pasižymi didesniu stabilumu, kas pasireiškia atspa-rumu oksidantams.
5. Fermentinis produktas pagal bet kuri, iš 1-4 punktų, besiskiriantis tuo, kad mutantinis proteolitinis fermentas yra kilęs iš gamtinės bakte-rinės serino proteazės.
6. Fermentinis produktas pagal bet kuri, iš 1-5 punktų, besiskiriantis tuo, kad nurodytas genas yra kilęs iš laukinio tipo alkalofilinio Bacillus kamieno .
7. Fermentinis produktas pagal bet kuri, iš 1-5 punktų, besiskiriantis tuo, kad nurodytas genas yra kilęs iš laukinio tipo geno, kamieno, atrinkto iš grupės, jungiančios B. subtilis, B. licheniformis ir B. amyloliquefaciens.
8. Fermentinis produktas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad laukinio tipo genas koduoja aminorūgščių seką, kuri mažiausiai 70% yra homologiška PB92 serino proteazės aminorūgščių sekai.
9. Fermentinis produktas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad laukinio tipo genas iš esmės koduoja tokią aminorūgščių seką:
10. Fermentinis produktas pagal 9 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad laukinio tipo genas yra kilęs iš naujos PB92 Bacillus rūšies.
11. Fermentinis produktas, susidedantis iš mutantinio proteolitinio fermento, besiskiriantis tuo, kad pagerintos jo savybės daro ji, labiau tinkamą panaudoti plovikliuose, lyginant su laukinio tipo fermentu; jo aminorūgščių seka iš esmės atitinka PB92 proteazės aminorūgščių seką, turi mažiausiai vienos iš šių aminorūgščių 116, 126,127, 128, 160, 166, 169, 212 ir 216 mutaciją.
12. Fermentinis produktas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad įvykdyta mutacija 116 aminorūgšties vietoje, pakeičiant gliciną aukštesnio molekulinio svorio nepoliarine alifatine aminorūgštimi.
13. Fermentinis produktas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad 126 aminorūgšties mutacija įvykdyta, pakeičiant seriną bet kuria nehidroksilinta aminorūgštimi; 127 aminorūgštį pakeičiant bet kuria ki-ta aminorūgštimi; 128 aminorūgšti, pakeičiant bet kuria kita aminorūgštimi.
14. Fermentinis produktas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad 216 aminorūgšties mutacija įvyksta, pakeičiant metioniną kita tiorūgštimi.
15. Fermentinis produktas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad mutacija prie 160 ami-norūgšties įvyksta, pakeičiant ją glicinu arba anijonine aminorūgštimi.
16. Fermentinis produktas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad mutacija prie 166 amino-rūgšties įvyksta, pakeičiant ją anijonine aminorūgš-timi .
17. Fermentinis produktas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad mutacija prie 169 aminorūgšties įvyksta, pakeičiant ją nepoliarine alifatine aminorūgštimi.
18. Fermentinis produktas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo,kad mutacija prie 212 amino-rūgšties įvyksta, pakeičiant ją anijonine aminorūgš-timi .
19. Fermentinis produktas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad mažiausiai viena mutacija_ įvyks-ta, pakeičiant neutralią aminorūgštį anijonine amino-rūgštimi.
20. Fermentinis produktas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad mažiausiai viena mutacija įvyksta 116 aminorūgšties vietoje, gliciną pakeičiant valinu, izoleicinu arba leicinu.
21. Fermentinis produktas pagal 20 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi mažiausiai vieną papildomą mutaciją 126, 127 ar 128 vietoje.
22. Mutantinis proteolitinis fermentas pagal bet kuri, iš 1-21 punktų, besiskiriantis tuo, kad yra atrinktas iš grupės PB92 serino proteazės mutantų, būtent: [ M216S] ; [ M216Q] ; [ N212D] ; [ S160D] ; [ S160G, N212D] ; [ S160D, M216Q] ; [ S160D, M216S] ; [ A166D, M169I] ; [ G116V, S12 6V, P127E, S128K] ; [ G116V, S126G, P127Q, S128I] ; [ G116V, S126L, P127N, S128V] ; [ G116V, S126L, P127Q, S128A] ; [ G116V, S126V, P127M] ; [ G116V, S126H, P127Y] ; [ G116V, S126R, P127S, S128P] ; [ G116V, S126F, P127Q] ; [ G116V, S126F, P127L, S128T] ; [ S126M, P127A, S128G] ; [ S126M, P127A, S128G, S160D] ir [ G116V, S126N, P127S, S128A, S160D] .
23. Proteolitinio fermento, labiau tinkamo panaudoti plovikliuose, atrankos būdas, besiskiriantis tuo, kad susideda iš stadijų:mutagenezė klonuoto geno, koduojančio dominanti, fer-mentą arba jo fragmentą;gautos mutantinės proteazės išskyrimas, ir identifikavimas mutantinių proteazių su pagerintomis savybėmis panaudojimui plovikliuose.
mutagenezė klonuoto geno, koduojančio dominanti, fer-mentą arba jo fragmentą;gautos mutantinės proteazės išskyrimas, ir identifikavimas mutantinių proteazių su pagerintomis savybėmis panaudojimui plovikliuose.24. Mutantinis genas, koduojantis mutantini, proteolitini, fermentą pagal 1- 22 punktus.
25. Ekspresijos vektorius, turintis mutantini, geną pagal 24 punktą.
26. Prokariotinis kamienas- šeimininkas, transformuotas ekspresijos vektoriaus pagal 25 punktą pagalba.
27. Transformuotas prokariotinis kamienas- šeimininkas pagal 2 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad yra Bacillus.
28. Transformuotas prokariotinis kamienas- šeimininkas pagal 27 punktą, besiskiriantis tuo, kad priklauso alkalofilinei Bacillus rūšiai.
29. Transformuotas prokariotinis kamienas šeimininkas pagal 28 punktą, besiskiriantis tuo, kad yra nauja Bacillus PB92 arba jos mutantas.
30. Transformuotas kamienas- šeimininkas pagal 27 punk-tą, besiskiriantis tuo, kad yra atrinktas iš grupės B. subtilis, B. licheniformis ir B. amyloliquefaciens.
31. Kamienas- šeimininkas pagal bet kuri, iš 26- 30 punk-tų, besiskiriantis tuo, kad iki transformacijos iš esmės nesugeba gaminti neląstelinių pro-teolitinių fermentų.
32. Mutantinio proteolitinio fermento pagal bet kuri, iš 1- 22 punktų gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad apima kamieno- šeimininko, transformuoto ekspresijos vektoriumi, turinčiu mutantini, proteolitini, geną, kultivavimą atitinkamose fermentacijos sąlygose ir pagaminto fermento išskyrimą.
33. Ploviklio kompozicija su fermentiniais priedais, besiskirianti tuo, kad tokiu priedu gali būti vienas ar keli fermentiniai produktai pagal 1-22 punktus.
34. Vieno ar kelių mutantinių proteolitinių fermentų pagal 1- 22 punktus panaudojimas ploviklių kompozici-j ose.
35. Vieno ar kelių mutantinių proteolitinių fermentų pagal 1- 22 punktus panaudojimas skalbimo procese.