[LT] Išradimas panaudijamas biologinių tirpalų analizei medicinoje, diagnostikos tikslams, mikrobiologinėje pramonėje. Gaminant fermentinį elektrodą, citochromas b2 absorbuojamas ant suodžiais PM-75 modifikuoto stiklo anglies elektrodo paviršiaus. Prieš modifikaciją suodžiai oksiduojami azoto rūgštimi ir disperguojami acetono suspensijoje, kurioje yra 2-5 % suodžių. Išradimas užtikrina stiklo anglies elektrodo modifikacijos supaprastinimą; gaunamo fermento elektrodo darbinio potencialo sumažinimą, padidinantį jo selektyvumą; jautrumo padidinimą, leidžiantį naudoti smarkiai praskiestus biologinius tirpalus.
[EN]
[0001] Išradimo sritis yra biochemija. Konkrečiai šis išradimas skirtas fermentinio elektrodo sukūrimo metodui, ir gali būti panaudotas enzimologijoje mokslo-tiriamiesiems darbams, taip pat medicinoje ar mikrobiologinėje pramonėje elektrocheminiam L-laktato nustatymui biologinėse terpėse, pvz. kraujyje, kitų terpių diagnostikoje.
[0002] Žinomas elektrodo, skirto L-laktato nustatymui, sukūrimo būdas, panaudojant citochromą b2 / MMM06iimi30BaHHbie cpepMeHTbi t.2. ct. 169-176 (1976) /. Naudojant šį būdą, fermentas imobilizuojamas gelyje, kuriuo padengiamas elektrodas, o į tiriamąjį tirpalą įvedamas redoks mediatorius, pernešantis elektronus nuo fermento aktyvaus centro į elektrodą. Šio būdo trūkumas - tirpaus mediatoriaus poreikis. Paprastai mediatorinę funkciją atlieka toksiniai chinono junginiai, pvz. benzochinonas. Todėl tokių elektrodų negalima panaudoti analizėms in vivo, taip pat mikrobiologiniuose reaktoriuose ir masinei biologinių terpių analizei.
[0003] Žinomas fermentinis elektrodas sudarytas iš stiklo anglies darbinio paviršiaus, padengto citochromu b2 ir laktatdehidrogenaze, ir uždengto dializine membrana / TSRS a.l. Nr.1242803 /. Šio elektrodo trūkumas - papildomo fermento naudojimas. Be to laktatui nustatyti taip pat reikalingas tirpus mediatorius.
[0004] Žinomas fermentinio elektrodo L-laktatui nustatyti citochromo b2 pagrindu sukūrimo būdas - paremtas fermento adsorbcija ant srovei laidžios matricos, sudarytos iš organinių katijonų ( metilintų fenazino darinių, akridino, chinolino, piridino darinių ) ir 7,7,8,8-tetraciano-p-chinodimetano anijon-radikalo kompleksų /TSRS a. I. Nr. 894534 /. Šio elektrodo panaudojimas analizei nereikalauja tirpaus mediatoriaus buvimo tiriamajame tirpale. Žinomo metodo trūkumas - proceso sudėtingumas, reikalaujantis papildomai sintezuoti kompleksus ir jų komponentus, pvz., tetraciano-p-chinodimetano radikalą.
[0005] Išradimo esmė - elektrodo sukūrimas, adsorbuojant citochromą b2 ant modifikuoto stiklo anglies elektrodo paviršiaus. Elektrodas modifikuojamas suodžiais PM-75, kurie naudojami kaip dažas spaustuvėse arba užpildas gumos pramonėje. Prieš modifikaciją suodžiai oksiduojami azoto rūgštimi ir ultragarsu disperguojami fluoroplastinio lako tirpale acetone. Suspensijoje, panaudojamoje modifikacijai, yra 2-5 % fluoroplastinio lako ir 12-20 % suodžių.
[0006] Fermentinio elektrodo veikimo mechanizmas aiškinamas redukuoto citochromo b2 elektrooksidacija modifikuoto elektrodo paviršiuje. L-laktatas redukuoja citochromą b2.
[0007] Oksiduojant suodžius azoto rūgštimi, jų paviršiuje atsiranda elektroaktyvios chinono grupės (Q), katalizuojančios citochromo b2 elektrooksidaciją:
[0008] Pagal šį išradimą suodžiai PM-75 prieš modifikaciją 5 paras laikomi 55 % azoto rūgštyje kambario temperatūroje. Po to jie perplaunami vandeniu iki neutralios reakcijos ( pH 7,0 ) ir išdžiovinami. Paruoštų suodžių ir fluoroplastinio lako tirpalo acetone mišinys disperguojamas ultragarsu ( 44 kHz ) 0,5-1 vai. Stiklo anglies elektrodas pamerkiamas į gautą suodžių suspensiją 3-5 sek., po to išdžiovinamas, perplaunamas distiliuotu vandeniu ir buferiniu tirpalu. Ant suodžiais modifikuoto elektrodo darbinės plokštumos užpilama 10 mkl citochromo b2 tirpalo. Darbinė plokštuma padengiama kaprono tinkleliu ir dializine membrana, kurie po to pritvirtinami guminiu žiedu. Elektrodas pamerkiamas j 0,1 M K-fosfat-citratinį buferinį tirpalą ( pH 7,0), prijungiamas prie poliarografo ( darbinis potencialas - -0,2V pagal Ag/AgCI). Į elektrodo gardelę jvedamas tiriamasis skystis, registruojama stacionarios oksidacinės srovės priklausomybė nuo L-laktato koncentracijos.
[0009] 1 Pavyzdys. L-laktato koncentracijos vandeniniame tirpale nustatymas
[0010] Elektrodas paruošiamas pagal aukščiau pateiktą metodiką. Disperguojant suodžius ultragarsu imama suspensija acetone, turinti 2-5% fluoroplastinio lako ir 12-20% suodžių. Nustatoma srovės prie -0,2V pagal
[0011] h
[0012]
[0013] Pagal 1 lentelės duomenis, srovė tiesiškai priklauso nuo L-laktato koncentracijos iki 0,5 mM (Fig. 1 ).
[0014] Naudojant šiuo būdu pagamintą elektrodą, L-laktatas elektrooksiduojamas prie pakankamai žemo potencialo, todėl askorbino rūgštis (elektroaktyvus biologinių skysčių komponentas) signalui įtakos neturi. Iš fig. 1 matyti, kad elektrodas yra pakankamai jautrus ( 5,3 mkA/mM L-laktato ), tai leidžia analizei naudoti labiau praskiestus biologinius tirpalus. Padidinus suodžių arba lako koncentraciją virš nurodytos viršutinės ribos, sulėtėja elektrocheminiai paviršinių suodžių grupių virsmai. Sumažinus komponentų koncentraciją žemiau žemutinės nurodytos ribos, sumažėja elektrodo stabilumas.
[0015] Pagal 1 pavyzdį nustatoma, kad askorbino rūgšties elektrooksidacija prasideda nuo potencialo - 0,1 V pagal Ag/AgCI, dėl to jos buvimas netrukdo L-laktato nustatymui prie 0,2 V.
[0016] Elektrodas paruošiamas pagal aukščiau pateiktą metodiką. 12 parų laikotarpyje periodiškai matuojama elektros srovė ( potencialas -0,2 V pagal Ag/AgCI) laktato koncentracija - 0,1-0,3 mM. Duomenys pateikti 2 lentelėje.
[0017] Matome, kad elektrodas išlaiko darbingumą ne mažiau 12 parų. Jų metu atlikta ne mažiau kaip 40 matavimų. Elektrodo praplovimas ir matavimas tęsiamas ne daugiau kaip 4 min.
[0018] 3 Pavyzdys. L-laktato koncentracijos biologiniuose tirpaluose nustatymas
[0019] Elektrodas paruošiamas pagal aukščiau pateiktą metodiką. L-laktato koncentracija nustatoma kraujo plazmoje ir kultūrinėje galvijų leukozės viruso auginimo terpėje pagal 1 pavyzdį. Lygiagrečiai L-laktato koncentracija nustatoma spektrofotometriniu būdu pagal fericianido redukciją, katalizuojamą citochromo b2. Įvedant plazmos ar kultūrinio skysčio pavyzdžius j elektrocheminę ar spektrofotometrinę gardelę, jie praskiedžiami 10-40 kartų. Gauti duomenys pateikiami 3 lentelėje.
[0020] Kaip matome iš 3 lentelės duomenų, L-laktato koncentracijos, nustatytos spektrofotometriškai ir naudojant fermentinį elektrodą, praktiškai sutampa. Nustatymo laikas - ne didesnis kaip 4 min. Taigi, gautas elektrodas gali būti panaudotas L-laktato nustatymui biologinėse terpėse.
[0021] Kitas siūlomo būdo pranašumas - stiklo anglies elektrodo modifikacijos supaprastinimas.
Fermentinio elektrodo, skirto L-laktatui nustatyti, sukūrimo būdas naudojant citochromo b2 adsorbciją laidininko sluoksnyje, besiskiriantis tuo, kad elektrodą modifikuoja suodžiais, oksiduotais azoto rūgštyje, o suodžius prieš elektrodo modifikaciją disperguoja acetono suspensijoje, turinčioje 2-5% fluoroplastinio lako ir 12-20% suodžių.