[LT] Išradimas susijęs su mikrobų auginimo būdu kietoje auginimo terpėje, kuriame iš esmės neturintys katijonų ir poringi silicio dioksido karkasai, gauti iš silikatinių dalelių, užpildomi maistinių medžiagų šaltiniu ir pridedama viena ar daugiau mikrobų rūšių. Išradimas taip pat susijęs su produktu, kuris sudarytas iš žymia dalimi neturinčiu katijonų bei poringų silicio dioksido karkasų, gautų iš silikatinių dalelių, ir vienos ar daugiau mikrobų rūšies.
[EN]
[0001] Išradimas skirtas mikroorganizmų auginimo kietoje mi-tybinėje terpėje būdui, pagal kuri, prie silikatinės me-džiagos, įsodrintos mitybine medžiaga, pridedama viena ar daugiau mikrobų rūšių, ir padarytas mišinys laikomas sąlygose, kuriose mikrobai galės veistis. Išradimas taip pat skirtas produktui, kuris yra mišinys si-likatinės medžiagos ir vienos ar kelių mikrobų rūšių.
[0002] Mikrobų auginimas kietoje kultivavimo terpėje yra senas būdas, kuris ypač dažnai naudojamas maisto pramonėje, pavyzdžiui, mėlynųjų sūrių ir rytietiškų kodži tipo produktų gamyboje. Šie procesai buvo paveldėti pir-miausia per tradicijas, iš pradžių neturint jokių žinių apie jų mikrobiologini, ir fermentini, charakteri,.
[0003] Paskutiniais metais biotechnologinėje pramonėje didėjo supratimas, jog procesas su fermentacija kietame būvyje (SSF) yra verta dėmesio metodika šalia dažniausiai naudojamos fermentacijos, panardinant i, skystą terpę. Daugiausia SSF yra vienintelis galimas procesas tam tikrų produktų biotechnologinėje gamyboje, pavyzdžiui, dėl naudojamų mikrobų augimo fiziologijos. Taip pat, dažnai SSF yra labiau ekonomiškas procesas nei fermentacija panardintoje būsenoje: kai kuriuose taikymuose nėra tokie dideli reikalavimai sterilumui, procesas yra pa-prastesnis ir tolesnio apdorojimo kaina yra žemesnė dėl mažesnio vandens kiekio terpėje.
[0004] SSF tinkamumas labai priklauso nuo kultivavimo terpės savybių: maistinių medžiagų, surišamo vandens tūrio ir struktūros. Tradiciniuose SSF naudojama terpė yra san-tykinai sudėtinga medžiaga, kuri vienu metu tarnauja kaip maisto medžiagų šaltinis, vandens surišiklis ir nešančioj i medžiaga. Tokių medžiagų pavyzdžiais yra javų grūdai, pelai, kapoti šiaudai, pjuvenos, durpės ir kompostas (pvz.,US patentas Nr. 4748021, FI patentas Nr. 69390) . Kartais prie šių terpių pridedami tokie komponentai kaip gipsas ar kalkės, kurie pagerina ter-pių struktūrą.
[0005] Aukščiau pateiktų kultivavimo terpių pramoninis panau-dojimas iš dalies pagrįstas jų kainos ekonomiškumu ir lengvu prieinamumu. Vystant naujus biotechnologinius produktus, tokius kaip mikrobinius inikuliatus, labai svarbu, kad galutinio produkto savybės būtų tiksliai tokios, kokių pageidaujama. Pavyzdžiui, kai biomasė, turinti celiuliozės, yra naudojama kaip SSF terpė, tai praktiškai neįmanoma gauti mikrobinio inokuliato sausų miltelių pavidalu, kuriuos galima būtų panaudoti kaip sėklas apveliantį agentą ar išbarstymo miltelius.
[0006] Iš anksčiau žinoma, jog įvairūs silikatiniai mineralai, tokie kaip vermikulitas, bentonitas ir kaolinitas, buvo naudojami kaip SSF nešančioj i medžiaga, ypač gaminant azotinių bakterijų ir grybienos inokuliatus (pvz., Appl. Env. Microbiol. 53 (1987) 2138-2140; Curr. Sci. 51
[0007] (1982) 430-432). Tačiau galimybės sudaryti tokius produktus galutiniam naudojimui yra ribotos ir iš tikrųjų jie dažniausiai yra naudojami tokie kaip yra, padžio-vinti ar dar dažniau nedžiovinti, arba kokiu nors būdu granuliuoti.
[0008] Sudarant preparatus, kurie turi gyvus mikroorganizmus, stengiamasi suteikti jiems tokį pavidalą paprastai arba koncentruotų tirpalų, arba miltelių pavidalą, kad jie kaip galima labiau tiktų duotiems tikslams. Pavyzdžiui, žemės ūkyje patogiau kai mikrobiniai preparatai gali būti išpurškiami ant taikinių arba panaudojami apvelti augalų sėklas. Tai kelia didelius reikalavimus mikrobinio preparato sudarymui, ypač mikroorganizmų gyvy-bingumui ir preparato purškimo ir apvėlimo savybėms. Paprastai sudarant naudojamos nešančios medžiagos, įvairios apsaugančios medžiagos, drėkintojai, disper-guojantys agentai ir pH kontroliuojantys agentai. Nešančioj i medžiaga turi ne tik apsaugoti mikrobus, bet taip pat tarnauti kaip skiediklis; charakteringais tokio tipo nešikliais yra įvairios natūralios organinės medžiagos, jų dariniai ar neorganiniai mineralai. Ap-sauginėmis medžiagomis gali būti, pavyzdžiui, apsau-gančios nuo UV spindulių ar antioksidacinės medžiagos. Tarp savybių, kuriomis turėtų pasižymėti nešančioj i me-džiaga, yra tinkamas lyginamasis paviršiaus plotas, gera buferizavimo talpa ir teisingas pH diapazonas.
[0009] Kaip žinoma iš anksčiau, sudarant mikrobiologinius preparatus, kaip nešančiosios medžiagos vartojami įvairūs neorganiniai silikatiniai mineralai, tokie kaip vermikulitas, kaolinitas ar montmorilonitas (pvz., Can. J. Microb., Vol. 12 (1966), pp. 1235-1246). Tokio tipo medžiagų kokybė gali labai svyruoti ir, be to, jose gali būti komponentų, inhibuoj ančių mikrobus, dėl to gali atsirasti problemų sudarant iš mikroorganizmų preparatus .
[0010] Pramoninio mikrobinių preparatų gamybos požiūriu, bū-tina auginimo ar sudarymo metu turėti galimybę naudoti pigią, vienodos kokybės nešančiąją medžiagą, kurios dė-ka galima būtų gauti reikiamas auginimo terpės ir galutinio produkto naudingas savybes.
[0011] Žemiau pateiktas eilės svarbiausių reikalavimų rin-kinys, pramoninio masto SSF kultivavimo terpei: Auginimo terpės struktūra: terpė turi būti poringa, geriausia granuliuota, kad mikrobai turėtų maksimalų augimo paviršių tūrio vienetui. Granulinė struktūra taip pat užtikrina pakankamą deguonies tiekimą mikrobams .
[0012] Drėgmės kiekis: drėgmės kiekis turi būti pakankamai didelis, kad mikrobai galėtų augti terpėje. Tačiau laisvo vandens kiekis terpėje turi būti minimalus tam, kad vanduo neužimtų erdvės, kurioje cirkuliuoja oras. Didelis vandens kiekis taip pat padidintų džiovinimo ir atskyrimo kainas toliau apdorojant.
[0013] Maistinių medžiagų naudojimas: tam, kad procesas būtų ekonomiškas, geriau, kai maistinių medžiagų yra tiksliai toks kiekis, koks reikalingas mikrobų augimui ir/arba reikalingų medžiagų gamybai norimu greičiu.
[0014] Tolesnis apdorojimas: auginimo terpė turi būti lengvai įvedama į fermentatorių ir pašalinama iš jo. Mikrobinių inokuliatų atveju būtina, kad terpę galėtume lengvai džiovinti taip, kad mikrobai ar jų sporos išliktų gyvi džiovinimo metu. Po džiovinimo dažnai būtina produktą švelniai sutrinti į miltelius taip, kad organizmai per daug nenukentėtų.
[0015] Sudarymas: geriau, kad terpė turėtų komponentus, kurie pagerina produkto vartojimo savybes (lipnumas prie sėk-lų, gniutulų nesusidarymas, sugebėjimas sudaryti suspensijas) .
[0016] Kaina: auginimo terpės kaina turi būti priimtina, ly-ginant su produkto kaina.
[0017] Šiame išradime minėtieji tikslai buvo pasiekti naujo proceso ir produkto dėka, kurie yra aprašyti patento nepriklausomuose apibrėžties punktuose. Tuo būdu, buvo pastebėta, kad silicio dioksido karkasas, gaunamas iš-plaunant katijonus iš silikatinių mineralų, yra pui-kiai tinkamas kaip nešančioj i medžiaga SSF procesui ir mikrobiologiniams preparatams, kuriuose yra gyvų mikro-bų. Pagal savo paviršiaus savybes silicio dioksido karkasas yra hidrofilinė medžiaga, turinti didelį spe-cifinį paviršių. Jos akyta struktūra sudaryta pirmiau-sia iš mikro ir mezoporinių struktūrų, su natūraliu
[0018] sugebėjimu išlaikyti vandenį, adsorbuotą jos pa-viršiuje. Drėgmė daugiausia yra porose, ir todėl tarpai tarp dalelių išlieka sausi.
[0019] Tinkamo tipo silicio dioksido karkasas paprastai gaunamas silikatinį mineralą išplaunant rūgštimi. Išplautų katijonų vietas silicio dioksido karkase užima van-denilio atomai ir paviršius pasidaro hidrofiliniu.
[0020] Išplovimo metodika priklauso nuo bet kokių gardelės defektų, esančių minerale; šių defektų dėka rūgštis gali įsiskverbti į silikatą ir pašalinti katijonus. Pirmame pavyzdyje toks defektas atsiranda dėl to, kad dalis geležies yra dvivalentė, o kita dalis - tri-valentė. Kai dvivalentė geležis, esanti gardelėje iš-plovimo metu, yra oksiduojama iki trivalentės, geležies jono spindulys sumažėja ir gardelėje susidaro daugiau erdvės, kurioje rūgštis gali prieiti prie katijoninės struktūros ir išplauti katijonus, nepažeisdama silikato silicio dioksido karkaso. Beveik visuose natūraliuose silikatuose yra gardelės defektų, kurių dėka silikatai gali būti išplauti tam, kad būtų gautas silicio dioksido karkasas.
[0021] Produkto gamyboje pagal šį išradimą pradinė medžiaga sudaryta iš silikatinių dalelių, tokių kaip flogopito, biotito, vermikulito, betonito arba kaolinito dalelių. Geriau tinka nuosėdinių silikatų dalelės, ypač flogopitas arba biotitas, sintetinis žėrutis taip pat gali būti panaudotas.
[0022] Katijonų, esančių silikate, pašalinimui, silikatų da-lelės yra veikiamos vandeniniais rūgščių tirpalais, ku-rių koncentracijos kinta nuo 0,7 iki 70 % pagal svorį, geriau nuo 4 iki 65 % pagal svorį. Atitinkamas šiam atvejui pH diapazonas yra apytiksliai 0-7. Tinkamas temperatūrinis diapazonas yra apytiksliai 0-100°C, kai slėgis normalus. Kai kurios tinkamos rūgštys yra H2S04, HC1, HN03, HF, HBr, HI, HC103, HBr03, HC104, HP04, cit-rinos rūgštis, salicilo rūgštis, vyno rūgštis, orga-ninės rūgštys, oksalo rūgštis ir šių rūgščių mišiniai. Labiausiai tinkamos yra sieros, druskos ir azoto rūgš-tys .
[0023] Jei reikalinga, tai apdorojimas rūgštimi gali būti at-liekamas, esant oksiduojantiems ar redukuojantiems priedams. Būdingais oksiduojančių priedų pavyzdžiais yra HN03, H202, Mn04(-), Cr07(2-), C104(-), C103, 02, persulfatai, Cl2, Br2. Naudojamų redukuojančių agentų pavyzdžiais yra Sn(II), Fe(II), S203 (-), Cu(I), aldehi-dai, ketonai, H2P04(-), sulfatai, fosfatai, V(II) ir V(III). Oksiduojančių ar redukuojančių priedų kiekis priklauso nuo efekto dydžio, kurį norima padaryti ka-tijonų, esančių silikatuose, tirpumui. Tipiški priedų kiekiai yra 0-20 % pradinės medžiagos svorio.
[0024] Dėl rūgštinio išplovimo produkte, pagamintame pagal ši, išradimą, esančios karkasinės silicio dioksido me-džiagos tankis sumažėja maždaug 30-50 %. Todėl aki-vaizdu, kad produktas, pagamintas pagal išradimą, bus žymiai lengvesnis nei produktai, šiuo metu gaminami naudojant neišplautas silikatines daleles. Tinkamas da-lelių, sudarytų iš karkasinės silicio dioksido me-džiagos, dydžių diapazonas, naudojamas produkte, kinta priklausomai nuo vartojimo pobūdžio.Tinkamas dalelių dydžio diapazonas yra 1-2000 jum, geriausias yra 10-900 jjm. Lyginamasis paviršiaus plotas yra maždaug 10-1000 m /g diapazone, tai leidžia panaudoti šią medžiagą taiky-mams, reikalaujantiems didelio lyginamojo paviršiaus.
[0025] Tuo būdu produktas pagal ši, išradimą susideda iš silicio dioksido dalelių su mikrobiniu inokuliatu ant jų paviršiaus. Mikrobais gali būti, pvz., grybai, bakterijos, augalų ląstelės ar gyvūnų ląstelės. Mikrobai gali būti auginami ant silicio dioksido karkaso pa-viršiaus, panaudojant SSF, arba jie sumaišomi su silicio dioksido medžiaga po kultivavimo, tokiu atveju mikrobai auginami atskirai, pavyzdžiui, panaudojant fer-mentaciją panardintoje būsenoje.
[0026] SSF procese kaip maistinių medžiagų šaltinis gali būti panaudotos tiek tirpios, tiek ir netirpios, pvz., chitinas, maistinės medžiagos. Po auginimo staciona-riame stulpeliniame reaktoriuje arba fermentacijoje kietame būvyje su maišymu ir po galimo džiovinimo produktas paruoštas vartojimui. Parengiamasis ir tolesnis produkto apdorojimas (malimas, sterilizacija) yra ne-sudėtingi, kadangi pagrindinės silicio dioksido karkaso savybės nepakinta poveikio metu.
[0027] Dėl terpės granuliuotumo mikrobų augimui skirtas pa-viršiaus plotas yra didelis ir deguonies tiekimas mikroorganizmams vyksta be kliūčių net dideliuose reakto-riuose. Terpės pašalinimas iš fermentatoriaus po to, kai baigiasi auginimas, taip pat nesudėtingas tais at-vejais, kai reikalinga aseptika.
[0028] Terpės kartu su jose esančiais mikrobais ir/arba sporo-mis džiovinimas, jei jis reikalingas, taip pat nesu-keltų sunkumų. Poringa silicio dioksido medžiagos struktūra apsaugos mikrobus ir švelnus produkto try-nimas po kultivavimo nebus žalingas mikroorganizmams, kadangi nešiklis iš silicio dioksido iš anksto buvo sumaltas \ smulkius miltelius. Taip gautas produktas yra puikus kaip medžiaga, skirta sėklų apvėlimui, ar kaip milteliai, skirti išpurškimui.
[0029] Dėl savo paviršiaus savybių silicio dioksido karkasas efektyviai tarnauja mikrobams, sumaišytiems su jomis, kaip gynybinė ir nešančioj i medžiaga. Be to, ji ne-leidžia susidarinėti grumstams produkte.
[0030] Žemiau išradimas smulkiai aprašytas pavyzdžių dėka.
[0031] Silicio dioksido karkaso paruošimas iš flogopito
[0032] a)
[0033]
[0034] Iš žėručio, vandens ir sieros rūgšties paruošiama suspensija, kuri kaitinama iki 95°C, po to paduodamas žemiau paviršiaus H202 apytiksliai 5 valandoms, nuolat maišant. Bendras išplovimo laikas yra 7 valandos, iš kurių apie vieną valandą, prieš paduodant H202, tik maišoma bei kaitinama, ir vieną valandą, po H202 padavimo pabaigos, tik maišoma. Po to, motininis skystis nufiltruojamas ir tai, kas liko (silicio dioksido karkasas) , keletą kartų perplaunama, sudarant tarp plovimų suspensijas tam, kad pašalintų rūgšti, ir katijonų liekanas.
[0035] b)
[0036]
[0037] Išplovimas vykdomas kaip aprašyta aukščiau, išskyrus
[0038] tai, kad nereikalingas oksidantas, kadangi azoto rūgš-tis pati turi oksiduojanti, poveiki,.
[0039] Procedūra kitais atžvilgiais yra tokia, kaip 1 pavyzdyje, išskyrus tai, jog vietoje flogopito naudojamas anortozitas.
[0040]
[0041] Išplovimo temperatūra - 95-97°C, išplovimo trukmė - 7 valandos. Temperatūra buvo pakelta iki 95°C ir lėtai že-miau paviršiaus įvesta HN03 5 valandoms. Po padavimo pabaigos, prieš filtravimą mišinys buvo maišomas 2 va-landas. Motininis skystis buvo nufiltruotas, iš nuosėdų suformuota suspensija 1% H2S04 tirpale ir palikta stovėti 1-3 dienas. Nuosėdos suspenduotos ir praplautos 5 kartus dejonizuotame vandenyje. Galutinio filtrato pH buvo 4,1.
[0042] Procedūra kitais atžvilgiais yra tokia, kaip ir prieš tai buvusiame pavyzdyje, bet buvo naudotas mineralas vermikulitas arba volanstonitas.
[0043] Fungicidinių grybų auginimas kietoje silicio dioksido terpėje
[0044] 1 g smulkiai sumalto chitino sumaišoma su 9 g. druskos tirpalo, sudaryto iš:
[0045] Mišinys buvo sterilizuojamas (20 min, 120°C) ir at-šaldžius i, ši, mišini pasėtas 1 ml fungicidinių Trichoderma rūšių sporų suspensijos; ši suspensija gauta nugrandant sporas iš indo su PDA (bulvių dekstrozės agaru) d, sterilų distiliuotą vandeni,.
[0046] Chitino suspensija, kurioje inokuliuota Trichoderma, sumaišoma su 6 g smulkiai sumalto silicio dioksido karkaso, paruošto pagal pirmą pavyzdi, iš flogopito, dėl to auginimo terpė pasidaro granuliuota. Ši terpė in-kubuojama kambario temperatūroje (20°C) 7 dienas, kol terpę visiškai uždengia grybo micelis ir sporos.
[0047] Terpė, paskleista plonu sluoksniu Petri lėkštelėje, džiovinama vieną dieną kambario temperatūroje. Gautas sausas produktas sutrinamas grūstuvėje i, miltelius. Sporų koncentracija produkte buvo 2,4*109/g.
[0048] Gliocladium rūšių preparate, paruoštame atitinkamu bū-du, sporų koncentracija buvo 4,8*108/g.
[0049] Fungicidinis Streptomyces griseoviridis iš aktinomicetų buvo auginamas kietoje auginimo terpėje, sudarytoje iš:
[0050] Terpė buvo autoklavuojama ir inokuliuotas 1 ml akti-nomicetų sporų suspensijos. Auginimas truko 7 dienas prie 28°C. Terpė po pilno išaugimo buvo džiovinama kambario temperatūroje. Sporų koncentracija produkte buvo 3*109/g.
[0051] Grybas Phlemia gigantea, skirtas kovai su Fomes annosum, buvo auginamas toje pačioje terpėje kaip ir aktinomicetai. Po 11 dienų auginimo terpė buvo džio-vinama kambario temperatūroje. Sporų koncentracija produkte buvo 2,5*107/g.
[0052] Insekticidinių grybų auginimas kietoje silicio dioksido terpėje
[0053] 1 g smulkiai sumalto chitino buvo sumaišyta su 9 gra-mais druskos tirpalo, sudaryto iš:
[0054] Mišinys buvo sterilizuotas (20 min., 120°C) ir i, atšal-dytą mišini, buvo inokuliuotas 1 ml insekticidinio Beauveria bassiana sporų suspensijos, suspensija buvo gauta nugrandant sporas iš PDA indo X sterilų disti-liuotą vandeni,.
[0055] Maišymas su silicio dioksido nešikliu, auginimas ir džiovinimas buvo vykdomas kaip ir su Trichoderma 5 pavyzdyje. Sporų koncentracija išdžiovintame ir sutrin-tame produkte buvo 3,4*108/g.
[0056] Insekticidinio Metarrhizium anisopliae preparate, kultivuotame atitinkamu būdu, sporų koncentracija buvo 1,5* 108/g.
[0057] Fungicidinio aktinomicetinio preparato sudarymas silicio dioksido pagrindu
[0058] Aktinomicetas Streptomyces griseoviridis buvo augintas išrūgų terpėje (10 g/l išrūgų baltymų) ir užauginta kultūra buvo išskirta centrifuguoj ant. 9,0 g sacharozės ir 15,0 g smulkiai sumalto silicio dioksido, paruošto pagal 1 pavyzdi, buvo sumaišyti su 5,1 g atskirtų ląs-telių sausos medžiagos. Mišinys buvo liofilizuotas ir sutrintas. Gautas sauso produkto gyvybingumas buvo 5,9*107 CFU/g. Po šešių savaičių saugojimo prie 28°C gyvybingumas buvo 1,4*107 CFU/g.
[0059] Bacillus pumilus buvo išaugintas terpėje, sudarytoje iš:
[0060] Išauginta kultūra buvo išskirta centrifuguojant, 2,2 g sacharozės bei 3,6 g smulkiai sutrinto silicio dioksido, paruošto pagal pirmą pavyzdį, buvo sumaišyti su 1,3 g išskirtų ląstelių sausos medžiagos. Po liofi-lizacijos ir malimo gyvybingumas buvo 6*10 CFU/g, o po 10 savaičių saugojimo prie 28°C jis buvo 2,6*108.
[0061] Fungicidinių mielių preparato sudarymas silicio dioksido pagrindu
[0062] Cryptococcus macerans mielės buvo augintos bulvių gliu-kozės terpėje. Išauginta kultūra buvo išskirta centrifuguojant ir 4 g sacharozės ir 11,7 g smulkiai sumalto silicio dioksido, paruošto pagal 1 pavyzdį, buvo su-maišyti su 11,8 g išskirtų ląstelių masės. Mišinys buvo liofilizuotas ir sumaltas. Gautas produkto gyvybingumas buvo 9*104 CFU/g.
1. Fermentacijos kietoje terpėje būdas, skirtas mikrobų auginimui, kuriame silikatinė medžiaga įsodrinama mitybine medžiaga ir pridedama viena ar kelios rūšys mikroorganizmų bei gautas mišinys laikomas sąlygose, kuriose mikrobai gali veistis, besiskiriantis tuo, kad kaip silikatinę medžiagą naudoja iš esmės neturinčius katijonų bei poringų silikatinių dalelių silicio dioksido karkasus.
2. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad iš esmės neturinčius katijonų ir poringus silicio dioksido karkasus paruošia, apdoruojant flo-gopitą, biotitą, vermikulitą, bentonitą arba kaolinitą su rūgštimi, galbūt, esant oksiduojantiems ar redukuojantiems priedams tam, kad iš esmės pašalintų katijonus, esančius minėtuose silikatuose.
3. Būdas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad iš esmės neturintys katijonų ir poringi silicio dioksido karkasai yra gelio pavidalo.
4. Būdas pagal 1, 2 arba 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad iš esmės neturintys katijonų, poringi silicio dioksido karkasai adsorbuoja maistines medžiagas.
5. Būdas pagal bet kuri, ankstesni, punktą, besiskiriantis tuo, kad naudojamais mikro-organizmais yra grybai arba bakterijos.
6. Produktas, sudarytas iš silikatinės medžiagos ir vienos ar kelių rūšių mikroorganizmų, besiskiriantis tuo, kad silikatinę medžiagą sudaro iš esmės neturintys katijonų bei poringi silicio dioksido karkasai.
7. Produktas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad iš esmės neturintys katijonų ir poringi silicio dioksido karkasai yra flogopitas, biotitas, vermikulitas, bentonitas, kaolinitas, geriau gelio pavidalo ir apdoroti rūgštimi.
8. Produktas pagal 6 arba 7 punktą, besiskiriantis tuo, kad iš esmės neturintys katijonų ir poringi silicio dioksido karkasai turi daleles, ma-žesnes nei 2000 |am, geriau mažiau nei 900 )im.
9. Produktas pagal bet kuri, iš 6 - 8 punktų, besiskiriantis tuo, kad naudojamais mikro-organizmais yra grybai arba bakterijos.