[LT] Šis išradimas siūlo žmogaus folikulus stimuliuojančio harmono (FSH) išvalymą nuo poklimaksinio šlapimo gonadotropino, panaudojant imunochromatografiją ir aukšto slėgio atvirkščių fazių skysčių chromatografiją. Gaunamas biologiškai aktyvus hormonas, neturintis liuteinizuojančio hormono (LH) ir kitų šlapimo baltymų priemaišų.
[EN]
[0001] Šis išradimas skirtas iš šlapimo išskirtam folikulus stimuliuojančiam hormonui bei ji turinčioms vaistinėms kompozicij oms.
[0002] Folikulus stimuliuojantis hormonas (FSH) , kaip žinoma, naudojamas gydant nevaisingumą. Ši, hormoną turintys preparatai naudojami išsaugant nėštumą in vivo ir in vitro. Žmogaus FSH išskirtas iš žmogaus hipofizio ir iš poklimaksinio periodo moters šlapimo. Neseniai FSH gautas panaudojant rekombinantinės DNR metodiką.
[0003] Pirmo komercinio preparato, turinčio FSH, sudėtyje buvo (pavyzdžiui, Fergonal® Serono) žmogaus menopauzės gonadotropinas (ZMG), ekstrahuotas iš poklimaksinio šlapi-mo. Tai buvo FSH, liuteinizuo j ančio hormono (LH) bei kitų šlapimo baltymų mišinys. Tiek moksliniams, tiek ir terapiniams tikslams stengtasi gauti išvalytus FSH preparatus. Siuo metu parduodamas produktas Metrodin (Serono) yra iš šlapimo išskirtas FSH preparatas, turintis ir kitų šlapimo baltymų, tačiau LH kiekis jame minimalus, ir jis naudojamas gydant nevaisingumą. Šis produktas ypač naudotinas tais atvejais, kai nepagei-dautina drauge su FSH i,vesti ir egzogenini, LH, pa-vyzdžiui, esant kiaušidžių polikistozės sindromui (KPS).
[0004] Iki šiol gydymo tikslais FSH buvo naudojamas injekcijų raumenis pavidalu. Kadangi šias injekcijas daro gy-dytojai ar kiti profesionalūs medikai, ligoniams tenka lankytis reguliariai chirurgo kabinete ar ligoninėje tam, kad gautų gydymą. Tai sudaro tam tikrus sunkumus. Be to, ligoniai dažnai išreiškia nepasitenkinimą ryšium su tuo, kad gydymas užsitęsia keletą savaičių ar net mėnesių ir visą tą laikotarpi reikia gaišti laiką vais-tinių preparatų įvedimui.
[0005] Poodinės injekcijos suteiktų galimybę ligoniui pačiam susileisti vaistus ir jis pats labiau galėtų dalyvauti gydyme.
[0006] Žmogaus menopauzės gonadotropino (ŽMG) poodinės injekcijos jau aprašytos (Nakamura ir kt., Vaisingumas ir nevaisingumas, 46 (i), p. 46-54, 1985) moters nevaisin-gumo gydymo metu peristaltinio poodinio siurbliuko pagalba pulsuojančiai įvedant ŽMG. Poodines injekcijas gali lydėti vietinės alergijos reakcijos, sukeltos pre-parate esančių priemaišų, ir gali tekti nutraukti gy-dymą .
[0007] P. Ruz ("Žmogaus folikulus stimuliuojantis hormonas", Actą Endocrinologica Supplementum, 131, 1968) aprašė ir apibūdino hipofizio ir šlapimo FSH išgrynintus preparatus, išskirtus atitinkamai iš užšaldytų hipofizių ir poklimaksinio šlapimo koncentrato. Hipofizio FSH biologinis aktyvumas buvo apie 14000 tarptautinių vie-netų/l mg, o šlapimo FSH - 780 tarptautinių vienetų/1 mg. Tikimasi, kad daugumoje aktyvių hipofizio ir šlapimo preparatų LH priemaiša sudaro apytikriai 0,1% masės. Preparato valymui naudojama viena ar daugiau sekančių metodikų, kaip antai chromatografija dietilaminoetil-celiuliozėje, Sefadekso G-100 gel-filtracija, hidrok-silapatitinė chromatografija, elektroforezė poliakrilamido gelyje ir pan.
[0008] Donini ir kt. ("Klimaksinio šlapimo FSH išvalymas ir dalinis fizikocheminis ištyrimas" Gonadotropinai ir kiaušidžių vystymasis, Dviejų darbinių susitikimų me-džiaga, E. ir C. Livingston, Edinburgas ir Londonas, 1970) aprašė vieną iš labiausiai išvalytų FSH pre-paratų, kuris turėjo 1255,6 tarptautinių vienetų/l mg biologini, aktyvumą, o LH priemaiša sudarė iki 3,2 tarp-tautinių vienetų/l mg. Šiam atvejui pradine medžiaga pasitarnavo žmogaus klimaksinis gonadotropinas (ŽKG) preparato Pergonal® pavidalu, kuris, kaip buvo nurodyta aukščiau, yra FSH, LH bei kitų šlapimo baltymų mišinys. Galutinis rezultatas buvo pasiektas periodiškai valant pradinį ŽKG dietilaminoetilceliuliozės kolonėlėje, gel-f i 1truoj ant Sefadekse G-100 ir paskutinėje stadijoje panaudojant preparatyvinę poliakrilamido gelio-elekt-roforezę.
[0009] Dar didesnio efektyvumo pasiekė H. van Heli ir kt.
[0010] ("Žmogaus šlapimo FSH ir LH valymas ir kai kurie ypa-tumai" , Gonadotropinai, I tarptautinio simpoziumo gona-dotropinu klausimu medžiaga, 1971, Uili, Intersaiens, Niujorkas) prie tradicinių chromatografinio valymo me-todų pridėjęs dar papildomas imunochromatografijos ir gel-filtracijos stadijas. Imunochromatografij a atlikta panaudojant pririštus prie Sefarozės antikūnus žmogaus chorioniniam gonadotropinui, tam, kad būtų iš dalinai išvalyto FSH pašalintas LH. Labiausiai išvalytos FSH frakcijos FSH aktyvumas buvo 4720 tarptautinių vie-netų/l mg, o LH aktyvumas tesudarė tik 15 tarptautinių vienetų/l mg, išmatuojant radioimunoanalizės būdu.
[0011] Donini ir kt. aprašė imunochromatograf ini, valymo būdą
[0012] ("FSH ir LH išvalymas ir išskyrimas iš ŽKG", Actą Endocrinologica, 52, p. 186-198, 1966), kuomet dar 1966 m. gavo FSH preparatą, kurio aktyvumas buvo 329,7 tarptautiniai vienetai/l mg ir LH-2,4 tarptautiniai viene-tai/l mg. Kadangi preparato, pasižymėjusio FSH aktyvumu 329,7 tarptautiniai vienetai/l mg, jokia radioimuno-analizė nebuvo daryta, todėl galima prielaida pagal analogiją su H. van Helo rezultatais (žr. iki pat šla-pimo sekrecijos. Cheminė-fizinė diferenciacija parodyta eksperimente, lyginant labai išvalytą FSH, išskirtą iš šlapimo pagal ši, išradimą, su labai išvalytu FSH pre-paratu, išskirtu iš hipofizio.
[0013] Iki- ir po- transliacinės modifikacijos, matyt, ir sudaro FSH mikroheterogeniškumo pagrindą. FSH- tai gli-koproteidas, sudarytas iš dviejų skirtingų glikozilintų nekovalentiškai sujungtų polipeptidinių grandinių, ži-nomų kaip alfa ir beta subvienetai. Beta- subvienetas sąlygoja molekulės biologini, specifiškumą.
[0014] Be visa kita, šis straipsnis bando paaiškinti esmini, skirtumą, stebimą lyginant biologini, aktyvumą/mg labai išvalytų FSH, išskirtų iš šlapimo ir iš hipofizio. Galima prielaida, kad tai sąlygoja angliavandeninės da-lys, o konkrečiai, sialo rūgšties galinės liekanos.
[0015] Tenka pažymėti, kad, nežiūrint to, kad tiek hipofizio FSH, tiek ir šlapimo FSH vadinami "FSH", tačiau nėra tvirto įrodymo, kad šios molekulės, išskirtos iš skir-tingų dviejų šaltinių yra cheminiu požiūriu vienodos ir ekvivalentiškos.
[0016] Šiuo metu žinoma, kad iš poklimaksinio šlapimo koncentrato galima išskirti labai išvalytą žmogaus šlapimo FSH, neturinti, net pėdsakinių kiekių LH ar kitų šlapimo baltymų. Be to, atlikus išskirto pagal ši, išradimą šlapimo FSH aminorūgščių analizę, netikėtai išaiškintas naujas FSH beta- subvienetas, susidedantis iš 111 ami-norūgščių, vietoje 118 ar 108, kaip tai buvo nurodyta anksčiau (žr. pvz., Skotas ir kt. aukščiau) apibūdinant žinomą FSH beta- subvienetą. Šis išradimas siūlo naują FSH beta- subvieneto aminorūgščių seką:
[0017]
[0018] o taip pat naują baltymą, turinti, naują gonadotropino alfa- subvienetą ir beta- subvienetą, susidedantį iš 111 aukščiau išvardintų aminorūgščių. Baltymas pasižymi fo~ likulus stimuliuojančio hormono ( FSH) biologiniu aktyvumu. Jis dažniausiai sutinkamas glikozilintoj e formoje. Jo didžiausias privalumas, kad jis neturi liuteini-zuojančio hormono ir kitų šlapimo baltymų priemaišų pėdsakų.
[0019] Šio išradimo realizacijos kitas variantas yra farmacinė kompozicija, turinti pagal išradimą išvalytą baltymų ir farmaciniu požiūriu tinkamą užpildą. Tinkamiausia jai forma yra poodinės injekcijos. Po oda įšvirkšti šie vaistai nesukelia alerginių reakcijų, būdingų vartojant žinomus FSH preparatus.
[0020] Pagal šio išradimo kitą variantą siūlomas naujo ir labai išvalyto FSH gavimo būdas. Būdas grindžiamas imunovalymo stadijos ir atvirkščių fazių aukšto slėgio skysčių chromatografijos kombinacija. Imunovalymo stadijoje naudojami imobilizuoti monokloniniai antikūnai lygiai taip, kaip tai aprašyta aukščiau paminėto patento (Didžioji Britanija, Nr. 2173803A) paraiškoje, su vieninteliu esminiu skirtumu, kad FSH iš imunokomplekso eliuojamas esant aukštesnėms pH reikšmėms.
[0021] Pagal šiame išradime pateikiamą būdą eliucijai patogu, naudoti vandenini, tirpalą, kurio pH apytikriai 10 ir moliaringumas - apytikriai 0,5. Pateikėjų atlikti eks-perimentai parodė, kad esant tokioms sąlygoms, imobilizuoti antikūnai neinaktyvuojami. Tai prieštarauja aukščiau paminėtos patento paraiškos (Didžioji Britanija) (1 psl., 36-37 eilutės) doktrinai, skelbiančiai "Eliuentų, turinčių tokias aukštas pH reikšmes, panaudojimas praktikoje neįmanomas, kadangi tai sukelia greitą antikūnų inaktyvaciją".
[0022] Ši, skirtumą gali sąlygoti metodų, naudotų antikūno su-rišimui su polimeru, skirtumai.
[0023] Pagal ši, išradimą eliuento geresnis pH aukščiau 11, o geriausias yra intervale nuo 11,3 iki 11,7.
[0024] Moliaringumo reikšmė geresnė daugiau 0, 8 ir geriausia apie 1.
[0025] Pagal išradimą tinkami eliuentai yra amoniakas, dietil-aminas ir tokie buferiai kaip TRIS-buferis, glicinas-NaOH ir pan.
[0026] Sekanti atvirkščių fazių aukšto slėgio skysčių chromatografijos stadija leidžia pašalinti bet kuri, iš prie-maišinių baltymų. Imunovalymo stadijos vienos nepakanka tokiam išvalymui pasiekti. Tai pripažįstama ir Didžio-sios Britanijos patento paraiškos tekste. Panaudota pa-pildoma aukščiau paminėta valymo stadija ne tik efek-tyviai išvalo preparatą nuo priemaišų pėdsakų, bet taip pat išsaugo pilną FSH aktyvumą. Pastarasis rezultatas yra visai netikėtas P. Chalino ir S.A. Chano straipsnio šviesoje (J. Liq. Chromat., 9/13, p, 2855-2868/1986), kuriame skelbiama, kad jaučio FSH ir žmogaus FSH (ŽKG standartas) praranda biologini, aktyvumą atvirkščių fa-zių skysčių chromatografijos metu. Kita vertus, tame pačiame straipsnyje parodomas patenkinamas biologinio aktyvumo atstatymas, tačiau pasiekiamas tik dalinis iš-valymas, kuomet žmogaus šlapimo preparatas, turintis tiek FSH, tiek ir LH, valomas aukščiau nurodytu būdu.
[0027] Po atvirkščių fazių aukšto slėgio skysčių chromatografijos stadijos FSH atstatomas panaudojant gradiento metodikas. Produktą galima liofilizuoti saugojimo ir/ar manipuliavimo tikslu. Produkto koncentracijai, stabili-zacijai ar kitam apdorojimui numatomos kitos tam tikslui tinkamos metodikos.
[0028] Be abejo, poklimaksinis šlapimas yra žymiai prieinames-nė medžiaga negu žmogaus hipofizis. Ši aplinkybė su-teikia šiam išradimui ryškų privalumą.
[0029] FSH-specifinius monokloninius antikūnus, naudojamus pagal ši, išradimą gavimo būdui, galima gauti panaudojant žinomas metodikas.
[0030] Tipišku atveju hibridomos 9/14 linijos ląstelės skri-ninguojamos optimalaus afiniškumo FSH atžvilgiu Kembri-džo Universitete. Ląstelės kultivuojamos ir monokloniniai antikūnai produkuojami i, supernatanto terpę, iš kurios jie išskiriami panaudojant 50% amonio sulfatą
[0031] (skaičiuojant svori, tūriui). Po to naudojama atvirkščių
[0032] fazių joninė chromatografija ir aukšto slėgio skysčių chromatografinė gel- filtracij a ir dializė.
[0033] Ląstelių 9/ 14 linijos produkuojami ir nurodytu aukščiau būdu išvalyti monokloniniai antikūnai atitinka šiuos techninius reikalavimus: a) baltymo švarumas ne mažiau 90% ; b) imunoglobulino klasė: IgG 1;
[0034]
[0035] FSH- specifiniai monokloniniai antikūnai chemiškai suri-šami su Sefaroze 4B panaudojant divinilsulfoną pagal me-todą, kurį aprašė Dž. Poratas " Methods in Enzymology" , 34, p. 13- 30, 1974.
[0036] Tipiškame pavyzdyje 1 litras Sefarozės 4B praplaunamas porėtame stikliniame šviesofiltre iš pradžių 5 litrais distiliuoto vandens, o po to 5' litrais 1 M natrio karbohidrato tirpalo, pH 11. Išplauta sefarozė suspenduojama 1 litre 1 M natrio karbonato tirpalo ( pH 11) . Nuolat maišant, lašais pridedama 200 ml divinilsulfono. Reakcija pabaigiama per 70 min kambario temperatūroje ir nutraukiama pridedant 1 N HC1 tirpalo (pH iki,7,0).
[0037] Aktyvuota smala suspenduojama 1 litre 0,25 M natrio bi-karbonato tirpalo (pH 9,0), turinčio 2g anti-FSH mono-kloninių antikūnų, gaunant didesni negu 90% antikūnų susirišimą su aktyvuota derva. Gauta imunoderva saugoma 4°C temperatūroje. 1 pavyzdyje pateikiamos šio išradimo dvi valymo būdo stadijos, tinkamos komerciniam ŽKH, t.y. Pergonalo® preparato (Serono) aktyviam ingradientui.
[0038] Reikia suprasti, kad nors ŽKH yra geresnė išeitinė me-džiaga šio išradimo būdui, tačiau visa tai tinka ir kitoms mažiau išvalytoms medžiagoms, tokioms kaip poklimaksinio šlapimo koncentratai ir panašioms. Geri rezultatai gauti naudojant kaip išeitinę medžiagą šlapimo koncentratą, turinti, tik 1 tarptautini, vienetą FSH/1 mg.
[0039] Kiti šio išradimo variantai ir privalumai bus akivaiz-dūs susipažinus su sekančiais pavyzdžiais, kuriais iš-radimas neapsiriboja.
[0040] 1 stadija: Imunovalymas panaudojant anti- FSH MoAK- DVS-Sefarozę.
[0041] Imunoderva anti-FSH MoAK-DVS-Sefarozę inkubuojama su 0,1 M Tris-HCL, 0,3 M NaCl buferyje, pH 7,5 4°C tem-peratūroje. Į kolonėlę įvedamas tam tikras FSH kiekis tarptautiniais vienetais (RIA), atitinkantis 80-90% bendros FSH rišančios gebos.
[0042] Laisvi baltymai eliuojami buferiu tol, kol eliuato op-tinis tankis ties 280 nm (OD280) nebus mažiau 0,02.
[0043] Absorbuotas šlapimo FSH eliuojamas iš imunodervos 1 M amoniako tirpalu 4°C temperatūroje. Amoniakiniai eliua-tai, atitinkantys apytikriai 4-kartini, imunodervos tū-rį, yra grupuojami, pH pasiekiamas iki 9,0 kaip galima greičiau 4°C temperatūroje pridedant ledinės acto rūgš-ties. Po to tirpalas ultrafiltruojamas Amikon aparate (membrana C.0.10000 daltonų) ir koncentruojamas iki ma-žo tūrio.
[0044] 2 stadija. Atvirkščių fazių aukšto slėgio chromatografija
[0045] Gauto tirpalo pH privedamas iki 5,6, po to jis įvedamas kolonėlę C18 su atvirkščiomis fazėmis (Pre Pak waters) , kuri prieš tai buvo sulygsvarinta 0,05 M buferiniu amonio acetato tirpalu kambario temperatūroje. Tirpiklio fronto judėjimo greitis - 100 ml/min. Eliua-tas matuojamas ties 280 nm.
[0046] Valymui naudojamas aparatas Prep 500 A (Waters), turintis UV-detektorių ir preparatyvaus gradiento genera-torių .
[0047] Biologiškai aktyvus labai išvalytas šlapimo FSH eliuojamas izopropanolio gradientu iki 50% judrios fazės. Frakcijos tikrinamos panaudojant analitinę gel-chroma-tografiją ir radioimunoanalizę.
[0048] Organinis tirpiklis pašalinamas distiliuojant vakuume 40°C temperatūroje. Po to tirpalas užšaldomas ir liofilizuojamas.
[0049] Pagal ši, išradimą gautą labai išvalytą šlapimo FSH preparatą tiria keliais cheminiais-fiziniais, biologi-niais ir imunologiniais metodais tam, kad gautų jo pilną charakteristiką. Kaip nurodyta žemiau, dauguma tyrimų atlikta lyginant su labai išvalytu FSH prepa-ratu, išskirtu iš hipofizio, gautu pagal žemiau apra-šytą metodą.
[0050] Išeitine medžiaga panaudotas neišvalytas žmogaus hipofizio ekstraktas, gautas kaip pašalinis produktas ekstrahuojant žmogaus augimo hormoną.
[0051] 1)Neišvalyto žmogaus hipofizio ekstrakto pirminis išva-lymas ekstrahuojant 40% etanoliu, turinčiu 6% amonio acetato, pH 5,6, precipituoj ant supernatantą 96% šal-tu etanoliu. 2)Tolimesnis valymas panaudojant joninę chromatografijądietilaminoetilceliuliozėj e su 0,15 M natrio acetato tirpalu, pH 7,0 kaip eliuentu, ir po to precipi-tuojant 96% šaltu etanoliu. 3) FSH frakcijos tolimesnis valymas gel-filtracijos Sefadekse S 100 būdu panaudojant kaip buferi, 0,05 M amonio bikarbonatą. 4) FSH valymo paskutinė SP stadija panaudojant joninę chromatografiją kolonėlėje Sefadeksas S 50. Labai iš-valytas hipofizio FSH eliuojamas 0,1 M fosfatiniu buferiniu tirpalu pH 6,2 ir po to liofilizuojamas.
[0052] Kaip buvo nustatyta, hipofizio FSH biologinis santy-kinis aktyvumas in vivo (Stilmano-Rolei testas; tarp-tautinis vienetas antrojo IRP-NMS) sudaro 4770 tarptau-tinių FSH vienetų 1 mg liofilizuotų miltelių. Šiam nustatymui naudota metodika, aprašyta žemiau po antrašte "Biologinio aktyvumo kiekybinis nustatymas".
[0053] Šis testas atliekamas panaudojant specifinę LH (liutei-nizuojantis hormonas) radioimunoanalizę su LH standarto pagalba, graduoto pagal antrąja, IRP-ZKH P125 f-LH kaip žymėtą atomą, naudojant trigubą KIT (kodas 10204), pagamintą Biodata kompanijos. Kaip antiserumas naudo-tas ožkos anti-ChGH (žmogaus choriono gonadotropinas) antiserumas, kurį gavo pareiškėjas. Šis antiserumas rodė 100% kryžminę reakciją su LH ir mažiau negu 0,1% su FSH.
[0054] Radioimunoanalizės metodas būtinas patikrinant, ar gautas pagal 1 pavyzdi, labai išvalytas šlapimo FSH nėra užterštas liuteinizuojančių hormonu.
[0055] Aukščiau pateikti rezultatai patvirtinti panaudojant kitą jautresni, metodą DELFIA (disociaci j a-pagerinta lautanid-fluoro-imunoanalizė) , kuriam įrangą pateikia firma LKB-Farmacij a.
[0056] Elektroforezė poliakrilamido gelyje su natrio dodecil-sulfatu
[0057] Blokinė elektroforezė plokščiame gelyje su natrio do-decilsulfatu vykdoma redukcinėmis sąlygomis 13,5% poliakrilamido gelyje, pH 8,8 pagal metodą, aprašytą Lemli žurnale Nature, 227, p. 680-685 (1970).
[0058] Dažoma briliantiniu Kumasi mėliu R-250, 0,25% 25% meta-nolio / 75% acto rūgšties.
[0059] Šiuo metodu tiriamas tiek labai išvalyto FSH preparatas, gautas kaip aprašyta aukščiau. Bandymo rezultatai parodyti Fig. 1, kur parodytos tiek šlapimo, tiek hipofizio FSH preparatų juostos drauge su molekulinės masės markeriais (M.M.).
[0060] Abiejuose FSH preparatuose pagrindinė didžioji juosta, būdinga glikoproteidams, sutinkama vienos ir tos pačios molekulinės masės, apytikriai 20000 daltonų, kas atitinka literatūrinius duomenis. Dėl žinomo glikoproteidų elgesio šios elektroforezės sąlygomis gautas dydis yra šiek tiek didesnis nei yra iš tikrųjų.
[0061] Labai išvalyti FSH preparatai, išskirti iš šlapimo ir iš hipofizio, analizuojami kolonėlėje TKG 2000 SW naudojant 0,1 M buferini, fosfatini, tirpalą, pH 6,8, + 0,2 M NaCl kaip eliuentą. Tirpiklio fronto judėjimo greitis 0,7 ml/min, matuojama ties 230 nm.
[0062] Fig. 2 pateikiami duomenys, kurie rodo įprastus pagrin-dinius šlapimo ir hipofizio FSH pikus, kurių laikai panašūs (atitinkamai 13,37 ir 13,35 min).
[0063] Izoelektrofokusavimas atliekamas 5% plonasluoksniame poliakrilamidmiame gelyje (Anfolin, LKB , pH 3,5-9,5), fiksuojama 11,5% (masės) trichloracto rūgštimi ir 3,5%
[0064] (masės) sulfosalicilo rūgštimi, dažoma sidabru iš BIO-(f)
[0065] Fig. 3 pateikti duomenys apie labai išvalytus FSH preparatus, išskirtus iš šlapimo ir hipofizio, įskaitant ir izoelektrinio taško markerius. Kaip matyti iš pa-veikslėlio, abu preparatai rodo keletą juostų, tačiau jų piešinys skiriasi. Šlapimo FSH pagrindinės juostos yra pH intervale mažiau kaip 4,8, kai tuo tarpu hipofizio FSH pagrindinės juostos pasireiškia aukštesniame pH intervale.
[0066] Šie bandymai rodo, kad šlapimo ir hipofizio FSH nėra identiškos molekulės ir kad jų skirtumus sąlygoja ang-liavandeninių, o gal ir pačių baltyminių dalių skirtumai .
[0067] Labai išvalyto šlapimo FSH preparato biologini, aktyvumą in vivo nustato Stilmano- Rolėj metodu (Endokrinolo-gija, 53, p. 604-616, 1953) naudodami kaip etaloną ŽKH-Haus etaloną, graduotą pagal 2-ąj į Tarptautini, Etalo-nini, Preparatą ŽKH, skirtą biologinio aktyvumo kieky-biniam nustatymui. Šią analizę priėmė visos pagrindinės Farmakopėjos ir Tarptautinių Vienetų nustatymo Svei-katos apsaugos Tarnybos FSH biologinio aktyvumo nustatymui .
[0068] Nustatyta, kad labai išvalytas šlapimo FSH preparatas, gautas pagal aukščiau pateiktą pavyzdi,, pasižymi santykiniu aktyvumu lygiu 6200 T.V. FSH/1 mg liofilizuotų miltelių, tai didžiausias kada nors aprašytas iš šla-pimo išskirto FSH aktyvumas.
[0069] Šlapimo FSH subvienetai išskiriami panaudojant aukšto
[0070] slėgio skysčių chromatografijos sistemą Waters, turin-čią kolonėlę Akvapor RP-300, 200 x 4,6 nm, 7 j^m (Braunli Lebs) . Eliuentai sekantys: A=0,1% TFA (tri-fluoracto rūgštis, Iners), B=0,055% TFA acetonitrile. Tirpiklio fronto judėjimo greitis - 1 ml/min prie 35°C. Pradinis režimas - 15% B. Per 20 min gradientas pa-didinamas 40% B. UV-detektorius dirba ties 229 nm. Įve-dama analizinė serija - 20 ^1 0,5 mg/ml FSH tirpalo ir 0,5% TFA. Pradinė inkubacija TFA tirpale nebūtina. Preparatyviai išskiriama toje pačioje kolonėlėje. Gau-nama gera skiriamoji geba, kuomet įvedama 0,5 mg labai išvalyto žmogaus šlapimo FSH (serija Nr. 032), iš-tirpinto A buferyje. Frakcijos renkamos rankiniu būdu ir džiovinamos koncentratoriuj e Spid Vak. Subvienetai ištirpinami vandenyje, analizuojami aukšto slėgio skys-čių chromatografija ir saugomi minus 20°C tempera-tūroje .
[0071] Beta-subvienetas eliuojamas apytikriai po 10,5 min kaip platus pikas, alfa-subvienetas eliuojamas per 15 min kaip smailus pikas. Kiekvienas pikas identifikuojamas kaip alfa- ir beta-subvienetas radioimuninės analizės būdu. Paprastai redukuojama apie 50% subvieneto, kai tuo tarpu alfa-subvieneto redukuojama daugiau kaip 90%.
[0072] b) Alfa- ir beta-subvienetų redukavimas ir karboksi-metilinimam
[0073] Išskirtų, kaip aprašyta a) dalyje, subvienetų-redukavimas atliekamas panaudojant 0,5% Tris; 0,1% EDTA, 6 M guanidin-HCl, pH 8,5 2 vai bėgyje 37°C temperatūroje pridėjus DTT (ditiotreitolio, Servą) 15-kartų didesniu moliaringumu negu cisteino. Po to i, reakcijos mišinį pridedama natrio jodacetato (2,1 moliaringumo negu DTT) ir paliekama 30 min tamsoje. Reakcija sustabdoma pri-dėjus 1% merkaptoetanolio it TFA. Karboksimetilintus subvienetus valo aukšto slėgio skysčių chromatografija. Beta-karboksimetilintas subvienetas blogai tirpsta vandenyje, todėl galutinė išeiga nereikšminga. c) Beta-subvieneto redukavimas, piridiletilinimas ir poveikis tripsinu.
[0074] Išskirto kaip aprašyta a) dalyje, beta-subvieneto redukavimas atliekamas kambario temperatūroje 2 vai bėgyje šiuo būdu: 0,1 mg beta-subvieneto inkubuojama su 0,5 ml 0,5 M Tris tirpalo, 0,1% EDTA, 6 M guanidin-HCL, pH 8,5, 2,7 mg ditiotreitolio. Piridiletilinama pridė-jus 0,02 ml 4-vinilpiridino prie aukščiau paminėto tirpalo. Reakcija vyksta 2 vai kambario temperatūroje. Pagaliau, reakcijos mišinys patalpinamas i, S4-patroną
[0075] (Beiker), su 0,1% TFA. Patronas praplaunamas 0,1% TFA ir piridiletilintas beta-subvienetas eliuojamas 40% acetonitrilu, 0,1% TFA. Eliuotos frakcijos džiovinamos ir valomos aukšto slėgio skysčiu chromatografija kaip tai aprašyta aukščiau. Išvalytas piridiletilintas beta-subvienetas ištirpinamas 1% NH4HC03 tirpale, pH 8.
[0076] Alfa-subvieneto, karboksimetilinto alfa-subvieneto arba
[0077] viso labai išvalyto šlapimo FSH sekvenavimas (amino-rūgščių liekanų sekos nustatymas) atliekamas panardi-nant 5 nmolių ar mažiau į baltymini, sekvenseri, (470 A, Eplaid Biosistem) ir panaudojant standartinę programą 03PRTH, pateiktą Eplaid Biosistem, arba specialią prog-ramą, kurioje ciklai, skaldantys P o arba Cly, pakeisti specialiu ciklu 03CPPO.
[0078] Pradedant nuo molekulės NH2 galo identifikuojama pirmos 45 liekanos, šie rezultatai patvirtina seką, žinomą iš literatūros ( J. Biol. Chem., 250, p, 6735/ 1975). Asn 52 padėtyje ir 78 padėtyje žinomoje sekoje prasidedančioje Ala, ir yra tos aminorūgštys, kur vyksta glikozilinimas. NH2 gale visada yra nevienodumas ir jis visada toks pats visuose sekvenuotuose mėginiuose. Visa mole-kulė ( t. y. prasidedanti Ala) būna 65% grandinių, mo-lekulė, neturinti pirmųjų dviejų aminorūgščių ( t. y. prasidedanti Asp), pasitaiko 5% molekulių, o neturinti pirmųjų trijų aminorūgščių ( t. y. prasidedanti Vai) pasitaiko 30% atvejų.
[0079] Atliekamos kelios sekvenavimo serijos, panaudojant be-ta- subvienetus, karboksimetilintus beta- subvienetus, visą labai išvalytą žmogaus šlapimo FSH ir piridil-etilinto beta- subvieneto tripsinizuotus peptidus. Mė-giniai panardinami i, baltymų sekvenseri, ( 470 A9 Eplaid Biosistem) ir panaudojama programa 03PPTH, pateikta Eplaid Biosistem. Duomenys rodo, kad šis subvienetas turi 111 aminorūgščių ilgi, ir sekančią seką:
[0080] Asn 7 ir 24 padėtyje, pradedant nuo Asn 1 padėtyje, yra tos aminorūgštys, kur vyksta glikozilinimas.
[0081] Beta-subvieneto NH2 gale visada yra nevienodumas, kuris vienodas visuose sekvenuotuose mėginiuose. Pilna mole-kulė (t.y. prasidedanti nuo Asn) pasitaiko 35% gran-dinių, molekulė, neturinti pirmos aminorūgšties (t.y. prasidedanti Ser) pasitaiko 15%, o molekulė, neturinti pirmųjų dviejų aminorūgščių (t.y. prasidedanti Cys) pasitaiko 50% .
[0082] Beta-subvieneto nevienodumas.
[0083] Farmacinių vaisto formų, turinčių labai išvalytą šla-pimo FSH, gautą pagal ši, išradimą, gavimas nesudaro sunkumų. Kadangi medžiaga išlaiko savo biologini, ak-tyvumą po liofilizacijos, pastaroji talkina gaunant formą, tinkamą injekuojamiems preparatams.
[0084] Liofilizuotas preparatas, turintis labai išvalytą šla-pimo FSH, tirpinamas fiziologiniame tirpale ir/ar ki-tokiame tinkamame skiediklyje ir gaunamas švirkščiamas tirpalas.
[0085] Kai kurie užpildai gali būti panaudoti kompozicijoje kaip jos dalis, pavyzdžiui, manitas, laktozė, glicinas, gliukozė, sacharozė ir jų mišiniai. Galima naudoti ir kitus tradicinius užpildus ar jų mišinius.
[0086] Bandymuose, atliktuose pagal išradimą, švirkščiamiems preparatams kaip užpildas panaudota laktozė.
[0087] Gaminant injekcinius preparatus, pasirinktinai gali keisti pH iki tam tikros reikšmės, pridedant tradicinių rūgštinių ar šarminių medžiagų. Kaip rūgštinė medžiaga gali būti naudojama acto rūgštis ir pan. Iš šarminių medžiagų naudojamas natrio šarmas ir pan. Galima naudoti mišinius.
[0088] Šio išradimo rėmuose galima panaudoti vieną ar daugiau stabilizatorių, pavyzdžiui, albuminą ir pan.
[0089] 20000 ampulių, kurių kiekviena turi 75 tarptautinių vienetų FSH, partijos vaistų gamybos pavyzdys atrodo sekančiai: Liofilizuotų FSH miltelių paskaičiuotas kiekis (biologinio aktyvumo vienetais) ištirpinamas 700 ml šalto
[0090] apirogeninio vandens, skirto injekcijoms. Jeigu reika-linga, pH pasiekiamas intervale nuo 6,2 iki 6,8 tam tikslui panaudojant acto rūgšti, ar natrio šarmą. Po to tirpalas sterilinamas filtruojant per filtrą, kurio po-ros 0,2 |xm dydžio.
[0091] 200 g laktozės ištirpinama 2 litruose apirogeninio vandens, skirto injekcijoms, sterilizuoja kaip aprašyta aukščiau ir prideda prie FSH tirpalo.
[0092] Apirogeninis vanduo injekcijoms pridedamas tam, kad bū-tų pasiektas galutinis 15 litrų tūris. Po to tirpalas išpilstomas i, ampules (po 0,75 ml kiekviena) ir liofi-lizuojama steriliame liofilizatoriuje. Gaunamos ampu-lės, kurių kiekviena turi po 75 tarptautinius vienetus FSH ir 10 mg laktozės.
[0093] Geresniame variante kiekviena ampulė gali turėti 150 tarptautinių vienetų FSH ir 10 mg laktozės.
[0094] Pagal kitą vaistinio preparato pavyzdį gaunamos am-pulės, turinčios be laktozės kaip užpildo dar po 1 mg albumino kaip stabilizatoriaus.
[0095] Nors šis išradimas iliustruojamas specifiniais pavyz-džiais reikia suprasti, kad įvairūs variantai gali būti papildomai realizuoti šio išradimo apimties ir esmės ribose.
IŠRADIMO APIBRĖŽTIS1. Baltymas, turintis alfa- ir beta-subvienetus, kurio alfa-subvienetas yra gonadotropino alfa-subvienetas ir beta-subvienetas turi sekančią aminorūgščių seką: