[LT] Rasti nauji kamieninių ląstelių faktoriai, juos koduojantys oligonukleotidai ir jų gavimo būdai. Taip pat rastos farmacinės kompozicijos, turinčios savo sudėtyje minėtus faktorius.
[EN] The present invention provides new strain cells factors, oligonucleotides encoding thereof and process for preparing thereof. The invention also provides pharmaceutical compositions containing strain cells factor.
[0001] Ši paraiška yra tęsinys paraiškos, kurios registracijos Nr 573616, išduotos 1990 rugpjūčio 24 d., kuri yra tęsinys paraiškos reg. Nr 537198, pateiktos 1990 birželio 11 d., kuri yra tęsinys paraiškos reg. Nr 422383, paduotos 1989 spalio 16 d.; visos jos įtrauktos kaip išnašos aprašyme.
[0002] Šiuo išradimu pateikiami nauji faktoriai, kurie stimuliuoja primityvias pirmines ląsteles, įskaitant ankstyvąsias kraujodaros pirmines ląsteles pagal DNR sekas, koduojančias tokius faktorius. Iš dalies, šis išradimas susijęs su šiais naujais faktoriais, jų fragmentais ir polipeptidų analogais ir DNR, koduojančios šiuos fragmentus ir analogus, sekomis.
[0003] Žmogaus kraujo susidarymo sistema (kraujodaros sistema) įjungia daugybę baltųjų kraujo kūnelių (tai neutrofilai, makrofagai, bazofilai, bazinės ląstelės, eozinofilai, T- ir V-ląstelės, raudonieji kraujo kūneliai (eritrocitai) ir tromboląstelės (megakariocitai, trombocitai).
[0004] Manoma, kad nedidelis kiekis tam tikrų kraujodaros augimo faktorių iššaukia diferenciaciją nedidelio kiekio "kamieninių ląstelių", kurios yra kaip pirminės kraujo ląstelės, sukelia labai greitą šių ląstelių dauginimąsi ir sąlygoja galutinę šių linijų subrendusių kraujo ląstelių diferenciaciją. Kraujodaros regeneracinė sistema gerai funkcionuoja esant normalioms sąlygoms. Tuo tarpu paveikus chemoterapiškai, apšvitinus arba esant natūraliems mielodiplastiniams pažeidimams pasireiškia periodas, kurio metu pacientui atsiranda rimta leukopenija, anemija ar trombocitopenija.
[0005] Kraujodaros faktorių suaktyvinimas ir panaudojimas pagreitina kaulų čiulpų regeneraciją šiuo pavojingu periodu. Esant kai kuriems virusiniams pažeidimams, pvz. imuninio deficito sindromui (AIDS), kraujo elementai tokie kaip T-ląstelės, gali būti specifiškai suardomi. Tokiais atvejais sustiprintas T-ląstelių produkavimas gali turėti terapinį veikimą.
[0006] Kadangi kraujodaros faktoriai egzistuoja labai mažais kiekiais, jų aptikimas ir identifikavimas remiasi analizių sistema, kurių metu įmanomas tiktai išskirstymas pagal skirtingus faktorius, remiantis stimuliuojančiais efektais, kurie veikia kultivuojamas ląsteles dirbtinėse sąlygose.
[0007] Rekombinantinių genetinių metodų panaudojimas įgalino suprasti individualių augimo faktorių biologinį aktyvumą. Pvz., buvo gautos aminorūgščių sekos ir DNR žmogaus eritropoetinui (EPO), kuris stimuliuoja eritrofilų gamybą (žr., Lin, JAV patentas 4703008, įtrauktas į aprašymus kaip išnaša). Rekombinantiniai metodai taip pat buvo panaudojami komplementarios DNR granuliocitinio faktoriaus išskyrimui, kuris stimuliuoja kolonijas (G-CFS) (žr., Souza, JAV patentas 4810643, įtrauktas į aprašymus kaip išnaša) ir faktoriaus, stimuliuojančio makrofagines žmogaus granuliocito (GM-CFS) kolonijas (Lee ir kiti, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, 82 t., 4360-4364 psl.; Vong ir kiti, Science, 1985, 228 t., 810-814 psl.), pelių granuliocitinio ir žmogaus granuliocito-makrofaginio-CFS (Yokota ir kiti, Proc Nat. Acad. Sci. USA, 1984, 81 t., 1070 psl.; Fung ir kiti, Nature, 1984, 307t., 233 psl; Hoyhx ir kiti, Nature, 1984, 309 t., 763 psl.) ir faktoriaus, stimuliuojančio žmogaus makrofago (CFS-1) kolonijas (Kavasaki ir kiti, 1985, 230 t., 291 psl.).
[0008] Ląstelės, sudarančios kolonijas su aukštu audringo dauginimosi potencialu (HPP-CFS), ir jų analizės sistema buvo išbandytos faktorių poveikiu (Zont, J. Exp. Med., 1984, 159 t., 679-690 psl.). Literatūroje yra nemažai pranešimų apie faktorius, kurie yra aktyvūs analizuojant HPP-CFS. Šių faktorių šaltiniai nurodomi 1 lentelėje. Žemiau aptariami geriau charakterizuoti faktoriai.
[0009] Žmogaus blužnies aktyvumas kondicinėje terpėje išreiškiamas sinergizmo faktoriumi (SF). Kai kurie žmogaus audiniai, taip pat žmogaus ir pelių ląstelių linijos gamina sinergetinį faktorių, pavadintą SF-1, kuris sąveikauja sinergetiškai su CSF-1, stimuliuoja išankstinį HPP-CFS. Sinergetinis faktorius SF-1 pasireiškia žmogaus blužnies kondicinių ląstelių terpėje, taip pat juo pasižymi žmogaus placentos ląstelės, ląstelės 5637 (pūslinės karcinomos ląstelių linija) ir EMT-6 (pelių pieno liaukų karcinomos ląstelių linija). Tačiau nenustatytas SF-1 ląstelių identiškumas. Pirmiausiuose pranešimuose pateikiamas interleukino-1 su SF-1 aktyvumo blokavimas (Scebo ir kiti, Blood, 1988, 71 t., 962-968 psl.). Tačiau paskutiniais pranešimais buvo pademonstruota, kad interleukinas-1 (IL-1) sąveikoje su CSF-1 negali stimuliuoti tokių
[0010] kolonijų susidarymo, kurios būtų gautos iš CSF-1 kartu su dalinai išvalytu kondicinės terpės 5637 preparatu (MacNiec. Blood, 1989, 731., 919 psl.).
[0011] Sinergetiniu faktoriumi, esančiu apvaisintos pelės gimdoje yra CSF-1. VVEHL-3 ląstelių (pelių mielomonocitinės leukemijos ląstelių linija) produkuojamas sinergetinis faktorius, kuris, kaip pasirodė, yra identiškas interleukinui-3. Kaip CSF-1, taip ir IL-1 stimuliuoja kraujodaros pirmtakai, kurie yra labiau subrendę, negu SF-1 taikinys.
[0012] Buvo parodyta, kad TC-1 ląstelių (stromalinės ląstelės, gautos iš kaulų čiulpų) kondicinėje terpėje yra kitos klasės sinergetinis faktorius. Ši ląstelių linija produkuoja faktorių, kuris stimuliuoja ankstyvojo mieloidinio tipo, o taip pat limfoidinio tipo ląsteles. Jis buvo pavadintas kraujolimfodaros augimo faktoriumi-1 (HLG-1). Jo molekulinė masė 120000 (MakNies ir kiti, Exp. Hematol. 1988, 16 t., 383 psl.).
[0013] Iš žinomų interleukinų ir CSF faktorių nustatyta, kad IL-1, IL-3 ir CSF-1 pasižymi aktyvumu analizuojant HPP-CSF. Kiti sinergetinio aktyvumo šaltiniai paminėti I lentelėje ir struktūriškai neidentifikuoti. Remiantis polipeptidine seka ir biologinio aktyvumo profiliu, pateikiamas molekulės išradimas, kuri skiriasi nuo IL-1, IL-3, CSF-1 ir SF-1.
[0014] Naudojant parenteralinį būdą, baltymai dažnai (greitai) išskaidrėja nuo cirkuliacijos ir todėl gali pasireikšti santykinai trumpu farmakologinio aktyvumo periodu. To pasekoje,
[0015] norint išlaikyti terapinį efektą, gali prireikti dažnų injekcijų ir atitinkamai didelių dozių bioaktyvių baltymų. Žinoma, kad baltymai modifikuoti kovalentiškai prijungiant vandenyje tirpstančius polimerus, tokius kaip polietilenglikolis, polietilenglikolio polipropilenglikolio polimerus, karboksimetilceliuliozę, dekstraną, polivinilo alkoholį, polivinilpirolidoną arba poliproliną, pasižymi atitinkamai dideliu skilimo periodu kraujyje,
[0016] juos įvedus intraveniškai, lyginant su nemodifikuotų baltymų išsiskaidymo periodu (Abuchovskii ir kiti, Fermentai it medikamentai, red. CHolcenberg ir kiti, VViley-Interscience, New York, 367-383 psl. (1981), Nevvmark ir kiti, V.Appl. Biochem., 1982, 4
[0017] t., 185-189 psl.; Katre ir kiti, Proc. Natl. Acad. Sci. 5A, 1987, 84 t., 1487-1491 psl.). Be to, tokios modifikacijos gali padidinti baltymų tirpumą vandeniniuose tirpaluose, išvengti agregavimo, sustiprinti baltymo fizikinį ir cheminį stabilumą ir žymiai sumažinti baltymo imunogeniškumą ir antigeniškumą. To pasekoje gali būti pasiekiamas norimas biologinis aktyvumas įvedus gyvam organizmui tokius polimero-baltymo aduktus rečiau, arba mažesnėmis dozėmis, lyginant su nemodifikuotais baltymais.
[0018] Ypač yra naudingas polietilenglikolio (PEG) prijungimas prie baltymų, nes PEG pasižymi labai žemu toksiškumu žinduoliams (Karpenter ir kiti, Toxicol., Appl. Farmacol. 1971, 18 t., 35-40 psl.). Pvz., JAV leidžiama naudoti polietilenglikolio ir adenozindeaminazės aduktą, gydant žmogaus stiprų kombinuotą imunodeficito sindromą. Kitas pranašumas, pasiekiamas PEG konjugacija, yra tas, kad efektyviai sumažėja heterologinių baltymų imunogeniškumas ir antigeniškumas. Pvz., polietilenglikolio aduktas su žmogaus baltymu gali būti naudingas gydant kito tipo žinduolių susirgimus, nebijant imuninės reakcijos efektų pasireiškimo.
[0019] Polimerus, tokius kaip PEG, galima patogiai prijungti prie vienos ar kelių sugebančių reaguoti baltymo aminorūgščių liekanų, tokių kaip alfa-amino grupės amino-galo aminorūgščiij, epselon-aminogrupės šoninių lizino grandinių, sulfhidrilinės grupės cisteino šoninių grandinių, karboksilinės grupės aspartilo ir glutamilo šoninių grandinių, alfa-karboksilinė grupės karboksi-galo aminorūgšties, tirozino šoninės grandinės arba aktyvuotos glikozilinės grandinės, prijungtos prie asparagino, serino ar treonino kai kurių liekanų.
[0020] Aprašyta daugybė PEG aktyvuotų formų, tinkamų sąveikai su baltymais. Naudingi polietilenglikolio reagentai reakcijai su baltymų aminogrupėmis apima aktyvius anglies rūgšties esterius arba karbonato darinius, ypač tuos, kuriuose atskeliama grupė yra N-hidroksisukcinimidas, para-nitrofenolis, imidazolas arba 1-hidroksi-2-nitrobenzen-4-sulfonatas. Polietilenglikolio dariniai, turintys maleimido- ar halogenacetilo grupes yra naudingi reagentai modifikuojant sulfihidrilines grupes, nesurištas su baltymais. Analogiškai, polietilenglikolio reagentai, turintys amino-, hidrazino- ar hidrazido grupes, yra naudingi sąveikoje su aldehidais, kurie susidaro baltymuose, veikiant angliavandenilių liekanas periodatu.
[0021] Šio išradimo tikslas yra pateikti faktorių, iššaukiantį ankstyvųjų pirminių kraujodaros
[0022] Išradimo reziumė
[0023] Šiuo išradimu yra pateikiami nauji faktoriai, čia vadinami "kamieninių ląstelių faktoriai" (CSF), kurie pasižymi savybe stimuliuoti primityvių pirminių, įskaitant ankstyvąsias kraujodaros ląsteles, augimą. Šie faktoriai taip pat gali stimuliuoti nekraujodaros kamienines ląsteles, tokias kaip neuralinės kamieninės ląstelės ir gemalinės kamieninės ląstelės. Be to, šis išradimas taikomas polipeptidams nesutinkamiems gamtoje, kurie turi pakankamą dubliuojančią aminorūgščių seką, lyginant su natūraliai egzistuojančių kamieninių ląstelių faktoriumi.
[0024] Šis išradimas taip pat pateikia išskirtą DNR seką, naudojamą išskyrimui ekspresijos prokariotų ar eukariotų ląstelėse-šeimininkėse polipeptidinių produktų, turinčių
[0025] aminorūgščių sekas, pakankamai panašias lyginant su natūralios kilmės kamieninių ląstelių faktoriaus seka, siekiant aprūpinti pakankamu kraujodaros biologinio aktyvumu natūralios kilmės ląstelių kamienų faktorių. Tokios DNR sekos apima:
[0026] a) DNR sekos arba jų komplementarios grandinės, pateiktos Fig.14B, 14C, 15B, 15C, 42 ir 44; b) DNR sekos, kurios hibridizuotos pagal sekas, nurodytas a) arba jų fragmentus; c) DNR sekos, išskyrus genetinio kodo išsigimimą, kurios gali hibridizuotis su DNR
[0027] Be to, susidaro vektoriai, turintys tokias DNR sekas, ir tokiais vektoriais transformuotos ar transfekuotos šeimininko ląstelės. Taip pat šis išradimas apima CSF gavimo būdus, naudojant rekombinantines metodikas ir pažeidimų gydymo būdus. Be to, pateikiamos vaistinės kompozicijos, apimančios CSF ir antikūnus specifiškai surišančius CSF.
[0028] Išradimas taip pat apima efektyvų kamieninių ląstelių išskyrimo iš medžiagos, turinčios CSF, metodą, be to, šis metodas apima jonų mainų stadiją, chromatografinį išskyrimą ir/arba išskyrimą skysčių chromatografija.
[0029] Šiuo išradimu pateikiamas biologiškai aktyvus aduktas, turintis pailgintą skilimo periodą ir padidintą potencialą veikiant žinduolius, įskaitant CSF, kovalentiškai sujungtą
[0030] su vandenyje tirpstančiu polimeru, tokiu kaip polietilenglikolis ir polipropilenglikolis, kuriame nurodytas polimeras yra nepakeistas ar pakeistas iš vieno alkilo grupės galo.
[0031] Kitu šio išradimo aspektu pateikiamas anksčiau aprašyto adukto gavimo būdas, apimantis sąveiką CSF su vandenyje tirpstančiu polimeru, turinčiu mažiausiai vieną
[0032] galinę reakcijoje dalyvaujančią grupę, o taip pat gauto adukto valymo būdas, norint gauti produktą su pailgintu skilimo cirkuliuojant periodu ir padidintu biologiniu aktyvumu.
[0033] Fig.3 - chromatograma valant žinduolių CSF agliutininą (iš daigintų kviečių) - agarozės kolonėlėje Fig.4- žinduolių CSF valymas katijonine chromatografija
[0034] Fig.11 - parodyta žinduolių CSF faktoriaus aminorūgščių seka, išvesta iš baltymų
[0035] Fig.12 - parodyta: A. Oligonukleotidai žiurkės kamieninių ląstelių faktoriaus komplementariai DNR. B. Oligonukleotidai žmogaus kamieninių ląstelių faktoriaus DNR.
[0036] Fig. 13 - parodyta: A. Polimerazės ciklinės reakcijos (PCR) sustiprinimo schema žiurkės faktoriaus (CSF) komplementariai DNR. B. Polimerazės ciklinės reakcijos (PCR)sustiprinimo schema žmogaus faktoriaus (CSF) komplementariai DNR. Fig. 14 - parodyta: A. Žiurkės genominės DNR sekos paieškos strategija. B. Nukleino rūgščių seka žiurkės genominei DNR. C. Žiurkės faktoriaus SCF komplementarios DNR nukleino rūgščių seka ir aminorūgščių seka žiurkės baltymo SCF. Fig.15 - parodyta: A. Sekos paieškos strategija žmogaus genominei DNR. B.
[0037] Nukleino rūgščių seka žmogaus genominei DNR. C. Žmogaus faktoriaus CSF komplementarios DNR nukleino rūgščių sekos ir žmogaus baltymo CSF aminorūgščių sekos kompozicija.
[0038] Fig.16 - parodytas palyginimas aminorūgščių sekos žmogaus, beždžionės, šuns,
[0039] Fig.17 - parodyta žinduolių ląstelės ekspresijos vektoriaus V19.8 SCF struktūra. Fig.18 - parodyta žinduolių CHO ląstelės ekspresijos vektoriaus pDSVE struktūra.
[0040] Fig.20 - parodyta: A. Žinduolių SCF radioimuninės analizės duomenys. B. Imuno-išsodinto žinduolių CSF SDS-PAGE.
[0041] Fig.23 -pateikiama diagrama, iš kurios matyti žiurkės COS-1 ląstelės produkuojamo
[0042] Fig.24 - parodytas žiurkės rekombinantinio CSF efektas gydant Stilo pelių makrocitinę anemiją. Fig.25 - parodytas skaičius periferinių baltųjų kraujo kūnelių (WEC) Stilo pelių, apdorotų žiurkės rekombinantiniu CSF. Fig.26 - parodytas Stilo pelių, apdorotų žiurkės rekombinantiniu CSF, trombocitų skaičius. Fig.27 - parodytas Stilo pelių (WEC) diferenciacinis skaičius, apdorojant žiurkės rekombinantiniu SCF1"164 PEG 25. Fig.28 - parodytas Stilo pelių limfocitų rinkinys, apdorojant žiurkės rekombinantiniu SCF1"164 PEG 25. Fig.29 - parodytas paprastų primatų apdorojimo rekombinantine CSF seka efektas, išaugant periferinių WEC skaičiui. Fig.30 - parodytas paprastų primatų apdorojimo rekombinantine CSF seka efektas, išaugant hematokritų ir trombocitų skaičiui. Fig.31 - parodytos fotografijos: A. žmogaus kaulų čiulpų kolonijos, stimuliuotos žmogaus rekombinantiniu SCF1"162. B. Rait-Gemzo dažytos ląstelės iš kolonijos Fig. 31 A. Fig.32 - parodyti duomenys SDS-PAGE frakcijos iš kolonėlės su S-sefaroze iš Fig.33 chromatogramos. Fig.33 - pateikiama chromatograma žmogaus rekombinantinio SCF, išskirto iš E. coli kolonėlėje su S-sefaroze. Fig.34 - parodyti duomenys SDS-PAGE frakcijos iš kolonėlės C4 iš chromatogramos, parodytos Fig.35 : A. su redukuojančiu agentu, B. be redukuojančio agento. Fig.35 - pateikia chromatograma žmogaus rekombinantinio SCF, išskirto iš E. coli kolonėlėje C4. Fig.36 - pateikiama chromatograma žiurkės rekombinantinio SCF, išskirto iš CHO kolonėlėje su Q-sefaroze. Fig.37 - pateikiama chromatograma žiurkės rekombinantinio SCF, išskirto iš CHO kolonėlėje C4. Fig.38 - parodyti duomenys SDS-PAGE frakcijos iš C4 kolonėlės iš chromatogramos parodytos Fig.37. Fig.39 - parodyti duomenys SDS-PAGE rekombinantinio žiurkės SCF, išskirto iš išvalyto CHO, iki ir po deglikozilinimo. Fig.40 - parodyta: A. gel-filtracinė chromatograma rekombinantinio žiurkės pegiliruoto SCF1"164 reakcijos mišinio. B. gel-filtracinė chromatograma rekombinant. žiurkės nemodifikuoto SCF1"164.
[0043] Fig.42 - parodyta žmogaus SCF komplementarios DNR seka, gautos iš fibrosarkomos ląstelių linijos HT1080. Fig.43 - parodyta autoradiograma ląstelių COS-7, išreiškiančių žmogaus SCF1"248 ir CHO ląstelių, išreiškiančių žmogaus SCF1"164. Fig.44 - parodyta žmogaus SCF komplementarios DNR seka, gauta iš pūslinės karcinomos ląstelių linijos 5637. Fig.45 - parodytas apšvitintų pelių išgyvenimo procento padidėjimas, apdorojus
[0044] SCF.
[0045] Fig.46 - parodytas apšvitintų pelių išgyvenimo procento padidėjimas, po kaulų čiulpų su 5% klubo kaulo transplantacijos ir apdorojimo SCF. Fig.47 - parodytas apšvitintų pelių išgyvenimo procento padidėjimas po kaulų čiulpų su 0.1 ir 20% klubo kaulo transplantacijos ir apdorojimo SCF.
[0046] Daugybė šio išradimo aspektų ir pranašumų akivaizdūs šios biochemijos srities specialistams, peržiūrėjus sekantį detalų aprašymą, kurį papildo praktinio išradimo įgyvendinimo iliustracijos optimaliems variantams šioms dienoms.
[0047] Šiuo išradimu pateikiami nauji kamieninių ląstelių faktoriai ir DNR sekos, kurios koduoja visus arba dalį tokių SCF faktorių. Čia naudojamas terminas "kamieninių ląstelių faktoriai" arba SCF yra SCF natūralios kilmės (pvz. žmogaus SCF), o taip pat polipeptidai dirbtinės kilmės (t.y. besiskiriantys nuo randamų gamtoje), kurie turi aminorūgščių sekas ir glikozilinimą pakankamai panašius lyginant su tokiais natūralios kilmės kamieninių ląstelių faktoriais, kurie apsprendžia gamtinio kraujodaros kamieninio faktoriaus biologinį aktyvumą. Kamieninių ląstelių faktorius pasireiškia sugebėjimu stimuliuoti ankstyvųjų kraujodaros pirmtakų augimą, kurie gali subręsti ir virsti eritroidais, megakariocitais, limfocitais ir makrofaginėmis ląstelėmis. Žinduolių gydymas
[0048] CSF faktoriumi įgalina absoliutų kraujodaros ląstelių, tiek mieloidinių, tiek ir limfoidinių, padidėjimą. Viena iš kamieninių ląstelių kritinių charakteristikų yra jų sugebėjimas diferencijuotis į mieloidines ir limfoidines ląsteles (VVaisman, Science, 1988, 241 t., 58-62 psl.). Veikiant Stilo (8B pavyzdys) peles rekombinantiniu žiurkių faktoriumi SCF, pastebimas granuliocitų, monocitų, eritrocitų, limfocitų ir trombocitų padidėjimas. Veikiant paprastus primatus rekombinantiniu žmogaus SCF faktoriumi, pastebimas mieloidinių ir limfoidinių ląstelių padidėjimas (pavyzdys 8C).
[0049] Egzistuoja embrioninė ekspresija SCF ląstelėmis migraciniuose takuose ir chomingoviniuose melanoblastų, gemalinių ląstelių kraujodaros ląstelių centruose, galvos smegenyse ir nugaros smegenų chordoje.
[0050] Ankstyvosios pirminės kraujodaros ląstelės kaupiasi žinduolių kaulų čiulpuose, kuriuos veikia 5-fluoruracilas (5-FU). Chemoterapinis medikamentas 5-FU selektyviai išsekina vėlesnius kraujodaros pirmtakus. SCF faktorius yra aktyvus kaulų čiulpams po apdorojimo su 5-FU.
[0051] SCF biologinis aktyvumas ir pasiskirstymo audiniuose charakteris rodo jo pagrindinį vaidmenį embriogenezėje ir kraujodaroje, o taip pat potencialą gydant įvairius kamieninių ląstelių trūkumus.
[0052] Šis išradimas pateikia DNR sekas, kurios apjungia: kodonų, "pageidaujamų" ekspresijai išrinktų šeimininkų-nežinduolių įjungimo; skaldymo vietos pateikimą veikiant restrikcinės endonukleazės fermentams; aprūpinimą papildomomis pradinės, terminalinės ir tarpinės DNR sekomis, kurios palengvina lengvai ekspresuojamų vektorių konstravimą. Šis išradimas taip pat pateikia DNR sekas, kurios koduoja polipeptidų analogus ar išskiriamą SCF, kuris skiriasi nuo randamų gamtoje formų identiškumu ar keletu aminorūgščių liekanų (pvz. deleciniai analogai, turintys ne visas liekanas, skirtas SCF; pakeitimo analogai, kuriuose viena arba keletas specifinių liekanų pakeistos kitomis liekanomis; adityviniai analogai, kuriuose viena arba keletas amino rūgščių liekanų pridedama prie terminalinės arba medialinės polipeptido dalies) ir kurie pasižymi kai kuriomis arba visomis gamtoje sutinkamomis savybėmis. Šis išradimas ypač taikomas DNR sekoms, koduojančioms visą neapdorotos aminorūgščių sekos ilgį, o taip pat DNR sekas, koduojančias apdorotą SCF formą.
[0053] Šio išradimo naujos DNR sekos apima sekas, naudingas esant išskirtai ekspresijai prokariotinėse ar eukariotinėse polipeptidinių produktų šeimininkų ląstelėse, turinčiose mažiausiai dalį pirminės struktūrinės konformacijos ir vieną arba keletą gamtinės kilmės SCF biologinių savybių. Specifiškai, DNR sekos apjungia: a) DNR sekas, pateiktas
[0054] Fig.14B, 14C, 15B, 15C, 42 ir 44, arba jų komplementarias spirales; b) sekas, kurios hibridizuotos (hibridizacijos sąlygomis, aprašytomis 3 pavyzdyje, arba dar griežtesnėse sąlygose) su DNR sekomis Fig.14B, 14C, 15B, 15C, 42 ar 44 arba jų fragmentais; ir c) DNR sekas, kurios, išskyrus genetinio kodo degeneraciją, gali hibridizuotis prie DNR sekų Fig.14B, 14C, 15B, 15C, 42 ar 44. Specifiškai apimtos dalyse b) ir c) yra genominės DNR sekos, koduojančios SCF formos alelinius variantus ir/arba koduojančios SCF iš kitų žinduolių rūšių, ir gautos DNR sekos, koduojančios SCF, šio faktoriaus fragmentai ir jo analogai. DNR sekos gali įjungti kodonus, palengvinančius informacinės RNR transkripciją ir transliaciją mikrobiniuose šeimininkuose. Tokios gautos sekos gali būti lengvai sukonstruotos pagal Altono ir kt. metodus, publikuotus paraiškoje PST WO 83/04053.
[0055] Remiantis kitais šio išradimo aspektais, čia aprašytos DNR sekos, kurios koduoja polipetidus, turinčius SCF aktyvumą, yra vertingos dėl informacijos, kurią jos suteikia apie žinduolių baltymų aminorūgščių seką, kuri iki šiol buvo nepasiekiama. Šios DNR sekos taip pat yra vertingos kaip produktai, naudingi esant didelių mastelių SCF sintezei, padedant daugybei rekombinantinių metodikų. Kitais žodžiais tariant, šiuo išradimu pateikiamos DNR sekos naudojamos dirbant su naujais ir naudingais virusiniais ir cirkuliariniais DNR plazmidės vektoriais, naujomis ir naudingomis transformuotomis ir transfekuotomis prokariotinėmis ir eukariotinėmis šeimininkų ląstelėmis (įskaitant bakterijų ir mielių ląsteles ir kultūroje auginamas žinduolių ląsteles), ir naujais ir naudingais tokių ląstelių-šeimininkų kultivavimo metodais, tinkamų SCF ekspresijai ir šiam faktoriui giminingiems produktams.
[0056] Šio išradimo DNR sekos taip pat yra tinkamos panaudojant jas kaip žymėtus pavyzdžius izoliuojant žmogaus genominę DNR, koduojančią SCF ir kitus genus giminingiems baltymams, o taip pat komplementarios DNR sekoms ir kitų žinduolių rūšių genominei DNR.
[0057] DNR sekos taip pat gali būti panaudojamos įvairiuose alternatyviuose baltymų sintezės būduose (pvz., vabzdžių ląstelėse) arba žmogaus ir kitų žinduolių genetinės terapijos atveju. Manoma, kad šio išradimo DNR sekos gali būti panaudojamos dirbant su transgeninėmis žinduolių rūšimis, kurios galima panaudoti kaip eukariotinius "šeimininkus" gaminant SCF faktorių ir jo produktus dideliais kiekiais. Žr. Palmitero ir kitų bendrame straipsnyje žurnale Science 1983. 2221., 809-814 psl.
[0058] Šis išradimas pateikia išskirtą ir išvalytą gamtinės kilmės SCF (t.y. išvalytą iš gamtinio ir padarytą taip, kad pirminė, antrinė ir tretinė glikozilinimo konformacija ir charakteris būtų identiški natūralios kilmės medžiagai), o taip pat dirbtinės kilmės polipeptidus, turinčius pirminę struktūrinę konformaciją (t.y. nepertraukiamą aminorūgščių liekanų seką) ir glikozilinimą, pakankamai duplikatų natūralios kilmės kamieninių ląstelių faktoriui, tam kad jie pasižymėtų natūralios kilmės SCF faktoriaus kraujodaros biologiniu aktyvumu. Tokie polipeptidai apjungia darinius ir analogus.
[0059] Ypač siūlomame SCF variante, jis charakterizuojamas kaip prokarioto ar eukarioto šeimininko ekspresijos (pvz., bakterijų, mielių, aukštesniųjų augalų, vabzdžių ir žinduolių ląstelių kultūroje) DNR egzogeninių sekų produktas, gautas klonuojant genominę ar komplementarią DNR arba genetinės sintezės būdu. T.y., siūlomame SCF variante jis charakterizuojamas kaip "rekombinantinis SCF". Ekspresijos produktai tipiškuose mielių ( ass agomuse cerevisiae) ar prokariotų (pvz., E. coli) ląstelėse-šeimininkėse laisvi nuo susijungimo su kokiais nors žinduolių baltymais. Ekspresijos produktai stuburinių (pvz., žinduolių, besiskiriančių nuo žmogaus (COS ir CHO), ir paukščių) ląstelėse laisvi nuo susijungimo su kokiais nors žmogaus baltymais. Priklausomai nuo panaudojamo šeimininko, šio išradimo polipeptidai gali būti glikozilinti žinduolių angliavandeniais arba kitais eukariotų angliavandeniais, arba gali būti neglikozilinti. Ląstelė- šeimininkė gali būti pakeičiama panaudojant metodikas,
[0060] tokias kaip aprašytos Lii ir kitų darbe, J.Biol.Chem. 1989, 264 t., 13848 psl., kuris įvestas kaip išnaša. Be to, išradimo polipeptidai gali įtraukti išeiginio metionino aminorūgščių liekanas (l-padėtyje).
[0061] kitus SCF produktus, tokius kaip SCF peptidinius analogus. Tokie analogai įjungia SCF fragmentus. Naudojant anksčiau paminėtos Altono ir kitų (WO 83/04053) paraiškos
[0062] metodikas, galima lengvai sukonstruoti ir gauti genus, kurie koduoja ekspresiją mikrobinių, turinčių pirminę konformaciją, polipeptidų, besiskiriantys nuo čia aptariamų identiškumo terminais arba išsidėstymu vienos ar kelių liekanų (pvz., pakeitimai, terminaliniai ir tarpiniai prijungimai ir delecija). Alternatyviai, komplementarios DNR ir genomo genų modofikacijos gali būti lengvai įgyvendinamos su gerai žinomų lokališkai nukreiptų mutagenezių metodikų pagalba ir naudojamos SCF degeneruotiems analogams ir dariniams. Tokie produktai dalyvauja mažiausiai viena iš biologinių SCF savybių, bet gali skirtis nuo kitų. Kaip pavyzdžiai, išradimo produktai gali apjungti sutrumpintus produktus, pvz., delecijomis arba tuos, kurie stabilesni hidrolizei (ir todėl gali turėti labiau išreikštų ar ilgaamžiškesnių efektų, negu natūralios kilmės produktai); arba tie, kurie pakeisti pašalinimui ar pridėjimui vieni ar kelių potencialių centrų O-glikozilinimui ir/arba N-glikozilinimui, arba tie, kurie turi vieną ar keletą cisteino liekanų, pašalintų arba pakeistų, pvz., alanino ar serino liekanomis ir potencialiai lengviau aktyvioje formoje išsiskiria iš mikrobinių sistemų; arba tie, kurie turi vieną ar kelias tirozino liekanas, pakeistas fenilalaninu, ir lengviau ar sunkiau susiriša su baltymais taikinio ar receptoriais ant taikinio ląstelių. Be to, išradimas apima polipeptidinius fragmentus, dublikuojančius tik dalj nepertraukiamos amino rūgščių sekos ar antrinę SCF vidaus informaciją, ir šie fragmentai gali pasižymėti vienomis SCF savybėmis (pvz., receptoriaus ryšiu), o ne kitomis (pvz., ankstyvųjų kraujodaros ląstelių augimo aktyvumu). Užtenka paminėti, kad aktyvumas nėra būtinas kokiam nors vienam ar keliems išradimo produktams, bet pasižymi terapiniu naudingumu (žr., VVeiland ir kiti, Blood, 1982, 44 t., 173-175 psl.), arba nauda kituose kontekstuose, tokiuose kaip SCF antagonizmo analizės. Konkurentiniai antagonistai gali būti visai naudingi, pvz., SCF perprodukcijos atveju arba žmogaus leukemijos atvejais, kada piktybinės ląstelės perprodukuoja receptorius SCF, ką parodo SCF receptorių perprodukcija leukeminiuose blastuose (13 pvz.).
[0063] Išradimo panaudojamais polipeptidų analogais yra pranešimai apie imunines savybes sintetinių peptidų, kurie iš esmės dubliuoja aminorūgščių seką, išlikusią natūralios prigimties baltymuose, glikoproteinuose ir nukleoproteinuose. Konkrečiau buvo parodyta, kad santykinai mažo molekulinio svorio polipeptidai dalyvauja imuninėse fiziologiškai svarbių baltymų reakcijose, tokių kaip virusiniai antigenai, polipeptidiniai hormonai ir 1.1. Tokiose imuninese reakcijose polipeptidai apima: specifinių antikūnų susidarymo provokacijas imunologiškai aktyviuose gyvūnuose [(Lerner ir kt., Cell, 23, 309-310 (1981); Ross ir kt., Nature, 294, 654-656 (1981); Walter ir kt., Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 77, 5197-5200 (1980); Lerner ir kt., Proc.Natl.Acad. Sci.
[0064] USA, 78, 4882-4886 (1981); Wong ir kt., Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 79, 5322-5326
[0065] (1982); Baron ir kt., Cell, 28, 395-404 (1982); Dressman ir kt., Nature, 295, 185-160
[0066] (1982); Lerner, Sci.Amer., 248, 66-74 (1983).Žr. t.p. Kaiser ir kt., Sci. 223, 249-255
[0067] (1984)] reaguojančių į sintetinių baltymų, kurie artimai atkartoja peptidinių hormonų antrinę struktūrą, bet negali atkartoti jų pirminės struktūrinės konformacijos, biologines ir imunologines savybes.
[0068] Be to, šis išradimas apima tų polipeptidų klasę, kurie užkoduoti DNR dalimis, komplementaria ir baltymus koduojančia spirale žmogaus k-RNR ar genominėmis DNR
[0069] Šiuo išradimu pateikiami SCF polipeptidai apima, bet neapsiriboja SCF faktorius: 1-148, 1-162, 1-164, 1-165, 1-183 (Fig.15C); 1-185, 1-188, 1-189 ir 1-248 (Fig.42); ir 1-157,
[0070] 1-160, 1-161 ir 1-220 (Fig.44).
[0071] SCF faktorius gali būti išvalytas naudojant metodikas, kurios yra žinomos specialistams šioje biochemijos srityje. Tyrimo objektas apjungia SCF valymo metodus iš medžiagos, turinčios SCF, tokios kaip kondicinės terpės ar žmogaus šlapimo, plazmos, be kita ko metodas apima vieną ar kelias stadijas, tokias kaip: medžiagų, turinčių SCF, gryninimas jonų mainų chromatografija (katijonine ar anijonine chromatografija); medžiagų, turinčių SCF, gryninimas skysčių chromatografija, naudojant imobilizuojančias C4 ar C6 dervas; gryninimas skysčių chromatografija panaudojant imobilizuojantj lėktiną, t.y. SCF pririša prie imobilizuojančio lėktino ir eliuuoja naudojant cukrus, kurie yra konkurentai tokiam "pririšimui". Šių metodų panaudojimo detalės paaiškės iš SCF valymo aprašymo pateikto 1, 10 ir 11 pavyzdžiuose. Metodikos, aprašytos 2 pvz. JAV patente 4667 016 (Lay ir kt.), įtrauktos į aprašymą su išnaša, taip pat yra naudojamos, valant kamieninių ląstelių faktorių.
[0072] SCF izoformos išskiriamos naudojant standartines metodikas, tokias kaip metodikos, išdėstytos JAV paraiškoje reg. Nr. 421444 1989 spalio 13, pavadintoje "Eritrodarinių izoformos" (bendras valdymas), čia įtraukta kaip išnaša.
[0073] Šis išradimas taip pat pateikia farmacines kompozicijas, apimančias terapiškai efektyvius polipeptidinių produktų kiekius kartu su atitinkamais tirpikliais, konservantais, tirpinamais priedais, emulgikliais, promotoriais ir/arba nešikliais, naudojamais SCF terapijoje. Čia naudojamas terminas "terapiškai efektyvus kiekis" yra toks kiekis, kuris užtikrina terapinį efektą esant tam tikrai būklei ir paskyrimo režimui. Tokios kompozicijos yra skysčiai ar liofilizuotos formos arba kitaip išdžiovintos pagal receptūrą, ir įjungia tirpiklius su skirtingo turinio buferiais (pvz., Tris-HCI, acetatas, fosfatas), pH ir jonų jėgos reguliatoriai, tokie kaip albuminas ar želatina, tam kad sutrukdyti adsorbciją paviršiuje), detergentai (pvz., Tween-20, Tween-80, Pluronic F68, skrandžio rūgščių druskas), tirpinančius agentus (pvz., glicerinas, polietilenglikolis), antioksidantus (pvz., askorbino rūgštį, natrio metabsulfitą), konservantus (pvz., tiomersalį, benzilo alkoholį, parabenzeną), tūrio medžiagas ar koncentracijos modifikatorius (pvz., laktozė, manitolas), polimerų, tokių kaip polietilenglikolis, kovalentiškai pririštų prie baltymų (aprašyta žemiau, 12 pavyzdyje), komplekso sudarymas su metalo jonais ar preparato įvedimas į/arba ant polimerinių medžiagų granuliuotų preparatų, tokių kaip pieno rūgštis, poliglikolio rūgštis, hidrogeliai ir kt., ar liposomos, mikroemulsijos, miceliai, vienasluoksniai ar daugiasluoksniai nešikliai, eritrocitų "šešėliai" ar sferoplastai. Tokios kompozicijos gali turėti įtakos fiziniam būviui, tirpumui, išsiskyrimo gyvame organizme stabilumo laipsniui ir SCF buvimo gyvam organizme laipsniui. Kompozicijos pasirinkimas priklausys nuo baltymų, turinčių SCF aktyvumą, fizinių ir cheminių savybių. Pvz., produktas, gautas iš membranoje-surištos formos SCF, gali reikalauti receptūros, turinčios detergentų. Kompozicijos su reguliuojamu ar pastoviu išskyrimu turi lipofilinių formų receptūrą (pvz., riebiosios rūgštys, vaškai, aliejai). Taip pat išradimas apima granuliuotas kompozicijas, padengtas polimerais (pvz., poloksamerais ar poloksaminais) ir SCF, surištas su antikūnais, nukreiptais prieš audinių specifinius receptorius, ligandus ar antigenus ar surištus su ligandais audinyje specifiniais receptoriais. Kiti išradimo įgyvendinimo variantai apima granuliuotas formas, apsauginius apvalkalus, proteazių inhibitorius ar
[0074] prasiskverbimo sustiprintojus įvairiems įvedimo būdams, įskaitant parenteralinį, per kvėpavimo takus, per nosį ar per burną.
[0075] Šio išradimo polipeptidai gali būti "žymėta" priemone sujungimui su detekticine žymėta medžiaga (pvz., su Jodo-125 radioaktyvia žyme ar biotinilinimu), siekiant pateikti reagentus, tinkamus detekcijai ir kiekybiniam SCF ar jo ląstelių, turinčių receptorius, įvertinimui tvirtuose audiniuose ir skystuose pavyzdžiuose, tokiuose kaip kraujas ar šlapimas.
[0076] Biotinilintas SCF naudojamas kartu su imobilizuotu streptavidinu siekiant "praplauti" leukeminius blastus iš kaulų čiulpų autologinėje kaulų čiulpų transplantacijoje. SCF toksiniai konjugatai, tokie kaip ricinas (Ur, Prog Clin.Biol.Res. 1989, 288 t., 403-412
[0077] psl.), difteria-toksinas (Moolten.J. Natl. Con. Inst. 1975, 55t., 473-477) ir radioizotopai naudojami anti-neoplastinėje terapijoje (13 pvz.) ar sudarant kaulų čiulpų transplantacijoje kondicinį režimą.
[0078] Išradimo nukleino rūgščių produktai naudingi, jeigu pažymėti detekcinėmis žymėmis (tokiomis kaip radiožymės ir neizotopinės žymės, tokios kaip biotinas) ir panaudojami hibridizacijos procese, žmogaus SCF faktoriaus geno vietos nustatymui ir/arba bet kokio giminingo geno vietos nustatymui chromosominiame žemėlapyje. Jie taip pat panaudojami žmogaus SCF geno pažeidimų nustatyme genetiniame lygyje ir naudojami kaip genetiniai markeriai kaimyninių genų identifikacijai ir jų pažeidimams nustatyti. Žmogaus SCF genas koduojamas ant 12 chromosomos, o pelių SCF ant 10 chromosomos žemėlapių 1 aplinkoje.
[0079] SCF faktorius naudojamas pats vienas arba kartu su kitomis terapijomis gydant eilę kraujodaros pažeidimų. SCF galima panaudoti vieną arba su vienu ar keliais kraujodaros faktorių, tokiais kaip EPO, G-CSF, GM-SCF, CSF-1, IL-1-IL-11, IGF-1 ar IIF, gydant kraujodaros pažeidimus.
[0080] kaulų čiulpų masės sumažėjimu, kurią iššaukia toksiniai, radiaciniai ar imunologiniai pažeidimai ir kurie gali būti išgydyti su SCF. Aplatinė anemija yra taip pat kamieninių
[0081] ląstelių pažeidimas, ir šiuo atveju kraujodaros audiniai pakeičiami riebaliniais, ir pancitopenija. SCF sustiprina kraujodaros proliferaciją ir yra naudinga gydant aplastinę anemiiją (8B pvz.). Kaip žmogaus aplastinės anemijos modelį panaudoja Stilo peles (Jons, Exp.Hematol. 1983, 111., 571-580 psl.)- Buvo gauti perspektyvūs rezultatai panaudojus aplastinės anemijos gydymui giminingą citokiną, GM-SCF (Antin ir kt., Blood, 1987, 70 t., 129a psl.). Paroksizmalinė nokturalinė hemoglobinurija (PNG) yra kamieninių ląstelių pažeidimas ir charakterizuojama defektyvių trombocitų ir granuliocitų, o taip pat nenormalių eritrocitų, susidarymu.
[0082] Egzistuoja daugybė susirgimų, kurie gali būti išgydomi SCF faktoriumi. Tai apima: mielofibrozę, mielosklerozę, osteopetriozę, metastatinę karcinomą, ūmią leukemiją, daugybinę mielomą, Chodžkinso ligą, limfomą, Gašė ligą, Niemano-Piko susirgimą, Letterere-Sivo ligą, refraktorinę eritroblastinę anemiją, di Guglielmo sindromą, kongestinę splenomegaliją, Kala azarą, sarkoidozę, pirminę blužnies pancitopeniją, miliarinę tuberkuliozę, išbėrimų grybelinius susirgimus, fulminacinę senticemiją, maliariją, vitamino Bi2 ir folinės rūgšties deficitą, piridoksino deficitą, Daimondo Blakfano anemiją, hipopigmentinius pažeidimus, tokius kaip piebaldizmas, vitiligo. SCF eritroidinės, megakariocitinės ir granuliocitinės stimuliuojančios savybės pailiustruotos 8B ir 8C pvz.
[0083] Kraujodaros kamieninių ląstelių, tokių kaip pirmosios gemalinės ląstelės, melanocitai, išsivystę iš nervinės skiauterės, komisūraliniai aksonai, išsivystę iš dorsalinės nugaros chordos, normalių mezonefritinių irmetanefritinių kepenų kanalėlių kriptų ląstelės, ir apgaubiančių išaugų augimo sustiprėjimas pagerina jų būklę, kai įvyksta audinių pažeidimas šiose vietose. SCF naudojamas neurologinių pažeidimų gydymui ir yra nervo ląstelių augimo faktorius. SCF naudojamas apvaisinimo ne organizme metodikose ir nevaisingumo atvejais. SCF naudingas gydant žarnyno pažeidimus, atsiradusius dėl spinduliavimo ar chemoterapijos.
[0084] Yra mieloproliferacinių kamieninių ląstelių pažeidimai, tokie kaip policitemija, chroninė mielogenozinė leukemija, mieloidinė mataplazija, pirminė trombocitemija ir ūminės leukemijos, kurios gali būti gydomos naudojant SCF, anti-SCF antikūnus ar SCF-toksinų konjugatus.
[0085] Yra daugybė atvejų, kur užfiksuota išaugusi leukeminių ląstelių proliferacija paveikus kraujodaros ląstelių augimo faktoriams G-SCF, GM-SCF ir IL-3 (Deivei ir kt., 1988, 72 t., 1944-1949 psl.). Kadangi daugelio chemoterapinių medikamentų sėkmė priklauso nuo to, kad neoplatinės ląstelės daug aktyviau praeina vystymosi ciklą, negu normalios ląstelės, SCF, kaip toks, ar kartu su kitais faktoriais, veikia kaip augimo faktorius neoplatinėms ląstelėms ir padidina jų jautrumą toksiniams chemoterapinių medikamentų efektams. SCF receptorių padidinta ekspresija leukeminimas blastams parodyta 13 pvz.
[0086] Atliktas eilės rekombinantinių kraujodaros faktorių tyrimas, nustatant jų sugebėjimą sumažinti kritinį leukocitų sumažėjimą, įvykstantį dėl chemoterapijos ir radiacinės chemoterapijos. Nors šie faktoriai yra pakankamai naudingi šioje aplinkoje, egzistuoja ankstyvasis kraujodaros atsiskyrimas, kuris pažeistas ypač spinduliavimu, turi būti pakartotinai atnaujintas anksčiau, negu šie vėlesni augimo faktoriai pasireikš optimaliu veikimu. Vieno ar kartu su šiais faktoriais SCF naudojimas papildomai sumažina ar eliminuoja kritinį leukocitų ir trombocitų sumažėjimą, iššauktą chemoterapinio ar radiacinio poveikio. Be to, SCF įgalina padidinti antineoplatinio ar apšvietimo režimo dozę (19 pvz.).
[0087] SCF yra naudingas ankstyvųjų kraujodaros pirmtakų išplėtimui singeninėje, alogeninėje ar antologinėje kaulų čiulpų transplantacijoje. Buvo parodyta, kad kraujodaros augimo faktorių panaudojimas pratęsia neutrofilinio audinio atsistatymą po transplantacijos (Donahvvu ir kt. Nature, 1986, 321 t., 872-875 psl. ir Welt ir kt. J.Exp.Med. 1987, 165 t., 941-948 psl.). Kaulų čiulpų transplantacijai naudojami tokie trys scenarijai, vieni ar kartu: a) donoras apdorojamas vienu SCF ar kartu su kitais kraujodaros faktoriais iki kaulų čiulpų išsiurbimo ar periferinės kraujo leukoferozės tam, kad padidinti ląstelių, tinkančių transplantacijai, kiekį; b) kaulų čiulpai apdorojami ne organizme tam, kad juos aktyvuoti ar padidinti ląstelių skaičių iki transplantacijos; ir c) recipientas apdorojamas siekiant sustiprinti donoro kaulų čiulpų priėmimą.
[0088] SCF faktorius naudojamas kraujodaros kamieninių ląstelių efektyvumo genetinėje terapijoje, transfekcijos pagrindu (arba infekcijos su retrovirusiniu vektoriumi) sustiprinimui. SCF galima kultivuoti ir multiplikuoti ankstyvąsias kraujodaros pirmtakų ląsteles, kurios tinkamos transfekcijai. Kultūra gali būti padaroma su vienu SCF ar kartu su IL-6, IL-3 arba ir su tuo ir kitu. Po transfekcijos šios ląstelės supilamos į kaulų čiulpų transplantus pacientams, nukentėjusiems dėl genetinių pažeidimų (Lim, Prs, Nali, Acad. Sci. 1989, 86 t., 8892-8896 psl.). Genai, kurie naudojami gydant genetinius pažeidimus yra: adenozin-deaminazė, glikocerebrozidazė, hemoglobinas ir cistinė fibriozė.
[0089] SCF naudojamas gydant imunodeficitą (AIDS) ar sunkias kombinuotas būkles, kaip toks arba kartu su kitais faktoriais, tokiais kaip IL-7 (žr. 14 pvz.). Tokio efekto iliustracija yra SCF terapijos sugebėjimas padidinti absoliutų cirkuliuojančių limfocitų T-helperių
[0090] (CD4, OKT4) lygj. Šios ląstelės yra pirmi ląsteliniai taikiniai žmogaus imunodeficito viruso (HIV), privedančio prie imunodeficito būklės pacientus su AIDS (Montanier knygoje Nima T-Ceff Leukemia a/Lumphoma virus, red. Galio, Cold spring harbor, New Yor, 1984 369-370 psl.). Papildomai, SCF naudojamas kaip priešnuodis mielosupresiniam anti-HIV medikamentų, tokių kaip azidotimedinas (AZD), veikimui (Gogi, Life Sci. 1989, 451., Nr 4).
[0091] SCF naudojamas kraujodaros sugebėjimams atsistatyti po stipraus nukraujavimo, sustiprinimui.
[0092] Gyvo organizmo apdorojimas SCF naudojamas kaip reimunizacija imuninės sistemos kovoje su neoplazija (vėžiu). Terapeutinės naudos tiesioginio imuninės funkcijos sustiprinimo su neseniai klonuotu citokinu (IL-2) pavyzdys aprašytas (Rozenbergo ir kt., N.Eng.J.Med., 1987, 3131., 1485).
[0093] SCF įvedimas su kitais agentais, tokiais kaip vienu ar keliais kraujodaros faktoriais, vykdomas palaipsniui arba iš karto. Iki apdorojimo SCF, padidinamas pirmtakų kiekis, kas įgalina terminalinį veikiantį faktorių, tokį kaip C-CSF ar EPO. Jvedimo būdas gali būti intraveninis, į pilvą, po oda ar į raumenis.
[0094] Sis išradimas taip pat apima antikūnus specifiškai surišančius kamieninių ląstelių faktorių. Žemiau 7 pvz. aprašoma polikloninių antikūnų gamyba. Papildomas išradimo įgyvendinimas yra monokloniniai antikūnai, specifiškai surišantys SCF (žr.20 pvz.). Skirtingai nuo tradicinių (polikloninių) antikūnų preparatų, kurie paprastai apima įvairius antikūnus, nukreiptus prieš įvairius determinantus (epitopus), kiekvienas monokloninis antikūnas nukreiptas prieš vienintelį determinuotą antigeną. Monokloniniai antikūnai naudojami pagerinti diagnostinių ir analitinių metodų selekcijai ir specifiškumui, naudojant antigeno-antikūno surišimą. Be to, jie naudojami neutralizacijai ar SCF pašalinimui iš plazmos. Antras monokloninių antikūnų pranašumas yra tas, kad jie gali būti susintetinti naudojant hibridines ląsteles kultūroje, neužterštoje kitais imunoglobulinais. Monokloniniai antikūnai gali būti paruošiami iš kultivuotų hibridomos ląstelių nuosėdų skysčio arba iš ascitų, indukuotų pelių pilvo ertmėje hibridominių ląstelių inokuliatu. Ši hibridominė metodika aprašyta pirmiausiai Kelero ir Milšteino (Eug.J.lmmun. 1976. 6 t., 511-519 psl.), plačiai buvo naudojama hibridinėms ląstelių linijoms, kurios išskiria didelės koncentracijos antikūnius prieš daugybę specifinių antigenų, gamybai.
[0095] Sekantys pavyzdžiai taikomi išradimo pilnesnei iliustracijai, tačiau neapribojant išradimo apimties.
[0096] Kamieninių ląstelių, gautu iš Bufalo žiurkės kepenų ląstelių kondicinės terpės, faktoriaus valymas/ charakterizavimas.
[0097] SCF faktoriui, o taip pat rekombinantiniam žiurkės baltymui SCF. Vienas iš tokių aktyvumų yra jo poveikis ankstyvosioms kraujodaros ląstelėms. Šis aktyvumas gali būti išmatuotas analizuojant ląsteles, kurios sudaro kolonijas su aukštu dauginimosi potencialu (HPP-SCF) (Scebo ir kt., cit. aukščiau, 1988). Faktorių efektų ankstyvosiose kraujodaros ląstelėse tyrimui, HPP-SCF sistemoje, naudojami pelių kaulų čiulpai, paimti iš gyvūnų praėjus dviems paroms po apdorojimo 5-fluoruracilu (5-FU). Chemoterapinis medikamentas 5-FU selektyviai alina vėlesniuosius kraujodaros pirmtakus, dėl ko galima ankstyvųjų pirmtakų ląstelių detekcija ir faktoriai, kurie pasižymi tokių ląstelių veikimu. Žiurkės SCF užneša ant pusiau kietų agarizuotų kultūrų esant CF-1 ar IL-6. Agarizuotos kultūros turi pilną MakKoiso terpę (D1BCO), 30% jaučio serumo, 0.3%
[0098] agaro ir 2.105/ml kaulų čiulpų ląstelių. Pilna MakKoiso terpė susideda iš: 1xMakKois terpė, papildyta 0.1 mM piruvato, 0.24x būtinomis aminorūgštimis, 0.24x nebūtinomis aminorūgštimis, 0.027% natrio bikarbonatu, 0.24x vitaminais, 0.72 mM glutaminu, 25
[0099] Įig/ml serinu ir 12 |.ig/ml L-asparaginu. Kaulų čiulpų ląstelės buvo gautos iš Balb/c pelių, kurioms buvo daromos 150 mg/kg 5-fluoruracilo injekcijos. Kaulus išėmė praėjus 2 paroms po apdorojimo 5-FU, ir iš jų išplovė kaulų čiulpus. Raudonos kraujuotos ląstelės iki patalpinimo ant plokštelių, buvo lizuojamos raudonųjų kraujo kūnelių lizavimo reagentu (firma Bekton Dikenson). Tiriamąją medžiagą patalpino į 30 mm lėkšteles su klampiu mišiniu. Po 14 parų skaičiavo kolonijas (didesnes kaip 1 mm diametro), kurios turi tūkstančius ląstelių. Šis bandymas buvo naudotas gryninant natūralų, gaminamą žinduolių, žiurkės SCF faktorių.
[0100] Tipiniu tyrimo atveju žiurkės SCF iššaukia proliferaciją maždaug 50 HPP-CSF/200000 ląstelių. Žiurkės SCF pasižymi sinergetiniu veikimu pelių kaulų čiulpų ląstelėms, apdorotoms 5-FU; HPP-SCF kolonijos negalėjo susiformuoti esant vieninteliams faktoriams, tačiau kartu su SCF ir SCF-1, ir IL-6 šiame bandyme turėjo aktyvumą.
[0101] Kitas naudingas tiek gamtinės, tiek rekombinantinės kilmės žiurkės SCF biologinis aktyvumas yra sugebėjimas iššaukti pelių vaisinių ląstelių linijos, priklausančios nuo IL-4, MC/9 (ATCC CRL 8306), proliferaciją. MC/9 ląstelės buvo kultivuotos su IL-4 šaltiniu, pagal protokolą ATCC CRL 8306. Šiame biologiniame bandyme naudojama terpė buvo RPML 1640, 4% jaučio serumo, 5.10"5 mol/l 2-merkaptoetanolio ir 1x glutamin-pen-strap. MC/9 ląstelės greitai dauginosi paveikus SCG, nereikalaudamos kitų augimo faktorių. Ši proliferacija išmatuojama pirmiausiai ląsteles kultivuojant 24 vai. be augimo faktoriaus, po to esant po 5000 ląstelių kiekvienoje iš 96 plokštelės duobučių ir su tiriamuoju pavyzdžiu kultivuojant 48 vai., purtant 4 vai. su 0.5 3H-timidinu (santykinis aktyvumas 20 kiuri/mmol).Po to tirpalą išpylė ant stiklo pluošto filtro ir po to išmatavo specifinį radioaktyvumą. Šis bandymas buvo naudojamas valant žiurkės SCF, gautą iš žinduolių ląstelių po ACA 54 gel-filtracijos stadijos, žr. šio pavyzdžio 2 skyrių. Paprastai, SCF iššaukia 4-10 kartinį CPM augimą lyginant su fonu.
[0102] Žinduolių išvalyto SCF, tiek gamtinės kilmės tiek rekombinantinio, veikimas nepriklausomai nuo trukdančių faktorių, stimuliuojančių kolonijas (CSFs), buvo įvertinama ant normalių neišsekintų pelės kaulų čiulpų. SCF veikimo ant normalių kaulų
[0103] psl). Trumpiau, bendras kaulų čiulpų ląstelių kiekis po raudonųjų kraujo kūnelių lizavimo patalpinamas ant pusiau kietos agarizuotos kultūros, turinčios tiramąją medžiagą. Po 10 parų, skaičiavo kolonijų kiekį, turinčių klasterius iš daugiau kaip 40 ląstelių. Agarizuotos kultūros gali būti išdžiovintos ant stiklinių plokštelių, ir ląstelių morfologija gali būti nustatoma su specialiais histologiniais dažais.
[0104] SCF, stimuliuojantis kolonijų, turinčių nesubrendusių ląstelių, neutrofilų, makrofagų, eozinofilų ir megakariocitų augimą, nereikalaujant kitų faktorių. Iš 200 tūkst. ląstelių daugiau kaip 100 tokių kolonijų auga 10 parų laikotarpyje. Kaip žiurkių, taip ir žmogaus rekombinantinis SCF faktorius stimuliuoja eritroidinių ląstelių produkciją, kartu su EPO,
[0105] B. Kondicinė terpė
[0106] Bufalo žiurkės (BRI), iš Amerikos tipo kultūrų (ATCC CRI 1442), kepenų ląsteles SCF gamybai augino ant mikronešiklių 20-litrinėje perfuzinėje kultivavimo sistemoje. Šioje sistemoje buvo naudojamas Biolafit (modelis 1CC-20) fermentatorius, išskyrus tinklus,
[0107] kurie buvo naudojami išlaikyti mikronešikliams ir vamzdeliai parūgštinimui. Tinklai, kurių
[0108] porų diametras 75 |.im buvo saugomi nuo užsikimšimo mikronešiklių periodiškai prapučiant, tai atliekama reguliuojamų vožtuvų ir siurblių sistemos pagalba, valdoma ESM. Kiekvienas tinklas funkcionuoja kaip mitybinė terpė ir kaip derliaus surinkimo
[0109] vieta. Tokia osciliruojančios srovės savybė įgalina tinklo darbą be užsikimšimo. Parūgštinimo padavimas buvo vykdomas per silikonines žarnas (50 pėdų/15.4 m ilgio, vidinis diametras 0.25 d/6,3 mm, sienelės storis 0.03 d/0.76 mm). ERL 3A ląstelių kultivavimui naudojama auginimo terpė buvo sudaryta iš minimalios terpės (Erlzo, F.Gibko druskomis), 2 mmol glutamino, 3 g/l gliukozės, 2.95 g/l triptozės fosfato, 5%
[0110] jaučio serumo ir 5% veršiuko serumo. Galutinė terpė buvo tokia pati, išskyrus serumus. Reaktoriuje buvo 2 Citodex (Pharmacia) mikronešikliai, kurių koncentracija 5 g/l, ir buvo
[0111] supilamas 3.109 ląstelių ERL 3A inokuliatas, išaugintas kratomuose buteliuose ir išskirtas tripsinizacija. Šioms ląstelėms leido prisijungti prie mikronešiklių ir 8 paras ant jų augti. Augimo terpę perfuzavo per reaktorių pagal gliukozės poreikį. Gliukozės koncentracija buvo palaikoma 1.5 g/l. Po 2 parų, reaktorių perfuzavo šešiais terpės, neturinčios serumo, tūriais, kad pasišalintų didžioji dalis serumo (baltymo koncentracija mažiau 50 mg/ml). Po to reaktorius dirbo integruotu režimu, kol gliukozės koncentracija nenukrito iki 2 g/l. Nuo šio momento reaktorius dirbo esant pastoviam perfuzijos greičiui, maždaug 10 l/per parą. pH buvo palaikomas 6.9±0.3, reguliuojant anglies dioksido padavimą. Ištirpusio deguonies koncentracija buo palaikoma 20% aukštesnė, negu prisotinant oru, kadangi pagal poreikį buvo paduodamas grynas deguonis. Temperatūra buvo palaikoma 37±0.5°C.
[0112] Tokia nurodyta sistema generuoja maždaug 336 I kondicinės terpės, neturinčios serumo ir ją panaudoja kaip žaliavą gauti gamtiniam, gautam iš žinduolių ląstelių, žiurkės SCF faktoriui.
[0113] Kondicinę terpę, generuotą auginant BRI 3A ląsteles ir neturinčią serumo, skaidrina filtracijos būdu per 0.45 |.im Sartokapsules (firma Sartorius). Keletą įvairių partijų (41 I, 27 I, 39 I, 30.2 I, 37.5 I ir 161 I) atskirai koncentruojama, diafiltruojama/buferiniais mainais ir vykdoma jonų mainų chromatografija ant DEAE-celiuliozės vienodai visoms partijoms. Po to DEAE-celiuliozės partijas apjungia ir toliau papildomai apdoroja kaip vieną pavyzdį, kaip B2-5. Iliustracijai aprašytas 41 I apdorojimas. Nufiltruotą kondicinę terpę koncentruoja iki 700 I, naudojant tangentinės srovės ultrafiltracijos įrenginius (firma Millipor Pellicon) su 4 kasetėmis polisulfonine (molek.masė 10000) membrana. Bendras membranos plotas -20kv.pėdų (1.8 m2), pratekėjimo greitis-1095 ml/min ir filtracijos greitis 250-315 ml/min. Po to vykdomi diafitraciniai/buferiniai mainai anijonų mainų chromatografijos aparate, pridedant į koncentratą 500 ml buferio (50 mmol/l) Tris-HCI pH-7.8. Tirpalą pakartotinai koncentruoja iki 500 ml, naudojant ultrafiltracijos įrenginius su tangentine srove ir šią procedūrą pakartoja dar 6 kartus. Galutinai koncentruotas/diafiltruotas preparatas gaunasi 700 ml tūrio. Šį preparatą paleidžia per anijonų mainų kolonėlę su DEAE-celiulioze (5x20.4 cm; derva DE-52, f.Batman), kurią privedė prie pusiausvyros 50 mmol/l Tris-HCI buferiu pH-7.8. jvedus mėginį į kolonėlę praplaunama 2050 ml Tris-HCI buferiu ir įvedamas druskų gradientas (0-300 mmol/l natrio chlorido Tris-HCI buferyje, bendras tūris 41). Frakcijos imamos po 15 ml esant tekėjimo greičiui 167 ml/val. Chromatograma parodyta Fig.1. Kolonų skaičius atitinka biologinį aktyvumą HPP-CCF bandyme. Tiriama nurodytų frakcijų 100 |.il. Šioje Fig.1
[0114] pieš. neparodytos frakcijos, paimtos įvedant mėginį į kolonėlę ir praplauta frakcija. Jos neturėjo biologinio aktyvumo.
[0115] Visų kondicinės terpės partijų po koncentravimo, diafiltracinių/buferinių mainų ir anijonų mainų chromatografijos charakteristikos buvo identiškos. Šių partijų baltymų koncentracija nustatyta pagal Bredfordo metodą (Apl.Bioch. 1976, 72 t., 248-254 psl.)
[0116] su jaučio serumo baltymu, kaip standartu, ir sudarė nuo 30 iki 50 f.ig/ml. Bendras kondicinės terpės, naudojamos šiam preparatui, tūris buvo apie 336 y.\.
[0117] Apjungiamos frakcijos, turinčios biologinį aktyvumą pagal naudotą metodą ant DEAE-celiuliozės kolonėlės. Kiekvienai iš šešių kondicinės terpės partijų, aptartų aukščiau (pvz., frakcija 87-1114, pavaizduota Fig.1.), ir koncentruoja iki sumarinio tūrio 74 ml, naudojant maišomas Amikon kiuvetes ir membranas UM 10. Ši medžiaga paduodama ant gel-filtracinės ACA 54(firma EKB) kolonėlės (Fig.2.) privestos iki pusiausvyros Tris-HCI buferiu (50mmol/l), 50mmol/l natrio chloridu esant pH-7.4. Frakcijos imamos po 14 ml, esant tekėjimo greičiui 70 ml/val. Dėl to, kad inhibiciniai faktoriai eliuuojasi kartu su aktyviomis frakcijomis, aktyvumo pikas (HPP-CSF kolonijų skaičius) pasidaro išskaidytas. Tačiau pagal ankstesnes chromatogramas, bedras eliuatų aktyvumas koreliuoja su pagrindiniu baltymų piku ir todėl šios frakcijos apjungiamos.
[0118] Frakcijos 70-112 iš gel-filtracinės kolonos ACA 54 buvo apjungtos (500ml). Gautą
[0119] mišinį padalijo perpus, naudojant agliutinino (iš daigintų kviečių)-agarozės kolonėlę
[0120] (5x24.5cm; derva iš E-U Labaratoris, San-Mateo, Kalifornia) (daigintų kviečių agliutininas turi atitinkamą angliavandenių struktūrą), privestą iki 20 mmol/l Tris-HCL buferio, 500 mmol/l natrio chlorido esant pH-7.4. Po mėginių įvedimo, kolonėlę praplauna maždaug 2200 ml kolonos buferiniu mišiniu, po to atliekamas surištosios
[0121] medžiagos eliuavimas, paduodant N-acetil-D-gliukozamino 350mmol/l tirpalą, ištirpintą kolonos buferiniame tirpale, pradedant nuo 210 frakcijos (Fig.3.). Pila frakcijas po 13.25
[0122] ml esant tekėjimo greičiui 122 ml/val. Vieno chromatografijos bandymo rezultatai parodyti Fig.3. Frakcijų dalys, kurios buvo tiriamos, buvo dializuotos fiziologiniame tirpale su fosfatiniu buferiu. Dializės medžiagos (5 į.iI) tiriamos bandyme MC/( (Fig.3 duotos CPM reikšmės impulsai/min) ir po 10 į.iI HPP-SCF bandymui (Fig.3 parodyta kolonijų skaičius). Galima matyti, kad aktyvi medžiaga susiriša kolonoje ir eliuojasi N-acetil-D-gliukozaminu, tuo tarpu kai didžioji dalis priemaišų praeina per kolonėlę užnešant mėginius ir praplaunant. 4. Greitos srovės katijonų mainu chromatografija ant S- sefarozės Frakcijos 211-225 iš agliutinino (iš daigintų kviečių)-agarozės chromatografijos, parodytos Fig.3 ir ekvivalenčios frakcijos iš antrojo bandymo buvo apjungtos (375ml) ir dializuotos 25 mmol/l natrio formiate pH 4.2. Siekiant sumažinti tokiu rūgščiu tirpalu veikimo laiką, dializė buvo atliekama 8 vai. Šio dializės periodo pabaigoje mėginio tūris buvo 480 ml, kai pH reikšmė ir mėginio pralaidumas buvo artimi dializės buferiui. Dializės metu mėginyje atsiranda nuosėdos. Jas pašalina centrifuguojant 30 min. 22000x9.8 m2/sek. Po centrifugavimo supernatantą įveda ant greitos srovės kolonėlės su S-sefaroze (3.3x10.25cm, derva fimos Pharmacia), kuri privedama natrio-fosfato buferiu. Esant tekėjimo greičiui 465 ml/val, paima frakcijas po 14.2 ml. Po mėginio padavimo kolonėlė praplaunama 240 ml kolonos buferiniu tirpalu ir eliuoja surištą medžiagą gradientu 0-750 mmol/l natrio chloridu (natrio chloridas ištirpintas kolonos buferyje; bendras gradiento tūris 2200 ml), pradedant nuo 45 frakcijos, Eliuavimo profilis parodytas Fig.4. j surinktas frakcijas įdeda 200 į.iI Tris (0.97mol/l) privedus jo pH iki 7-7.4. Impulsų skaičius per min. (CPM) taip pat parodytas rezultatu, gautu biologiniame bandyme MC/9. Nurodytų frakcijų dalys dializuojamos fiziologiniame tirpale su fosfatiniu buferiu ir 20 j.il mėginį atiduoda bandymams. Iš Fig.4 galima matyti, kad didžioji dalis biologiškai aktyvios medžiagos praeina per koloną nesusirišusi. Priešingai, didesnė priemaišų dalis susiriša ir eliuojasi druskų gradientu.
[0123] 75 % izopropilo alkoholio) leidžia srove 540 ml/val greičiu per C4 kolonėlę (Vidac Proteis C4; 2.4x2 cm), kuri privesta A buferiu (62.5% amonio acetato (60 mmol/l+37.5% izopropanolio). jvedus mėginius, tekėjimo greit] sumažina iki 154 ml/val ir koloną praplauna 200 ml A buferio. Po to veikiama linijiniu gradientu nuo bufero A iki buferio B (bendras tūris 140 ml) ir surenka frakcijas po 9.1 ml. Mišinio porcijas, gautas po kolonėlės su S-sefaroze, kolonėlės C4 pavyzdys, praėjusį mišinį ir praplautą mišinį priveda iki jaučio serumo baltymų kiekio 40 (ag/ml, pridedant atitinkamus tūrius žaliavinio tirpalo 1 mg/ml ir produktas dializuojamas fiziologiniu tirpalu fosfatiniame buferyje. Analogiškai, gradiento frakcijų alikvotos po 40 |il apjungia su 360 jll I fiziologinio tirpalo su fosfatiniu buferiu, turinčiu 16 mg jaučio serumo baltymo ir šį mišinį dializuoja fiziologiniame tirpale su fosfatiniu buferiu. Šios skirtingos frakcijos analizuojamos MC/9 bandyme (alikvotos po 6.3 |il paruoštų gradiento frakcijų; impulsų skaičius per min.-žr Fig.5). Bandymo rezultatai rodo, kad maždaug 75% aktyvios medžiagos yra praeinančioje ir praplovimo frakcijose, o 25% gradiento frakcijose, parodytose Fig.5. SDS-PAGE (Laemli Nature, 1970, 227 t., 680-685 psl.) koncentruojantys geliai turi 4% akrilamido, o skiriamieji geliai-12.5% akrilamido (skirtingų frakcijų alikvotos parodytos Fig.6). Demonstruojamų gelių alikvotų pavyzdžius džiovino vakuume ir po to pakartotinai ištirpino, naudojant 20 įi I pavyzdžio apdoroto buferio (neredukuojantis, t.y. be 2-merkaptoetanolio) ir virino 5 min. prieš užnešant į gelį. A ir B juostos atitinkamai atvaizduoja žaliavinę kolonos medžiagą (75 į.i I
[0124] iš 890 ml) ir praėjusią frakciją (75 įi I iš 880 ml).
[0125] Kairiojoje figūros dalyje sunumeruoti žymėjimai rodo migracinę padėtį markerių
[0126] (sumažinti), turinčių molekulinį svorį 103 didesnį už nurodytus numerius. Šie markeriai yra fosforilazė (mol. sv. 97400), jaučio serumo baltymas (mol. sv. 66200), kiaušinio baltymas (mol. sv. 42700), anglies anhidrazė (mol. sv. 31000), sojos tripsino inhibitorius (mol.sv. 21500) ir lizocimas (mol. sv. 14400). 4-9 juostos atitinka fakcijas, paimtas po
[0127] gradiento (60 ^1 iš 9.1 ml). Gelis buvo nudažytas sidabru (Morisey, Anai. Bioch. 1981, 117 t., 307-310 psl.). Galima iš A ir B juostų palyginimo matyti, kad didžioji medžiagos dalis kuri gali nusidažyti, praeina per koloną. Nudažyta 4-6 frakcijų medžiaga truputį aukščiau ir žemiau esančiose dalyse mol sv. 31000- standartas-pagal biologinį aktyvumą sutampa su frakcijų gradientu (5 pieš.) ir yra biologiškai aktyvi medžiaga. Būtina pažymėti, kad ši medžiaga vizualiai matosi 4-6 juostose, bet ne A ar B todėl, kad daug didesnė dalis nuo bendro tūrio (0.66% nuo 4-6 frakcijų sumos, prieš 0.0084% nuo sumos A ir B) buvo užkrauta pirmu atveju. Iš šios kolonos 4-6 frakcijos buvo apjungtos.
[0128] Kaip buvo minėta anksčiau, maždaug 75% išaiškinto aktyvumo praeina per koloną C4 (Fig.5). Ši medžiaga buvo pakartotinai valyta chromatografiškai naudojant C4 dervą, praktiškai tokią, kaip aprašyta aukščiau, išskyrus tai, kad buvo naudojama daug didesnė kolona (1.4x7.8 cm) ir sumažintas srovės tekėjimo greitis (50-60 ml/val.) Maždaug 50% išaiškinto aktyvumo turėjo praeinanti frakcija ir 50% gradiento frakcija, kas yra analogiška SDS-PAGE aktyvioms gradiento frakcijoms bandyme, (Fig.6) Aktyvios frakcijos buvo apjungtos (29 ml).
[0129] Analitinė kolonėlė C4 praktiškai dirbo kaip ir aprašyta, gi frakcijos buvo ištirtos abiem biologiniais metodais. Kaip parodyta Fig.7, frakcijų, iš šios analitinės kolonos, biologiniai aktyvumai MC/9, o taip pat HPP-CSF eliuojasi analogiškai. Esant SDS-PAGE analizei (Fig.8) buvo išaiškintas baltymo, kurio molekulinis sv. 31000, kolonos frakcijoje buvimas, kuris ir sulaiko medžiagą, turinčią biologinį aktyvumą abiejuose bandymuose.
[0130] Aktyvi medžiaga, atitinkanti antrą (santykinai mažesnį) aktyvumo piką, registruotą chromatografijoje ant S-sefarozės (pvz. Fig.4, 62-72 frakcijos, ankstyvosios frakcijos druskų gradiente) taip pat buvo išvalyta C4 chromatografijos metodu. Ji pademonstravo tokias pačias charakteristikas ant SDS-PAGE ir turėjo tokią pačią N-galo amino rūgščių seką (žr. 2D pvz.), kaip ir medžiaga, gauta C4 chromatografijoje iš praeinančių frakcijų ant S-sefarozės. 6. Valymo reziumė
[0131] Aprašytos aukščiau 1-5 apibendrintos valymo stadijos pateiktos 2 lentelėje.
[0132] skirtame chromatografijai ant S-sefarozės šio pavyzdžio dializės eigoje, buvo pašalinta centrifuguojant. Po centrifugavimo pavyzdys turėjo maždaug 264mg baltymo.
[0133] 3Aktyvių gradiento frakcijų iš dviejų bandymų ant C4 kolonos suderinimas paeiliui, kaip ir aprašyta.
[0134] 4Sekančioje stadijoje (šis pvz. aukščiau) buvo naudota tik 450 ml šios medžiagos. 5Nustatyta Bredfordo metodu (žr. aukščiau, 1976), išskyrus aptartus atvejus.
[0135] įvertinimas, remiantis intensyvumu nudažius sidabru po SDS-PAGE, ir po aminorūgščių sudėties analizės, kaip aprašyta 2 pavyzdžio skyriuje.
[0136] Apjungtų gradiento frakcijų po dviejų praleidimų ant C4 didelių išmatavimų kolonos, SDS-PAGE duomenys pateikti Fig.9. j pirmą C4 kolonėlę pakrovė 60 |ul mišinio (1 juostelė) ir į antrą C4 koloną-40 f.il mišinio (2 juostelė). Šios gelio juostelės buvo nudažytos sidabru. Molekulinio svorio markeriai buvo tokie patys, kaip aprašyta Fig.6. Kaip buvo paminėta, difuziškai migruojanti medžiaga, kurios molekulinis svoris aukštesnis ir žemesnis lyginant su markeriu 31000, yra biologiškai aktyvi medžiaga. Didelio laipsnio heterogeniškumą apsprendžia glikozilinimo heterogeniškumas.
[0137] Norint charakterizuoti glikozilinimą, išvalyta medžiaga paveikiama jodo izotopu J-125, apdorojama daugybe glikozidazių ir analizuojama SDS-PAGE metodu (atstatytomis sąlygomis) autoradiografijos pagalba. Rezultatai parodyti Fig.9. 3 ir 9 juostelės yra žymėta jodo izotopu medžiaga be jokio glikozidazinio apdorojimo. 4 ir 8 juostelės atitinka izotopu žymėtą medžiagą, apdorotą glikozidazėmis, kaip aprašyta žemiau: 4 juostelė-neuraminidaze, 5-neuraminidaze ir O-glikanaze, 6-N-glikanaze, 7-neuraminidaze ir N-glikanaze. Apdorojimo sąlygos: 5 mmol/l 3-((3-cholamidopropil)dimetilamonio)-1-propansulfonato (CHAPS), 33 mmol/l 2-merkaptoetanolio, 10mmol/l Tris-HCI buferio, pH 7-7.2, 3 valandas, esant 37°C temp. Neuraminidazė (iš Arthrobacter ureafaciens organizmo, firma Calbiochem) buvo naudojama galutine koncentracija 0.23 U/ml. O-glikanazė (Genzim; endo-alfa-N-acetil-galaktozaminazė) buvo naudojama 45 mU/ml koncentracijos; N-glikanazė (Genzim; peptidas: N-glikozidazė F; peptidas-N4 (N-acetil-beta-gliukozaminil asparaginamidazė) naudojama 10 U/ml koncentracijos.
[0138] Gauti rezultatai buvo analogiški tiems, kurie pateikti Fig.9, apdorojant žymėtą išvalytą SCF glikozidazėmis ir vizualiam įvertinimui po SDS-PAGE dažant sidabru.
[0139] Esant būtinumui, buvo atliekami įvairūs kontroliniai kultivavimai. Juos sudarė: kultivavimas atitinkamame buferyje, be glikozidozės siekiant patvirtinti, kad rezultatus įtakojo glikozidazių preparatų pridėjimas. Kultivavimas su glikoziduotais baltymais (pvz., glikozilintu rekombinantiniu žmogaus eritropoetinu) kaip žinoma, yra substratai glikozidazėms, norint patvirtinti, kad naudoti glikozidaziniai fermentai buvo aktyvūs; ir kultivavimas su glikozidazėmis, tačiau ne su substratais, siekiant patvirtinti, kad pačios vienos glikozidazės neįtakoja ar netrukdo vizualiniam gelio juostelių įvertinimui.
[0140] Be kita ko, glikozidazinis apdorojimas buvo vykdomas su endo-beta-()-acetilgliukozamidaze F (endo F; ()E()Diupon) ir su endo-beta-()-acetilgliukozaminidaze H (endo H; firma ()E()Diupon) ir šiose kultivavimo operacijose esant atitinkamai kontrolei. Endo apdorojimo sąlygos buvo tokios: 3 min. virinama esant 1 masės % SDS, 100 mmol/l 2-merkaptoetanoliui, 100 mmol/l etilendiamintetra-acto rūgščiai, 320 mmol/l natrio fosfatui, pH 6; po to seka 3-kartinis praskiedimas įvedant Nonidet Pi-40 (1.17 tūrio% galutinė koncentracija), natrio fosfato (200 mmol/l galutinė kone.) ir endo F (7 U/ml galutinė koncentracija). Endo H apdorojimo sąlygos buvo analogiškos, išskyrus tai, kad SDS koncentracija buvo 0.5% (masė/tūris) ir endo H buvo naudojama 1(.ig/ml koncentracijos. Rezultatai su endo F buvo tokie patys kaip ir su N-glikanaze, tuo tarpu kai endo H neveikė išvalytos SCF medžiagos.
[0141] Iš aukščiau aprašytų glikozidazės eksperimentų galima padaryti eilę išvadų. Įvairūs apdorojimai N-glikanaze (kuri pašalinama kaip kompleksinis, taip ir N-surišantis
[0142] 4671 psl.) endo F, kuri veikia analogiškai N-glikanazei (Elder ir Alexander, Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1982, 79 t., 4540-4544 psl.), endo H, kuri pašalina didelius manozinius ir kai kuriuos N-surišančius hibridinio tipo angliavandenius (Tarentino ir kt. Meth.Enzym. 1978, 50C t., 574-580 psl.), neurominadaze, kuri pašalina sialinės rūgšties likučius, ir O-glikanaze, kuri pašalina kai kuriuos O-surištus angliavandenius (Lambin ir kt. Bioch. Soc.Trans, 1984, 12 t., 599-600 psl.), įgalina manyti sekančiai. Egzistuoja kaip N-, taip ir O-surišti angliavandeniai; didesnė N-surištų angliavandenių dalis priklauso kompleksiniam tipui; egzistuoja sialinė rūgštis, be kita ko nemažesnė jos dalis įeina į O-surišančias funkcines grupes. Iš duomenų apie amino rūgščių seką (2
[0143] kad apdorojant N-glikanaze endo F ir N-glikanaze/neuraminidaze heterogeninę medžiagą, matomai, SDS-PAGE pagalba, gali paversti į greičiau migruojančias formas kurios daug homoheniškesnės, atitinka tas išvadas, kad visa ši medžiaga yra vienas ir tas pats polipeptidas, kurio heterogeniškumas iššauktas heterogeniškumo glikozilinimo metu. Taip pat pažymėtina, kad mažos formos, gautos kombinacijų, apdorojant skirtingomis glikozidazėmis metu, turi molekulinį svorį nuo 18 iki 20 tūkst., markerių, naudojamų SDS-PAGE, molekulinio svorio atžvilgiu.
[0144] 31 tūkst., esant SDS-PAGE, yra biologiškai aktyvi medžiaga, turinti tą pačią pagrindinę polipeptidinę grandinę, yra tas faktas, kad amino rūgščių sekos duomenys, gauti iš medžiagos, migruojančios šioje srityje (pvz., po elektroforezės ir apdorojimo bromcianu, 2 pvz.), atitinka, kas pademonstruota išskirtam genui, kurio ekspresija rekombinantinės DNR priemonėmis priveda prie biologiškai aktyvios medžiagos (4
[0145] 2 pavyzdys. Žinduoliu SCF faktoriaus amino rūgščiu sekos analizė
[0146] A. Išvalyto baltymo atvirkščių fazių aukšto efektyvumo skysčiu chromatografija
[0147] Maždaug 5 Į.ig SCF faktoriaus, išvalyto kaip parodyta pvz. 1 (koncentracija 0.117 mg/ml) leidžiama atvikščios fazės HPLC sistemoje, naudojant C4 žemo poringumo koloną (VVidak, porų plotis 30 mm, kolonos dydis 2x15 cm). Baltymas eliuojasi linijiniame gradiente nuo 97% mobilios fazės A (0.1% trifluracto rūgšties)/3% mobilios fazės B (90% acetonitrilo 0.1% triftoacto rūgštyje) iki 30% judančios fazės A/70% judančios fazės B 70 min., su sekančiu trumpalaikiu eliuavimu dar 10 min., esant srovės tekėjimo greičiui 0.2 ml/min. Baigus chromatografiją tuščiu buferiniu tirpalu 5C, išryškėja vienintelis simetriškas pikas, esant sulaikymo laikui 70.05 min., kaip parodyta Fig.10. Šiomis sąlygomis negalima buvo stebėti kokių nors pikų, kuriuos duotų pagrindiniai teršiantys baltymai.
[0148] SCF faktorius, išvalytas kaip 1 pavyzdyje (0.5-1.0 nanomolių) apdorojamas tokiu būdu: ()-glikanaze, fermentu, kuris specifiškai atriša asparagino-surištas angliavandenių funkcines grupes, kurios kovalentiškai pririštos prie baltymų (žr., 1D pvz.). 6 ml sumaišytos medžiagos iš 4-6 kolonos C4 (Fig.5) frakcijos išdžiovino vakuume, po to pripylė 150 į.iI CHAP5 tirpalo (14.25 mmol/l), 100 mmol/l 2-merkaptoetanolio, 335 mmol/ l natrio fosfato pH -8.6 ir kultivavo 95 min. 37°C temperatūroje. Pridėjo dar 300 į.iI 74 mmol/l natrio fosfato tirpalo, 15 U/ml //-glikanazės pH-8.6 ir dar kultivavo 19 vai. Po to pavyzdį užnešė j 9-18% SDS-poliakrilamidinį gradientinį gelį (0.7 mm storio. 20x20 cm). Baltymines juostas gelyje elekroforetiškai pernešė ant polivinildifluorido (PVDF. firma Millipor Corp.), naudojant 10 mmol/l Kapso buferį (pH 10.5), esant pastoviai 0.5A srovei 1 vai. (Macudaira, J.Biol., Chem. 1987, 261 t., 10035-10038 psl.). Vizualizavimui perneštos baltymų juostos buvo nudažytos Coomasi Blue. Buvo aptiktos juostos, kurių molek. sv. 29-33 tūkst. ir 26 tūkst., t.y. deglikozilinimas praėjo tiktai dalinai (lyginti su 1D pvz., Fig.9.). Pirma juosta atitinka nesuardytą medžiagą, o paskutinė-medžiagą, iš kurios pašalintas N-surišantis angliavandenis. Gelio dalis išpjauna ir patalpina (40%-molek. sv. 29-33 tūkst. ir 80%-baltymui su molek. sv. 26000) į baltymų sekų analizatorių (Appl Biosystem Inc., modelis 477). Baltyminių sekų analizę atlieka naudojant programas, kurias pateikia gamintojas (Hevik ir kt., J.Biol.Chem. 1981, 256 t., 7990-7997 psl.), o išsiskyrusias feniltiohidantoinines aminorūgštis analizuoja srovėje, naudodami atvirkščių fazių aukšto efektyvumo skysčių chromatografiją su C18 mikroporomis. Abi pusės nerodė signalų
[0149] 20-23 sekų ciklams, dėl ko manoma, kad abi šios medžiagos nepraeina sekų analizės, naudojant metodologiją su Edmano chemija. Tokio sekų eilės išaiškinimo bandyme fono lygis yra 1-7 pikomoliai, kas yra daug žemiau už tokį baltymų kiekį, koks yra juostose. Pagal šiuos duomenis galima teigti, kad baltymas juostose blokuojamas N-gale.
[0150] C. Elektroforetiškai pernešto baltymo skaldymas ciano bromidu in situ ir sekos analizė Norint patvirtinti tai, kad baltymas iš tikrųjų buvo blokuotas, iš sekų analizatoriaus (B dalis) pašalino membrana ir in situ dėmėtas juostas suskaldė ciano bromidu CNBr (5% tirpalas 70%-tinėje skruzdžių rūgštyje) 45°C temperatūroje, 1 vai. Po to išdžiovino ir analizavo sekas. Buvo fiksuoti stiprūs sekų signalai, atitinkantys vidinius peptidus, gautus suskaldžius metionilo-peptidinį ryšį ciano bromidu. Abi juostos davė identiškus sumaišytos sekos signalus, išvardintos žemiau pirmiems penkiems ciklams.
[0151] Buvo sunku nuspėti blokuojančios funkcijos, esančios prie SCF galinės aminogrupės, cheminę prigimtį. Šis blokavimas gali būti potransliacinis gyvam organizme (F.VVorld, Ap.Rev.Bioch. 1981, 50t., 783-814 psl.) arba gali vykti valymo metu ne organizme. Dažniausiai buvo stebimos dvi potransliacinės modifikacijos. Gali vykti atitinkamų N-galo aminorūgščių, tokių kaip Ala, Ser ir kt., acetilinimas, kurį ir katalizuoja N-alfa-acetil-transferazė. Tai galima patvirtinti izoliacija ir N-galo blokuoto peptido masės-spektrofotometrine analize. Jeigu baltymo galinė aminogrupė yra glutaminas, tai gali vykti jo gama-amido deamidinimas. Po to gali vykti ciklizacija, įjungianti gama-karboksilatą ir laisvą N-terminalą susidarant piroglutamatui. Norint aptikti glutamatą, gali būti naudojamas fermentas piroglutamato aminopeptidaze. Šis fermentas pašalina piroglutamato likutį, palikdamas laisvą galinę aminogrupę. Sekų analizei po to galima naudoti Edmano chemiją.
[0152] SCF (išvalytą kaip I pvz., 400 pikomolių) kultivuoja 50 mmol/l natrio fosfatiniame buferyje (pH 7.6, kuriame yra ditiotreitolas ir etilendiamintetraacto rūgštis) su 1.5 vienetais piroglutamino rūgšties iš veršiuko kepenų (pE-AP) amidopeptidazės 37°C temperatūroje 16 vai. Po to reakcijos mišinį patalpina į baltymų sekų analizatorių. Pagrindinė seka gali būti identifikuota per 46 ciklus. Pradinė išeiga buvo maždaug 40%, o galutinė - 94.2%. SCF N-galo sekos, įskaitant piroglutamino rūgštį, buvo:
[0153]
[0154] His-xxx-Trp-Leu-Arg-Asp- xxx, 43 padėtyje neiššifruota. Šie rezultatai rodo, kad SCF turi piroglutamino rūgštį kaip N-galinę grupę.
[0155] SCF faktorius, išvalytas kaip parodyta 1 pavyzdyje, (20-28 (.ig; 1.0-1.5 nanomolių) apdorojamas N-glikanaze, kaip aprašyta 1 pvz. Šiuo atveju fiksuojamas pilnas pavertimas j medžiagą, kurios molek. sv. 26000. Šj pavyzdį džiovino ir suskaldė ciano bromidu 70% skruzdžių rūgštyje (5% bromciano) 18 vai. kambario temperatūroje. Suskaldytą produktą skiedė vandeniu, džiovino ir pakartotinai ištirpino 0.1% trifluoracto rūgštyje. Bromciano peptidai buvo išskirti atvirkščių fazių skysčių aukšto efektyvumo chromatografijos metodu, naudojant žemo poringumo C4 koloną ir eliuavimo sąlygas identiškas aprašytoms šio pavyzdžio A skyriuje. Buvo išskirta keletas pagrindinių peptidų frakcijų ir išanalizuota jų seka. Rezultatai pateikiami lentelėje:
[0156] Išvalytas SCF, kaip 1 pvz. (20 (ig) 160 į.iI bikarbonatiniame moliariniame tirpale buvo degeneruotas su 1 (.ig tripsino 37°C temperatūroje. 3.5 vai. Degeneravimo produktas buvo iš karto perneštas į koloną su atvirkščia faze C4 (žemo poringumo). Aukšto efektyvumo skysčių chromatografiją vykdė identiškomis eliuavimo sąlygomis, kaip aprašyta šio pavyzdžio A skyriuje. Visi eliuotų peptidų pikai turėjo sulaikymo periodus besiskiriančius nuo tų, kurie buvo pastebėti nedegeneruoto SCF atveju (A skyrius). Išskirtų peptidų sekų analizė pateikiama:
[0157] BRL- SCF peptidu seku, po Saurens Glu- C proteazinio skaldymo, išskyrimas ir nustatymas
[0158] SCF valė pagal 1 pavyzdį (20 mg/150ml 0.1 M amonio bikarbonato tirpale) ir veikė Glu-C proteaziniu skaldymu, santykiu proteazė-substratas 1:20. Procesas vyko 18 vai. 37°C temperatūroje. Produktas tirtas aukšto efektyvumo atvirkščių fazių siaurakanaline skysčių chromatografija. Buvo surinktos 5 pagrindinės frakcijos ir paskirstytos taip:
[0159] SCF (2mg) 10 ml amonio bikarbonato išdžiovino iki pastovaus svorio vakuuminiu centrifugavimu ir po to dar kartą ištirpino 100 ml ledinėje acto rūgštyje. Į tirpalą įpylė 10-20-kartinį moliarinį BNPS-skatolo perteklių ir mišinį termostatavo 50°C 60 min. Reakcijos mišinys po to buvo išdžiovintas vakuuminiu centrifugavimu. Išdžiovintas likutis po to buvo ekstrahuotas 100 ml vandens ir dar kartą 50 ml vandens. Apjungtus ekstraktus po to analizavo, kaip aprašyta aukščiau. Buvo stebima tokia seka:
[0160] Padėtis 28 nebuvo tiksliai nustatyta: ji buvo nustatyta kaip Asn, esanti potencialaus glikozilinimo N-surišimo vietoje.
[0161] SCF-baltymo (500 pikomolių) alikvota buvo patalpinta į 10 mM natrio acetato buferį, pH 4.0 (galutinis tūris 90 ml) ir pridėta Brij-35 iki 0.05% (masė/tūriui). Kiekybiniam baltymo nustatymui ėmė 5 ml alikvotą. 40 ml pavyzdžio praskiedė iki 100 ml aukščiau minėtu buferiu, po to pridėjo karboksipeptidazės P (iš Penicillium janthinellum) santykiu fermentas-substratas 1:200. Procesą vykdė 25°C; 20 ml alikvotas ėmė po 0, 15, 30, 60 ir 120 min. Procesą nutraukdavo kiekvieną kartą nurodytu laiku pridėdami trifluoracto rūgšties iki galutinės koncentracijos 5%. Pavyzdžiai buvo išdžiovinami ir aminorūgščiu išsiskyrimas buvo nustatomas reakcija su dabsilchloridu (dimetil-aminobenzensulfonilchloridu) 0.2 mM NaHC03 (pH 9.0) 70°C temperatūroje 12 min.
[0162] (Chang ir kt. Meth.Enzym. 90, 41-48, 1983). Susidariusios aminorūgštys (16 kiekvieno pavyzdžio) buvo analizuojamos siaurakanaliu atvirkščių fazių HPLC metodu, modifikuotu Chang ir kt. (Techn. in Protein Chem, T.Hugli, ed. Ac.Press, NY (1989), 305-311 pp). Kiekvieną nurodytą momentą kiekybiniai rezultatai buvo gauti palyginant su standartinėmis žinomomis aminorūgštimis (1 pikomolis). Pradžioje buvo stebimas suardytas glicinas. Inkubacijos metu vienintelė aminorūgštis, kurios išaugo kiekis, buvo alaninas. Po 2 inkubacijos vai., buvo nustatytas bendras kiekis Ala 25 pikomoliai: ekvivalentiškas 0.66 moliui Ala, išlaisvintas iš molio baltymo. Šis rezultatas rodo, kad gamtinė SCF molekulė žinduolių organizme turi Ala karboksilinės liekanos pavidale, kas atitinka C-galo S-2 peptido sekos analizę, kuri turi C-galo Ala. Ši išvada taip pat sutinka su žinomu karboksipeptidazės specifiškumu, PtLu ir kt., J.Chromat. 447, 351-364 (1981). Pvz., skaldymas nutraukiamas, jeigu sutinkama seka Pro-Val. S-2 peptidas turi seką S-R-V-S-V-(T)-K-P-F-M-L-P-P-V-A-(A) ir apspręstas C-galo peptidu SCF (žr. šio pavyzdžio skyrių).
[0163] C-galo seka — P-V-A-(A) riboja proteazinį skaldymą tiktai iki Ala. Peptido S-2 aminorūgščiu sudėtis parodo atliekamas 1 Thr, 2 Ser, 3 Pro, 2 Ala, 3Val, 1 Met, 1 Leu, 1 Phe, 1 Lys, 1Arg, viso 16 liekanų. Nustatytos 2 Ala liekanos rodo, kad gali būti 2 Ala liekanos šio peptido C-gale (žr. lentelę skyriuje G). Tokiu budu BRL SCF baigiasi Ala 185.
[0164] Apjungus rezultatus, gautus po nepažeisto SCF, po jo N-galo pirogliutamino rūgšties, (2) CNBr-peptidų, (3) tripsino peptidų, (4)4 Glu ir C-peptidazės fragmentų pašalinimo sekos analizės, buvo nustatytos N- ir C-galo sekos (11 pieš.) N-galo seka prasideda pirogliutaminine rūgštimi ir baigiasi Met"48. C-galo seka turi 84/85 aminorūgštis (padėtys nuo 82 iki 164/165). Seka nuo 49 iki 81 padėčių nebuvo pastebėta nei viename išskirtame peptide. Tuo labiau didelio, po BNPS-skatolinio skaldymo, peptido nustatyta seka buvo kaip aprašyta šio pavyzdžio H skyriuje. Iš šių papildomų duomenų, o taip pat iš DNR sekos, gautos iš žiurkės SCF (3 pvz.), C- ir N-galo sekos gali būti suprastos ir gali būti nustatyta bendra seka, kaip parodyta Fig.11. Molekulės N-gale yra pirogliutamimno rūgštis; C-gal-Ala, ką patvirtina pirogliutamataminopeptidazinis ir atitinkamai karboksipeptidazinis procesas.
[0165] Iš sekų duomenų išplaukia, kad Asn-72 glikozilinta; Asn-109 ir Asn 120, matomai, glikozilintos kai kuriose molekulėse. Asn-65 gali būti pastebėta analizuojant sekas ir, tuo pačiu, gali būti tik iš dalies glikozilinta, jeigu iš viso gali. Ser-142, Thr-143, Thr-155, spėjami iš DNR sekos, negalėjo būti nustatyti aminorūgščių analizės metu, ir to pasekoje galėjo būti O-surišto angliavandenio prijungimo vietoje. Šios galimos angliavandenio prijungimo vietos nurodytos Fig.11. N-surištas angliavandenis išskirtas storu šriftu; O-surištas angliavandenis nurodytas paprastu šriftu.
[0166] K. BRL SCF aminorūgščių kompozicinė analizė
[0167] Aminorūgščių kompozicinei analizei buvo paruošta medžiaga iš C4 kolonos, Fig.7, gauta koncentravimo ir buferinių mainų 50 mM amonio bikarbonate, būdu. Du pavyzdžiai po 70ml buvo atskirai hidrolizuoti 6 N HCI, turinčioje 0.1% fenolio ir 0.05% 2-merkaptoetanolio 110°C 24 vai. vakuume. Hidrolizatus išdžiovino, patalpino j natrio citrato buferį ir analizavo, naudojant jonų mainų chromatografiją (aminorūgščių analizatorius Beckman Model 6300).
[0168] Rezultatai pateikti 3 lentelėje. 164 aminorūgščių panaudojimas (iš baltyminių sekų duomenų) siekiant nustatyti aminorūgščių sudėtį, labiau atitinka spėjamoms reikšmėms, negu 193 aminorūgščių naudojimas (kaip nustatyta iš PCR-DNR-darinių sekos duomenų. (Fig.14C).
[0169] Žiurkių SCF baltymo fragmentų aminorūgščių sekų nustatymas leido sudaryti sujungtą, specifinę žiurkės SCF oligonukleotidų seką. Oligonukleotidai imami kaip hibridizacijos testas žiurkės kDNR genomo duotų bazių atskyrimui ir kaip pradmuo bandyme aplifikuojant kDNR dalis, naudojant polimerazės ciklinės reakcijos (PCR) strategiją (Mullis ir kt. Meth. in Enzym. 155, 335-350 (1987). Oligonukleotidus sintetino pagal fosfatinj metodą (Beansage et al, Tetrahedron Lett, 22, 1859-1862, 1981); (Mc Bride et al, Tetrahedron Lett, 24, 245-248, 19983); jų sekos parodytos Fig.12A. Raidėmis pažymėta A-adeninas; T-timinas; C-citozinas; G-guaninas; l-inozinas. Fig.12A ženklu "*" pažymėti oligonukleotidai, kurie turi apribojimų atpažįstant endonukleazines sekas, sekos parašytos 5'-»3\
[0170] Naudojant sumaišytų ologonukleotidų su žymėtu 32-fosforu tyrimus, buvo atrinktas žiurkių genominio kepenų kDNR ir du BRL kDNR bankų duomenys 219-21 ir 219-22 (Fig. 12A), kurių sekos remiasi aminorūgščių sekomis, gautomis pagal 2 pavyzdį. Šiuose eksperimentuose su standartinio metodo kDNR-klonavimu nebuvo išskirti klonai SCF (Maniatis et al, Molec.Cloning, Cold Spring Harbor, 212-246, 1982).
[0171] Alternatyvus priartėjimas ir rezultate išskirtos SCF nukleino rūgščių sekos, apėmė PCR technikos naudojimą. Pagal šią metodologiją DNR sritis, apsupta dviem pirminėmis DNR, naudojant daugkartinius replikacijos ciklus, katalizuojamus priimtina DNR-polimeraze (tokia kaip Tag DNR polimerazė), esant trifosfato dezoksinukleozidui, selektyviai amplifikuojasi in vitro termocirkuliatoriuje. PCR-amplifikacijos specifiškumas bazuojasi ant dviejų pirminių oligonukleotidų, flankiruojančių DNR fragmentų, kurie amplifikuojasi, ir hibridizuojančių prie priešingos spiralės. PCR su dvipusiu specifiškumu nustatant DNR sritis sudėtingame mišinyje ir pasiekiamas naudojant du pradmenis su sekomis, pakankamai specifiškomis šiai sričiai. PCR su vienpusiu specifiškumu naudoja vieną erdvinį specifinį pradmenį ir antrą, kuris gali užimti
[0172] užplanuotą vietą, esančią visose ar daugelyje atitinkamo mišinio DNR molekulėse. (Loh et al. Csi. 243, 217-220, 1989).
[0173] DNR produktai sėkmingai pravestose amplifikacijose yra informacijos apie DNR-sekas šaltiniai (Gylbensten, Biotechniques, 7, 700-708, 1989) ir gali tarnauti tam, kad žymėtos hibridizacijos produktai būtų didesnio ilgio ir didesnio specifiškumo, negu oligonukleotidiniai. PCR su atitinkama seka produktams taip pat galima užplanuoti klonavimą į plazmidinius nešiklius, kurie, kaip atrodo, turi užkoduoto peptidinio produkto charakterį.
[0174] Žiurkės SCF kDNR-sekos gavimo pagrindinė strategija pateikta Fig.13A. Mažos strėlytės rodo PCR-amplifikaciją, didelės-DNR eiliškumo reakciją. PCR 90.6 96.2 su kDNR-eiliškumo buvo naudojami žiurkės SCF kDNR nepilnai nukleino rūgščių sekai gauti. Šiose PCR pradmenys buvo sumaišyti oligonukleotidai, pagrįsti aminorūgščių seka parodyta Fig.11. Naudojant informaciją apie seką, gautą iš PCR 90.6 ir 96.2, buvo paruošti unikalūs sekų pradmenys (224-27 ir 224-26, Fig.12A), naudojami vėlesnėse amplifikacijos ir sugrupavimo reakcijose. DNR, turinti 5'-galą kDNR, buvo gauta PCR 90.3, 96.6 ir 625.1 naudojant vienpusio specifiškumo PCR. SCF baltymo papildoma DNR seka C-gale buvo gauta PCR 90.4. DNR seka koduojamos žiurkės SCF kDNR srities likučiui buvo gauta iš PCR produktų. PCR 630.1, 630.2, 84.1 ir 84.2, kaip aprašyta žemiau šio pavyzdžio C skyriuje. Technologija, naudojama gauti žiurkės SCF kDNR aprašyta žemiau.
[0175] RNR ruošė iš BRL ląstelių, kaip aprašyta Okajamos ir kt., Meth.Enzym. 154, 3-28
[0176] (1987). PolyA+RNR buvo išskirta oligo (T) celiuliozinės kolonos pagalba, aprašyta Jakobsono Meth in Enzym, 1521., 254-261 (1987).
[0177] Pirma spiralinė kDNR buvo susintetinta naudojant 1 mg BRLpolyA+RNR kaip šabloną ir (dT) 12-18 kaip pradmenį, teikiamą fermento Mo-MLV revers-transkriptazės (Bethesda Reseach Lab). RNR spiralinė degradacija vyko su 0.14 M NaOH 84°C temperatūroje 10 min. arba inkubuojant verdančio vandens vonioje 5 min. Tirpalo neutralizacijai pridėjo amonio acetato perteklių; kDNR is pradžių ekstrahavo fenoliu/chloroformu, po to chloroformu/izoamilo alkoholiu ir išsodino etanoliu. Esant galimybei naudoti oligo (dC)- pradmuo PCR reakcijoje turintis vienpusinį specifiškumą 3'-galui kDNR alikvotos su terminaline transferaze iš veršiuko skydliaukės (Boeringer Manheim) buvo pridėtas poli (dG) -"uodega", kaip anksčiau aprašyta (Deng et al, Meth.Enz., 100, 96-103, 1983).
[0178] PCR cikle vykdė 1 min., 94°C; prailginimą-3 ar 4 min. 72°C. Aneliavimo temp. ir trukmė varijavo iš PCR j PCR, dažnai priimant kompromisą tarp dviejų PCR. Mažinant pradmens koncentraciją siekiant kad susikauptų mažiau medžiagos su pradmeniu (VVatson, Amplific., 2, 56, 1969), buvo naudojamos didesnės aneliavimo trukmės; esant PCR didelei produkto koncentracijai didinant išeigą, naudojama mažesnė trukmė ir didesnė pradmenų koncentracija.
[0179] Nustatant aneliavimo temperatūrą, pagrindinis faktorius buvo pradmens Td sujungimo įvertinimas ir tikslai. (Suggs et al, Daylopmen.Biol.Using Purified Genes, Brovvn, D.D., Fox, C.F. Acad, NY, 683-693, 1981). Čia naudojamus fermentus gavo iš tiekėjų: Stratagene, Promega, arba Perkin-Elmer Cetus. Reakcijos surišėjai buvo naudojami pagal tiekėjų rekomendacijas. Amplifikacijas vykdė arba Soy Tempcycle arba Perkin-Elmer Cetus DNR thermosus. SCF kDNR fragmentų amplifikaciją paprastai vykdė agaro gelio pagalba esant etidiumbromidui ir stebėjo DNR jungtis fluorescencija, stimuliuojant UV spinduliais. Kai kada, kai buvo laukiami maži fragmentai, PCR produktus analizavo naudojant elektroforezę poliakrilamidiniame gelyje. Patvirtinti tam,
[0180] kad stebimos jungtys yra kDNR fragmentai, buvo stebimi atitinkami jungčių sekančių amplifikacijų su vienu ar daugiau viduje esančių pradmenų. Galutinis patvirtinimas gautas dideksi-sutvarkymu (Sanger et al, Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 74, 5463-5467,
[0181] 1967) PCR produkto ir tuos produktus palyginant su informacija apie SCF peptidinę seką.
[0182] sekos pagrindu (Gould, Proc.Natl.Acad.Sci, USA, 86, 1934-1938, 1989. Žemiau patektas PCR amplifikacijos aprašymas, kuri buvo atlikta norint gauti informaciją apie DNR sekas žiurkės kDNR, užkoduotų aminorūgščių, nuo 25 iki 162.
[0183] PCR 90.6 BRL kDNR aplifikavo su 4 pikomoliais 222-11 ir 223-6 kiekvieno po 20 ml.
[0184] PCR 90.6 produkto alikvotą tyrė elektroforetiškai agaro gelyje ir pastebėjo jungtj artimą norimam dydžiui. 1 ml PCR 90.6 produkto amplifikuotas toliau su 20 pM 222-11 ir 223-6 pradmenų, kiekvieno po 50 ml 15 ciklų, aneliavo 45°C. Dalis šio produkto toliau buvo amplifikuota 25 ciklais esant 222-11 ir 219-25 pradmenims (PCR 96.2), ir tas davė vienodą jungtj agaro gelio elektroforezėje. PCR 96.2 produkto asimetirnė amplifikacija su tais pačiais pradmenimis davė matricą, kuri buvo sutvarkyta. Toliau SCF 96.2 produkto sekas selektyviai amplifikavo naudojant PCR amplifikacijos produktą su 222-22 ir 219-21 pradmenimis. Šios PCR produktą naudojo kaip etaloną ir pavyzdžius, žymėtus izotopais.
[0185] Siekiant atskirti žiurkės SCF kDNR 5'-galą, (dC)n turinčias sekas, priimtinas poli-(dG)-"galų" kDNR, naudojo kaip nespecifines. PCR 90.3 turėjo (dC)12 (10 pM) ir 223-6 (4 pM) kaip pradmenis ir BRL kDNR kaip etaloną. Reakcijos produktas pasireiškė kaip agregatas su labai dideliu molek. sv., agaro gelio elektroforezėje likdamas arti užnešimo ribos. 1 ml produkto tirpalo buvo amplifikuotas su 25 pM (dC)12 ir 10 pM 25 ml 223-6 15 ciklų, aneliuojamų 45°C. 0.5 ml šio produkto po to buvo amplifikuota 25 cikluose su 219-25 ir 201-7 pradmenimis (PCR 96.6). Fig.12C parodyta 201-7 seka. Agaro gelio elektroforezėje jungties nebuvo. Dar po 25 PCR ciklų (aneliavimas 40°C) buvo viena matoma jungtis. Po blokingo buvo matoma viena ryški hibridinė jungtis.Papildomi 20 PCR ciklų (625.1), (aneliavimas 45°C) buvo vykdomas, naudojant 201.7 ir 224-27 pradmenis. Po asimetrinės PCR amplifikacijos, buvo sutvarkymas, ko pasekoje gavo seką, ilgesnę, negu N-galas peptidinio koduoto pre-SCF.
[0186] Šią seką naudojo oligonukleotidų pradmens 227-29, turinčio 5'-galo koduotą žiurkės SCF kDNR dalį, planavimui.
[0187] Panašiai, 3'-DNR seka, besibaigianti 162 aminorūgštimi, buvo gauta PCR 90.4
[0188] PCR rezultatai, išplečiant koduoto žiurkės SCF kDNR, kaip aprašyta A sk., buvo naudojami sudarant duomenų bazę su žiurkės genomo sekomis (gauti iš
[0189] ClonTech.Lab., No RI1022j). Buvo sukurta bakteriofago pradmens EMBL-3sP6/T7 biblioteka naudojant DNR, gauta iš žiurkės S praque Dawley suaugusio patino. Biblioteka turi 2.3x106 nepriklausomų klonų su vidiniu vidutiniu dydžiu 16kD.
[0190] PCR naudojo sukuriant 32P-žymes, naudojamas bibliotekos sudarymui. PCR (Fig.13A) atliko reakcijoje su 16.7 mM 32P (alfa)-dATP, 200 mM dGTP, 200 mM dCTP,
[0191] 200 mM dTTP, reakcijos buferiu, pateiktu Pertin Elmer Cetus, Tag-polimerazę (Pertin Elmer Cetus) 0.05 vnt/ml, 0.5 mM 219"2 6, 0.05 mM 223-6 ir 1 ml etalono 90.1, turintis pradmenų prisijungimo vietas. PCR2 vykdė analogiškomis sąlygomis, išskyrus tai, kad pradmenys ir etalonas buvo pakeisti - naudojo 0.5 mM 222-11, 0.05 mM 219-21 ir 1 ml etalono, gauto PCR 96.2.
[0192] Apie 106 bakteriofagų patalpino į lėkšteles, kaip aprašyta Maniatis et al, 1982. Plokštelės buvo perneštos ant filtrų Gene Screen Plus (22x22 cm; Nen/Du Pont), kurie
[0193] buvo denatūruoti, neutralizuoti ir išdžiovinti pagal tiekėjo instrukciją. Kiekvieną lėkštelę filtravo du kartus.
[0194] Filtrus prehibridizavo 1 M NaCI, 1% jaučio serumo albuminu, 0.1% fikoliu, 0.1% polivinilpirolidonu (hibridizavimo tirpalas) 16 vai., 65°C ir saugojo -20°C. Filtrus pernešė į šviežią hibridizacijos tirpalą su 32P žymėtu PCR produktu prie 1.2x105 crm/ml ir hibridizavo 14 vai. 65°C. Filtrus plovė 0.9 M NaCI, 0.09 M natrio citratu, 0.1% SDS, pH
[0195] 7.2 (plovimo tirpalas) 2 vai. kambario temp., po to - antras plovimas 30 min. šviežiame vandens tirpale 65°C. Bakterofagų klonai lėkštelėse atitinkantys radiaktyvias demes,
[0196] DNR iš teigiamų klonų buvo paveikta endonukleazėmis BamHI, Sphl ar Ssti ir gauti fragmentai subklonuoti (Fig.19) ir iš eilės sutvarkyti. Sutvarkymo schema žiurkės genominio SCF DNR parodyta Fig.14A. Piešinio viršutinėje dalyje - žiurkės genominio SCF DNR. Tarpai linijose - sritys, kurios nebuvo sutvarkytos. Dideli boksai - SCF geno koduotų dalių aksonai. Strėlėmis nurodytos sritys, kurios buvo sutvarkytos ir naudojamos žiurkės geno SCF sekų jungtims. Žiurkės SCF seka parodyta Fig.14B.
[0197] Naudojant PCR1 žiurkės genomo bibliotekai, buvo išskirti klonai, atitinkantys koduotų SCF aminorūgštimis nuo 19 iki 176, aksonus. Norint gauti klonus aksonams,
[0198] 19 aminorūgščių kodavimo srityje atrinkta biblioteka naudojant oligonukleotidų 228-30 mėginius. Tas pats filtrų rinkinys, kaip ir PCR1, buvo prehibridizuotas ir hibridizuotas tirpale su 32P žymėtu oligonukleotidu 228-30 (0.03 pM/ml) 50°C 16 vai. Filtrus plovė 30 min. kambaro temperatūroje praplovimo tirpale, po to antras praplovimas šviežiame vandeniniame tirpale 15 min., 45°C. Bakterofagų klonai buvo išimti iš lėkštelių ir sortiruoti su 228-30 pvz. DNR iš teigiamų klonų buvo paveikta endonukleazėmis ir subklonuota. 228-30 tyrimai įgalino gauti klonus, atitinkančius koduotas amino rūgštis nuo 20 iki 18 aksonuose.
[0199] Buvo keletą kartų bandyta išskirti klonus, atitinkančius aksonus (a), turinčius 5'-netransliuotas sritis ir aminorūgščių nuo -25 iki -21 kodavimo sritis. Šioje srityje žiurkės SCF klonai nebuvo išskirti.
[0200] Tam, kad įsitikinti ar gali žiurkės SCF aktyvus polipeptidinis produktas būti išreikštas ar sekretuojamas žinduolių ląstelių, buvo naudotos žiurkės SCF (SCF1162, SCF1"164) ir SCF1"193 baltymo ekspresijos sistemos, žinomos iš geno transliacijos,(Fig.14C).
[0201] Šiuose eksperimentuose naudojamas ekspresijos pernešėjas turi pVC119, SV40 ir HTLV sekas. Pernešėją naudojo autonominėje replikacijoje žinduolių ir E. coli ląstelėse ir egzogeninės DNR ekspresijai, kontroliuojant virusinės DNR sekai. Šis pernešėjas pažymėtas V19.8, esantis E. coli DH5, pteiktas Amer. TypeCultureColIect., 12301 Parklavvn Drive Rockville, M (ATCC#68124). Šis pernešėjas yra pSVDM19 darinys, aprašytas JAV patente 4 810 643.
[0202] kDNR žiurkės SCF buvo įvesta į plazmidinį nešiklį V19.8. kDNR seka parodyta
[0203] Fig.14C. Šioje konstrukcijoje naudojo DNR, sinezuotą PCR 630.1 ir 630.2 reakcijose, kaip parodyta Fig.13A. Šios PCR yra nepriklausomos amplifikacijos ir naudojo sintetinius oligonukleotidu pradmenis 227-29 ir 227-30. Sekos šiems pradmenims buvo gautos iš kDNR, generuotos PCR, kaip aprašyta šio pvz. A skyriuje. 50ml reakcijos mišinys buvo iš reakcijos buferio (iš rinkinio Perkin Elmer Cetus), 250 mM dATP, 250 mM dCTP ir 250 mM dGTP, 250 mM dTTP, 200 mg oligo (dT), 1 pM 227-29, 1 pM 227-30 ir 2.5 vnt Tag-polimerazės (Perkin Elmer Cetus). kDNR amplifikavo per 10 ciklų, denatūravimo temp. 94°C 1 min., užgrūdinimo temp. 37°C 2 min., prailginimo temp. 72°C 1 min. Po šių PCR ciklų į kiekvieną reakciją pridėjo po 10 pM 227-29 ir 10 pM 227-30. Amplifikaciją vykdė 30 ciklų tomis pačiomis sąlygomis, išskyrus tai, kad aneliavimo temp. buvo iki 55°C. PCR produktai veikti endonukleazėmis Hind III ir Sstll. V19.8 analogiškai veikė Hindlll ir Sstll ir, vienu atveju, plazmidinį nešiklį veikė veršiuko skrandžio fosfataze, kitu atveju-izoliavo didelį fragmentą ardyto produkto iš agarinio gelio. kDNR ligavo V19.8 naudojant polinukleotidinę ligazę T4. Ligavimo produktus transformavo į kompetentinį kamieną. E. coli DH5, kaip aprašyta (Okajama et al, Supra,
[0204] Fig. 17 parodyta V19.8. Šias plazmides naudojo žinduolių ląstelių transfekcijoje, kaip parašyta 4 ir 5 pvz.
[0205] Žiurkės SCF1-164 ekspresijos pernešėjas buvo sukonstruotas pagal metodą, naudojamą SCF1-162, kur kDNR susintetinta PCR amplifikacijos pagalba ir įvesta į
[0206] V19.8. kDNR buvo susintetinta PCR amplifikacijoje su V19.8, turinčiu SCF1"162 kDNR (V19.8:SCF1162) kaip matricą, 227-29 kaip pradmuo geno 5'-galui ir 237-19, kaip pradmuo geno 3'-galui. Dublikacijos reakcija (50 ml) turėjo reakcinį buferį lx, 250 mM
[0207] dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 2.5 vnt Tag polimerazės, 20mg V19.8:SCF1"162 ir po 20 pM pradmens. kDNR amplifikavo 35 cikluose 94°C 1 min., 55°C 2 min., 72°C 2 min. Gautus produktus veikė endonukleaze Hindlll ir Sstll ir įterpė į V19.8. pernešėjas turi aminorūgščių SCF kodavimo sritį nuo -25 iki 164. kDNR 193 aminorūgščiai (žiurkės SCF1"193 numatomas iš DNR sekų transliacijos,Fig.14C) taip pat buvo įterpta į V19.8, analogiškai SCF1"162. Čia naudojama kDNR susintetinta PCR reakcijose, 84.1 ir 84.2 (Fig.13A) su 227-29 ir 230-25 oligonuleotidų pagalba. Dvi amplifikacijos reakcijos prasideda nuo skirtingų RNR preparatų. Pagal šio pavyzdžio A skyrių, PCR reakcijoje buvo gauta seka 227-29; 230-25 gauta iš žiurkės genomo DNR (Fig. 15B). Reakcijos (50
[0208] dTTP, 200 mg oligo (dT)/10 pM 227-29, 10 pM 230-5 ir 2.5 Tag (Perkin Elmer Cetus).
[0209] kDNR amplifikavo 5 ciklais, 94°C 1.5 min., 50°C 2 min., 72°C 2 min. Po šių ciklų amplifikacija buvo vykdoma dar 35 ciklus tokiomis pat sąlygomis, išskyrus tai, kad aneliavimas buvo 60 °C. PCR amplifikacijos produktus veikė endonukleazėmis Hindlll,
[0210] ligavo iki V19.8 polinukleotidinės ligazės T4 pagalba. Ligandus transformavo į kompetentinį E. coli kamieną ir sutvarkė DNR, paruoštą iš individualių klonų. Šias plazmides naudojo žinduolių ląstelių transfekcijai 4 pvz.
[0211] Žmogaus SCF kDNR gavo iš hepatomos HepS2 ląstelių linijos (ATCC HB 8065) PCR amplifikacijos pagalba, parodyta Fig.13B. Amplifikaciją vykdė su pradmenimis, kurių seka buvo gauta iš žiurkės SCF .
[0212] RNR ruošė pagal Maniatis et al, (1982). PoliA+RNR gavo naudojant oligo (dT) celiuliozę pagal tiekėjo (ColIab.Res. I nc) instrukciją.
[0213] Pirmos grandinės kDNR ruošė kaip ir BRL kDNR, išskyrus tai, kad sintezę iniciavo 2 mM oligonukleotidu 228-28, parodytu Fig.12C, turinčiu trumpą 3' seką, prijungtą prie ilgesnės unikalios sekos. Dalis unikalios sekos 228-28 apsprendžia tikslinę vietą PCR amplifikacijai su 228-29 pradmeniu. Žmogaus kDNR sekos giminingos žiurkės kDNR sekoms, buvo amplifikuotos iš HepG2 per PCR, naudojant 227-29 ir 228-29 pradmenis (PCR 22.7, žr. 13B pieš.); 15aneliavimo ciklų 60°C, po to 15 ciklų 55°C.
[0214] Agaro gelio elektroforezė neišryškino jungčių, tik dėmes heterogenines DNR dydžio atžvilgiu. Sekanti PCR buvo vykdoma su 1 ml PCR 22.7 produkto, naudojant žiurkės SCF 222-11 ir 228-29 pradmenis (PCR 24.3; 20 aneliavimo ciklų 55°C). Agaro gelyje vėl buvo heterogeninės DNR dėmės. Dvipusė specifinė PCR amplifikacija PCR 24.3 produktų su 222-11 ir 227-30 pradmenimis (PCR 25.10, 20 ciklų) padidino produkto ordinarinę pagrindinę jungtį iki žiurkės SCF kDNR PCR produkto reikšmės. Asimetrinės PCR (PCR 33.1) DNR, naudojant 224-24 pradmenį, produkto sutvarkymas davė apie 70 žmogaus SCF sekų.
[0215] Amplifikacija PCR 22.7 1 ml produkto su 224-25 ir 228-29 pradmenimis (PCR 24.7, 20 ciklų), o po to su 224-25 ir 227-30 pradmenimis (PCR 41.11) davė vieną pagrindinę tokio pat dydžio jungtj, kaip ir žiurkės SCF atveju, ir po asimetrinės amplifikacijos (PCR 42.3) davė didelio homogeniškumo sekas, lyginant su žiurkės SCF sekomis, naudojant 224-24 pradmenį. Buvo susintetinti unikalūs oligonukleotidai, planuoti žmogaus SCF kDNR; jų sekos pateiktos Fig.12B.
[0216] Norint gauti PCR generuotos, koduotos žiurkės SCF sekomis, kurias naudojo tiriant ekspresiją ir aktyvumą, žmogaus SCF dublikatą, buvo vykdoma PCR su 227-29 ir 227-30 pradmenimis 1 ml PCR 22.7 produktui, 50 ml tūrio (PCR 39.1). Amplifikaciją vykdė SoyTempcycter.
[0217] Kadangi buvo nežinomi neatitikimai tarp žmogaus SCF kDNR ir su unikaliu 227-30 pradmeniu žiurkės SCF, pirmuose trijuose cikluose aneliavimą naudojo tik 37°C, po to 55°C. Pasirodė aiški tokio pat dydžio jungtis (apie 590 Dp), kaip ir žiurkės homologo, papildomai amplifikavo ištirpintas nedideles porcijas PCR 39.1 ir PCR su priedais (PCR
[0218] 41.1). Dėl to, kad PCR 41.1 produktuose buvo daugiau kaip viena jungtis, sekančias PCR darė su tikslu nustatyti bent dalį sekų klonavimui. Ordinarinė intensyvi jungtis pastebėta po PCR 23 ciklų su 231-27 ir 227-29 pradmenimis (PCR 51.2). Asimetrinės PCR su 227-29 ir 231-27 ir sutvarkymas patvirtino žmogaus SCF kDNR sekų buvimą.
[0219] 162 PCR fragmentams. DNR iš atskirų bakterinių klonų sutvarkyta pagal Sangerio didezoksi metodą.
[0220] Mėginį PCR7, sudarytą iš PCR amplifikuotos kDNR, žr. Fig.13B, naudojo bibliotekos sudarymui, turinčios žmogaus genomines sekas. Ribomėginį, tinkamą daliai žmogaus SCF kDNR (žr. žemiau), naudojo teigiamiems trombocitams persėti. PCR7 mėginj paruošė pradedant nuo PCR 41.1 produkto (žr. Fig.13B). PCR 41.1 produktą amplifikavo su pradmenimis (PCR 58.1). PCR 58.1 produktą skiedė 1000 kartų 50 ml reakcijos mišinio , turinčio 20 pM 233-13 ir amplifikavo 10 ciklų. Pridėjus 10 pM 227-30,
[0221] 90 ml ir PCR pailgino 15 ciklų. Reakcijos produktus skiedė 200 kartų 50 ml ir pridėjo 20 pikoM 231-27 ir 20 pikoM 233-13, ir PCR tęsė 35 ciklų aneliavimo temp. 48°C 96.1 reakcijoje. Žymėtos P-32 PCR vykdė panašiai, išskyrus: PCR 96.1 50 ml tūryje 100
[0222] kartų skiedė; 5 pikoM 231-27 naudojo kaip vienintelį pradmenį; 45 PCR ciklus vykdė
[0223] Ribomėginiu 1 buvo 32P žymėta RNR, tinkanti nukleotidų 2-436hSCF DNR-sekoms, parodytoms Fig.15B. Sudarant pernešėją, PCR 41.1 (Fig.13B) produktą DNR veikė su Hindlll ir EcoRI, klonavo į polilinkerį (polyLinker) plazmidinio nešiklio pGEM3 (Promega, Madison, VVisconsin). Rekombinantinis pGEM3:SCF plazmidinės DNR veikė su Hindlll.
[0224] pagal instrukcijas, pateiktas firmos Promega. Reakcija apėmė (3 ml) 250 mg
[0225] plazmidinę DNR ir 20 mM 32P-STR (katalog.No NEG-008H, NevvEngiand Nuclear (NEN) su papildoma nežymėta STR.
[0226] Žmogaus genominė biblioteka buvo gauta iš stratogeno (LaJolIa, CA; cat.No 946203). Biblioteką konstravo bakterofaginiame nešiklyje LambadaFix II, naudojant DNR, gautą iš kaukaziško ežio placentos. Biblioteka turėjo 2000000 pirminių dėmių
[0227] (plagues), su vidiniu vidutiniu dydžiu daugiau kaip 15kD. Apie 1000000 bakteriofagų patalpino j lėkštelę, kaip aprašyta Maniatis ir kt.(Supra, 1962). Krūvius pernešė ant Gene Screen Pius filtrų (22 kv.cm; NEN Dupont)pagal instrukcijas. Kiekvienai lėkštelei buvo du fltravimai. Filtrus prehibridizavo 6xSSC (0.9 m NaCI, 0.09 M natrio citrato, pH 7.5), 1% SDS 60°C temperatūroje. Hibridizavo filtrus šviežiame tirpale 6xSSC, 1% SDS, turinčiame 32 P žymėtą PCR7 mėginį 200000 srm/ml ir hibridizavo 20 vai. 62°C.
[0228] Filtrus plovė 6xSSC, 1% SDS 16 vai. 62°C. Bakterofago mėginius, atitinkančius radioaktyvias dėmes, pašalino iš lėkštelės persortiruotos su PCR7 ribomėginiu I tokiu būdu: Filtrus prehibridizavo 6xSSC, 1% SDs ir hibridizavo 18 vai. 62°C, 0.25 M Na3P04, (pH 7.5), 0.25 M NaCI, 0.001 M EDTA, 15% formamido, 7% SDS ir 1x106 srm/ml. Filtrus plovė 6xSSC, 1% SDS 30 min. 62°C. DNR iš teigiamų klonų veikė endonukleazėmis BamH, Sphl ar Sstl ir gautus fragmentus subklonavo pNC119.
[0229] PCR 7 mėginio pagalba gavo kloną, turintj koduojamų amino rūgščių nuo 40 iki 176, aksoną ir šj kloną perkeltą į ATCC (depozitas#40681). Norint gauti kloną papildomiems aksonams SCF, žmogaus genominė biblioteka sortiruota ribomėginiu 2 ir oligonukleotidų mėginiu 235-29. Sortiravo kaip paprastai, išskyrus: hibridizaciją su 235-29 mėginiu vykdė 37°C ir praplovimai buvo po 1 vai. 37°C ir 44°C. Teigiami klonai
[0230] sortiruoti su ribomėginiu 2, 3 ir oligonukleotidų mėginiu 235-29 ir 236-31. Ribomėginius
[0231] 2 ir 3 gavo naudojant analogišką ribomėginį 1, išskyrus: rek. pGEM3:hSCF plazmidinės
[0232] DNR veikė endonukleaze P ir (ribomėginys 2e ar Psi (ribomėginys 3) ir (d) ribomėginio
[0233] Fig.15A parodyta strategija, naudota žmogaus genominės DNR sutvarkymui.
[0234] PCR 9 produktų sutvarkymas, inicijuotas dviem genospecifiniais pradmenimis, duoda seką srities, apribotos pradmenų 3'-galais. PCR 9, kaip parodyta 3 A pvz., gali duoti flankiruotų sričių sekas. Vienpusė PCR buvo naudota žmogaus SCF 5'-netransliuotos srities sekų išplėtimui.
[0235] 5637 (ATCC HTB 9), naudojant oligonukleotidą 228- (Fig.12C), kaip pradmenį, kaip aprašyta 3 pvz. Šios DNR su 6 liekanomis pailginimas, sekantis po PCR amplifikacijos su (dC)n pradmenimis, nedavė kDNR fragmentų išplėtimo.
[0236] (apie 50 ng) ir 2 pikoM 228-28, inkubavo su Klionovo polimeraze ir po 0.5 pikoM kiekvieno dATP, dCTP, dGTP ir dTTP prie 10-12°C 30 min., į 10 ml 1xNick-translation buferio (Maniatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab., 1982).
[0237] Gautos kDNR amplifikacija su 228-29, kombinacijoje su SCF-pradmenimis (tokia tvarka: 235-30, 233-14, 236-31 ir 235-29) davė sudėtingus mišinius, turinčius dėmių agaro gelyje, išvaizdą. SCF fragmentų praturtėjimas buvo: specifinės produkto jungties intensyvumas stebimas, kai palyginamieji produktai buvo amplifikuoti dviem pradmenimis (227-29 ir 235-29), pvz., duodant produktą apie 150 dr. Bandymai paimti eilę produktų pagal individualius dydžius, išskiriant dėmes iš agarizuoto gelio ir preamplifikuojant PCR, dauguma atvejų nebuvo gauta tiksliai apibrėžta jungtis, turinti SCF sekas.
[0238] Viena PCR 16.17 reakcija, turinti tik 235-29, įtakojo jungties augimą, kuri išaugo dėl iniciavimo 235-29 pagalba nežinomoje vietoje, 5' koduojančios srities priedus, kaip parodyta žemėlapyje Fv II ir Fst I su fermentais ir PCR analize su pradmenimis. Šį produktą išvalė iš gelio ir peramplifikavo su 235-29, sutvarkė pagal Zangerio didezoksi metodą, naudojant 32P-žymėtą 228-30 pradmenį. Gauta seka buvo bazė konstruojant 254-9 oligonukleotidą (Fig.12B). Naudojant 3'-nukreiptą pradmenį vėlesnėse PCR kombinacijoje su 5'-nukreiptais SCF pradmenimis, buvo gautos norimų dydžių sekos. Sutvarkius pagal Zangerį tokius PCR produktus, buvo gauti nukleotidai su 180 iki 204 Žmogaus SCF kDNR sekomis (Fig. 15C).
[0239] Norint gauti didesnę seką 5'-gale hSCF kDNR, buvo paruošta kDNR pirmos linijos iš
[0240] 16 ml mišinio, turinčio 0.2 vnt MMLU reversinės transkriptazės ir 500 mM kiekvieno dNTP. Po ekstrakcijos fenoliu/chloroformu ir chloroformu ir išsodinimo etanoliu (iš 1 M amonio acetato), nukleino rūgštys buvo suspenduotos 20 ml vandens, patalpintos j verdančio vandens vonią 50 min., po to atšaldytos ir pailgintos terminaline transferaze esant 80 mM dATP CaCI2-turinčiame buferyje (Dengand W, Meth.Enzim., 100, 96-103). Pirmos linijos kDNR su (dA)n-"uodega" produktas buvo išvalytas fenolio-chloroformo ekstrakcija ir etanolio išsodinimu ir perresuspenduotas 20ml 10 mM Tris pH 8.0 ir 1 mM EDTA. Žmogaus SCF kDNR 5' fragmentų, apie 20 ng svorio (dA)n- 5637 praturtinimą ir amplifikaciją vykdė taip: pirmus vienpusės PCR 26 ciklus vykdė esant SCF-pradmeniui 236-31 arba pradmenų mišiniui, turinčiam (dT)n-sekas ar kartu su 3' galu, pvz., pradmuo 221-1 ar mišinys 220-3, 220-7 ir 22011 (12C pieš.). Šių PCR produktai (1 ml) buvo po to amplifikuoti antroje PCR, kur buvo 221-12 ir 235-29. Apie 370 bp produkto pagrindinė jungtis stebėta kiekvienu agaro gelio atveju. Gelio mėginys, turintis dalį šios jungties, buvo išimtas Pastero pipetės galiuku ir perneštas į mažą mėgintuvėlį. Pridėjo 10 ml vandens ir tirpdė kaitinimo bloke, kurtemp. 84°C.
[0241] PCR su 221-12 ir 235-29 (8 pikomoliai kiekvienoje) inokuliuota 40 ml su 2 ml ištirpinto gelio. Po 15 ciklų, analizuojant ant agaro gelio, stebėjo lengvą difuzinę jungtį, apie 370 bp. Vykdė asimetrinius PCR siekiant sudaryti matricas su viršutiniais ir apatiniais siūlais: kiekvienai reakcijai 4 ml produkto ir 40 pikomolių 221-12 ar 235-29 pradmenų, 100 ml tūrį veikė 25 PCR ciklais (1 min., 95°C; 30 sek., 55°C; 4 sek., 72°C). Tiesioginis PCR produktų mišinių, inicijuotų 221-12 (po standartinės ekstrakcijos ir išsodinimo etanoliu) su 32P-žymėtu 262-13 (Fig.12B) sutvarkymas, įgalino gauti 5'seką nuo nukleotido 1 iki 179 (Fig.15C).
[0242] G. Žmogaus genominės DNR pirmojo koduojančio SCF aksono srityje amplifikaciją ir sutvarkymas
[0243] Žmogaus genominės bibliotekos su SCF oligonukleotidų mėginiais atranka nedavė
[0244] klonų, turinčių pirmojo koduojančio aksono garsią sritį, po ko buvo mėginta naudoti vienpusės PCR techniką šio aksono supančių genomo sekų, amplifikacijai ir klonavimui.
[0245] Pradmenų išplėtimą denatūruotoje žmogaus placentinėje DNR (gauta iš Sigmos) vykdė su DNR polimeraze I (Klionovo fermentas, didelis fragmentas) naudojant ne SCF pradmenis 228-28 ar 221-11 žemoje temperatūroje (12°C), kas įtakoja iniciavimą daugelyje skirtingų centrų. Kiekviena reakcija po to buvo skiesta 5 kartus Tag I DNR polimerazės buferyje, kur buvo Tag I polimerazė ir 100 mM kiekvieno dNTP, pailginimas buvo 10 min., 72°C. Produktas buvo praturtintas SCF oligonukleoitais pirmojo aksono (kaip 254-9), PCR reakcijoje su neSCF pradmenimis (228-29 ir 221-11). Elektroforezė parodė, kad dauguma produktų buvo trumpi (<300 bp). Kad pailginti, kiekvieno tarpo gelyje dalis buvo išpjauta ir eliuota. Po išsodinimo etanoliu ir resuspendavimo vandenyje, iš gelio išvalyti produktai buvo klonuoti pGEM4 dariniui, turinčiam Stil dalį, kaip Hind III fragmentą iki Stil.
[0246] Kelios teigiamos kolonijos buvo identifikuotos Zangerio pagalba. Seka, kuri tęsiasi žemyn nuo pirmo aksono per atitinkamą jungtį eksonitrono į kitą introną, parodyta
[0247] H. SCF kDNR. koduojančio pelių, beždžionių ir šunų sritis, amplifikaciia ir sutvarkymas
[0248] Pirmo pakrovimo kDNR ruošė iš bendros RNR ar poli A+RNR iš beždžionės kepenų
[0249] (gauta iš Clontechi) ir ląstelių linijos NIH-3T3 (pelės, ATCC CRL 1858), ir D17 (šuns, ATCC CCL 183). DNR sintezėje naudojamu pradmeniu buvo arba nespecifinis 228-28,
[0250] 29 ir viena iš 227-30, 237-19 ar 237-20 davė laukto dydžio fragmentą, kuris buvo sutvarkytas arba tiesiai, arba klonuojant į V19.8 ar pGEM.
[0251] Papildomos sekos prie SCF kDNR 5' galo gautos iš PCR, naudojant SCD specifinį pradmenį, 254-9 ir 228-29 kombinaciją.
[0252] Papildomas sekas prie 3' galo gavo po 230-25 DNR, (pelės atveju) ar 241-6 inicijuotos kDNR (beždžionės atveju) su 230-25 ar 241-6, ir 3' nukreipto SCF-pradmeniui, PCR. Panašiais atvejais, amplifikuojant DNR D17, negavo SCF PCR produktų jungčių. Nespecifinis 228-28 buvo naudojamas pirmo pakrovimo iš bendros RNR D 17 sintezės inicijavimui, ko pasekoje susidaręs mišinys buvo praturtintas SCF sekomis, naudojant PCR 3'galo SCF pradmenis, 227-29 ar 225-31 kombinacijoje su 228-29. Produktų mišinį klonavo į pGEM4 darinius (Promega, Madison, VVisconsin), turinčius Stil sritį bukajame fragmento gale. Gauta heterogeninė biblioteka buvo atsėta su radiožymėtu 237-20, keletas teigiamų klonų buvo sutvarkyta, kas davė šuns SCF3'-galo sekas. Žmogaus (Fig.42), beždžionės, šuns, pelės ir žiurkės SCF subrendusių baltymų amino rūgščių sekos pateiktos Fig.16.
[0253] Žinomos SCF-aminorūgščių sekos yra homologiškos per visą jų ilgį. Identiški sutapimai signalinių peptidinių sekų yra subrendusio baltymo amino galo koduojamose srityse, lyginant su žiurkės SCF. Ji pažymėta No 1. Šuns kDNR seka turi neapibrėžtą aminorūgščių seką, kas yra valino rezultatas 129 kodone. Žmogaus, beždžionės, šuns, pelės aminorūgščių sekos pateikiamos be kokių nors įtarpų ar iškirpimų. Šuns aminorūgščių seka turi vieną papildomą liekaną 130 pozicijoje. Žmogaus ir beždžionės skiriasi tik vienoje pozicijoje, valino pakeitime (žmogaus) j alaniną (beždžionės) 130 pozicijoje. Numatyta SCF seka iki ar po spėjamo procesinio centro prie 164 liekanos labai pastovi rūšių atžvilgiu.
[0254] Pereinamajai ekspresijai COS-1 ląstelėse (ATCC SRL 1650), nešiklis V19.8 (3C pvz.), turintis SCF1-164 ir SCF1-193 genus, transfekuotas dubliuotose 60 mm lėkštelėse (VVigler et al, Cell, 14, 725-731, 1978). V19.8 SCF plazmidė parodyta Fig.17. Kaip kontrolė, nešiklis taip pat buvo transfekuotas. Plaukiojantys ant paviršiaus kultūros audiniai buvo surinkti skirtingais post-transfekcijos momentais ir analizuotas jų biologinis aktyvumas. 4 lentelėje sumuojami rezultatai Hpp-SCF, 5 lentelėje - MC/93H-timidino duomenys iš tipinių transfekcijos eksperimentų. Biomėginių, plaukiojančių COS-1 ląstelių, transfekuotų tomis plazmidėmis, paviršiuje rezultatai pateikti 4 ir 5 lentelėse; C-galo žiurkės SCF su C-galu aminorūgštis 162 pozicijoje (V19.8 žiurkės SCF1-162), SCF1-162, turinčio glutamino rūgštį 81 pozic. (V19.8 žiurkės SCF1-162 (Glu 81)) ir SCF1-162, turinčio Ala 19 pz. (V19.8, žiurkės SCF1-162 (Ala19)). Aminorūgščių pakaitalais buvo PCR, vykdytos SCF1-162 amplifikacijoje, produktai, kaip parodyta 3 pvz. Žiurkės SCF1-162 individualūs V19.8 klonai buvo sutvarkyti ir buvo nustatyta, kad du klonai turi aminorūgščių pakaitalus. Kaip matyti 4 ir 5 lent., rekombinantinis žiurkės SCF aktyvus mėginiuose, naudotuose gamtinio žinduolių SCF išvalyme.
[0255] Rekombinantiniai žiurkės SCF ir kt. faktoriai buvo tirti žmogaus CFU-GM (Broxmaer et al., 1977) analize, matuojant normalių kaulų čiulpų ląstelių dauginimąsi; duomenys 6 lent. Paviršiaus COS-1 duomenys po 4 dienų po transfekcijos su V19.8 SCF1-162, kombinacijoje su kitais faktoriais, parodyta 6 lent. Kolonijų skaitlingumas -triplikatinių kultūrų vidurkis.
[0256] Rekombinantiniis žiurkės SCF turi sinergetinį aktyvumą normalioms kaulų čiulpų ląstelėms CFU-GM tyrimuose. Eksperimente (6 lent.) SCF veikė kartu su žmogaus GM-SCF, LI-3 ir žm. SCF-1. Kituose tyrimuose, sinergizmas pasireiškė taip pat su G-SCF.
[0257] Žmogaus kaulų čiulpų proliferacija po 14 dienų su SCF turėjo įtaką; grupėse buvo
[0258]
[0259] Šis pavyzdys taikomas stabiliai žinduolių ekspresijos sistemai, SCF sekrecijai iš CHO (ATCC CCL 61, dHFR-).
[0260] V19.8 (Fig.17) buvo ekspresijos, naudojamos SCF gavimui, nešikliu. Pasirenkamu markeriu gauti stabiliems genams buvo dihidrofolinės reduktazės plazmidėje pDSVE I, genas. pDSVE 1(18 pieš.) yra darinys, sukonstruotas pDSVE veikiant sali fermentu ir liguotas iki oligonulkleotidų fragmento.
[0261] Pernešėjas pDSVE aprašytas US.Nr. 025344 ir 152045, išnašose. Dalis V19.8 ir pDSVE pernešiklio turi ilgas homologijas, įskaitant bakterinį replikacijų šaltinį CO 1 EI ir ampilininio pasipriešinimo geną ir 2-40 replikacijų šaltinį. Tai apsprendžia homologinę rekombinaciją transformacijos proceso metu ir, ryšium su tuo, sąlygoja transformaciją.
[0262] Kalciofosfatinės nuosėdas V19.8 SCF konstrukcijos ir pDSVE-1 ruošė esant 10 mg pelių DNR nešiklio, naudojant 1 ar 0.1 mg pDSVE-1, kurį veikė endonukleaze FVUI ir 10 mg V19.8 SCF. Kolonijas atrinko pagal geno ekspresiją DHFR iš pDSVE-1. Kolonijas, kurios auga nesant hipoksantino ir timidino, atrinko klonuojančių cilindrų pagalba ir išplėtė kaip ląst. linijas. Viršutinio sluoksnio ląsteles tyrė pagal MC/93 H timidino sugėrimą. Rezultatai pateikti 7 lent.
[0263] SCF ekspresija CHO ląstelėse buvo pasiekta naudojant pDSVRa2 ekspresijos pernešiklj, kuris aprašytas serNo 501904 nuo 1990.03.29, pateikto išnašose. Šis vektorius turi geną selekcijai ir klonų amplifikacijai, paremtai geno DHFR ekspresija. Klonas pDSVRa2 SCF buvo generuotas dviejų stadijų procese. V19.8 SCF veikė fermentu BamHI ir ligavo pGEM3. DNR iš pGEM3SCF veikė Hindlll ir Sali ir ligavo pDSRa2, paveiktą Hindlll ir Sali. Procesą pakartojo žmogaus genams, užkoduojant COOH-galą 162, 164 ir 183 aminorūgščių pozicijose (Fig.15C) ir 248 - Fig.42.
[0264] Sukurtos ląstelių linijos buvo patikrintos su metotreksatu (Shimre, Meth.in Enzym., 151, 85-104, 1987) esant 10 nm, siekiant padidinti geno DHFR ir SCF geno ekspresiją. Rek. žmogaus SCF ekspresijos lygį analizavo radioimuniniu būdu, kaip 7 pvz., ir/arba kolonijų suformavimo in vitro, indukcija, naudojant žmogaus periferinius kraujo
[0265] i
[0266] leukocitus. Tyrimą atliko kaip aprašyta 9 pvz., (12 lent.), išskyrus, kad inkubacija buvo
[0267] esant 20% deguonies, 5% anglies dvideginio ir 75% azoto, esant žmogaus EPO (10 vnt/ml). 8 lent.-tipinio eksperimento rezultatai. CHO klono žmogaus SCF1-164 ekspresija buvo patalpinta į ATCC (CRL 10557, 1990.09.25) ir pavadinta HiSCF17.
[0268] Šis pavyzdys yra SCF polipeptidų ekspresija E.coli, koduojant DNR sekas /Met-i/žiurkės SCF1193 (Fig.14C). Nors baltymų ekspresijoje gali būti naudojamas bet koks nešiklis, naudojama ši DNR plazmidė pCFM 1 156 (Fig.19). Ši plazmidė lengvai konstruojama iš pCFM 836 (JAV patentas Nr.4710473) suardant dvi endogenines Ndel dalis, naudojant polimerazę T4, einančią po buko galo ligavimo ir pakeičiant nedidelę
[0269]
[0270] Kontroliavo baltymo ekspresiją pCF M 1156 plazmoje, naudojant sintetinį stimuliatorių. Aprūpinant Met-iniciavimo kodoną ir atstatant kodoną, pirmoms trims žiurkės SCF polipetido aminorūgščių liekanoms (Glu, Gln, lle) buvo paruoštas sintetinis oligonukleotidinis linkeris.
[0271] su Nd el ir Bglll liekanomis. Žiurkės SCF geno nedidelis nukleotidas ir fragmentas buvo įterpti į pCFNI 156 liguojant unikalioje padėtyje Ndel ir Sstil plazmidėje, parodytoje Fig.19. SCF1-193 ekspresijos pCEMI plazmidė yra šios reakcijos produktas.
[0272] Plazmidė pCFM I 156 žiurkės SCF1 -193 buvo transfekuota į kompetentines FM E. coli ląsteles. Plazmidžių selekciją vykdė pagal atsparumą markerinio geno antibiotikui (kanomicinui). Plazmidės buvo atskirtos nuo kultūrinių ląstelių ir sintetinių poligonukleotidų DNR sekas ir jų susijungimą su žiurkės SCF genu patvirtino DNR sutvarkymo būdu.
[0273] Plazmidės pCFM I 156 žiurkės SCF1"162 koduoto (Met"1) žiurkės SCF1"162 polipeptido fragmento iš EcoRL iki Sstll, buvo išskirtas iš V19.8 žiurkės SCF1"162 ir liguotas į pCEM žiurkės SCF1"193 unikaliose padėtyse, tokiu būdu pakeičiant koduojančias sritis žiurkės SCF geno karboksilinėmis liekanomis.
[0274] Plazmidės pCFM 1156 žiurkės SCF1"164 ir pCEM 1156 SCF"1"165, koduotų (Met1) žiurkės SCF1"164 ir (Met1) žiurkės SCF1"165 polipeptidų, atitinkamai buvo izoliuoti EcoRL ir Sstll fragmentai iš PCR DNR, užkoduojantys 3' galo SCF ir pakeitė DNR koduoto SCF geno karboksilinio galo padėtį. DNR amplifikaciją vykdė su pradmenimis 227-29 ir 237-19 konstruojant pCFiyi I 156 žiurkės SCF1"164 ir 227-29 ir 237-20, konstruojant pCFM 1156 SCF1"165
[0275] Šis pavyzdys aprašo ekspresiją E. coli ląstelėse žmogaus SCF polipeptido, koduojant DNR (Met 1) žmogaus SCF1"164 ir (Met1) žmogaus SCF1"183 (Fig.15C). Plazmidė su V19.8 žmogaus SCF1"162 , turinti žmogaus SCF1"162 geną, naudojo kaip matricą PCR žmogaus SCF geno amplifikacijoje.
[0276] Oligonukleotidinius pradmenis 227-29 ir 237-19 naudojo PCR DNR generavimui ir veikė endonukleazėmis Pstl ir Sstl. Aprūpinant Met-iniciavimo kodoną ir atstatant kodonus pirmoms keturioms žmogaus polipeptido SCF aminorūgštims (Glu, Gly, lle, Cys), buvo paruoštas sintetinis oligonukleotidinis linkeris su Ndel ir Pstl galūnėmis
[0277]
[0278] Nedidelis oligolinkeris, gautas iš žmogaus SCF geno, ligavimo pagalba buvo įstatytas į pCEM 1156 (kaip aprašyta anksčiau) unikaliose vietose Ndel ir Pstl plazmidėje, parodytoje Fig.19.
[0279] Plazmidė pCEM 1156 žmogaus SCF1"164 transformuota į FM5 E.coli kompetentines ląsteles. Ląstelių su plazmidėmis selekciją vykdė pagal atsparumą markerinio geno antibiotikui (kanomicinui). Plazmidės buvo atskirtos nuo kultūrinių ląstelių ir DNR geno sekas patvirtino DNR sutvarkymo būdu.
[0280] Plazmidės pCEM 1156 žmogaus SCF1"183 koduojančio polipeptido (Met1) žmogaus polipeptido SCF1"183 (Fig.15C), apribojantys fragmentai nuo EcoRL iki Hindlll, koduojantys žmogaus SCF geno karboksilinj galą, buvo izoliuotas iš pGEM žmogaus SCF 114-183 (aprašyta žemiau), apribojantis fragmentus nuo Sstl iki EcoRI, koduojantis N-galą žmogaus SCF geno ir buvo izoliuotas iš pCEM 1156 žmogaus SCF1-164, o taip pat buvo izoliuotas didelis fragmentas nuo Hindlll iki Sstl iš pCEM
[0281] 183, kuris buvo transformuotas įFMS E. coli. Po selekcijos pagal atsparumą kanomicinui, buvo izoliuota plazmidinė DNR ir DNR sekų teisingumas tikrintas sutvarkymu.
[0282] Plazmidės pGEM3 žmogaus SCF114-183 yra pGEM3 darinys, kuris turi EcoRI-SpHI fragmentą, apjungiantį nukleotidus nuo 609 iki 820 sekų, parodyta Fig.15C. EcoRI-Sphl įjungimas buvo izoliuota iš PCR, kurioje naudojo oligonukleotidinius pradmenis 235-31 ir 241-6 (Fig.12C) ir PCR 22.7 (Fig.13B), kaip matricą. 241-6 seka remiasi žmogaus seka nuo 3'-galo aksono, turinčio 176 aminorūgšties kodoną.
[0283] gQpM64 gavjmuj fermentaciją vykdė 16 litrų fermentatoriuose, naudojant FM5 E. coli K12, turinčią plazmidę pCFM 1156 žmogaus SCF 1-164. Kultūros kamienus laikė -80°C 17% glicerine Luria terpėje. Pasėjamosios medžiagos gavimui 100 ml atšildyto kamieno pasėjamosios pernešė į 500 ml Luria terpės dviejų litrų Erlenmejerio kolbą ir paliko per
[0284] Norėdami gauti E. coli biomasę, naudojamą kaip pradinę medžiagą žmogaus SCF1"
[0285] Kamieninė kultūra aseptiškai buvo pernešta j 16 litrų fermentatorių, kuriame buvo 8 I terpės (žr. 9 lentelę). Kultūrą augino iki optinio tankio OD6oo=3.5. j fermentatorių peristaltinio siurblio pagalba steriliai supylė pasėjamąją medžiagą (1 užsėjimas, 10 lent.), kontroliuojant užsėjimo greitį. Pasėjamosios augimo greitis buvo eksponentinis ir augimo greitis 0.15 l/val. Augimo fazės metu, temperatūra buvo apie 30°C. Ištirpusio deguonies koncentracija fermentatoriuje buvo kontroliuojama automatiškai, palaikant 50% įsotinimą deguonimi, kontroliuojant oro padavimą, maišymo greitį, slėgį inde ir deguonies padavimą kontrolei. pH 7.0 buvo reguliuojamas automatiškai, naudojant fosforo rūgštį ir amoniaką. Esant OD6oo « 30, temperatūra nuo 30°C pakeliama iki 42°C ir tuo įvykdoma indukcija. Tuo pačiu metu nutrauktas 1 užsėjimas ir pradėtas 2 užsėjimas (11 lent.) 200 ml/val greičiu. Praėjus maždaug 6 vai. po temperatūros pakėlimo, fermentatoriaus turinį atšaldė iki 15°C. SCF 1-164 išeiga buvo maždaug 30 mg/OD-L. Biomasę centrifugavo Beckman J6-B, 3000xg 1val. Biomasė buvo laikoma - 70°C šaldytuve.
[0286] SCF 1-164 parinktas metodas analogiškas metodui, aprašytam aukščiau, išskyrus
[0287] i
[0288] 2. Pasėjamosios padavimo greitis išauga lėčiau, ir tai duoda mažesnį augimo greitį
[0289] Pagal šį procesą SCF1"164 išeiga buvo gauta maždaug 35-40 mg/OD-l, esant OD-25.
[0290] Metalų pėdsakų tirpalas: FeCI3x6H20 - 27 g/l; ZnCl2x4H20 - 2 g/l; CaCl2x6H20 - 2 g/l; Na2Mo04x2H20 - 2 g/l; CuS04x5H20 -1.9 g/l; koncentruota HCL, 100 ml/l.
[0291] Vitaminų tirpalas: riboflavinas 0.42 g/l; pantoteno rūgštis 5.4 g/l; niacinas 6.0 g/l, piridoksinas 1.4 g/l; biotinas 0.06 g/l; folinė rūgštis 0.04 g/l.
[0292] Metalų pėdsakų tirpalas: FeCI3x6ft20 - 27 g/l; ZnCI2x4H2o - 0.2 g/l; CaCI2x6H20 - 2 g/l; Na2Mo04x2H20 - 2 g/l; CuS04.x5H20 -1.9 g/l; koncentruota HCL, 100 ml/l.
[0293] Vitaminų tirpalas: riboflavinas 0.42 g/l; pantoteno rūgštis 5.4 g/l; niacinas 6 g/l, piridoksinas 1.4g/l; biotinas 0.06 g/l; folinė rūgštis 0.04 g/l.
[0294] Radioimuninių mėginių procedūras (RIP) naudojo SCF kiekybiniam nustatymui
[0295] SCF preparatą iš BRL 3A ląstelių, išvalytą, kaip 1 pavyzdyje, inkubavo kartu su antiserumu 2 vai. 37°C. Po 2 vai. inkubacijos mėgintuvėlius su pavyzdžiais atšaldė lede, pridėjo 125J-SCF, mėgintuvėlius inkubavo 4°C temp. 20 vai. kiekviename mėgintuvėlyje buvo 500 ml inkubacinio mišinio, sudaryto iš 50 ml skiesto antiserumo, -60.000 ort125J-SCF (3.8x107 sp/mg) 5ml trazilolo ir 0-400 ml standartinio SCF su buferiu (fosfatinis užbuferintas fiz.tirpalas, 0.1% veršiuko albumino serumo, 0.05% tritono X-100, 0.025% azido), išlaikydami patovų tūrj. Antiserumu buvo antrojo testo triušio kraujas, imunizuotas 50%-nio švarumo natūraliu SCF iš BRL 3A preparatu. Galutinis antiserumo praskiedimas mėginyje buvo 1:2000.
[0296] Surištas su antikūnu 125J-SCF buvo išsodintas pridedant 150 ml Staph A (Calbiochem). Po 1 vai. inkubacijos kambario temperatūroje pavyzdžius centifugavo ir nuosėdas du kartus praplovė 0.75 ml Tris-HCI pH 8.2, kuriame buvo 0.15 M NaCI, 2 mM EDTA, 0.05% Tritono X-100. Praplautas nuosėdas perskaičiavo gama-skaitliuku, nustatydami 125J-SCF surišimo procentą. Paskaičiuoti ryšiai iš mėgintuvėlių be serumo, buvo atskirti iš galutinių reikšmių, siekiant koreguoti nespecifinį išsėdimą. Tipinis RIP parodytas Fig.20. 125J-SCF-ryšio, gauto su nežymėtu standartu, inhibavimo procentas priklauso nuo dozės (Fig.20A), ir kaip parodyta Fig.20B, tiriant imuno-išsodintas nuosėdas SDS-PAGE ir autoradiografija susilygino 125J-SCF-baltymo jungtis (Fig.20B) dalis 1-125J-SCF, 2,3,4,ir5-imuno-išsodinti 125J-SCF, sulyginti su 0. 2, 100 ir 200 g SCF standarto, atitinkamai. Kaip nustatyta abiem metodais, išsodintų antikūnių
[0297] sumažėjimas, stebimas RIP mėgintuvėliuose ir imuno-išsodintų 125J-SCF-baltyminės jungties (migracija prie maždaug Mr = 31.000) sumažėjimas ir poliklonalinis antiserumas atpažįsta standartinį SCF, išvalytą pagal 1 pvz.
[0298] Rekombinantinio SCF, išskirto E. coli, nustatymui, COS-1, CHO ląstelėse taip pat naudojo VVestern procedūras. Iš dalies išvalytas, išreikštas E. coli, žiurkės SCF1"193 (10 pvz.), išreikštas ląstelėje COS-1 žiurkės SCF 1"164 ir SCF 1"193, taip pat, kaip žmogaus SCF 1"162, (4 ir 9 pvz.), ir išreikštas ląstelėje CHO žiurkės SCF 1162 (5 pvz.) buvo tirti SDS-PAGE. Po elektroforezės proteininius ryšius pernešė ant 0.2 mM nitroceliuliozės aparato Bio-Rad Transbiot pagalba, esant 60 V per 5 vai. Nitroceliuliozinę membraną blokavo 4 vai. fosfatiniame buferyje pH 7.6, turinčiam 10% ožio serumo, po to - 14 vai. inkubavo kambario temperatūroje kiekvieną triušio preimuninj ar imuninį serumą skiedžiant 1:200 (imunizacija aprašyta aukščiau). Serumo-antikūnų kompleksus stebėjo naudojant su peroksidaze konjuguotus ožio antitriušio IgG reagentus (Vector Laboratories) ir spalvos reagentą 4-chlor-1 naftolį.
[0299] gauti iš ląstelių COS-1 žmogaus EPO (COS-1, transfekuoti su V19,8 EPO); 8 sritis-dažyti molekulinių masių markeriai..
[0300] 1-4 inkubavo su preimuniniu serumu. Imuninis serumas specifiškai atpažįsta difuzinį
[0301] Fig.22 1 ir 7 sritys dalinai išvalytas žiurkės SCF 1"193, gautas iš E.co//; 2 ir 8 sritys - žiurkės SCF1"193, gautas iš COS-1 ląstelių iš kviečių grūdų, išvalytų agliutinin-agarozėje; 4 ir 9 - žiurkės SCF1162, gautas iš COS-1 ląstelių iš kviečių grūdų, 5 ir 10 sritys, išvalytų agliutinin-agarozėje; 6 sritis - žiurkės SCF'1"164, gautas iš kviečių šeimos CHO ląstelių, išvalytų agliutinin-agarozėje; ir 6 sritis - dažyti molekulinių masių markeriai.
[0302] iš E. coli žiurkės SCF"1"193 (1 ir 7 sritys) migruoja su Mr = 24.000 daltonų, tuo metu, kai žiurkės SCF"1"193, gautas iš CO-1 ląstelių (2 ir8 sritys) migruoja su Mr = 24-36,000 daltonų. Šis molekulinių masių skirtumas lauktas todėl, kad žinduolių ląstelės, bet ne bakterijos, tinkamos glikozilinimui.
[0303] Koduotų žiurkės SCF"1"162 sekų transformacija į COS-1 ląsteles (4 ir 9 sritys) ar CHO ląsteles (5 ir 10 sritys), duoda ekspresiją SCF su mažesne molekuline mase, negu esant transfekcijai su SCF1"193 (2 ir 8 sritys).
[0304] Žiurkės SCF1"162 iš COS-1 ląstelių ir CHO ekspresijos produktai-tai ryšių serija, turinti matomą Mr tarp 24-36,000 daltonų. Ekspresuoto SCF heterogeniškumas, matomai, apsprendžiamas angliavandenių variantais, kur polipeptidinis SCF glikozilinasi skirtingais dydžiais.
[0305] Apskritai, Western analizė rodo, kad triušių, imunizuotų žinduolių gamtiniu SCF, imuninis serumas priima rekombinantinj SCF, gautą iš E. coli ląstelių, COS-1 ir CHO, bet nepriima bet kokių ryšių kontroliniame pavyzdyje, sudarytame iš gautų EPO ląstelių COS-1. Toliau palaikant SCF antiserumo specifiškumą SCF, iš anksto imunizuotas to
[0306] pačio triušio serumas nereagavo su bet kokiu žiurkės ar žmogaus SCF ekspresijos produktu.
[0307] COS-1 ląsteles transfekavo V19.8 SCF1-162 pilnoje eksperimentų eilėje (T175 cm2 kolbos vietoje 60 mm lėkštelių), kaip aprašyta 4 pvz. Buvo surinkta maždaug 270 ml paviršinio sluoksnio, kurį chromatografavo kviečių grūdų agliutinin-agarozėje ir S-sefarozėje, kaip aprašyta 1 pvz. Rekombinantinij SCF įvertino kaulų čiulpų transplantacijos modelyje, remiantis w/wv genetika. Pelės w/wv turi rūšinį ląstelių defektą, kuris kartu su kitais priveda iki mokrocitų anemijos (didelės raudonos ląstelės) ir jgalina kaulų čiulpų transplantaciją iš normalių gyvūnų neprisireikiant apšvitinti recipientus (Russel et al, Sci. 144, 844-846, 1964). Normalias donorines rūšines ląsteles po transplantacijos perauga defektinės ląstelės.
[0308] Pateikiamame pavyzdyje kiekvienoje grupėje buvo po 6 subrendusias peles. Kaulų čiulpus surinko iš normalių pelių-donorių ir transplantavo j w/wv peles. Gyvūno-recipiento kraujas buvo tiriamas kelis kartus po transplantacijos; Kaulų čiulpų per-sodinimas atliekamas perkeliant periferinio kraujo iš recipiento donoriniam fenotipui. Konversija iš recipiento donoriniam fenotipui pasireiškia pasekminio raudonų kraujo
[0309] ląstelių išsibarstymo profilio (FASCAM, Becton Dickenson) stebėjimu. Kiekvieno transplantuoto gyvūno profilis buvo lyginamas su kontrolinių gyvūnų donorų ir recipientų profiliais kiekvieną laiko momentą. Palyginimas buvo atliekamas naudojant kompiuterines programas, paremtas Kolmogorovo-Smirnovo statistika bėgančių sistemų histogramų analizei (Young.J.Histochem & Cytochem, 25, 935-941, 1977)). Priauginimo nepriklausomu kokybės indikatoriumi yra hemoglobininis tipas, nustatomas hemoglobino recipiento kraujyje elektroforezės būdu (Wong et al,
[0310] Mol.&Cell.Biol., 9, 798-808, 1989), ir gerai sutinka su Kolmogorovo-Smirnovo statistikos nustatymo savybėmis.
[0311] pieš.) iš C56BL/6J donorų w/wv recipientams. Antra grupė gavo 300000 ląstelių, apdorotų SCF (600 vnt/ml) esant 37°C, 20 min. ir įvestų j organizmą kartu (grupė iki apdorojimo, Fig.23). Vienas SCF vienetas, kaip rasta, duoda pusiau maksimalią stimuliaciją MC/9 biomėginyje. Trečios grupės pelės buvo injekuotos po oda (sub-Q) maždaug 400 vnt. SCF/per dieną 3 dienos po 30000 donorinių ląstelių transplantacijos (grupė poodinių injekcijų, Fig. 23 ). Kaip parodyta Fig.23, abiejose apdorotose SCF grupėse, kaulų čiulpai prigyja greičiau, negu neapdorotoje kontrolinėje grupėje. Po 29
[0312] Dėl Sl-lokuso mutacijų, atsiranda nepakankamumas kraujodaros, pigmentinėse, sėklidžių ląstelėse. Dėl kraujodaros defekto sumažėja raudonųjų kraujo kūnelių skaičius (Russel & Al Gordon, Regulation of Hematopoises, 1 t., 649-675, Appieton-Cent.-Crafts, NY, 1970), neutrofilų (Ruscetti, Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 152, 398, 1976)), monocitų (Shibata, J.lmm. 135, 3905, 1985), megakariocitų (Ebbe, Exp.Hemat., 6, 201,
[0313] 1978), ląstelių-žudikų (Clark, Immunogenetics, 12, 601, 1981) ir mast ląstelių (Hayachi, Dev.Biol, 109, 234, 1985). Broniruotos pelės yra blogi recipientai persodinamų kaulų
[0314] čiulpų dėl sumažėjusių sugebėjimų palaikyti prigimtines ląsteles (Banneman, ProgHematol, 8,131, 1973).
[0315] Broniruotos pelės jautrios SCF aktyvumui in vivo modelyje. Skirtingi SCF rekombinantiniai baltymai buvo tiriami pelėse Steel-Dickie (S1/S1) įvairius laiko tarpus. Steel pelių (WCB6F1-S10S1d), 6-10 savaičių amžiaus gavo iš Jackson Labs, Bar Harbor, ME. Periferinį kraują stebėjo ląstelių skaitiklyje SYSMEX F-800 (Baxter, Irvine,
[0316] CA): raudonas ląsteles, hemoglobiną ir trombocitus. Baltųjų kraujo kūnelių paskaičiavimui (BKK) naudojo Goulter Channelizer 256 (Coulter Electronics, Marietta GA).Eksperimente, 24 pieš., Steel-Dickie pelės buvo apdorojamos SCF1-164, gaminamu E. coli, išvalytu, kaip 10 pvz., 100 mg/kg/per dieną doze 30 dienų laikotarpyje, po to 30 mg/kg/per dieną doze - 20 dienų. Baltymas buvo fiziologiniame tirpale (Abbots Lab, N.Chicago), IL+0.1% jaučio serumo. Injecijos darytos po oda kiekvieną dieną. Periferinio kraujo monitoringą atliko per uodegų kraujavimą po 50 ml
[0317] nurodytu Fig.24 laiku. Kraują rinko 3% EDTA praplautais švirkštais ir supylė į perskalautus EDTA mikrofuginius mėgintuvėlius (Brinkmann, VVestburg NY). Buvo stebima žymi apdorotų gyvūnų makrocitinės anemijos korekcija lyginant su kontroliniais gyvūnais. Apdorojimus nutraukus, apdoroti gyvūnai grįžo j pradinę makrocitinės anemijos padėtj.
[0318] Eksperimente, parodytame Fig.25 ir Fig.26, Steel-Dickie pelės buvo apdorotos skirtingomis rekombinantinio SCF formomis, kaip aprašyta aukščiau, bet 100 mg/kg/per dieną doze 20 dienų. Dviejų formų £.co//'-žiurkės SCF, SCF 1164 ir SCF 1193 darinius ruošė kaip nurodyta 10 pvz. Papildomai E. coli SCF1"164 modifikavo pridedant polietilenglikolio (SCF 1164 PEG 25), kaip buvo patikrinta 12 pvz. CHO-darinys SCF1"164 gautas, kaip 5 pvz ir išvalytas, kaip 11 pvz., buvo taip pat patikrintas. Gyvūnų kraujas buvo imamas širdies punktūra, 3% EDTA praplautais švirkštais ir supilamas j EDTA praplautus mėgintuvėlius. Periferinio kraujo, po 20 dienų apdorojimo profiliai parodyti Fig.25 baltoms kraujo ląstelėms (BKK) ir Fig.26 - trombocitams. Skirtingi BKK SCF 1164 PEG 25 grupei parodyti Fig.27. Fiksuojami absoliutūs neutrofilų, monocitų, limfocitų ir trombocitų padidėjimai. Ypač stiprus efektas stebimas su SCF1"164 PEG 25.
[0319] Buvo taip pat atliktas nepriklausomas limfocitų rinkinių išmatavimas; duomenys pateikti Fig.28. Žmogaus CD4 murininis ekvivalentas, ar T-pagalbinių ląstelių markeris yra L3T4 (Dialinas, J.lmmun. 131, 2445, 1983.
[0320] Lut-2 yra murininiu antigenu citoksinių T-ląstelių (Ledbetter, J.Exp.Med, 153, 1503, 1981). Apdorotų gyvūnų T-ląstelių rinkinių jvertinimui naudojo monokloninius antikūnius prieš šiuos antigenus.
[0321] Visą kraują T-limfocitų rinkiniui nudažė sekančiu būdu. 200 į. iI viso kraujo buvo paimta iš gyvūnų individualiai j EDTA apdorotus mėgintuvėlius. Kiekvieną kraujo pavyzdj lizavo steriliu dejonizuotu vandeniu 60 sek, ir po to padarė izotoniniu naudodami 10xDilbecco fosfatinį buferinj fizioginj tirpalą (FBF) (Gibco, Grand Islan, NY). Šį lizuotą kraują praplovė 2 kartus IXDulbecco fosfatiniu buferiniu fiziologiniu tirpalu (Gibco, Grand Island, NY), pateikiamu su 0.1% jaučio serumu (Flow Lab. McLean, Va) ir 0.1% natrio azidu. Ląstelių nuosėdas (turinčias 200000-105 ląsteles) resuspendavo su 20 į.iI žiurkės priešpeliniu L 34T, konjuguotu su fikoeritrinu (FE)
[0322] (Beckton Dickinson, Mountain View), ir 20 įiI žiurkės priešpeliniu Lyt-2, konjuguotu su fluoresceino izotiocianatu, inkubuotu lede (4°C) 30 min. (Beckton Dickinson). Po inkubacijos ląsteles 2 kartus praplovė IX FBR. Kiekvieną kraujo pavyzdį po to analizavo AC sap ląstelių analizės sistemoje (Beckton Dickinson, Mountain View, CA).
[0323] Ši sistema buvo standartizuota standartinių prieškompensacinių procedūrų ir kalibracinių granulių pagalba (Beckton Dickinson, Mountain Vievv, CA). Šie duomenys parodė tiek ląstelių T-pagalbininkų, tiek ir citoksinių T-ląstelių absoliutų augimą.
[0324] 6.
[0325] Apdorojamiems gyvūnams kiekvieną dieną buvo daromos poodinės injekcijos. Pilniems kraujo, retikuliocitiniams ir trombocitiniams paskaičiavimams pavyzdžiai imti 1,
[0326] Visi gyvūnai iškentė procedūrą ir neturėjo neigiamų reakcijų SCF terapijai. BKK skaičius išaugo pas gyvūnus, gavusius 100 mg/kg.per dieną, kaip parodyta Fig.29. Diferencijuotas skaičiavimas atliktas pagal VVright Giemsa periferinių kraujo dėmių dažymą ir taip pat nurodytas Fig.29. Buvo fiksuotas absoliutus neutrofilų, limfocitų ir monocitų augimas. Paip parodyta Fig.30, buvo taip pat hemtokritų ir trombocitų augimas, esant 100 mg/kg/per dieną dozei.
[0327] taip pat buvo tikrintas su babuinais duodant 200 mg/kg/per dieną dozę, pailgintu intraveniniu įvedimu ir lyginamas su nemodifikuotu baltymu. Gyvūnai SCF gavo nuo 0
[0328] iki 28 dienos. Periferinio BKK rezultatai pateikti sekančioje lentelėje. PEG modifikuoti SCF rodė ankstesnį periferinio BKK augimą, negu nemodifikuoti SCF.
[0329]
[0330] Rekombinantinio žmogaus SCF aktyvumas
[0331] Žmogaus SCF , atitinkantį amino rūgštis 1-162, gautą PCR reakcijos pagalba, aprašytą ED pvz., ekspresavo COS-1 ląstelėje atitinkamai su aprašytu SCF 4 pavyzdžiu. COS- 1 ląstelių skystį bandė žmogaus kaulų čiulpuose, o taip pat mėginiuose ant murininės HPP-SCF ir MC/9. Žmogaus baltymas buvo neaktyvus tiriamajame koncentracijų intervale bet kokioje murino analizėje; tuo tarpu, jis buvo aktyvus tiriant žmogaus kaulų čiulpuose. Analizės kultivavimo sąlygos buvo tokios: sveikų savanorių kaulų čiulpus centrifugavo Fco11-Hypaque gradiente (Pharmacia) ir kultivavo sistemoje iš 2.1% metilceliuliozės, 30% veršiuko serumo, 6x10"5 M 2-merkaptoetanolio, 2 mM gliutamino, Iskovo terpėje (GIBCO), 20 vnt/ml EPO ir 1x10"5 2 ląst./ml 14 dienų atmosferoje, kurioje buvo 7%02> 10% CO2 ir 83% N. 12 lentelėje nurodyti kolonijų, generuotų esant rekombinantinio žmogaus ir žiurkės SCF COS-1 nuosėdų skysčiams, numeriai. Nurodytos tos kolonijos, kurių dydis 0.2 mm arba didesnės.
[0332] Kolonijos, išaugusios per 14 dienų, parodytos Fig.31A. (12-kartų padidinta). Strėle pažymėta paprasta kolonija. Pagal savo dydį, tokia kolonija primena murino HPP-SCF kolonijas (vidutiniškai 0.5 mm). Dėl EPO buvimo, kai kurio tokios kolonijos hemoglobunizuotos. Išskiriant tokias kolonijas ir jas centrifuguojanr ant objektinių stiklelių naudojant Citospiną (Shandon) su po to sekančiu dažymu Baltuoju Gemza,
[0333] tam tikras ląstelių tipas turėjo nediferencijuotą ląstelę su dideliu santykiu branduolys/citoplazma, kas parodyta Fig.31B. (padidinta 400 kartų). Fig.31B strėlėmis parodyta tokios struktūros: 1 strėlė-citoplazma; 2-branduolys; 3-vakuolė. Nesubren-
[0334] dusios ląstelės, kaip klasė, yra didelės ir tokios ląstelės tampa mažesnės, priklausomai nuo subrendimo laipsnio (Digss et al, Morfologija žmogaus kraujo ląstelių, Abbot Labs, 3, 1978). Ankstyvųjų ląstelių branduolys pagal hemopoetinį subrendimą atitinka citoplazmą. Be to, nesubrendusių ląstelių citoplazma nusidažo Baltuoju Gemza giliau,
[0335] negu branduolys. Pagal ląstelių subrendimą, branduolys įgauna tamsesnę spalvą, negu citoplazma. Žmogaus kaulų čiulpų, gautų iš kultūros dalyvaujant rekombinantiniam SCF, ląstelių morfologija sutinka su išvadomis apie tai, kad taikinys ir SCF produktas yra santykinai nesubrendęs kraujodaros pirmtakas.
[0336] Žmogaus rekombinantinį SCF bandė agarizuotų kolonijų analizėje pagal poveikį kaulų čiulpams kombinacijoje su kitais augimo faktoriais, pagal ankstesnį aprašymą. Gauti rezultatai pateikti 13 lentelėje.
[0337] Sinergizmas pasireiškia esant G-SCF, GM-SCF, IL-3 ir EPOn, individualiais SCF
[0338]
[0339] Kitas žmogaus rekombinantinio SCF aktyvumas pasireiškia sugebėjimu iššaukti ūmios žmogaus mieologeninės anemijos ląstelių linijos proliferaciją (AMI) KG-1 (ATCC CCI 246) pusiau kietame agare. Nuosėdų skystis COS-1 nuo transfekuotų ląstelių buvo klonuotas ant agaro KG-1 (Koefflor et al, Sci. 200, 1153-1154, 1978) praktiškai pagal aprašytą metodiką išskyrus tai, kad ląsteles išsėjo 3000/ml kiekiu. 14 lentelėje pateikti kultūrų trijų paralelių bandymų rezultatų vidurkiai.
[0340] E.coli fermentaciją žmogaus SCF 1164 vykdė pagal 6C pavyzdžio metodiką. Biomasę
[0341] (svoris šlapios biomasės 912 g) suspendavo vandenyje iki 4.6 I tūrio ir ardė tris kartus leisdami per laboratorinį homogenizatorių (Gaulin 15MP-8TBA), esant 55158 kPa slėgiui. Centrifuguodami gavo susmulkintų ląstelės granulių frakciją (17700xg, 30 min.,
[0342] 4°C), praplovė vandeniu (resuspendavimas ir recentrifugavimas) ir pagaliau suspendavo vandenyje iki 400 ml.
[0343] 10-12 g) sudėjo į 3950 ml atitinkamo mišinio taip, kad galutinė mišinio komponentų koncentracija buvo 8 M karbamido (ypatingo švarumo), 0.1 mM EDTA, 50 mM natrio acetato, pH 6-7, SCF koncentraciją įvertino kaip 1.5 mg/ml. Siekiant ištirpinti SCF, inkubavo kambario temperatūroje 4 vai. Likusią neištirpusią medžiagą pašalino centrifuguodami (17700xg, 30 min., kambario temp.). Pakartojant (parūgštėjimas ištirpusio SCF), nusėdusią frakciją lėtai, maišant supylė į 39.15 I atitinkamo mišinio taip,
[0344] 0.01 mM EDTA, 5 mM natrio acetato, 50 mM Tris-HCL, pH 8.5, 1 mM gliutationo, 0.02%
[0345] (masė/tūriui) natrio azido. SCF koncentraciją nustatė 150 (.ig/ml. Po 60 vai. kambario temperatūroje (galima laikyti mažiau, pvz. 20 vai.), maišant, mišinys buvo du kartus koncentruotas naudojant Millipor Pelicon ultrafiltracijos įrenginį su trimis mem-braninėmis iš polisulfono, molek. masė 10000, kasetėmis (bendras plotas 1,39 m2) ir po to diafiltravo atitinkamai 7 tūriais 20 mM Tris-HCI, pH8. Temperatūra koncentravimo (ultrafiltracijos) metu buvo 4°C, tekėjimo greitis-5 l/min ir filtracijos greitis 600ml/min.
[0346] Galutinis tūris buvo 26.5 I. Naudojant SDS-PAGE operaciją, kurią vykdė su pavyzdžiais arba be jų, darosi aišku, kad didesnė dalis (>80%) frakcijos SCF nuosėdų po centrifugavimo ištirpsta inkubuojant su 8 M karbamido ir kad po parūgštėjimo, sistemoje egzistuoja daug SCF formų, ką rodo neatstatyto pavyzdžio SDS-PAGE. Pagrindinė forma, kuri yra kaip teisingai parūgštintas SCF (žr. žemiau), migruoja su Mr maždaug 17000 (neredukuota) santykinai markerių (redukuotų), aprašytų Fig.9 su išnaša, molekulinei masei. Daugelis formų turi medžiagą, migruojančią su Mr 18-20000 (neredukuotas), matomai, turi SCF neteisingais disulfidiniais ryšiais; sudarančiais SCF polipeptidines grandines kovalentiškai surištas su dimerų ar stambių oligomerų susidarymu. Paskutinės frakcionavimo stadijos priveda prie likusių E. coli priemaišų ir nepageidaujamų SCF formų pašalinimo ir to rezultate pasiekiamas SCF išvalymas iki homogeniško ir biologiškai aktyvaus būvio.
[0347] Ultrafiltruoto retentato pH nustatė lygų 4.5, pridedant 375 ml 10% (tūris/tūriui) acto rūgšties, ir to pasekoje medžiaga išsėdo. Po 60 min., kada didžioji dalis išsėdusios medžiagos nusėdo ant dugno, viršutinius 24 I dekantavo ir filtravo, kad nuskaidrėtų per
[0348] Sipo 30 SP filtrus 500ml/val greičiu. Po to filtratą skiedė 1.5 karto vandeniu ir 4°C temp. leido per koloną (9x18.5 cm) greita tėkme S-sefarozės (Pharmacia) išlygsvarintą 25 mM
[0349] natrio acetato, pH 4.5. Kolonėlėje tekėjimo greitis buvo 5 l/val ir temperatūra 4°C. Po pavyzdžio praleidimo, koloną praplovė 5 tūriais (6 I) buferio ir SCF, surišto su kolonos medžiaga eliavo 0-0.23 M NaCI kolonos buferio eliuentu. Bendras gradiento tūris buvo 20 I ir frakcijas ėmė po 200 ml. Eliuavimo profilis atvaizduotas Fig.33. Frakcijos
[0350] alikvotos (10 įuI) surinktos iš kolonos su S-sefaroze analizavo SDS-PAGE metodu, kurį vykdė kaip su pavyzdžio redukavimu (Fig.32A), taip ir be jo (Fig.32B). Iš tokios analizės
[0351] duomenų matyti, kad praktiškai visas sugėrimas buvo 280 nm srityje (Fig.32 ir Fig.33) ir gali būti priskirtas SCF.
[0352] Teisingai oksiduota forma pirmiausiai atitinka sugėrimo piką (22-38 frakcija, Fig.33). Formos su nedideliu kiekiu, kurį galima vizualiai stebėti frakcijose, įjungia neteisingai oksiduotą medžiagą su Mr 18-20.000 ant SDS-PAGE (neredukuotas) atstojantį pagrindinio piko sugėrimo petį (10-21 frakcijos, Fig.32B); o disulfidiškai surišta dimerinė medžiaga randasi visame sugėrimo intervae (10-38 frakcijos, Fig.32B).
[0353] Frakcijos 22-38 iš kolonos su S-sefaroze nupylė ir pH gauto mišinio nustatė 2. 2, pridedant maždaug 11 ml 6 N HCI ir praleido per C4 Vudac koloną (aukštis 8.4 cm, diametras 9 sm) nulygsvarintą 50% etanoliu (tūris/tūriui), 12.5 mM HCI tirpalu (A) prie 4°C. Dervą kolonai paruošė sausą, dervą suspenduodami 80% etanolio (tūris/tūriui),
[0354] 12.5 mM HCI (tirpalas B) ir išlygsvarino tirpalu (A). Prieš gaunant pvyzdžius naudojo tuščią gradientą nuo tirpalo A iki tirpalo B (bedras tūris 6 I) ir po to koloną vėl išlygsvarino tirpalu A. Gavus pavyzdžius, koloną plovė 2.5 I A tirpalu ir SCF medžiagą surištą su kolonos medžiaga eliuavo tirpalų A-B gradientu (bendras tūris 18 I), greitis 2670 ml/val. Buvo paimtos 286 frakcijos po 50 ml ir alikvotos analizuotos pagal sugėrimą ties 280 nm (Fig.35), o taip pat SDS-PAGE metodu (25 įil iš frakcijos) atitinkamai aukščiau esančio aprašymo (Fig.34A, redukuojančios sąlygos; Fig.34B neredukuojančios sąlygos). 62-161 frakcijos, turinčios teisingai oksiduotas SCF gerai išvalytame būvyje nupylė, (santykinai didelius kiekius neteisingai oksiduoto monomero su Mr 18-20000 (neredukuotas) vėliau eliuavo gradiento terpėje (166-211 frakcijos), disulfidiškai surištą dimerinę medžiagą eliuavo taip pat vėliau (maždaug 199-235 frakcijos) (Fig.35).
[0355] Etanolio pašalinimui iš gauto 62-161 frakcijų mišinio ir SCF koncentravimui naudojo metodiką, naudojant jonų-mainų dervą su greitu O-sefarozės tekėjimu (Pharmacia).
[0356] Mišinį (5 I) skiedė vandeniu iki 15.625 I tūrio, etanolio koncentraciją sudarydami maždaug 20% (tūris/tūriui). Po to siekiant nustatyti pH-8, pridėjo 1 M Tris-bazės (135
[0357] ml) ir papildomai 1 M Tris-HCI: pH 8, (23.6 ml) nustatydami bendrą koncentraciją Tris 10 mM. Po to pridėjo 10 mM Tris-HCI, pH 8 (15.5 I) privedant iki bendro sistemos tūrio 31.26 I ir etanolio koncentraciją iki 10% (tūris/tūriui). Po to medžiagą leido per O-sefarozės koloną 4°C greita tėkme (aukštis 6.5 cm, diametras 7 cm) nulygsvarintą 10
[0358] mM Tris-HCI. pH 8, po to koloną praplovė 2.5 I kolonos buferiu. Tekėjimo greitis imant pavyzdžius ir praplaunant buvo 5.5 l/val. Siekiant eliuuoti su SCF surištą medžiagą, per koloną priešinga kryptimi leido 200 mM NaCI, 10 mM Tris-HCL, pH 8, 200 ml/val. greičiu. Frakcijas ėmė po 12 ml ir jas analizavo 280 nm sugėrimo bangoje ir taip pat SDS-PAGE metodu, aprašytu aukščiau. 16-28 frakcijas nupylė (157 ml).
[0359] Po to mišinį turintį SCF analizavo dviem atskiromis chromatografijomis (po 78.5 ml kiekviename bandyme) ant gel-filtracinės kolonos (5x138 cm) su Sefakrilu S-200 HP
[0360] (Pharmacia); nulygsvarinus fosfatiniu buferiu 4°C temperatūroje. Frakcijas ėmė po 15 ml esant 75 ml/val tekėjimo greičiui. Kiekvienu atveju, pagrindinį piką, esant sugėrimo bangos ilgiui 280 nm. eliuavo atitinkamais tūrį kiekiais 1370-1835 ml. Frakcijas iš dviejų nurodytų kolonų, duodančias pikus, apjungė į vieną mišinį 525 ml tūrio, turintį maždaug 2.3 g SCF. Šią medžiagą steriliai filtravo naudojant Millipor Milipak membranas.
[0361] Iš kitos pusės, medžiaga iš kolonos C4 gali būti koncentruota ultrafiltracija ir prieš
[0362] Išskirta rekombinantinė žmogaus SCF 1164 medžiaga turi didelę švarumo klasę
[0363] (>98% pagal SDS-PAGE analizę dažant sidabru) ir laikoma, kad toks švarumas atitinka farmakologinius reikalavimus. Naudojant metodus, aprašytus 2 pvz., buvo nustatyta, kad gauta medžiaga turi aminorūgščių seką atitinkančią gautą SCF genų analize ir turi N-galo amino rūgščiųseką Met-Glu-Gly-lle..., kaip ir buvo laukta atitinkamai su Met koduojančiu iniciatyviniu kodonu.
[0364] Pagal metodus lyginamus su aprašytais žmogaus SCF 1164 ekspresuoto E. coli, gali būti išskirtas SCF1"164 (taip pat esant netirpios formos ląstelės viduje) išvalytoje būklėje aukšto laipsnio biologiniu aktyvumu. Analogišku būdu gali būti išskirtas žmogaus SCF 1-183 ir žiurkės SCF 1-193 Žiurkės SCF 1193 susidarymo eigoje (oksidavimas turi tendenciją sudaryti įvairius oksiduotus darinius) gali apsunkinti pašalinimą chromatografijos eigoje. Žiurkės SCF 1193 ir žmogaus SCF 1183 gali būti proteolitiškai degraduoti ankstyvose išskyrimo stadijose. Pirminė proteolizės vieta yra tarp 160 ir 170 liekanų. Proteolizė gali būti minimizuota reguliuojant sąlygas pvz., SCF koncentracija, pH pakeitimu, 2-5 mM EDTA įvedimu j sistemą ar kitų proteazių (inhibitorių) įvedimu, o taip pat degraduotų formų tokiu kiekiu, kokiu egzistuoja sistemoje, pašalinamu atitinkamose frakcionavimo stadijose.
[0365] Nors nurodoma, kad karbamido naudojimas stabilizuojant yra pirmaeilis, taip pat sėkmingai galima naudoti kitus stabilizacijos agentus, tokius kaip guanidino hidrochloridą (pvz., 6 M ir 0.25 M), o taip pat N-lauroil-sarkoziną. Pašalinant agentus po pakeitimo/parūgštinimo, išvalytas SCF, pagal SDS-PAGE analizę, gali būti regeneruotas naudojant atitinkamas frakcionavimo stadijas.
[0366] Be to, nors geriau dubliavimo/oksidinimo metu naudoti 1 mM kone. gliutationą lygiu ar artimu efektyvumu, gali būti naudojamos ir kitos sąlygos. Pavyzdžiui, naudojant vietoje 1 mM gliutationo, 2 mM gliutationo ir 0.2 mM oksiduoto gliutationo, ar 4 mM gliutaniono ir 0.4 mM oksiduoto gliutationo, ar 1 mM 2-merkaptoetanolio ar kitus tiolinius reagentus.
[0367] Be aprašytų chromatografijos metodikų, kurios gali būti naudojamos SCF aktyvios formos išskyrimui, gali būti naudojamos hidrofobinė chromatografija (pvz., naudojant fenil-Sefarozę (Pharmacia) su pavyzdžio neutralia pH reikšme, esant 1.7 M amonio sulfatui ir gradientinė eliuacija, mažinant amonio sulfato kiekį); chromatografija su imobilizuojančiais metalais (pvz., naudojant chelatinę Sefarozę (Pharmacia), pakrautą
[0368] Cu2+ jonais , pavyzdžio pH esant artimam neutraliam naudojant 1 mM imidazolo) ir hidroksilapatitinė chromatografija (naudojant neutralaus pH pavyzdį su 1 mM fosfato ir eliavimą gradientu, padidinančiu fosfato kiekį); o taip pat kitos šos srities specialistams žinomos metodikos.
[0369] Kitos žmogaus SCF formos, visiškai ar dalinai atitinkančios atvirą koduotų aminorūgščių 1-248 seką ar atitinkančios atviro skaitymo rėmelį (Fig.44) taip pat gali būti ekspresuotos E. coli ir išskirtos švarioje formoje pagal metodiką, analogišką čia aprašytai, o taip pat kitus šios srities specialistų žinomus metodus.
[0370] Formų turinčių taip vadinamą transmembraninę dalį, kurią rodo 16 pavyzdys, valymas ir formavimas, apima detergentų utilizavimą, įtraukiant nejoninius detergentus,
[0371] o taip pat lipidus, įtraukiant fosfolipidus turinčias liposomines struktūras.
[0372] Rekombinantinis SCF iš žinduoliu ląstelių
[0373] A. CHO ląstelių, produkuojančiu SCF. fermentaciją
[0374] Rekombinantinius kiniško žiurkėno kiaušidžių (CHO) ląstelių, CHO pDSPa2hSCF1-162 kamienus augino ant mikronešiklių perfuzinėje kultivavimo sistemoje, siekiant gauti produkuojamą žmogaus SCF1"164. Fermentatoriaus sistema analogiška BRI 3A ląstelių auginimo iš 1 B pavyzdžio, išskyrus: CHO ląstelėms naudojama kultivavimo terpė buvo modifikuotos Dulbeko (DMEM) ir mitybinės Chamso 12 terpės mišinys, santykiu 1:1 (GIBCO), kurią papildė 2 mM gliutamino, nebūtinomis aminorūgštimis (tam, kad padvigubintų esamą koncentraciją, praskiedus 1:100 Gibco terpę) ir 5%veršiuko serumu. Galutinė terpė buvo identiška, išskyrus serumą. Reaktorių užsėjo 5.6x109 CHO ląstelėmis, išaugintomis 3 I kolbose. Ląsteles augino iki koncentracijos 4x105 ląst/ml. Po to įpylė 100 g iš anksto išsterilinto citodeks-2 mikronešiklio (Pharmacia) 3 I fosfatinio buferio. Ląstelėms leido susirišti ir augino ant šių mikronešiklių 4 dienas. Kultivavimo terpę perfuzuodavo per reaktorių pagal gliukozės išnaudojimą. Gliukozės koncentracija buvo palaikoma maždaug 2.0 g/l. Po 4 dienų, fermentatorių perfuzavo šešiais terpės, neturinčios serumo, tūriais, kad baltymo koncentracija būtų <50 mg/ml.
[0375] Po to reaktorius dirbo periodiniu režimu, kol gliukozės koncentracija nesumažėjo iki 2 g/l. Po šito, reaktorius dirbo pastovaus perfuzijos greičio režimu, lygiu 20 l/dieną.
[0376] Kultūrinės terpės pH buvo 6.9±0.3, palaikomas reguliuojant CO2 tekėjimo greitį. Ištirpusio deguonies kiekis buvo palaikomas aukščiau 20% įsotinimo oru, esant būtinumui, paduodant gryną deguonį.
[0377] Anksčiau aprašytoje sistemoje gavo maždaug 450 I neturinčios serumo kondicinės
[0378] terpės ir ją naudojo kaip išeiginę medžiagą rekombinantinio žmogaus SCF1-162 valymui.
[0379] Analogiškai vykdytoje sistemoje, naudojant CHO pDSPa2hSCF1-162, gavo maždaug 589 I neturinčios serumo kondicinės terpės ir ją naudojo kaip žaliavą gauti žiurkės SCF 1"162
[0380] Kondicinę terpę be serumo, gautą auginus ląstelių pDSRa2 žiurkės SCF 1162 kamieną, pagal A skyriuje aprašytą metodiką, filtravo per 0.45 (.im Sartokapsules
[0381] (Sartorius). Keletą skirtingų partijų (36 I, 101 I, 102 I, 200 I, 150 I) atskirai koncentravo ir veikė diafiltraciniais/buferiniais mainais. Iliustracijai aprašyta operacija su 36 I. Nufiltruotą kondicinę terpę koncentravo iki 500 ml naudojant tangentinį ultrafiltracijos aparatą Millippor Pelikon su trimis membranų iš acetatceliuliozės, molek. masė 10000 (bendras membranos plotas 1,39 m2, tekėjimo greitis 220ml/min), kasetėmis. Po to vykdė diafiltraciją/buferinius mainus anijonų mainų chromatografijos preparate, pridedant 2000 ml 10 mM Tris-HCI, pH 6.7-6.8 iki 500 ml tūrio į antrinio koncentravimo koncentratą, naudojant ultrafiltracijos aparatą su tangentine srove ir 5 kartus pakartojant operaciją. Koncentruotas/diafiltruotas preparatas galutinai buvo 1000 ml.
[0382] kiekis partijose nustatytas Bredfordo metodu (Anal.Bioch. 72, 248-253, 1976), naudojant kaip standartą veršiuko albuminą, ir sudarė 70-90 (.ig/ml. Bendras kondicinės terpės kiekis buvo 589 I.
[0383] Koncentruoti/diafiltruoti preparatai iš visų penkių kondicinės terpės partijų buvo apjungti (bendras tūris 5000ml). pH nustatė 6.75, pridedant 1 M HCI, 2000 ml 10 mM Tris-HCI, pH 6.7, pralaidumas 0.700 mm o.
[0384] Preparatą leido per anijonų-mainų koloną su Q-Sefaroze greita tėkme (36x14 cm; Sefarozė greitos tėkmės, Pharmacia), nulygsvarinant 10 mM Tris-HCI buferiu, pH 6.7.
[0385] Po pavyzdžio praleidimo, koloną praplovė 28.700 ml Tris buferiu. Po to koloną plovė 23.000 ml mišiniu iš 5 mM acto rūgšties (1 mM glicino/6 M šlapalo), 20 įjM CuS04
[0386] esant pH 4.5. Po to plovė 10 mM Tris-HCI, 20 mM CuS04, esant buferio pH 6.7, siekiant pH priartinti prie neutralaus ir pašalinti karbamidą ir po to naudojo druskų gradientą (0-
[0387] 700 mM NaCI/10 mM Tris-HCI, 20 mkM CuSŪ4, buferio pH 6.7; bendras tūris 40 I). Frakcijas ėmė po 490 ml, esant tekėjimo greičiui 3.250 ml/val. Gauta chromatograma parodyta Fig.36. "MC/9 imp./min." atspindi biologinį aktyvumą, tiriant MC/9; aukščiau nurodytas frakcijas analizavo po 5 |il. Pieš. neparodyti surinkti pavyzdžių eigoje eliuantai, o taip pat plovimo tirpalai; kurie šiose frakcijose neturėjo biologinio aktyvumo. 3. Chromatografija, naudojant dervas angliavandeniu, surištu su silicio oksidu, pagrindu.
[0388] Fig.36 parodyto bandymo 44-46 frakcijas apjungė (11.200 ml) ir pridėjo EDTA iki galutinės koncentracijos 1 mM. Medžiaga 200 ml/val greičiu užnešta ant kolonos C4 (Vidak baltymai C4; 7x8 cm) nulygsvarintos buferiu (A) 10 mM tris pH 6.7 (20% etanolio). Užnešus pavyzdį, koloną plovė 1000 ml A buferiu. Po to naudojo linijinį gradientą nuo buferio A iki buferio B (10 mM tris su pH 6.7/94% etanolio) (bendras tūris 6000 ml) ir frakcijas ėmė po 30-50 ml. Iš kolonos C4 išeiginės medžiagos porcijos, nupylus medžiagas gautas bandyme ir praplovimo tirpalus, o taip pat gradiento frakcijos 0.5 ml alikvotas atitinkamai dializavo fosfatiniu buferiu. Tokias skirtingas frakcijas tyrė MC/9 analize, 5 j.il alikvotas, gautas frakcijų gradiente; imp./min. Fig.37.
[0389] SDS-PAGE duomenys (Lazmli, Nature, 227, 680-685, 1970); skirtingų frakcijų alikvotų koncentruojantys geliai su 4% (masė/tūriui) akrilamido ir skiriamieji geliai su 12.5% (sv./tūriui/akrilamido) parodyti Fig.38. Gelių pavyzdžių alikvotas (100 įaI )džiovino vakuume ir po to pakartotinai ištirpino naudodami 20 ^il apdorojančio buferio (redukavimas pvz., su 2-merkaptoetanolio) ir virė 5 min. prieš užnešant ant gelio. Pieš. kairiame kampe skaičiais pažymėtos markerių molek. masės (redukuoti), kaip ir Fig.6. Skaičių eilutės rodo atitinkamas frakcijas, surinktas paskutinėje gradiento dalyje. Geliai buvo dažyti sidabru (Morisei, Anal.Bioch., 117, 307-310, 1981).
[0390] Iš kolonos C4, parodytos Fig.36, 98-124 frakcijas nupylė (1050 ml), ir praskiedė 1:1 santykiu 10 mM Tris-buferiu pH 6.7, sumažinant etanolio koncentraciją. Po to tirpalą užnešė ant anijonų mainų greitos tėkmės kolonos su Q-sefaroze (3.2x3cm, Q-sefarozė greitos tėkmės, Pharmacia), išlygsvarino 10 mM Tris-HCI buferiu, pH 6.7. greitis 463 ml/val. Po pavyzdžio, koloną praplovė 135 ml kolonos buferio ir surištą medžiagą eliuavo plaunant 10 mM tris-HCI, 350 mM NaCI, pH 6.7. Tekėjimą priešinga kryptimi kolonoje keitė tam, kad minimizuoti eliuanto kiekį ir eliuavimo eigoje ėmė frakcijas po 7.8 ml.
[0391] Frakcijas su eliuuotu baltymu, gautas iš druskų praplovimo stadijos po anijonų mainų greitos tėkmės kolonos su Q-Sefaroze, apjungė (31 ml). 30 ml tokio mišinio užnešė ant gel-filtracijos kolonos su Sefakrilu S-200 (Pharmacia), (5x55.5 cm) išlyg-svarintą fosfatiniu buferiu. Frakcijos po 6.8 ml buvo renkamos 68 ml/val greičiu. Frakcijas, atitinkančias 280 nm sugėrimo piką, apjungė kaip galutinį išvalytą produktą.
[0392] 15 lentelėje susumuoti valymo rezultatai.
[0393] ir pusė piroGlu-GIn-ILE... atitinkamai 2 pavyzdžio nustatymo būdui. Gautas rezultatas rodo, kad žiurkės SCF 1162 yra proteolitinio apdorojimo produktas (skaldymo liekanos pažymėtos (-1) (Thr) ir (+1) (Gln) Fig.14C). Analogiškai išvalytas iš kondicinės terpės transfekuotų CHO ląstelių žmogaus SCF 1-162 (žr. žemiau) turėjo N-galo aminorūgščių
[0394] seką Gln-Glu-lle, kaip apdorojimo produktą (skaldymas tarp liekanų žymimas skaičiais(-1) (Thr) ir (+1) (Gln) Fig.15C.
[0395] Naudojant aukščiau aprašytas sekų operacijas, gauna išvalytą CHO ekspresuotų
[0396] Papildomi valymo būdai, naudojami žinduolių ląstelių rekombinantinio SCF darinių valyme apima ir tuos būdus, kurie nurodyti 1 ir 10 pvz., o taip pat kitus žinomus šios srities specialistams metodus.
[0397] Kitos žmogaus SCF formos, pilnai ar dalinai atitinkančios atviro skaitymo rėmelio koduotas aminorūgštis 1-248, parodytas 42 pieš., arba užkoduotas kita atviro skaitymo rėmelio kRNR (pvz., tomis, kurios pavaizduotos kDNR sekoje, Fig.44) taip pat gali būti ekspresuotos žinduolių ląstelėse ir išskirtos valymo metodais, analogiškais šiam pavyzdžiui, o taip pat kitais specialistų žinomais metodais.
[0398] SDS PAGE apjungtų frakcijų iš gel-filtracinės kolonos su Sefakrilu S-200 HP duomenys parodyti Fig.39; tokius pavyzdžius užnešė po 2.5 įiI (1 eilė). Dažė sidabru. Molekulinės masės markeriai (6 pozicija) buvo tokie patys, kaip nurodyta Fig.6. Medžiaga, migruojanti truputj aukščiau ir žemiau markerio Mr 31000 yra biologiškai aktyvi medžiaga; o atsiradęs heterogeniškumas susijęs su glikozilinimo heterogeniškumu.
[0399] Siekiant charakterizuoti, išvalytą glikozilinimu medžiagą apdorojo dideliu kiekiu glikozidazių, analizavo SDS-PAGE metodu (redukuojančiomis sąlygomis) ir įvertino vizualiai po dažymo sidabru. Gauti rezultatai pateikti Fig.39. Pozicija 2-neuraminidazė, pozicija 3- neutraminidazė ir O-glikanazė, 4-neuraminidazė, N-glikanazė ir N-glikanazė, 5-neuraminidazė ir N-glikanazė, 7- N-glikanazė, 8-N-glikanazė be substrato, 9- N-glikanazė be substrato. Sąlygos buvo vykdomos sistemoje, kur buvo 10 mM 3-(chola-midopropil(dimetilamonio)-1-propano sulfonato) (CHAP), 66.6 mM 2-merkaptoetanolio 0.04% (masė/tūriui) natrio azido fosfatinis buferinis tirpalas, 30 min. esant 37°C inkubacijai, ir esant koncentracijoms per pusę mažesnėms nurodytoms ir esant glikozidazei 18 val.-37°C. Neuraminidazę (iš Arthrobacter vreafaciens, teikiamą Callbiochem) naudojo 0.5 vnt/ml galutinės koncentracijos. N-glikanazę (Genzim, endo-alfa-acetil-galaktozaminidazė) naudojo 7.5 milivnt/ml kiekį. N-glikanazę (Genzim, peptidas: N-glikozidazė F; peptidas-N4/N-acetilbeta-gliukozaminil(asparin amidazė) naudojo 10 vnt/ml kiekį.
[0400] Esant būtinumui, darė kontrolines inkubacijas. Tokios operacijos yra: inkubacija be glikozidazių, siekiant patvirtinti tą, kad gauti rezultatai susiję su glikozidazinių preparatų jdėjimu; inkubacija esant glikozilintiems baltymams (pvz., glikozilinto rekombinantinio žmogaus eritropoetino), kurie kaip žinoma, yra glikozidazių substratai, siekiant patvirtinti naudojamų glikozidazinių fermentų aktyvumus; ir inkubacija su glikodazėmis,
[0401] bet nesant substratui, siekiant gauti informaciją apie teigiamą ar neigiamą glikozidazinių preparatų rolę, vizualiai stebint juostas gelyje (Fig.39, 8 ir 9 pozicijos).
[0402] Iš aprašytų eksperimentų galima padaryti eilę išvadų. Skirtingi apdorojimai N-glikanaze (kurie pašalina tiek kompleksinius, tiek didelius manozinius N-surištus angliavandenius (Tarentino et al, BioChem, 24, 4665-4671, 1988), neutraminidazėmis (kurios pašalina sialo rūgšties likučius) ir O-glikanazės (kurios pašalina kai kuriuos O-surištus angliavandenius) (Lambin et al, Biochem. Soc.Trans., 12, 599-600, 1984),
[0403] leidžia daryti išvadas, kad: sistemoje egzistuoja tiek N-surišti, tiek O-surišti angliavandeniai; ir kad yra sialo rūgštis, ir kai kuriais atvejais jos kažkoks kiekis sudaro 0-surišus fragmentus. Faktas, kad apdorojimas N-glikanaze sugeba, pagal SDS-PAGE, paversti heterogeninę medžiagą j greitai migruojančią formą, kuri yra homogeniškesnė,
[0404] rodo tai, kad visa medžiaga yra vienas ir tas pats peptidas ir heterogeniškumą iššaukia heterogeniškumas glikozilinimo metu.
[0405] Žiurkės SCF1"164, gautą ekspresavimo sistema pagal pavyzdžių GA ir 10 metodikas iš rekombinantinio E. coli, naudojo kaip žaliavą polietilenglikolio modifikacijai, aprašytai žemiau.
[0406] Metoksipolietileno glikolio-sukcinimidilsukcinatą (18.1 mg=3.63 molio; SS-MPEG=Sigma, No M3152, molek. masės =5000) pridėjo j 0.327 ml dejonizuoto vandens ir pridėjo 13.3 mg (0.727 molio) rekombinantinio žiurkės SCF1"164 , 1ml 138
[0407] Gautą tirpalą atsargiai purtė (100 aps/min) kambario temperatūroje 30 min. Po to galutinio reakcijos mišinio 1 ml alikvotą (10 mg baltymo) leido per gel-filtracinę koloną
[0408] 6.9, 0.25 m/min greičiu kambario temperatūroje. 10 ml eliuanto atmetė ir po to ėmė frakcijas po 1.0 ml. Nepertraukiamai registravo eliuanto UV sugėrimą (280 nm) ir gautą spektrą pateikė Fig.40A. Frakcijas 25-27 apjungė ir sterilino ultrafiltracija per 0.2 jum polisulfoninę membraną (Gelman Sci., No 4454) ir gautą tirpalą pažymėjo indeksu PEC-25. Analogiškai apjungė 28-32 frakcijas, sterilizavo ultrafiltracija ir pažymėjo
[0409] indeksu PEC-32. Apjungta frakcija PEC-25 turėjo 3.06 mg baltymo, o frakcija PEC-32 turėjo 3.55 mg baltymo iš paskaičiavimų, naudojant A28o (sugėrimo ties 280 nm)
[0410] kalibruotę išmatavus 0.66/1 mg/ml nemodifikuoto žiurkės SCF1"164 tirpalo. Nereagavęs žiurkės SCF1"164, turintis 11.8% viso rekombinantinio mišinio baltymo, eliuavosi 34-37 frakcijose. Analogiškomis chromatografinio skyrimo sąlygomis nemodifikuotą žiurkės gQpi-i64 e|juavo kajp pagrindinį piką, 45.6 ml tūriu (Fig.40B). 77-80 frakcijos (Fig.40A) turėjo N-hidroksisukcinimidą, pašalinį SCF1"164 reakcijos su SS-MPEC produktą.
[0411] Potencialios reakcijai žiurkės SCF1"164 amino grupės turi lizino liekanas ir alfa amino grupę N-galo gliutamininėje liekanoje. PEG-25 apjungta frakcija turėjo 9. 3 molio reakcingų amino grupių moliui baltymo, kaip buvo nustatyta spektrofotometriškai titruojant trinitrobenzensulforūgštimi (TNBS) naudojant Chabibo aprašytą metodą
[0412] (Anal.Biochem., 14:328-336, 1966). Analogišku būdu, apjungta frakcija PEG-32 turėjo 10.4 molio, o nemodifikuotas žiurkės SCF1"164 atitinkamai turėjo 13.7 molio reakcinių amino grupių/moliui baltymo. Tokiu būdu, vidutiniškai 3.3 (13.7 minusi 0.4) žiurkės gQpi-i64 amjno grupių sujungtoje frakcijoje PEG-32 modifikuojasi pagal reakciją su SS-MPEC. Analogiškai, vidutiniškai 4.4 žiurkės SCF1"164 aminogrupių maišytoje frakcijoje PEG-25 tinka modifikavimui. Žmogaus CF/nSCF1"164 gautas pagal 10 pvz. metodiką taip pat buvo modifikuotas naudojant aukščiau nurodytas metodikas. 714 mg (38.5 molio)SCF1-164 reagavo su 962.5 mg (192.5 molio) SS-MPEG 75 ml 0.1 M natrio fosfatinio buferio. pH 8.0 kambario temperatūroje 30 min. Reakcijos mišinį leido per koloną su Sefakrilu S-200 HR (5x134 cm) ir eliuavo naudojant PB (fosfatinis buferinis tirpalas Gibko Dulbeko be CaCl2 ir MgC^), 102 ml/val greičiu ir frakcijas ėmė po 14.3 ml. Analoginio mišinio 39-53 frakcijas PEG-25, aprašyto aukščiau ir parodyto Fig.40A, apjungė ir nustatė, kad jos turi 354 mg baltymo. Tokio modifikuoto SCF duomenys in vivo primatuose pateikti 8C pavyzdyje.
[0413] Leukeminius blastus surinko iš paciento su leukemija maišytos sekos periferinio kraujo. Ląsteles centrifugavo veikiant tankio gradientu ir veikė adheziškai. Žmogaus SCF1"164 žymėjo jodu pagal aprašytą 7 pavyzdyje metodiką. Ląsteles inkubavo skirtingų koncentracijų SCF pagal aprašytą Brodi, Blood, 75, 1622-1626, 1990. Receptorių susirišimo rezultatai pateikti Fig.41. Receptoriaus paskaičiuotas tankumas buvo maždaug 70000 receptorių ląstelei.
[0414] 11-7 siekiant sustiprinti linfoidinių ląstelių proliferaciją, buvo tiriamas pelių kaulų čiulpų agarizuotose kultūrose. Šioje analizėje kolonijos suformuotos tiktai rrSCF1"164 pagalba ir turėjo monocitus, neutrofilus ir blastines ląsteles tuomet, kai kolonijos buvo stimuliuotos tik su 11-7 ar kombinacijoje su rrSCF1"164 ir turėjo geriausiu atveju pre-B ląsteles. Pre-B ląstelės charakterizuojamos kaip B220+, slg", cn+ ir buvo identifikuotos apjungtų ląstelių FACS analize, naudojant fluorescuojančius žymėtus antikūnus antigenams B220 (Kofman, Immunol.Rev., 69, 5, 1982) ir paviršiaus Ig (ožio ITC anti-K,
[0415] Pietų biotechnologinė asociacija, Birmenhem, Al); o taip pat citonugarinių skaidrių analizę citoplazminei j.i ekspresijai, naudojant fluorescuojančius žymėtus antikūnus (ožio TRITC anti-fi, Pietų biotechnologinė asociacija). Rekombinantinj žmogaus 11-7 (rh11 -7) gavo iš Tarptautinio biošaltinio (VVestlike vili, JA). Pridedant rrSCF1-164, kombinacijoje su ląstelių pirmtako B augimo faktoriumi, buvo pastebėtas kolonijų susidarymo greičio sinergetinis padidėjimas (16 lentelė), kas rodo stimuliuojantį rrSCF1"
[0416] 164 veikimą ankstyvosioms B ląstelėms.
[0417]
[0418] Atsakant į klausimą ar SCF1"164 yra c-kit ligandas, pilną murininj c-kit kDNR (Qu et al, EMBO J., 7, 1003-1011, 1988) sustiprino naudojant PCR iš reaguojančios su SCF1-164 ląstelių linijos MC/9 (Nabeli et al, Nature, 291, 332-334, 1981), esant pradmenims, sukonstruotiems iš publikuotų sekų. Ligandinius ryšius ir transmembranines žmogaus c-kit sritis, koduojančias aminorūgštis 1-549 (Jarden et al, EMBO J., 6, 3341-3351, 1987), naudojant analogiškas metodikas, klonavo iš žmogaus eritroleukemijos ląstelių linijų, HEI (Martin ir Capajonnopulu, Sci., 216, 1233-1235, 1982). kDNR c-kit statė į žinduolių ekspresijos vektorių V19.8, paveiktą transfekcijos į CO-1 ląstelę ir gavo membranines frakcijas analizei, ryšiui naudojant žiurkės ir žmogaus 1251-SCF1-164, pagal aprašytus žemiau, skyriuose B ir C, būdus. 17 lentelėje pateikti tipinės surišimo analizės duomenys. Specifinio surišimo 1251 žmogaus SCF1"164 su COS-1 ląstelėmis transfekuotomis tiktai su V19.8, nebuvo rasta. Tačiau, COS-1 ląstelės ekspresuojančios
[0419] LTI) nesuriša 125SCF1;164 (17 lentelė). Nežymėto žmogaus SCF1"164 200-kartinio moliarinio pertekliaus pridėjimas, surišimo laipsnį pažemina iki fono lygio. Analogiškai,
[0420] CO-1 ląstelės transfekuotos murininiu pilno ilgio c-kit (hckit-LTI) suriša žiurkės 1251-SCF1"164. Nedidelį kiekį surišto žiurkės 1251-SCF1"164 aptiko COS-1 ląstelių transfektantuose būnant tiktai V19.8 ir vėl buvo stebima netransfekuotose ląstelėse (pieš. neparodyta), kas reiškia, kad COS-1 ląstelės ekspresuoja endogeninį c-kit. Gautas rezultatas atitinka platų c-kit ekspresijos ląstelių paplitimą. Žiurkės 1251-SCF1 164 analogiškai susiriša tiek su žmogaus, tiek su murininiu c-kit, tada kai žmogaus 1251-gQpi- i64 susjrj§a esant žemesniam aktyvumo laipsniui su murininiu c-kit (17 lentelė). Šie duomenys atitinka SCF1"164 kross-reakcijos savybių tarp fragmentų, žemėlapiui. Žiurkės SCF1164 indukuoja žmogaus kaulų čiulpų proliferaciją esant santykiniam aktyvumui analogiško SCF1"164, tada, kai žmogaus SCF1"164 indukuoja murininiu ląstelių proliferaciją, kas yra 800 kartų mažiau negu žiurkės baltymo atveju.
[0421] Sumuojant aukščiau gautus rezultatus, galima sakyti, kad jie patvirtina tą faktą, kad fenotipiniai nukrypimai ekspresuotų w ar SI mutantinių pelių yra pirminių receptorių-ligandinių ryšių su c-kit, pasekmė, ir turi lemiamą reikšmę vystytis įvairių tipų ląstelėms.
[0422] kDNR ir murininio c-kit klonus gavo naudodami PCR metodus (Saiki et al, Sci., 239, 487-491, 1988) iš pilnos RNR, išskirtos ekstrakcijos sistemos parūgštintas fenolis/chloroformas metodu (Chomčinski ir Saši, Anal.Bioch, 162, 156-159, 1987), atitinkamai iš žmogaus eritroleukemijos ląstelių linijos HEI ir ląstelių MC/9. Speciali oligonukleotidų seka buvo sukonstruota iš publikuotų žmogaus ir murininių c-kit sekų,
[0423] Viengrandę kDNR susintetino iš pilnos RNR pagal metodikas, numatančias fermentinę, Mo-M1V atgalinę transkripciją (Betesda Riserch lab., Betesda, MD) naudojant antijautrius c-kit oligonukleotidus vietoje pradmens. Persidengiančių c-kit dalių ligandinio ryšio ir tirozinkinazės sričių sustiprėjimas buvo vykdomas atitinkamai naudojant porą pradmenų c-kit. Tokias sritis klonavo į ekspresuotą žinduolių vektorių V19.8 (Fig.17) dėl COS-1 ląstelių ekspresijos. Kelių klonų DNR sekos nustatymas įgalino nustatyti nepriklausomas mutacijas, atsiradusias kiekviename klone, matomai, PCR sustiprinimo metu. Neturintys tokių mutacijų klonai buvo konstruoti iš atskirų klonų pašalinant mutacijų nesudariusius fragmentus. Kai kurie skirtumai su publikuotomis sekomis buvo rasti visuose arba beveik visuose klonuose; ir buvo padaryta išvada, kad tikros sekos būna naudojamose ląstelių linijose ir jos gali turėti alelinių skirtumų nuo publikuotų sekų. Pateiktos žemiau plazmidės buvo konstruojamos V19.8, V19.8:mckit-LTI pilnam murininiam c-kit; o taip pat V19.8:hckit-LI, turinčiame ligandinius ryšius plius žmogaus c-kit transmembraninę sritj (1-549 aminorūgštys).
[0424] Po dviejų dienų po transfekcijos COS-1 ląsteles nukrapštė nuo objektinio stikliuko,
[0425] Po atšildymo ląsteles pakartotinai suspendavo 10 mM Tris-HCI, 1 mM MgCI2, turinčiu 1 mM PMSF, 100 (.ig/ml aprotinino, 25 |.ig/ml leupeptino, 2 (.ig/ml pepstatino ir 200 ng/ml TICK-HCI. Suspensiją dispergavo 5-kartiniu pipetavimo būdu, inkubavo lede 15 min. ir ląsteles homogenizavo 15-20 Daunso homogenizatoriaus ciklais. J homogenatą pridėjo sacharozės (250 mM) ir branduolių frakcijos ir likusias nesuardytas ląsteles centrifugavo 500xg, 5 min. Viršutinį sluoksnį centrifugavo 25000xg,
[0426] Žmogaus ir žiurkės SCF1"164 žymėjo radoaktyviu jodu naudojant chloraminą-T (Chanter ir Greenvod, Nature, 194, 495-496, 1962). COS-1 membraninę frakciją inkubavo kartu su žmogaus ar žiurkės 125J-SCF1"164 (1.6 nm) esant arba nesant 200 kartiniam moliariniam pertekliui nežymėto SCF1"164 surišančiame buferyje, sudarytame iš RPM 1 pridedant 1% veršiuko serumo albumino ir 50 mM HEPES (pH 7.4) 1 vai. kambario temperatūroje. Po inkubacijos, membraniniai preparatai atsargiai užnešami sluoksniais ant 150 įiI ftalio aliejaus ir buvo centrifuguoti 20min. Beckmano mikrofugoje 11, siekiant atskirti membraninius-surištus 125J-SCF1"164 nuo nesurištų 125J-SCF1"164. Po centrifugavimo nuosėdas išmetė ir įvertino surišto su membranomis 125J-SCF1"164 kiekį.
[0427] Pilną RNR išskyrė iš HT-1080 žmogaus fibrosarkomos ląstelių linijos (ATCC CCI 121) ekstrakcijos sistemoje: rūgštus tiocianat-guanidinas -fenolio-chloroformas (Chomčinski ir kt., Anal.Bioch., 162, 156, 1987), ir poli(A) RNR išskyrė naudodami oligo (dT) koloną
[0428] firmos Clontech. Dvisiūlę DNR gavo iš 2 fig poli (A) rnr pagal BRI metodiką (Betesdo Reach.Lab.) kDNR sintezės pagal tiekėjų rekomenduojamas sąlygas. Maždaug 100 ng kolonoje frakcionuotos dvisiūlės DNR, kurių vidutinis dydis apie 2 kD, ligavo su 300 ng Sa 11/Notl perdirbtu vektoriniu pSPORT 1 (d'Alessio ir kt., Focus, 12, 47-50, 1990) ir transformavo j DN5a (Bl, Betesda, MD) ląsteles elektroporacijos būdu (Dayer ir kt., NucI.Acids Res., 16, 6127-6145, 1988).
[0429] 5000 individualių klonų. Plazmidinę DNR gavo iš kiekvienos grupės nusodinimo metodu CTAB-DNR (Del Sal ir kt., Biotechnique, 7, 514-519, 1989). 2 (ag kiekvienos plazmidinės DNR veikė ribotu fermentu Not 1 ir atskyrė del-elekroforeze. Linearizuotą DNR pernešė ant GenSkreen Plius membranos (Diupon) ir hibridizavo su 32P-žymėtu PCR-generuojančiu žmogaus SCF kDNR (3 pvz.) anksčiau aprašytomis sąlygomis (Leen ir kt., Proc.Nat.Acad.Sci., JAV, 82, 7580-8584, 1985).
[0430] Hibridizacijos rezultate identifikavo 3 grupes turinčias teigiamą signalą. Šias kolonijų grupėms pakartotinai atliko skryningą pagal kolonijų hibridizacijos metodiką (Leen ir kt., Gene, 44, 201-209, 1986) iki to laiko, kol iš kiekvienos grupės gavo po vieną koloniją. kDNR dydžiai tokiuose trijuose išskirtuose klonuose buvo 5.0-5.4 kD. Ribojantis fermentų poveikis ir nukleotidų sekų 5' gale nustatymas parodė, kad 2 klonai iš trijų yra identiški vienas kitam (10-1 a ir 21-7a). Abu tokie klonai turi koduojamą sritį ir apie 200 kD 5' netransliuotos srities (5' UTR). Trečias klonas (26-1 a) 5' gale 400 kD trumpesnis, negu kiti du klonai. Tokia žmogaus SCF kDNR seka parodyta Fig.42. Reikia ypač pažymėti hidrofobinę transmembraninę seką, prasidedančią aminorūgštimi 186-190 srityje ir besibaigiančią ties 212 aminorūgštimi.
[0431] pDSRa2hSCF1"248 generavo naudodami plazmidę 10-1 a (pagal 16B aprašymą) ir pGEM3hSCF1"164 tokiu būdu: Hind III iš pCEM3 SCF1"164 perkėlė į M13 p18. Nukleotidus, esančius virš ATG inicijuojančio kodono pakeitė sait-kontroliuojama mutageneze CTTTCCTT ATC į GCCGCCGCC ATC naudodami antijautrų oligonukleotidą
[0432]
[0433] COS-7 ląstelės (ATCC SR I 1651) transfekavo DNR pagalba pagal ankstesnį aprašymą. 4x106 ląstelių sistemoje iš 0.8ml DEM+5%FBS veikė elektroporacija, 1600 V įtampa, esant 10 (.ig pDSRa2 hSCFK1"248 DNR arba 10 (.ig pDSRa2 vektorine DNR (kontrolės vektorius). Po elektroporacijos pakartotinai išsėjo j dvi lėkšteles po 60 mm diametro. Po 24 vai. terpę pakeitė šviežia pilna terpe.
[0434] Po 72 vai. po transfekcijos kiekvieną lėkštelę žymėjo 35S-terpe pagal Jardeno ir kt.
[0435] (PNAS 87, 2569-2573, 1990) modifikacijos protokolą. Ląsteles praplovė fosfatiniu buferiu ir po to 30min. inkubavo DMEM neturinčia metionino ir cisteino (Met-Cys-DMEM).
[0436] Terpę nupylė ir j kiekvieną lėkštelę pridėjo 1ml Met-Cys-DMEM, kurioje buvo 100 ĮiCi/ml Tran35S-žymės (ICN). Ląsteles inkubavo 8 vai. 37°C temperatūroje. Terpė su kultūra buvo centrifuguota siekiant pašalinti ląstelių nuolaužas ir užšaldyta -20°C.
[0437] Žymėtos kondicinės terpės COS/ pDSRa2 hSCFK1"248 ir vektorinės kontrolės COS/pDSRa2 alikvotos imunoišsodintos kartu su ląstelių 35S-žymėtos CHO/ pDSRa2 hSCFK1"164 terpės 17 klono pavyzdžiais (žr. 5 pvz.) pagal Jardeno ir kt., (EMBO, 6, 3341-3351, 1987) metodo protokolus. Vienas ml kiekvieno kondicinės terpės pvz. veiktas 10 jai preimuniniu triušio serumu (## 1379 P.I.). Pavyzdžius inkubavo 5 vai. prie 4°C. Į kiekvieną mėgintuvėlį pridėjo po 100 įiI 10% Staphylococcus aureus suspensijos (Pansorbin, Calbiochem) į 0.15 M NaCI, 20 mM Tris pH 7.5, 0.2% tritono X-100. Pavyzdžius inkubavo dar 1 vai. 4°C temp. Imuninius kompleksus nucentrifugavo 13.000xg 50 min. Supernatantus supylė j naujus mėgintuvėlius ir inkubavo su 5 į.iI triušio poliklonalinio serumo (## 1381 TB4), išvalyto kaip parodyta 11 pvz., atitinkamai gauto iš CHOhSCF1"162 per naktį 5°C. Valandos bėgyje pridėjo 100 nl pansorbino ir imuninius kompleksus nusodino pagal ankstesnį aprašymą.
[0438] Po centrifugavimo likusias nuosėdas praplovė lizavimo buferiu (0.5% Na-dezoksicholato, 50 mM NaCI, 25 mM Tris pH 8), tris kartus vandeniniu buferiu (0.5 M NaCI, 20 mM Tris pH 7.5, 0.2% Tritono X-100) ir vieną kartą 20 mM Tris pH 7.5. Nuosėdas pakartotinai suspendavo 50 f_il 10mM Tris pH 7.5, 0.1 % SDS, 0.1 M (3-merkaptoetanoliu. SCF baltymą eliuavo verdant 5 min. Pavyzdius centrifugavo 13000xg 5 min. ir išskyrė supernatantą.
[0439] Glikozidazėmis veikė tokiu budu: 3 į.iI 75 mM CHAP turinčio 0.6 mU O-glikanazės ir 0.02 U neuraminidazės pridėjo j 25 ^il inkubuotus 3 vai. prie 37°C, imuninius pavyzdžio kompleksus. Pridėjo tokį patį tūrį 2x PACE buferio ir pavyzdžius virino 3 min. Virti ir nevirti pavyzdžiai užnešti į elektoforezę ant 15 % SDS-poliakrilamidinio redukuojančio gelio per naktį prie 8 mA srovės. Gelį fiksavo metanolio-acto rūgšties sistemoje, su sustiprintoju Enlightening (NeN) 30min., džiovino ir eksponavo ant Kodak XAR-5 plėvelės -70°C.
[0440] Fig.43 parodyta gautų rezultatų autoradiograma. 1 ir 2 pozicijose yra kontrolinių COS/pDSRa2 kultūrų pavyzdžiai, 3 ir 4-pavyzdžiai COS/pDSRa2 hSCFK1~248, pozicijos 5 ir 6-COS/pDSRa2 hSCFK1"164. 1, 3 ir 5 pozicijos yra nesuardytos imuninės nuosėdos; 2, 4 ir 6 buvo suardyti dalyvaujant glikanazėms, kaip aprašyta aukščiau. Kairėje parodyta
[0441] markerių molekulinės masės. Apdorojimas SCF COS transfekuotų pDSRa2 hSCFK1"248 aiškiai parodo, kad yra analogiškas hSCFK1"164, sekretuoto iš CHO ir transfekuoto pDSRa2 hSCFK1"164, apdorojimui (pvz. 11). Gautas rezultatas patvirtina tą faktą, kad prigimtinis proteolitinio veikimo išskiriantis iš ląstelių SCF saitas yra arti 164 aminorūgšties. 17 pavyzdys Žmogaus SCF ketvirtinės struktūros analizė
[0442] Kalibruojant gel-filtracinę koloną (ACA 54) aprašytą 1 pvz., valant SCF iš BRI ląstelių kultūrinio skysčio, molekulinės masės standartų pagalba ir eliuuojant išvalytą SCF iš kitų gel-filtracinių kalibracinių kolonų žinoma, kad išvalytas SCF iš BRI ląstelių terpės yra medžiaga, kurios molekulinė masė apie 70000-90000 lyginant su molekulinės masės standartais. Skirtingai nuo šito, mol. masė pagal SDS-PAGE yra apie 28000-35000.
[0443] Nors žinoma, kad glikozilinti baltymai gali elgtis anomaliai tokiose analizėse, gauti rezultatai patvirtina tą faktą, kad žiurkės SCF, esantis BRI darinys, gali egzistuoti kaip nekovalentiškai surištas dimeras nedenatūruojančiomis sąlygomis. Analogiški rezultatai yra ir su rekombinantiniėmis SCF formomis (pvz., žiurkės ir žmogaus SCF1"164, kurie yra E. coli dariniai, o žiurkės ir žmogaus SCF1162 yra CHO ląstelių dariniai), todėl, kad molekulinis dydis nustatytas gel-filtracijos metodu nedenatūruojančiomis sąlygomis du kartus yra didesnis po gel-filtracijos denatūruojančiomis sąlygomis (pvz., esant SDS ar SDS-PAGE metodu) kiekvienu konkrečiu atveju.
[0444] Be to, analizė pagal nusėdimo greitį, kas atitinka molekulinę masę, duoda molekulinės masės dydžius apie 36000 rekombinantinio žmogaus SCF1-164 iš E. coli .
[0445] Šis dydis taip pat beveik du kartus didesnis, negu buvo gauta SDS-PAGE metodu (apie 18000-19000). Todėl, nors yra žinoma, kad gali būti daug oligomerinių darinių
[0446] Pilną RNR išskyrė iš žmogaus šlapimo pūslės karcinomos ląstelių (ATCC HTB-9) naudojant ekstrakcijos metodus su rūgštaus tiocianato guanidino-fenolio-chloroformo sistema (Chomčinski ir kt., Anal.Bioch., 162, 156, 1987) ir poli(A) RNR išskyrė naudodami oligo(dT) nugaros kolonas, teikiamas Klontex firmos. Dviejų siūlų kDNR
[0447] gavo iš 2 ^ig poli(A) RNR naudojant B I rinkinį kDNR sintezei tiekėjo rekomenduojamomis sąlygomis. Apie 80 ng frakcionuotos kolonoje dviejų siūlų kDNR ,
[0448] Focus, 12, 47-50, 1990) ir transformavo į ląsteles DN5a elektroporacija (Dover ir kt., NucI.Acids, Res, 16, 6127-6145, 1988).
[0449] 5000 individualių klonų. Plazmidinę DNR gavo iš kiekvienos partijos CTAB-DNR nusodinimo metodu (Del Sal ir kt., Biotechniųues, 7, 514-519, 1989). Du ng iš kiekvienos partijos plazmidinės DNR ardė fermentu Notl ir skyrė gel-elektroforeze. Linijinę DNR pernešė ant Henskrin Plius membranos (Liupon) ir hibridizavo su kDNR 32-P-žymėtu žmogaus pilno ilgio SCF, išskirtu iš HT1080 linijos (16 pvz.) naudojant anksčiau aprašytas sąlygas (Leen ir kt., Proc.Natl.Acad.Sci, USA, 82, 7580-7584, 1985).
[0450] Hibridizacijoje identifikavo 7 partijas, turinčias teigiamą signalą. Partijų koloniijas pakartotinai išskirstė pagal kDNR 32-P-žymėto žmogaus SCF PCR (3 pvz.), pagal kolonijų hibridizacijos metodiką (Leen ir kt., Gene, 44, 201-209, 1986) tol, kol iš keturių partijų liko tik viena. Keturių išskirtų klonų dydis buvo apie 5.3 kD. Ardymas ribojančiu fermentu ir 5'-galo klonų nukleotidinių sekų analizė įgalino identifikuoti keturis klonus. Tokios žmogaus kDNR seka parodyta Fig.44. Fig.44 kDNR koduoja polipeptidas, kurio 149-177 aminorūgščių seka, pavaizduota Fig.42, pakeistos viena Gly liekana.
[0451] Buvo tiriamas SCF padedantis išgyventi pelėms po letalinio apšvitinimo. Kaip tiriamuosius oblektus naudojo BAIb/c pelių pateles 10-12 savaičių amžiaus. Grupės buvo po 5 peles ir kiekvienam eksperimentui pelės buvo parenkamos pagal svorį. Peles švitino vienkartinėmis dozėmis 850 ir 950 rad. Pelėms įvedė tik faktorius arba faktorius su normaliomis kaulų čiulpų ląstelėmis BAIb pelių. Pirmu atveju, per 24 vai po apšvitinimo pelėms į veną buvo suleista žiurkės PEG SCF (20 pg/kg), išskirto iš E. coli, ir modifikuoto, pridedant polietilenglikolio pagal 12 pvz. metodiką, o kontroliniams gyvūnams - fiziologinį tirpalą. Praėjus 4 vai. po apšvitinimo, pelėms į veną suleido skirtingas dozes normalių BAib pelių kaulų čiulpų ląstelių. Žiurkės PEG-SCF1"164 apdorojimą vykdė pridėdami 200 ng/kg žiurkės PEG-SCF1"164 į ląstelių suspensiją likus 1 vai. iki injekcijos ir vykdant vienkartinę faktoriaus kartu su ląstelėmis, injekciją.
[0452] Po apšvitinimo 850 rad. doze pelėms įvedė žiurkės PEG-SCF1"164 arba fiziologinį tirpalą. Gauti rezultatai pateikti Fig.45. Žiurkės PEC-SCF1"164 įvedimas žymiai prailgino pelių išgyvenimo trukmę po apšvitinimo, lyginant su kontroline grupe (P<0.001). Pelės, injekuotos fiziologiniu tirpalu išgyveno vidutiniškai 7.7 dienos, kai pelės su PEC-SCF1"
[0453] Rezultatai, pateikti Fig.45, yra sumuoti duomenys skirtingų eksperimentų, naudojant kiekvienoje bandymo grupėje po 30 pelių.
[0454] Pelių, apdorotų PEG-SCF1"164 išgyvenimas rodo SCF įtaką apšvitintų gyvūnų kaulų čiulpų ląstelėms. Išankstiniai tokių gyvūnų hematologinių parametrų tyrimai rodo tam tikrus trombocitų lygio padidėjimus po 5 dienų po apšvitinimo, lyginant su kontroliniais gyvūnais. Tačiau po 7 dienų po apšvitinimo trombocitų lygis tik nežymiai skiriasi nuo kontrolinės grupės. Nebuvo užfiksuoti skirtumai RBC ir SBC lygio kaulų čiulpų ląstelių struktūroje.
[0455] Normalių BAIb/c pelių klubų kaulų čiulpų ląstelių 10 % dozės transplantuotos 850 rad apšvitintoms pelėms, gali išgelbėti 90 % ir daugiau gyvūnų (duomenys nepateikti). Todėl 850 rad dozė buvo naudojama dozuojant transplantantą į 5 % klubo kaulo,
[0456] siekiant nustatyti žiurkės PEG-SCF1"164 įtaką išgyvenimui. Esant tokiai dozei, buvo laukiama, kad didelis procentas pelių, negavusių SCF negali išgyventi; jeigu žiurkės PEG-SCF1"164 gali stimuliuoti transplantuotas ląsteles, tai gali būti didesnė išgyvenimo galimybė. Kaip parodyta Fig.46, apie 30 % kontrolinių pelių išgyvena 8 dienas po apšvitinimo. Apdorojimas žiurkės PEC-SCF1"164 žymiai sustiprina išgyvenimą, nors 95 %
[0457] tokių pelių išgyvena kraštutiniu atveju, net 30 dienų (Fig.46). Fig.46 pateikti rezultatai yra 4 atskirų eksperimentų, kuriuose naudojo po 20 pelių kontrolinėje ir tiek pat apdorotose PEG-SCF1"164 grupėse, vidurkiai. Esant daug didesnėms apšvitinimo dozėms, veikimas žiurkės PEG-SCF1"164 kartu su kaulų transplantantu taip pat žymiai padidina išgyvavimą (Fig.47). Kontrolinės pelės apšvitintos 950 rad doze ir transplantuotos 10% klubų kaulo, žuvo 8 dieną, kai maždaug 40% pelių paveiktų
[0458] klubų kaulų išgyveno per 20 dienų, kai 80% gyvūnų, paveiktų SCF, išgyveno šį laiką
[0459] Monokloniniu antikūnų prieš SCF produkavimas
[0460] BAIb pelių patelėms, 8 savaičių amžiaus (C.River, VVilmington. MA) buvo daromos poodinės injekcijos 20 |.ig žmogaus SCF1"164 ekspresuoto E. coli, Freundo pilname stimuliatoriuje (H37-Pa; Difco lab., Detroit, Ml). Pakartotinai imunizavo 50 j_ig šio antigeno Freundo stimuliatoriuje 14, 38 ir 57 dienas. Praėjus trims dienoms po paskutinės injekcijos, 2 peles papjovė ir paėmė jų blužnis su mielomine linija SP 2/0 pagal metodiką, aprašytą Novinskio ir kt., (Virusologija, 93, 111-116, 1979).
[0461] Ląstelių kultūrai SP 2/0 ir hibridomai naudojama terpė buvo modifikuota Dulbeko terpė Igla (DMEM) (Gibco, Ohaio) papildyta 20% termodezaktyvuotu veršiuko serumu (Fibro, Chem., N Y), 110 mg/ml natrio piruvato, 100 vnt/ml streptomicino (Gibco). Po ląstelių sujungimo hibridus selekcino HAT terpėje, kurioje buvo 10~4 M hipoksantino, 4x107 M aminopterino ir 1.6x10"5 M timidino dvi savaites, po to dvi savaites kultivavo terpėje turinčioje hipoksantiną ir timidiną.
[0462] Hibridomas rūšiavo tokiu būdu: polistirolinius rezervuarus (Costar, MA) sensibilizavo 0.25 f-ig žmogaus SCF1"164 { E. coli) 50 j.il 50 mM bikarbonatinio buferio, pH 9.2 dvi valandas kambario temperatūroje, po to per naktį 4°C. Po to plokšteles blokavo 5% BSA/PBS 30 min. kambario temperatūroje, po to inkubavo hibridominės kultūros nuosėdų sluosniu 1 vai. 37°C temperatūroje.
[0463] Tirpalą dekantavo ir surištus antikūnus inkubavo skiedžiant 1:500 ožio anti-pelės IgG konjugatu su peroksidaze (Boeringer Manhaim Biochemicals, I N) 1 vai. 37°C. Plokšteles plovė plovimo buferiu (KPI, Haitsburg, MD), po to ryškino H2O2 ir ABT mišiniu (KPI).Matavo kolorimetriškai ties 405 nm.
[0464] Ląstelių hibridominės kultūros sekretuojančios specifinius SCF1"164 ( E. coli) antikūnus analizavo ELISA. Hibridomas subklonavo ribojančio praskiedimo metodu. 55 rezervuarai tiriamų hibridų pasižymėjo aktyvumu žmogaus SCF1184 { E. coli)] 9 iš jų pasižymėjo aktyvumu žmogaus SCF1"162 (CHO) atžvilgiu.
[0465]
[0466] Nors šis išradimas buvo aprašomas remiantis priešlaikiniu įgyvendinimu, reikia turėti omenyje, kad šios srities specialistas gali turėti reikalų su pakeitimais ir modifikacijomis. Todėl laikoma, kad pateikta išradimo formulė apima ekvivalentinius variantus, kuriuos apima šio išradimo sfera.
1. Negamtinės kilmės polipeptidas, turintis aminorūgščių seką, iš esmės dubliuojančią seką, randamą gamtoje kamieninių ląstelių faktoriuje, kurios dėka įgyja gamtinio kamieninių ląstelių faktoriaus hemopoetinj biologinį aktyvumą.
2. Išvalytas polipeptidas, esantis randamu gamtoje kamieninių ląstelių faktoriumi.
3. Polipeptidas pagal 1 ir 2 punktus, besiskiriantis tuo, kad yra prokariotinės ar eukariotinės egzogeninės DNR sekos ekspresijos produktas.
4. Polipeptidas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad yra CHO ląstelių ekspresijos produktas.
5. Polipeptidas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad egzogeninės DNR seka yra kDNR seka.
6. Polipeptidas pagal 1 ir 2 punktus, besiskiriantis tuo, kad nurodytas kamieninių ląstelių faktorius yra žmogaus kamieninių ląstelių faktorius.
7. Polipeptidas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad egzogeninės DNR seka yra genominės DNR seka.
8. Polipeptidas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad egzogeninės DNR seką perneša ant autonomiškai replikuojančios plazmidinės DNR arba virusinio vektoriaus.
9. Polipeptidas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis pilnai ar dalinai turi žmogaus kamieninių ląstelių faktoriaus aminorūgščių seką, parodytą Fig.15B, 15C, 42 ir 44,o Fig.15B, 15C, 42 ir 44 yra šios apibrėžties dalis, arba bet kokį gamtoje randamą jos alelinį variantą.
10. Polipeptidas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad in vivo pasižymi gamtoje randamo kamieninių ląstelių faktoriaus biologiniu aktyvumu.
11. Polipeptidas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad in vitro pasižymi gamtoje randamo kamieninių ląstelių faktoriaus biologiniu aktyvumu.
12. Polipeptidas pagal 1 ir 2, punktus papildomai besiskiriantis tuo, kad yra kovalentiškai sujungtas su detekcine medžiaga-žyme.
13. Izoliuota DNR seka, naudojama polipeptidinio produkto, turinčio aminorūgščių seką, iš esmės dubliuojančią gamtoje randamo kamieninių ląstelių faktoriaus seką, ir dėl to turinčio gamtoje randamo kamieninių ląstelių faktoriaus kraujodaros biologinį aktyvumą, ekspresijai prokariotinėje ar eukariotinėje ląstelėje, ir kai nurodyta DNR priklauso:a) DNR sekoms, pateiktoms Fig.14B, 14C, 15B, 15C, 42, 44, o Fig. 14B, 14C, 15B, 15C, 42 ir 44 yra šios apibrėžties dalis, arba joms komplementarioms grandinėms;b) DNR sekoms, kurios hibridizuojasi su DNR sekomis, nurodytomis a) ar jų fragmentams; irc) DNR sekoms, turint omenyje genetinio fondo išsigimimą, hibridizuojamoms su DNR sekomis, nurodytomis a) ir b).
a) DNR sekoms, pateiktoms Fig.14B, 14C, 15B, 15C, 42, 44, o Fig. 14B, 14C, 15B, 15C, 42 ir 44 yra šios apibrėžties dalis, arba joms komplementarioms grandinėms;b) DNR sekoms, kurios hibridizuojasi su DNR sekomis, nurodytomis a) ar jų fragmentams; irc) DNR sekoms, turint omenyje genetinio fondo išsigimimą, hibridizuojamoms su DNR sekomis, nurodytomis a) ir b).14. Prokariotinė ar eukarotinė ląstelė-šeimininkė, besiskirianti tuo, kad yra transformuota ar transfekuota DNR seka, nurodyta 13 punkte, tokiu būdu, kad ląstelė-šeimininkė ekspresuoja nurodytą polipeptidinj produktą.
15. DNR sekos, nurodytos 13 punkte, ekspresijos prokariotinėse ar eukariotinėse ląstelėse, polipeptidinis produktas.
16. Izoliuota DNR seka, koduojanti ekspresuojamą prokariotinėje ar eukariotinėje ląstelėje polipeptidą, turintį aminorūgščių seką iš esmės dubliuojančią gamtoje randamo kamieninių ląstelių faktoriaus seką, kas jgalina jį turėti gamtoje randamo kamieninių ląstelių faktoriaus kraujodaros biologinį aktyvumą.
17. Seka pagal 16 punktą, besiskirianti tuo, kad ji yra kDNR-seka.
18. Seka pagal 16 punktą, besiskirianti tuo, kad ji yra genominė DNR-seka.
19. Seka pagal 16 punktą, besiskirianti tuo, kad ji koduoja žmogaus kamieninių ląstelių faktorių.
20. DNR seka pagal 19 punktą, besiskirianti tuo, kad ji turi vieną ar daugiau kodonų, pageidaujamų ekspresijai E. coli ląstelėse.
21. DNR seka pagal 16 punktą, besiskirianti tuo, kad ji atitinka sekas, parodytas Fig. 15B, 15C, 42 ir 44, o Fig. 15B, 15C, 42 ir 44 yra šios apibrėžties dalis.
22. DNR seka pagal 16 punktą, besiskirianti tuo, kad ji turi vieną ar daugiau kodonų, pageidaujamų ekspresijai mielių ląstelėse.
23. DNR seka pagal 16 punktą, besiskirianti tuo, kad ji kovalentiškai sujungta su detekcine medžiaga-žyme.
24. DNR seka, koduojanti gamtoje randamo kamieninių ląstelių faktoriaus polipeptidinj fragmentą ar polipeptidinj analogą.
25. DNR seka pagal 24 punktą, besiskirianti tuo, kad ji koduoja kamieninių ląstelių metionilintą faktorių.
26. Biologiškai funkcionali plazmidė ar virusinės DNR vektorius, turintis DNR seką pagal 16 punktą.
27. Prokariotinė ar eukariotinė ląstelė-šeimininkė, besiskirianti tuo kad ji yra stabiliai transformuota ar transfekuota DNR-vektoriumi pagal 16 punktą.
28. DNR sekos pagal 16 punktą ekspresijos prokariotinėse ar eukariotinėse ląstelėse polipeptidinis produktas.
29. Polipeptidas, turintis dalinę ar pilną aminorūgščių seką, parodytą Fig. 15C, 42 ar 44, o Fig.150, 42 ir 44 yra šios apibrėžties dalis,ir pasižymintis in vitro vienu ar daugiau gamtoje randamo kamieninių ląstelių faktoriaus biologiniu aktyvumu.
30. Polipeptidas, turintis dalinę ar pilną antrinę gamtoje randamo kamieninių ląstelių faktoriaus konformaciją ir turintis dalinę ar pilną aminorūgščių seką, parodytą Fig.15C, 42 ar 44, o Fig. 15C, 42 ir 44 yra šios apibrėžties dalis, ir pasižymintis gamtoje randamo žmogaus kamieninių ląstelių faktoriaus biologinėmis savybėmis.
31. Kamieninių ląstelių faktoriaus gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad:tinkamose mitybinėse terpėse augina prokariotines ar eukariotines ląsteles-šeimininkes,transformuoja ar transfekuoja DNR pagal 13 punktą, irišskiria pageidaujamus nurodyto vektoriaus DNR-sekos ekspresijos polipeptidinius produktus.
tinkamose mitybinėse terpėse augina prokariotines ar eukariotines ląsteles-šeimininkes,transformuoja ar transfekuoja DNR pagal 13 punktą, irišskiria pageidaujamus nurodyto vektoriaus DNR-sekos ekspresijos polipeptidinius produktus.32. Kompozicijos, besiskiriančios tuo, kad turi išskirtą ir išvalytą žmogaus kamieninių ląstelių faktorių, nesujungtą su kokiu nors žmogaus baltymu glikozilintoje ar neglikozilintoje formoje.
33. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad ji turi efektyvų polipeptido pagal 1 punktą kiekj ir farmakologiškai priimtiną tirpiklj, adjuvantąar nešiklį.
34. Polipeptidas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra skirtas kaulų čiulpų prigijimo laipsnio transplantacijos metu padidinimui, bei kaulų čiulpų atsistatymo, gydant kaulų čiulpų aplaziją ar mielosupresiją, atsiradusią dėl radiacijos, cheminių reagentų poveikio ar chemoterapijos, laipsnio padidinimui,
35. DNR seka, koduojanti žmogaus kamieninių ląstelių faktoriaus analogą, išrinktą iš grupės, kuriai priklauso:a) (Met-1)kamieninių ląstelių faktorius; irb) kamieninių ląstelių faktorius, kuriame vienas ar daugiau cisteinų pakeisti alaninu ar serinu.
a) (Met-1)kamieninių ląstelių faktorius; irb) kamieninių ląstelių faktorius, kuriame vienas ar daugiau cisteinų pakeisti alaninu ar serinu.36. DNR sekos pagal 35 punktą polipeptidinis produktas, ekspresuotas prokariotinėse ar eukariotinėse ląstelėse-šeimininkėse.
37. Farmcinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad turi rekombinantinį kamieninių ląstelių faktorių, turintį žmogaus faktoriaus aminorūgščių seką ir farmakologiškai priimtiną tirpiklį, adjuvantą ar nešiklį.
38. Antikūnai, besiskiriantys tuo, kad jie specifiškai suriša kamieninių ląstelių faktorių.
39. Antikūnai pagal 38 punktą, besiskiriantys tuo, jie yra monokloniniai antikūnai.
40. Kamieninių ląstelių faktoriaus iš SCF-turinčios medžiagos efektyvaus išskyrimo būdas, besiskiriantis tuo, kad vykdo tokios medžiagos jonų-mainų chromatografinio skyrimo stadiją.
41. Būdas pagal 40 punktą, besiskiriantis tuo, kad nurodytas jonų-mainų chromatografinis skyrimas yra anijonų-mainų chromatografinis skyrimas.
42. Būdas pagal 40 punktą, besiskiriantis tuo, kad papildomai atlieka atvirkščios fazės skysčių chromatografijos skyrimo stadiją.
43. Polipeptidas, turintis gamtinės kilmės kamieninių ląstelių kraujodaros faktoriaus biologinį aktyvumą ir turintis aminorūgščių seką, pateiktą Fig.15C, 42 ar 44, o Fig.15C, 42 ir 43 yra šios apibrėžties dalis, arba jo bet koks alelinis variantas, darinys, delecinis analogas arba adityvinis analogas, besiskiriantis tuo, kad jis yra egzogeninės DNR ekspresijos prokariotinėse ar eukariotinėse ląstelėse, produktas.
44. Polipeptidas pagal 43 punktą, besiskiriantis tuo, kad jį parenka iš grupės, kuriai priklauso:SCF1"148, SCF1162, SCF1"164, SCF1"165, (pateikti Fig.15C); SCF1'185, SCF1188, SCF1'189, ir SCF1 248, (pateikti Fig.42); SCF1'157, SCF1"160, SCF1"161, ir SCF1220 (pateikti Fig.44), o Fig.15C, 42 ir 44 yra šios apibrėžties dalis.
SCF1"148, SCF1162, SCF1"164, SCF1"165, (pateikti Fig.15C); SCF1'185, SCF1188, SCF1'189, ir SCF1 248, (pateikti Fig.42); SCF1'157, SCF1"160, SCF1"161, ir SCF1220 (pateikti Fig.44), o Fig.15C, 42 ir 44 yra šios apibrėžties dalis.45. Biologiškai aktyvi kompozicija, besiskirianti tuo, kad turi polipeptidą pagal 44 punktą, kovalentiškai sujungtą su vandenyje tirpstančiu polimeru.
46. Kompozicija pagal 45 punktą, besiskirianti tuo, kad nurodytą polimerą išrenka iš grupės, kuriai priklauso polietilenglikolis arba polietilenglikolio ir polipropilenglikolio kopolimeras, o nurodytas polimeras pakeistas ar nepakeistas iš vieno alkilo grupės galo.
47. Kompozicija pagal 45 punktą, besiskirianti tuo, kad polipeptidas yra (Met"1)SCF1" 164
48. Kompozicija pagal 45 punktą, besiskirianti tuo, kad nurodytas polimeras turi vidutinę molekulinę masę 1000-100000 D.
49. Kompozicija pagal 45 punktą, besiskirianti tuo, kad nurodytas polimeras turi vidutinę molekulinę masę 4000-40000 D.
50. Kompozicija pagal 45 punktą, besiskirianti tuo, kad nurodytas polimeras yra nepakeistas polietilenglikolis ar monometoksipolietilenglikolis.
51. Kompozicija pagal 45 punktą, besiskirianti tuo, kad nurodytą polimerą prijungia prie nurodyto peptido reakcija, kurios metu naudojamas aktyvus karboksi- rūgšties esteris ar nurodyto polimero karboksi-darinys.
52. Kompozicija pagal 45 punktą, besiskirianti tuo, kad nurodyto baltymo viena ar daugiau aminogrupių surištos su nurodytu polimeru reakcijoje su N-hidroksisukcinimidu, p-nitrofenoliu ar 1-hidroksi-2-nitro-benzen-4-sulfonatiniu polimero eteriu.
53. Kompozicija pagal 45 punktą, besiskirianti tuo, kad viena ar daugiau laisvų cisteino sulfhidrilinių grupių konjuguotos su nurodytu polimeru reakcijos su maleinimidu ar halogenacetilintu polimero dariniu pagalba.
54. Kompozicija pagal 45 punktą, besiskirianti tuo, kad polipetidas yra glikozilintas produktas, o polimerą prijungia jo aminohidrazino ar hidrazido darinio reakcijos su viena ar keliomis aldehidinėmis grupėmis, gautomis angliavandenių fragmentų oksidinimo metu, pagalba.
55. Biologiškai aktyvaus polimero-polipeptido adukto gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad polipeptido pagal 45 punktą, reakciją atlieka su vandenyje tirpstančiu polimeru sąlygose, leidžiančiose kovalentiškai prijungti polimerą prie nurodyto polipeptido ir išskirti tokiu būdu gauto aduktą.
56. Ankstyvųjų kraujodaros pirmtakų transfekcijos genu būdas, besiskiriantis tuo, kad vykdo:1) kraujodaros pirmtako ankstyvųjų ląstelių kultivavimą, esant SCF; ir2) kultivuojamų ląstelių transfekciją 1) stadijoje genu.
1) kraujodaros pirmtako ankstyvųjų ląstelių kultivavimą, esant SCF; ir2) kultivuojamų ląstelių transfekciją 1) stadijoje genu.57. Geno perkėlimo būdas žinduoliui, besiskiriantis tuo, kad vykdo stadijas:1) kraujodaros pirmtako ankstyvųjų ląstelių kultivavimą, esant SCF;2) kultivuojamų ląstelių transfekciją 1) stadijoje genu; ir3) žinduoliams naudoja transfekuotas ląsteles.
1) kraujodaros pirmtako ankstyvųjų ląstelių kultivavimą, esant SCF;2) kultivuojamų ląstelių transfekciją 1) stadijoje genu; ir3) žinduoliams naudoja transfekuotas ląsteles.58. Polipeptidas pagal 43 punktą, besiskiriantis tuo, kad jį parenka iš grupės, kuriai priklauso:(Met"1) SCF1"148, (Mef1) SCF1"162, (Met1) SCF1"164, (Met1) SCF1"165, (Mef1) SCF1"183, (15C pieš.); (Mef1) SCF1"185, (Met"1) SCF1"188, (Met1) SCF"1"189, (Met1) SCF1"248, (42 pieš.); (Mef1) SCF1157, (Met1) SCF1"160, (Mef1) SCF1"161 ir (Met"1) SCF1"220.
(Met"1) SCF1"148, (Mef1) SCF1"162, (Met1) SCF1"164, (Met1) SCF1"165, (Mef1) SCF1"183, (15C pieš.); (Mef1) SCF1"185, (Met"1) SCF1"188, (Met1) SCF"1"189, (Met1) SCF1"248, (42 pieš.); (Mef1) SCF1157, (Met1) SCF1"160, (Mef1) SCF1"161 ir (Met"1) SCF1"220.