[LT] Siūlomas išradimas priskiriamas medžiagų analizės ir tyrimo sričiai, kurių metu nustatomi elektrocheminiai parametrai, būtent, įrenginiui ir būdui, skirtiems disacharidų koncentracijos biologiniuose skysčiuose ir maisto produktuose nustatymui.@Išradimo tikslas - disacharidų koncentracijos nustatymo tikslumo pagerinimas, pasiekiamas elektrocheminėje gardelėje be disacharidinio elektrodo, panaudojant papildomą gliukozės elektrodą, elektroninis blokas papildytas kompleksinio signalo apdirbimo ir komutacijos blokais.
[EN]
[0001] Išradimas priskiriamas medžiagų tyrimui ir analizei, nustatant elektrocheminius parametrus, būtent, būdams ir analitiniams įrenginiams, skirtiems disacharidų koncentracijos nustatymui ir gali būti naudojamas biologijos ir maisto pramonės produktų analizei.
[0002] Šiuo metu disacharidų nustatymas labai svarbus įvai-riose biologijos pramonės srityje, analizuojant biolo-ginių substratų sudėti,. Pavyzdžiui, laktozės nustatymas pieno produktuose yra reikšmingas pieno kokybės kont-rolės rodiklis. Ypatingą reikšmę jis įgauna gaminant pieno mišinius vaikams ir laktozės gamyboje iš atliekų. Visais šiais atvejais gliukozės priemaiša apsunkina laktozės nustatymą ir sumažina atliekamų analizių tiks-lumą /Tenejib A., Xhmh*i h <į)H3HKa MOJiOKa. -M.: IlHmeBafl npo-MblUIJieHHOCTb, 197 9/.
[0003] Mikrobiologiškai hidrolizuoj ant medieną tarp šalutinių produktų gaunama celiuliozė /Ehoxhmh5I, 1984, T. 49, N° 7, c. 1110-1120/. Celiuliozės nustatymas tarp medienos hidro-lizės produktų - svarbus technologijos rodiklis, tačiau jo nustatymą ir čia apsunkina gliukozė.
[0004] Žinomas elektrocheminis sacharozės koncentracijos nustatymo būdas vandens tirpaluose, esant gliukozės ir/arba fruktozės priemaišai /Paraiška Nr. 3224461 Vokietijos patentui/. Išradimas pagrįstas tuo, kad nustatant sacharozės koncentraciją vandeninis jos tirpalas inventuoj amas, po to šarminėje terpėje elektro-chemiškai oksiduojamas, esant 650 mV (500-800 mV intervale) potencialui Ag/AgCl palyginimo elektrodo atžvil-giu. Oksidacijos srovė palyginama su pradinio sacha-rozės tirpalo elektrocheminės oksidacijos srove.
[0005] Šio būdo trūkumas - blogas selektyvumas gliukozės at-žvilgiu, nes minėtame 500-800 mV potencialo intervale oksiduojasi daug kitų biologinėse terpėse dažnai su-
[0006] tinkamų junginių: askorbininė rūgštis, purino- piri-dininės bazės, biogeniniai aminai ir kt. /- BHOaMnepO-MerpHfl. Bhjibhioc, 1986, c. 9/.
[0007] Žinomi fermentiniai metodai ir prietaisai, kuriuos naudojant pagerėja analizės selektyvumas.
[0008] Žinomas būdas skirtas laktozės nustatymui ir prietaisas jo realizavimui / Lactose analysis specification sheet YSI Model- 27. - Yellow Springs Instrument Company 1984/, kuriame panaudotas elektrocheminis daviklis, susidedantis iš platininio anodo, padengto atskiriančia, fermentine ir makroporine membranomis, ir palyginimo elektrodo. Fermentinėje membranoje imobilizuota galak-tozooksidazė paverčia laktozę i, atitinkamą dialdehidą ir vandenilio peroksidą, kuris daviklio paviršiuje oksiduojasi iki deguonies ir generuoja anodinę srovę. Daviklio srovės priklausomybė nuo laktozės koncentracijos - hiperbolinė. Mažesnei 1 mM laktozės koncentracijai šią priklausomybę galima laikyti tiesine.
[0009] Metodo trūkumai - siauras galutinio produkto koncentracijos nustatymo diapazonas ir blogas selektyvumas laktozės atžvilgiu, nes fermentinėje membranoje naudo-jama galaktooksidazė katalizuoja ir kitų substratais esančių angliavandenių ( D- talozės, galaktozės, melibio-zės, rafinozės ir t. t.) oksidaciją /- Anai. Chem., v. 49, Nr. 6, 1977/.
[0010] Žinomas fermentinis gliukozės elektrodas ir analizės būdas, skirtas gliukozės, sacharozės ir laktozės nustatymui švariuose ir realiuose mikrobiologiniuose tirpaluose /-) KAhX, t. 36, 1980, bhii. 6, c. 1168- 1173/. Fermentinį elektrodą sudaro platininis anodas ir Ag/ AgCl palyginimo elektrodas. Anodas padengtas trimis membranomis: triacetatceliuliozine, fermentine ( imobilizuotas fermentas - gliukozooksidazė) ir mikroporine lavsanine.
[0011] Iš pradžių tiriamoje terpėje nustatoma gliukozės koncentracija, po to 0,5-10,7 min. 70°C temperatūroje atliekama rūgštinė sacharozės hidrolizė ir poliaro-grafiškai nustatomas susidariusios gliukozės kiekis. Disacharidų koncentracija nustatoma pagal kalibracinį grafiką, sudarytą hidrolizuojant žinomas cukrų koncent-racijas .
[0012] Metodo trūkumas yra tas, kad, nežiūrint gero membranos selektyvumo, elektrodas reaguoja į daugeli, realiuose biologiniuose tirpaluose esančių medžiagų, todėl reikia iš anksto nustatyti liekamosios srovės dydi,.
[0013] Prototipu pasirinktas - ekspres-analizatorius elektro-cheminiam laktozės nustatymui ir analizės būdas, naudojant ši, prietaisą /KypTHHaHTeHe B.C., JlaypHHaBiraoc B.A. "3Kcnpecc aHajiroaTop onpe^eJieHH^ jiaKT03Li". -Mojioraaa u MflCHaa npoMBiinjieHHOCTL. 1990, No 5, c. 30-32; A.c. CCCP N° 1502995, kji . GOIN 27/30, 1987/. Įrenginio schema pateikta fig. 1. Įrenginį sudaro laktozės daviklis 1, kuri, sudaro elektrocheminė 1 cm3 tūrio gardelė 2 ir i, jos sienelę įmontuotas laktozės elektrodas 3. Gardelėje yra kiaurymė 4 tiriamojo tirpalo įvedimui. Tam naudojamas pipetinis dozatorius 5. Tirpalą gardelėje maišo magnetinė maišyklė 10, kurią suka pritvirtintas prie elektrinio variklio ašies 12 besisukantis magnetas 11. Elektrocheminę gardelę praplauna persistaltinis siurblys 18. Tam buferinis tirpalas 15 vamzdeliu 17 tiekiamas į gardelę ir išsiurbiamas vamzdeliu 19 į naudoto skysčio surinkimo talpą 16. Siurblį valdo blokas 14 maitinamas šaltinio 13.
[0014] Daviklio signalas patenka į keitiklį, matuojamą srovę paverčiantį jai proporcinga įtampa 9, į jautrumo derinimo įrenginį 8 ir per analoginį-skaitmeninį keitiklį 7 - į skaitmeninį tablo 6.
[0015] Laktozės nustatymo būdas grindžiamas daviklio fermen-tinėje membranoje vykstančiu katalitiniu laktozės ski-limu :
[0016] Oksiduojant H202 ant Pt elektrodo atsirandanti elektrodo anodinė srovė tam tikrame laktozės koncentracijų intervale tiesiai proporcinga laktozės koncentracijai (žiūr. fig. 3).
[0017] Analizės būdo ir prietaiso jo realizavimui trūkumas - blogas selektyvumas laktozės atžvilgiu, mažinantis lak-tozės nustatymo tikslumą, esant gliukozės priemaišai.
[0018] Išradimo tikslas - pagerinti disacharidų nustatymo būdo selektyvumą angliavandenilių mišiniuose.
[0019] Tikslas pasiektas sukuriant įrenginį (fig. 2), kuriame panaudotas disacharidų daviklis 1, susidedantis iš 1 mltr tūrio elektrocheminės gardelės 2, kurios sie-nelėje, skirtingai nuo prototipo, įmontuoti du davik-liai: disacharidų 3 ir gliukozės 20. Detaliau tai paro-dyta daviklio pjūvyje A-A (2a pav.). Gardelės dugne įmontuotas bendras abiems (gliukozės ir disacharidų) elektrodams pagalbinis elektrodas 21. Bendras taip pat yra ir Ag/AgCl palyginimo elektrodas, esantis viename iš elektrodų (brėžinyje neparodytas). Gardelėje yra kiaurymė 4 mėginio įvedimui pipetiniu dozatoriumi 5. Tiriamąjį skystį maišo magnetinė maišyklė 10, kurią suka pritvirtintas prie variklio ašies 12 magnetas 11. Elektrocheminę gardelę praplauna peristaltinis siurblys 18. Tuo tikslu buferinis tirpalas 15 vamzdeliu tiekiamas i gardelę ir išsiurbiamas vamzdeliu 19 į naudoto skysčio surinktuvą 16. Siurblį komutuoja val-dymo blokas 14 maitinamas šaltinio 13.
[0020] Keitiklis 22 gliukozės elektrodo srovės signalą verčia proporcingu įtampos signalu, kuris patenka i, jautrumo derinimo įrenginį 23 ir per komutatorių 24 ir ana-loginį-skaitmeninį keitiklį 7 į skaitmeninį tablo 6.
[0021] Disacharidų elektrodo srovės signalą keitiklis 9 verčia jam proporcinga įtampa. Abiejų elektrodų signalai patenka į kompleksinio apdirbimo bloką 25, jautrumo derinimo įrenginį 8 ir per komutatorių 24 ir analoginį-skaitmeninį keitiklį 7 - į skaitmeninį tablo 6.
[0022] Ant disacharidų elektrodo vyksta šie procesai:
[0023] Išradime pateikiamas disacharidų nustatymo būdas rea-lizuojamas naudojant aprašytą įrenginį. Disacharidų koncentracijos nustatymo selektyvumas pasiekiamas dėl to, kad įvedamas papildomas elektrodas substrate esan-čios gliukozės koncentracijos nustatymui, o taip pat naudojamas kompleksinis signalų apdirbimo blokas, kuriame iš suminio disacharidų elektrodo signalo atimamas sunormuotas pagal elektrodų jautrumų gliukozei santykį gliukozės elektrodo signalas. Disacharidų nustatymo bū-do bei įrenginio jo realizavimui veikimą iliustruoja 1-5 pavyzdžiai. 1 pavyzdys. Laktozės nustatymas buferiniuose tirpaluose su gliukozės ir laktozės mišiniu.
[0024] Nustatant siūlomu įrenginiu pirmiausia surenkamas daviklis. Laktozei ir gliukozei jautrūs elektrodai gami-nami pagal metodiką. Sumontuojama matavimo gardelė
[0025] (fig. 2a). Praplovimo sistema ir gardelė užpildoma 0,01 M pH 6,5 fosfatiniu buferiu, i, kuri, įeina ir 0,1 M K C1 /- BuoaMnepoMeipira. Bhjibhioc, 1986, c. 9/.
[0026] Reagentų paruošimas. Tokiame pačiame buferiniame tirpale ruošiami ir matavimo tirpalai - 2-30 mM laktozės tirpalai (pagal tikslius laktozės svėrimus) su įvai-riomis (nuo 0 iki 30 mM) gliukozės priemaišomis, taip pat 10 mM gliukozės tirpalas ir 10 mM laktozės tirpalas, skirti įrenginio kalibravimui.
[0027] Įrenginio kalibravimas. Kalibravimui į gardelę įvedama 0,05 mltr 10 mM laktozės kalibravimo tirpalo. Jautrumo derinimo įrenginiu (2a pav. 8 pvz.) skaitmeniniame tablo nustatomas parodymas "10,0". Peristaltinis siurblys išplauna gardelę (18 pvz. 2) buferiniu tirpalu. Skaitmeniniame tablo nustatoma nulinė reikšmė ir įvedama 0,05 mltr gliukozės kalibravimo tirpalo dozė. Kompleksinio signalo apdirbimo bloke iškompensuojami gliu-kozės ir laktozės daviklių signalai. Praplaunama gar-delė .
[0028] Matavimas. Analizuojamo laktozės arba laktozės ir gliukozės mišinio mėgininio 0,05 mltr dozė dozatoriumi įvedama į gardelę. Skaitmeninio tablo parodymas ati-tinka laktozės koncentraciją mėginyje išreikštą mM. Po praplovimo. įvedamas naujas mėginys.
[0029] Laktozės koncentracijos matavimo rezultatai pateikti 1 lentelėje.
[0030] Rezultatai rodo, kad pateikto įrenginio parodymai tie-siškai priklauso nuo laktozės koncentracijos tiek ne-sant gliukozės (1 skiltis), tiek su 2-30 mM gliukozės priemaiša (2-5 skiltys). Esant mėginio tūriui 0,05 mltr tiesinės priklausomybės diapazonas siekia 2-30 mM laktozės. Šiame diapazone santykinė standartinė matavimo paklaida neviršija 8%. Iki 30 mM gliukozės prie-maiša laktozės tirpaluose įrenginio parodymams įtakos neturi. Didesnės koncentracijos gliukozės priemaišos įrenginio parodymus keičia daugiau nei 10% (6 skiltis).
[0031] Matome, kad siūlomu įrenginiu laktozės koncentraciją galima nustatyti, esant gliukozės priemaišai ir be pa-pildomo mėginio apdirbimo.
[0032] Nustatymas naudojant prototipą. Tam, kad parodyti siū-lomo įrenginio pranašumą prieš prototipą pagal /KypTH-HaHTeHe B.C., JlaypHHaBiraoc B.A. "3Kcnpecc aHajnoaTop jum onpe-.nejiemra jiaicro3bi". -MojioHHaa h MacHaa npoMLniuieHHocTL. 1990, N° 5, C. 30-32/ metodiką, atlikti laktozės ir gliukozės miši-nių buferiniame tirpale matavimai, o jų rezultatai pateikti fig. 3.
[0033] Įrenginio kalibravimas ir matavimas atlikti pagal anks-čiau aprašytą metodiką. Iš 3 pav. matome, kad prototipo parodymai tiesiški laktozės koncentracijoms iki 30 mM (fig. 3 1 kreivė) . Pridedant 2, 10, 20 ir 30 mM gliu-kozės priemaišų prietaiso parodymai keičiasi priklau-somai nuo pastarosios koncentracijos (2-5 kreivės). Šiuo atveju laktozės daviklio srovę sukuria tiek esanti tirpale, tiek susidaranti membranoje gliukozė. Šių signalų atskyrimas neatliekamas, todėl gliukozės prie-maiša žymiai iškraipo laktozės matavimo rezultatus. 2 pavyzdys. Laktozės nustatymas mišiniuose su gliukoze.
[0034] Įrenginys surenkamas ir kalibruojamas taip, kaip apra-šyta 1 pavyzdyje. Mikroorganizmų kultivavimo maitinimo terpė buferiniu tirpalu pH 6,5 praskiedžiama 2 kartus, pieno mišiniai paruošiami pagal receptą (1,3 g į 100 mltr vandens) ir praskiedžiami buferiniu santykiu 1:10. Rezultatai pateikti 2 lentelėje.
[0035] Duomenys parodo, kad gautos laktozės koncentracijos reikšmės skiriasi nuo nurodytų receptūroje ne daugiau kaip 3,3%. 3 pavyzdys. Laktozės nustatymas piene su gliukozės priemaiša.
[0036] Karvės pienas praskiedžiamas buferiniu tirpalu 10 kar-tų. Į pieną pridedama 2-30 mM gliukozės ir 2-30 mM laktozės ir įrenginiu nustatoma laktozės koncentracija. Rezultatai pateikti 3 lentelėje.
[0037] Matome, kad pradinė laktozės koncentracija piene sudaro 10 mM ir analizatoriaus parodymai nekinta didinant gliukozės koncentraciją. Didinant laktozės koncent-raciją piene įrenginio parodymai tolygiai didėja, tačiau tiesinė parodymų priklausomybė nuo augančios laktozės koncentracijos ir augančių prietaiso parodymų išlieka tik iki suminės laktozės koncentracijos ti-riamam tirpale, ne daugiau 30 mM. 4 pavyzdys. Celobiozės nustatymas mišiniuose su gliukoze .
[0038] Elektrocheminis celobiozės elektrodas ruošiamas pagal / Bhoxhmhh, 1984, t. 49, N° 7, c. 1110-1120/ metodiką, bet vietoj galaktozidazės dedama 300 E/ml celobiozės. Įren-giniu nustatomos celobiozės koncentracijos buferiniuose tirpaluose su įvairiomis gliukozės koncentracijomis. Rezultatai pateikti 4 lentelėje.
[0039] Iš 4 lentelės duomenų matyti, kad įrenginio parodymai tiesiškai priklauso nuo celobiozės koncentracijos iki 25 mM. Iki 25 mM gliukozės priedas prietaiso parodymams įtakos neturi. Pagrindinė santykinė parodymų paklaida neviršija 8%. Gliukozės koncentraciją padidinus iki 30 mM sumažėja mažų (2-5 mM) ir didelių (25-30 mM) celobiozės koncentracijų nustatymo tikslumas. 5 pavyzdys. Sacharozės nustatymas buferiniuose tirpaluose su gliukozės priemaiša.
[0040] Elektrocheminis sacharozės elektrodas ruošiamas pagal /KypTHHairreHe B. C., JlaypHHaBjraioc B. A. "3Kcnpecc aHajnmTop jjjw onpeflejieHHH JiaKTcoLi". -MojioHHaa h MflCHas npoMLiiujieHHocTt. 1990, N° 5, c. 30-32/ metodiką, fermentinė membrana ga-minama iš 0,01 M fosfatinio buferinio tirpalo pH 7,2, kuriame yra 5% albumino, 300 E/ml gliukozooksidazės, 350 E/ml invertazės ir 500 E/ml mutarotazės, prie 0,1 mltr tirpalo pridedant 0,006 mltr 5% gliutaro aldehido tirpalo.
[0041] Į įrenginį įstatomi sacharozinis ir gliukozinis elektrodai ir nustatomos sacharozės koncentracijos buferiniuose tirpaluose (pH 7,2) pridedant gliukozės.
[0042] Matavimo rezultatai pateikti 5 lentelėje. Tiesinis sa-charozės nustatymo intervalas ir teisingi įrenginio parodymai išlieka 2-30 mM sacharozės koncentracijoms pridedant 2 mM gliukozės. Pridedant 5+20 mM gliukozės parodymai skiriasi nuo užduotųjų mažiau nei 9% 5-30 mM sacharozės koncentracijų intervale. Esant didelėms gliukozės koncentracijoms (virš 25 mM) parodymai skiriasi virš 65%.
[0043]
1. Prietaisas disacharidų nustatymui, sudarytas iš de-tektuojančio fermentinio elektrodo, esančio elektro-cheminėje gardelėje ir susidedančio iš vandenilio peroksido poliarografinio daviklio, turinčio platinos anodą, sidabro chlorido palyginimo elektrodą ir pagalbini, elektrodą bei fermentinę membraną; elekt-roninio bloko, skirto fermentinio elektrodo valdymui ir signalo apdirbimui; siurblio, skirto gardelės praplo-vimui, besiskiriantis tuo, kad elektrocheminė gardelė papildyta fermentiniu, gliukozei jautriu davikliu, o disacharidams jautriame fermen-tiniame elektrode panaudota keičiama, specifinė kiek-vienam disacharidui membrana, o elektrocheminis blokas papildytas kompleksinio signalų apdirbimo ir komutacijos bloku.
2. Būdas disacharidų koncentracijos nustatymui biologiniuose substratuose, susidedantis iš katalitinio disa-charidų skilimo elektrocheminio daviklio fermentinėje membranoje, susidarant monosacharidui ir gliukozei, tolimesnio gliukozės fermentinio skaldymo iki dialde-hido ir vandenilio peroksido, anodinės srovės regene-ravimo, oksiduojantis susidariusiam vandenilio peroksi-dui iki deguonies, besiskiriantis tuo, kad įveda papildomą fermentini, davikli,, skirtą gliu-kozės koncentracijai, esančiai biologiniame substrate, nustatyti, sudarytą iš fermentinės membranos ir vandenilio peroksido poliarografinio daviklio, turinčio platinos anodą, ir toliau gliukozės elektrodo signalą atima iš suminio disacharidinio elektrodo signalo, naudojant kompleksini, signalų apdirbimo ir komutacini, blokus.