[LT] Trigliceridų nustatymo būdas remiasi trigliceridų (neutralių riebalų) koncentracijos nustatymu, matuojant elektrocheminius parametrus ir gali būti naudojamas medicinoje. Metodas paremtas trigliceridųhidrolizės, katalizuojamos lipazės reakcija, kurios produktas glicerolis, veikiamas imobilizuotiems į lavsaninę membraną fermentams glicerokinazei ir glicerofosfotooksidazei buferiniame tirpale, turinčiame magnio chlorido ir adenozintrifosfato, fosforilinamas ir vėliau oksiduojamas, išsiskiriant vandenilio peroksidui.
[EN]
[0001] Išradimas priskiriamas medžiagų analizei fermentų pagalba, kurios metu nustatomi elektrocheminiai parametrai. Konkrečiai išradimas susietas su trigliceridų - neutralių riebalų koncentracijos analizės būdo patobulinimui. Šis išradimas gali būti naudojamas medicinoje diagnostikos tikslams ( pvz., esant nefrotiniam sindromui arba kitiems susirgimams, kai stebimas trigliceridų kiekio padidėjimas) / Cnpano'JHHK. JlaSopaTOpHbie mctoam HccneAOBaHUH b KJiHHHKe.n.p. B.B. MeHbiiiHKOBa. 1987, c. 246 - 247 / .
[0002] ir trijų riebiųjų rūgščių liekanų. Tiksli riebiųjų rūgščių liekanų sudėtis gamtiniuose riebaluose gali svyruoti tam tikrose ribose. Todėl, esantys trigliceridų analizės būdai pagrįsti glicerolio nustatymu, t. y. gautas trigliceridų kiekis išreiškiamas ne cheminės medžiagos svorio vienetais, bet trigliceridų molekulių skaičius randamas pagal šarminės ar fermentinės hidrolizės būdu atskelto glicerolio kiekį.
[0003]
[0004] Į matavimo gardelę įnešami fermentai, substratai ir analizuojamas pavyzdys, todėl kiekvienam pamatavimui sunaudojamas tam tikras fermentų kiekis.
[0005] Metodo trūkumas tas, kad analizę būtina atlikti skaidrioje terpėje, o taip pat sunaudojamas didelis brangiai kainuojančių fermentų kiekis.
[0006] Technologiniu požiūriu artimiausias yra fermentinis būdas, kuriame fermentu lipaze atskeltas glicerolis nustatomas pagal susidariusio NADH kiekį, naudojant platinos anodą, poliarografiškai / Anai. Letters, 1987, v. 20, Nr. 5, p. 783 - 790 /.
[0007] Į matavimo gardelę įnešama lipazė ir buferiniame tirpale ištirpintas analizuojamasis pavyzdys, o glicerodehidrogenazė imobilizuojama į pusiau pralaidžią halogeninę membraną, įdedamas NAD+ (nikotinamidadenindinukleotidas) ir pagal anodinės srovės padidėjimą nustatoma redukuoto NADH koncentracija, kuri proporcinga glicerolio ir, tuo pačiu, trigliceridų kiekiui.
[0008] Šis metodas yra pakankamai sudėtingas ir nepasižymi dideliu tikslumu nustatant trigliceridus biologiniuose skysčiuose, taip pat analizės metu pastoviai įnešamas NAD+, labai brangus daugelio fermentų kofermentas, o trigliceridai nustatomi iš redukuoto kofermento NAD-H kiekio.
[0009] Būdo esmė atskleidžiama šia schema. Trigliceridus hidrolizuoja fermentas lipazė iki glicerolio, kuris paveikus imobilizuotais į pusiau pralaidžią membraną glicerokinazės ir glicerofosfatoksidazės fermentais, dalyvaujant ATP ( adenozintrifosfatui) buferiniame tirpale, fosforilinamas ir toliau oksiduojamas. Dėl to susidaro H202, kurio koncentracija proporcinga trigliceridų kiekiui analizuojamame pavyzdyje, ir gali būti nustatyta iš anodinės srovės padidėjimo oksiduojantis H2O2, esant anodo potencialui + 0,6 V:
[0010] Analizė atliekama naudojant elektrocheminį vandenilio peroksido daviklį, sudarytą iš platininio anodo, padengto fermentine mikroporine lavsano membrana su imobilizuotais glicerokinazės ir glicerofosfatoksidazės fermentais, ir iš palyginamojo Ag/AgCl elektrodo. Į matavimo gardelę įnešama lipazė ir tiriamasis pavyzdys, ištirpintas buferiniame tirpale, kurio sudėtyje yra ATP ir MgCl2. Toliau vykdomi anodinės srovės matavimai iš kurių išskaičiuojama trigliceridų koncentracija.
[0011] Fermentinė membrana gaminama šiuo būdu: 0,5 ml 0,01 M fosfatinio buferio ( pH 7,2 ) ištirpinama 2,5 vnt. glicerokinazės, 3 vnt. glicerofosfatoksidazės ir 1,5 mg jaučio kraujo serumo albumino. Į gautą tirpalą dedama 10 ml 5 % glutaro aldehido ir tirpalas pilamas ant 4 cm2 mikroporinės lavsaninės membranos, kuri uždengiama acetilinta celiuliozės membrana.
[0012] Poliarografinis daviklis su fermentine membrana, kurioje imobilizuoti fermentai, įstatomas į 1 ml tūrio gardelę su 3 mM ATP ir 3 mM MgCk buferiniame tirpale ir nustatoma foninė elektrodo srovė. Į gardelę įnešama 0,1 ml alyvų aliejaus suspensijos fosfatiniame buferiniame tirpale ( 0,01 M, pH 7,2 ), ir 5 vnt. lipazės. Po 30 min. inkubacijos nustatoma stacionari elektrodo srovė. Tyrimų rezultatai parodyti 1 lentelėje ir, atitinkamai, 1 kalibraciniame grafike. Trigliceridų koncentracija alyvų aliejuje išskaičiuojama atsižvelgiant į enciklopedijos /XHMnqecKHH aHijBiaioneflHiecKHH cnoBapb. 1983, c. 407 / duomenis, kad 80 % alyvų aliejaus sudaro trigliceridai (daugiausia trioleatgliceridai, M = 885).
[0013] Kaip matyti iš 1 lentelės ( 1 kalibracinis grafikas ), tiesinė elektrodo srovės priklausomybė tiesiog proporcinga trigliceridų koncentracijai iki 1,5 mM
[0014] Membraną su imobilizuotais fermentais galima naudoti ilgiau kaip dvi savaites, o saugant ją šaldytuve - iki 6 mėnesių.
[0015] Tiesinė elektrodo srovės priklausomybė taip pat proporcinga kitų medžiagų koncentracijai, t. y. glicerolio ir ATP, susidarančioms reakcijų metu. Tai patvirtina 2 ir 3 pavyzdžiai.
[0016] Fermentinis elektrodas ir gardelė ruošiami pagal I pavyzdį. Į gardelę pilamas buferis su ištirpintais jame 3 mM ATP bei 3 mM MgC^ ir nustatoma foninė elektrodo srovė. Į kiuvetę įnešamas buferinis glicerolio tirpalas ir nustatoma stacionari elektrodo srovė. Rezultatai parodyti 2 lentelėje ir, atitinkamai, II kalibraciniame grafike.
[0017] Kaip matyti iš 2 lentelės, tiesinė elektrodo srovės priklausomybė proporcinga glicerolio koncentracijai iki 0,3 mM.
[0018] Fermentinis elektrodas ir gardelė ruošiami pagal I pavyzdį. Į gardelę pilamas buferis, kuriame yra 3 mM MgC^ bei 2 mM glicerolio ir nustatoma foninė elektrodo srovė. Tada į gardelę įnešamas ATP tirpalas ir nustatoma stacionari elektrodo srovė. Rezultatai parodyti 3 lentelėje ir, atitinkamai, III kalibraciniame grafike.
[0019] Kaip matyti iš duomenų, tiesinė stacionarinės elektrodo srovės priklausomybė nuo ATP koncentracijos, tiesiog proporcinga ATP koncentracijai iki 1,5 mM.
[0020] Šio elektrocheminio trigliceridų nustatymo būdo privalumas tas, kad nereikia nuolat į tirpalus įnešinėti brangiai kainuojančio NAD+ ir nustatinėti trigliceridų pagal
[0021] NADH oksidacijos - redukcijos reakciją. Visos NAD - priklausomos dehidrogenazinės sistemos, esančios tiriamose biologinėse terpėse, analizės eigai nemaišys. Metodas yra žymiai tikslesnis ir greitesnis.
Trigliceridų nustatymo būdas, pagrįstas tuo, kad analizuojamąjį pavyzdį su fermentu lipaze įneša į elektrocheminę gardelę, užpildytą buferiniu tirpalu ir turinčią daviklį, kuris sudarytas iš platininio anodo su pusiau pralaidžia fermentine membrana, po to matuoja anodinę srovę, pagal kurios padidėjimą nustato trigliceridų koncentraciją, besiskiriantis tuo, kad į buferinį tirpalą papildomai įneša adenozintrifosfatą ( ATP ) ir MgCl2, o platininį anodą padengia lavsanine membrana su imobilizuotais glicerokinazės ir glicerofosfatoksidazės fermentais.