[LT] Pasiūlytas kiaulės augimo harmono gavimo būdas, apimantis kDNR, koduojančios kiaulės augimo hormoną, gavimą, kDNR įterpimą į bakterinę plazmidę, Escherichia coli kamienų transformaciją gauta rekombinatine plazmide, klonų, kuriuose yra rekombinatinės plazmidės, atranką ir kDNR iš šių plazmidžių įterpimą į ekspersijos vektorių po to sekančia Escherichia coli kamienų transformaciją gauta rekombinatine plazmide, transformuotų kamienų atranką, kultivuojant terpėje, galutinio produkto išskyrimą ir gryninimą.
[EN]
[0001] Šis išradimas - tai kiaulės augimo hormono gavimo būdas, apimantis kDNR, koduojančios kiaulės augįmo hor-moną, gavimą, kDNR įterpimą į bakterinę plazmidę, Escherichia coli kamienų transformacija gauta rekombinantine plazmide, klonų, kuriuose yra rekombinantinės plazmidės, atranką ir kDNR iš šių plazmidžių įterpimą i, ekspresijos vektorių po to sekančia Escherichia coli kamienų transformacija gauta rekombinantine, plazmide, transformuotų kamienų atranką, kultivavimą tikslinio produkto išskyrimą ir gryninimą.
[0002] Genų ekspresija eukariotuose ir prokariotuose, nors ir naudojamos vienos ir tos pačios pagrindinės genų transkripcijos i, informacinę RNR (iRNR) stadijos ir po to sekančios šios iRNR transliavimas į baltymus, naudoja šiose stadijose įvairius viduląstelinius regu-liatorių derinius.
[0003] Be to, eukariotuose dauguma tikslinių baltymų iš pra-džių transliuojami kaip probaltymai, tai yra, kaip polipeptidai, kuriuose be tikslinio baltymo sekos yra lyderinė arba signalinė seka. Eukariotinė iRNR koduoja pilną probaltymą, kuris po transliacijos pakeičiamas taip, kad pašalinama lyderinė seka ir gaunamas tikslinis baltymas. Eukariotų ląstelėse yra procesingo sistema, kurios pagalba probaltymai paverčiami i, tikslinius baltymus, prokariotų ląstelės nesugeba atpažinti eukariotiniuose baltymuose esančių procesingo signalų. Tokiu būdu, jei pilna komplementarios eukariotų DNR (kDNR) transkriptai, iRNR, kuri naudojama kaip DNR seka ekspresijai prokariotuose, tai gaunamas probaltymas, o ne tikslinis baltymas, po to laboratorinėmis sąlygomis galima gauti tikslinius baltymus, bet toks būdas labai imlus.
[0004] Tuo atveju, kai tikslinio baltymo ekspresijai prokariotuose naudojama DNR seka, koduojanti pilną baltymą, šioje sekoje nėra eukariotų transliacijos ir potrans-liacinių signalų, kurie bendru atveju yra pagrindinės DNR sekos viduje. Todėl tam, kad ekspresuoti klonuotus eukariotų genus arba kitas heterologines DNR sekas prokariotuose, kaip buvo nustatyta, pageidautina naudoti prokariotinius kontrolės signalus, nes jie yra efektyvesni, o eukariotiniai signalai neatpažįstami prokariotinių recipientų.
[0005] Terminas "heterologinė DNR", naudojamas šiame išradime, reiškia tokią DNR, kurios bent dalies nėra recipiento ląstelės genome. Heterologines DNR pavyzdžiai yra vi-rusiniai ir eukariotiniai genai, genų fragmentai, ale-linės ir sintetinės DNR sekos. Terminas "heterologinis baltymas" arba "heterologinis polipeptidas" šiame iš-radime reiškia baltymą arba polipeptidą, kurių bent dalis nėra koduojama recipiento genome.
[0006] Prokariotiniai valdymo signalai yra promotorius, kurio pagalba nurodomas transkripcijos iniciavimas, transliacijos valdymo signalai, kuriuose yra ribosomos suri-šimo sritis, transliacijos pradžios ir pabaigos signalai. Visi šie signalai, išskyrus transliacijos pabaigos signalą, turi būti prieš eukariotini, geną arba kitą DNR, kuriuos norima ekspresuoti.
[0007] Žinomi keli heterologines DNR (pavyzdžiui, eukariotinių genų) ekspresijos prokariotuose būdai. Pagal vieną iš jų, DNR segmentas, koduojantis norimą baltymą, liguo-jamas su DNR, koduojančia visą bakterini, baltymą arba jo dali,, su bakteriniu promotoriumi. Endogeninėje pro-kariotinėje DNR būtinai turi būti ribosomos surišimo sritis ir transliacijos pradžios signalas. Tokios li-guotos DNR ekspresijos produktas yra sulietas baltymas, kuriame yra eukariotinis polipeptidas sujungtas arba sulietas su visu arba dalimi bakterinio baltymo. Eukariotini, baltymą galima gauti selektyviu fermentiniu
[0008] arba cheminiu skaldymu eukariotinio ir endogeninio baltymo suliejimo srityje arba selektyviai suskaldant pro-kariotines sekas.
[0009] Darbų, kuriuose aprašyta eukariotinių baltymų ekspresija bakterijose, pavyzdžiai yra paraiška Europos patentui Nr. 47 600 (publikuota 1982 m. kovo 17 d.), joje aprašomas sulietų baltymų ir "vientisų" baltymų, kuriuose yra jaučio augimo prohormonas arba jaučio augimo hormonas ("jAH") baltymo C gale ir prokariotinio baltymo dalis N baltymo gale gavimas, paraiška Di-džiosios Britanijos patentui Nr. 2073 245A (publikuota 1981 m. spalio 14 d.), joje aprašomas sulieto baltymo jAH ir E. coli p-laktamazės gavimas; E. Kešet ir kt. Nucleic acid Research, 9: 19-30 (1981) aprašomas sulieto baltymo jAH ir E. coli p-laktamazės gavimas; pa-raiškoje Europos patentui Nr. 95361 (publikuota 1988 m. lapkričio 30 d. ) aprašomas sulieto baltymo, kurio N gale yra endogeninis baltymas, amino rūgšties liekana - transkripcijos pradžios signalas - enterokinazės skėli-mo sritis ir egzogeninis baltymas (pavyzdžiui, augimo hormonas) C baltymo gale. Toks būdas nėra tinkamas, nes, išgryninus sulietą baltymą, reikia ji, labora-torinėmis sąlygomis perskelti fermentu, o šio fermento kaina, tai darant pramoniniu būdu, gali būti limi-tuojanti .
[0010] Vis dėlto, sulietų baltymų sistema tapo patrauklia sistema kai kurių eukariotinių genų arba kitų hetero-loginių DNR ekspresijai prokariotų ląstelėse, nes sulietas baltymas nėra veikiamas proteinazių ir heterologinis baltymas lieka nepažeistas. Bakterijų ląs-telės "atpažįsta" kai kuriuos eukariotinius baltymus, produkuojamus ląstelėje kaip "svetimus" ir tokiu būdu stengiasi suskaldyti šiuos baltymus iš karto po jų sintezės arba po tam tikro trumpo intervalo. Sulietuose baltymuose, sudarytuose, norint išvengti tikslinio baltymo proteinolizės, gali būti endogeninės polipeptidų sekos N gale arba C heterologinio baltymo gale. Tokios konstrukcijos pavyzdys aprašomas paraiškoje Europos patentui Nr. 111814 (publikuota 1984 m. birželio 27 d.); aprašomas sulieto baltymo, kuriame yra tam tikra jAH forma, turinti sintetinę baltymo pradžią (N galas), ir E. coli p-galaktozidazę C baltymo gale. Bet visi priva-lumai vėl sumenkėja, nes reikia sulietą baltymą atskel-ti nuo endogeninio baltymo, aukščiau aprašytu būdu.
[0011] Pagal kitą būdą transliacijos pradžios signalas ATG, esant reguliuojamam bakteriniam promotoriui, yra prieš pat DNR seką, koduojančią heterologini, (pavyzdžiui, eukariotinį) baltymą, kurio nei N, nei C gale nėra endogeninio baltymo. Nors tokių baltymų ir nereikia po išskyrimo skaldyti, bet šiuo būdu gauti baltymai turi N gale metioniną (atskirais atvejais - formilmetioniną), nes startinis kodonas ATG yra ir metionino kodonas. Jei tikslinis baltymas prasideda ne metioninu, tai tokiu būdu gauto baltymo N gale bus papildoma amino/rūgšties liekana - metioninas.
[0012] Tokios konstrukcijos pavyzdys yra: Harent ir kt., Cell,
[0013] (1980), t. 20, p. 543-553, kur triušio {5-globino genas, kurio N gale yra valino liekana, ekspresuojamas E. coli ląstelėse, naudojant tik ką aprašytą konstrukciją. Ištyrus, buvo nustatyta, kad triušio 0-globino N gale nėra metionino liekanos, o leucino liekanos yra 3, 14, 28, 31, 32 ... padėtyse. Žymėtam baltyme leucino liekanos buvo nustatytos 4, 15, 29, 32 ir 33 padėtyse, o metionino liekana nustatyta 1 padėtyje. Tai demonst-ruoja, kad šis baltymas yra triušio p-globinas plius metionino liekana N baltymo gale, kuri nėra nuskeliama E. coli ląstelėje, žiūr. ten pat p. 546-547.
[0014] Kitas pavyzdys yra augimo hormono gavimas bakterijose, naudojant aukščiau aprašytą konstrukciją. Šoter ir kt., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, (1984), t. 81, p. 5403-5407, kur aprašoma jAH aukštos ekspresijos bakterijose sistema, kurios pagalba gaunamas N-metioninis jAH, t.y., junginys, kurio amino rūgščių liekanų seka yra tokia pat kaip ir vieno iš gamtoje sutinkamų jAH formų plius metionino liekana N baltymo gale. Metionino liekanos prijungimas įvairių augimo hormono formų N gale, sin-tetinamų bakterijose, buvo nagrinėjamas paraiškoje Europos patentui Nr. 103395 (publikuota 1984 m. kovo 30 d.) ir paraiškoje Europos patentui Nr. 74 444 (publikuota 1983 kovo 30 d.) jAH atveju ir Siburg ir kt., DNA (1983), t. 2, p. 37-45 jAH ir kiaulės augimo hormono (" kAH" ) atvejais.
[0015] Metionino liekanos prijungimas natyvaus baltymo N gale gali būti nepageidautinas dėl kelių priežasčių. Pir-miausia, gali būti (nors šiuo metu tai mažai tikėtina), kad baltymas su papildoma metionino liekana yra anti-genas tame organizme, kur šis baltymas be metionino liekanos baltymo N gale yra endogeninis. Antra, papildoma metionino liekana N baltymo gale gali sumažinti šio baltymo biologini, aktyvumą arba pakeisti jo fi-zikines savybes. Trečia, ši modifikuota baltymo forma gali būti netinkama natyvaus baltymo funkcijos pri-klausomybės nuo jo struktūros tyrimams. Be to, pageidautina medicininiams ir veterinariniams tikslams naudoti biosintetinį baltymą, kuris yra labiausiai artimas gamtiniam.
[0016] Pastaruoju metu didelis dėmesys skiriamas prokariotų, tokių kaip bakterijos, sugebėjimui pašalinti metionino liekaną baltymo N gale sintezės metu ir po jos. Pavyzdžiui, Waller, J. Mol. Biol., (1963), t. 7, p. 483-496 ištyrė E. coli beląstelinio ekstrakto "tirpių" ir ribosominių baltymų amino liekanas N baltymų galuose, paraiškoje Europos patentui Nr. 103 395 (publikuota 1984 m. kovo 21 d.) pateikiamas metionino liekanos eukariotinio baltymo, sintetinamo E. coli, N gale pašalinimo būdas. Metionino liekana pašalinama iš dviejų minimų jAH, susintetintų bakterijose, šiuose abiejuose baltymuose po metionino liekanos N baltymų gale yra serino liekana. Geno konstrukcija, kuri buvo naudojama šiuose tyrimuose, buvo sudaryta iš sintetinės startinės sekos, kuri kodavo 5'-metioninas-serinas-leucinas-31, ir kuri buvo įterpiama prie 5'-galo sekos, koduojančios jAH, iš kurios buvo iš anksto pašalinamos pirmosios 4 arba 9 gamtinio baltymo aminorūgščių liekanos. Tokiu būdu, sintetinamas E. coli ląstelėse baltymas, nebuvo natyvus. Paraiškoje Didžiosios Britanijos patentui Nr. 2073245A (publikuota 1981 m. spalio 14 d.) nurodoma, kad jei Met ir Pro, tiksliniame jAH baltyme yra pakeisti Ala, tai "Met nuskeliamas bakterijose, ir gaunamas modifikuotas jAH, prasidedantis aminorūgščių liekanų seka Pro-Phe-Ala-Pro".
[0017] Tokiu būdu, reikalingas ekonomiškas ir aprašomas hete-rologinių (pavyzdžiui, eukariotų) baltymų, kuriuose ne-būtų pirmos aminorūgšties liekanos - metionino - to-kiuose mikroorganizmuose, kaip bakterijos, gavimo bū-das. Ypatingai pageidaujamas toks būdas, kurio pagalba tokie baltymai gaunami bakterijose, kurias naudojant nereikėtų papildomo baltymo apdorojimo po fermentacijos ir gaunamas baltymas neturėtų papildomos metionino liekanos baltymo N gale.
[0018] Augimo hormonai (taip pat vadinami somatotropinais) yra polipeptidai, produkuojami ir sekretuojami hipofizio ląstelėse, jie pasižymi rūšiniu specifiškumu. Be ske-leto augimo padidinimo, augimo hormonai įtakoja daugumą metabolizmo procesų: stimuliuoja pieno išsiskyrimą, padidina insulino ir gliukagono išsiskyrimą; jų pagalba pasireiškia lipidų mobilizacijos efektas. Naudojant jAH stambiems raguočiams, pavyzdžiui, padidėdavo primelžto pieno kiekis, efektyviau buvo naudojami pašarai ir/arba padidėdavo prieaugis, trumpėdavo penėjimo laikas ir padidėdavo liesos mėsos kiekis palyginus su riebalais. Bet iki šiol pilnai neaišku, kokiu būdu šis hormonas iššaukia šiuos efektus.
[0019] Platūs tyrimai, atlikti su žmogaus augimo hormonu (žAH), parodė, kad hipofizyje yra sekretuojamas ne vienas augimo baltymas, o polipeptidų mišinys. Frakcio-nuojant šias įvairias žAH formas, buvo gautos žAH frakcijos, kurios nepasižymėjo diabetogeniniu aktyvumu ir frakcijos, kurios nepasižymėjo lipolitiniu aktyvumu.
[0020] Taip pat jAH sutinkamas stambiuose raguočiuose yra kelių formų. Sintetinamos keturios jAH formos, kuriose yra skirtingos aminorūgščių liekanos dvejose padėtyse. Baltymo N gale aminorūgšties liekana gali varijuoti dėl nepilno signalinės sekos pašalinimo, todėl subrendęs baltymas prasideda NH2-Phe-Pro arba NH2-Ala-Phe-Pro. Be to, gali būti skirtingos aminorūgščių liekanos 126 pa-dėtyje: tai gali būti arba Leu, arba Vai. Tai, matyt, apspręsta alelinėmis populiacijos variacijomis. Wllis
[0021] (1969) FEBS Letters, 3, p. 118-120; Fellous ir Rogol
[0022] (1969) J. Biol. Chem. 224, p. 1567-1575; Feriades ir kt. (1971) FEBS Letters, 18, p. 53-54, Felloys (1973) personalus komentaras, pateikiamas Recent Progress in Hormone Research, 29, p. 404; Santoyn (1973) Eur. J. Biochem., 37, p. 164-170; Graf ir Li (1974) Biochem. Biophys. Res. Comm., 56, p. 168-176. Šiuose darbuose išskiriamos keturios molekulinės hipofizinio jAH formos :
[0023] Mills ir kt. (1970) J. Biol. Chem. 245, p. 3407-3415, taip pat identifikavo du bromciano pagalba perskeltus kiaulės augimo hormono (kAH) fragmentus, kurių N galai buvo skirtingi. Viename fragmento N gale buvo fenilalaninas, kitame - papildomas N gale alaninas. Šios kAH molekulinės formos toliau, atitinkamai, trumpinamos kAH(F) ir kAH(A).
[0024] Pilnos DNR sekos, koduojančios atitinkamas jAH(L) ir kAH(F) amino-rūgščių liekanų sekas buvo paskelbtos Siburgo ir kt. DNA (1983), 2, p. 37-45, šis darbas naudojamas šiame išradime nuoroda.
[0025] Atskirų rūšių stambių raguočių hipofizio ląstelės, kaip buvo nustatyta bendru atveju, produkuoja augimo hormonų mišini: jAH(A, L) ir jAH (L) arba jAH(A, V) ir jAH(V) . Analizuojant jAH, gautų, kultivuojant hipofizio ląs-teles baltymų N galus, buvo nustatyta, kad preparatuose yra molekulių mišinys santykiu 50:50; vienose N baltymo gale yra fenilalaninas (Phe), kitose - alaninas (Ala). Preparatuose, pagamintuose pramoniniu būdu iš surenkamų daugelio gyvūnų hipofizių, yra visos keturios jAH formos. Be to, žinoma, kad jAH preparatuose, gautuose iš surenkamų hipofizių, maždaug 30% molekulių yra leucinas 126 pozicijoje pakeistas valinu (Fernandes ir kt. , (1971) FEBS Letters, t. 18, p. 53-54) . Stan-dartiniais biocheminiais metodais negalima atskirti arba išskirti šias keturias formas pramoniniu būdu. Pageidautina ištirti ir pagaminti augimo hormono pre-paratus pramoniniais kiekiais, kuriuose būtų paminėtos atskiros jAH formos, besiskiriančios savo biologiniu aktyvumu, naudojant vieną iš keturių paminėtų hormono formų, kurių preparatuose nebūtų vienos formos arba kitų iš likusių trijų, ir/arba kad šiuose preparatuose nebūtų kitų jaučio baltymų priemaišų. Terminas "pagrindinai švarus" šiame išradime naudojamas, charakte-rizuojant specialaus baltymo arba baltymų; reiškia, kad baltymo preparate nėra baltymų ir/arba kitų medžiagų, su kuriomis baltymas (baltymai) yra susirišę natyviomis sąlygomis arba jo šaltinyje. Dėl šios ir kitų prie-žasčių, šio išradimo tikslas yra kiaulės augimo hormono gavimas, išskiriant kDNR, koduojančią kiaulės augimo hormoną, įterpiant kDNR i, bakterinę plazmidę, transformuojant E. coli kamienus gauta rekombinantine plaz-midę, atrenkant klonus, kuriuose yra rekombinantine plazmidė, ir įterpiant kDNR iš šių plazmidžių i, ekspresijos vektorių ir po to sekančia transformacija gauta rekombinantine plazmide, tam kad ekspresuoti baltymą E. coli kamienuose, atrenkant transformuotus kamienus, kultivuojant kultūrinėje terpėje, išskiriant ir išgryninant tikslini, produktą.
[0026] kAH polipeptidai, gauti pagal šio išradimo būdą, pasi-žymi tokiomis somatotropinėmis savybėmis, kaip pieno išsiskyrimo padidėjimas, augimo padidėjimas ir/arba efektyvesnis pašarų panaudojimas.
[0027] Pateikiamuose brėžiniuose diagramose punktyriniu kon-tūru pavaizduota DNR seka, koduojanti bakterini, pro-motorių, ištušuotas kontūras yra heterologinės DNR koduojanti seka, brūkšneliais pavaizduota papildomos koduojančios DNR sekos (jos konkrečiai pavaizduotos piešinėliuose) rodykle parodoma koduojančių DNR sekų orientacija 5' ir 3'. Taip pat nurodomos atitinkamos skėlimo sritys. Pažymėtos DNR sritys yra pateikiamos vaizdumui ir jos nesusietos su realiais šių sričių dy-džiais. Fig. 1 pavaizduota konstrukcija M13mp8/Xbal, kurioje yra vektorius M13mp8, kuriame SmaI restrikcijos srityje įterptas Xbal fragmentas. Fig. 2 pavaizduota konstrukcija MlSmpS/BGHg^, kurioje yra M13mp8/Xbal, koduojanti jAH(L) DNR seka. Fig. 3 pavaizduota konstrukcija DNR, koduojančios jAH(A, L), naudojant kryptingą oligonukleotidų mutage-nezę specialioje srityje. Fig. 4 pavaizduota konstrukcija DNR, koduojančios jAH(A, V), naudojant kryptingą oligonukleotidų mutage-nezę specialioje srityje. Fig. 5 pavaizduota ekspresijos vektoriaus pMON3209 konstrukcija su pBGHe^, kurioje yra koduojanti jAH(A, L) DNR seka vietoje koduojančios jAH(L) DNR sekos. Fig. 6 pavaizduota ekspresijos vektoriaus pMON3215 konstrukcija su pBGH^.^ kurioje yra koduojanti jAH(A, V) DNR seka vietoje koduojančios jAH DNR sekos. Fig. 7 pavaizduota konstrukcija M13mp9/PGHex_1, kurioje yra M13mp9, kurioje yra koduojanti kAH(F) DNR seka. Fig. 8 pavaizduota konstrukcija DNR, koduojančios kAH, gauta naudojant kryptingą oligonukleotidų mutagenezę specialioje srityje. Fig. 9 pavaizduota konstrukcija pBGH^.i* su pBGHex_1 kurioje EcoRI skėlimo sritis, esanti i, viršų, nuo 5' galo, koduojančio ptro, buvo iš anksto pašalinta. Fig. 10 pavaizduota ekspresijos vektoriaus pMON3213, kuriame yra pBGH^.!*, konstrukcija, kurioje yra DNR se-ka, koduojanti kAH(A), vietoje DNR sekos, koduojančios jAH(L).
[0028] Pagal ši, išradimą pateikiamas heterologinio polipeptido, tokio kaip eukariotinis (pavyzdžiui, žinduolio arba paukščio) baltymas, kurio N gale yra alaninas, gavimo prokariotuose būdas. Tokiu būdu, gaunamas polipeptidas be papildomo metionino jo N gale. Pastovus tokio polipeptido, kurio N gale nėra metionino, kuris yra gene, koduojančiame polipeptidą, gavimas yra naujas ir nelauktas rezultatas.
[0029] Pagal ši, išradimą pateikiamas efektyvus pagrindinai švarių baltymų, kurių N gale yra alaninas, gavimo būdas. Tokie baltymai gali būti, be kokių nors ap-ribojimų, minėti jaučio ir kiaulės somatotropinai ir jų variantai, augalų baltymai, konkrečiai, nedidelis sub-vienetas riboz-1,5-bisfosfatkarboksilazė, gliutationo S-transferazė ir termo šoko baltymas 70. Be to, šis išradimas gali būti efektyviai panaudotas, norint gauti kitus polipeptidus, kai pageidaujama, kad N gale būtų alaninas, o ne metioninas. Gali būti naudinga, kad N gale būtų alaninas, o ne metioninas, pavyzdžiui, nes alanino forma gali būti mažiau imunogeniška, arba pasižymėti kitomis fizikinėmis savybėmis arba modifi-kuotu biologiniu aktyvumu.
[0030] Šio išradimo realizavimo pavyzdžiai, kai gaunamos atskiros jAH arba kAH formos, kultivuojant bakterijų ląsteles, kai šių baltymų N gale nėra metionino todėl nereikalingas jo pašalinimas. Visuose jAH, homologiško
[0031] gamtiniam, ekspresijos bakterijose darbuose gaunami baltymai su metioninu baltymo N gale. Straipsnyje Siburgo ir kt. , DNR, ( 1983), t. 2, p. 37- 45, 44 pus-lapyje nurodyta, kad jAH, kurių N gale yra fenilalaninas, pavyzdžiui, jAH( L), sąmoningai pasirenkama jo ekspresija E. coli ląstelėse, kad išvengti antros hid-rofobinės aminorūgšties liekanos ( metionino) prisijungimo prie hidrofobinio alanino, esančio baltymo N gale, pavyzdžiui jAH( A, L) . Tokiu būdu, prieinami iki šiol atlikti tyrimai rodo, kad išlieka baltymo, sintetinamo bakterijose, N gale metioninas. Nežiūrint i, tai, pareiškėjai nustatė, kad dėl priežasčių, nurodytų aukščiau, būtina gauti kiekvieną iš dviejų formų jAH, jAH( A, L) ir jAH( A, V) ir kiaulės augimo hormono formą kAH( A). Šių somatotropinų gavimo bandymai bakterijose buvo atlikti, laukiant, kad bus sintetinami baltymai, kurių N gale bus metioninas.
[0032] Šio išradimo realizavimo pavyzdžiuose detaliai apra-šytas pareiškėjų metodas, kurio pagalba bakterijose gaunami jAH ( A, L), jAH ( A, V) ir kAH. Trumpiau, šis metodas gali būti aprašomas sekančiai. DNR sekos, ko-duojančios minėtus baltymus, sudaromos kryptingos mu-tagenezės tam tikroje DNR sekoje, kuri koduoja jaučio ir kiaulės somatotropinus, kurių N baltymų gale yra fenilalaninas, nukleotidų srityje, tai parodyta Fig. 3, 4 ir 8. Po to sekos, koduojančios jAH( A, L), jAH( A, V) ir kAH, įterpiamos i, ekspresijos vektorius, tokiu būdu, kad galutinė geno seka yra: promotorius, surišimo su ribosomomis sritis, ATG pradžios kodonas ( metioninas, esantis prie DNR sekos, koduojančios arba jAH( A, L), arba jAH( A, V), arba kAH( A), ir transliacijos pabaigos kodonas. E. coli kultūra transfekuojama gautu ekspresijos vektoriumi, kuriame yra norimas genas, kul-tivuojama tokiose sąlygose, kad būtų ekspresuojamas tikslinis heterologinis baltymas. Gauti baltymai ana-lizuojami, nustatant jų seką ir biologini, aktyvumą.
[0033] Tokiu būdu, pagal ši, išradimą, gaunama, kai DNR seka, kurioje yra transliacijos kodonas (metioninas) go to iš kart heterologinio polipeptido, kurio N gale yra alaninas, kodonai, tai išskirtame iš prokariotinio mikro-organizmo baltyme, iš tikrųjų, N gale yra alaninas, o ne metioninas. Panašu, kad analogiškas rezultatas gali būti gaunamas, jei alanino kodonas yra po apytikriai trijų vienas po kito einančių metionino kodonų, kurie apima iRNR transliavimo pradžią i, tikslini, polipeptidą. Pavyzdžiui, DNR, kurios sudėtyje yra transliacijos pra-džios signalas ir tikslinio polipeptido kodonai, gali būti bet kokia seka, kuri atitinkamai koduoja Met-Ala, Met-Met-Ala, Met-Met-Met-Ala arba bet koki, jo funkcini, ekvivalentą.
[0034] N-alanininis polipeptidas apibrėžiamas, kaip polipeptidas, kurio N gale yra alaninas. Pareiškėjas nenorėtų apsiriboti žemiau pateikiama mechanizmo teorija, bet jis įsitikinęs, kad po transliacijos N baltymo gale esantis metioninas fermentų pagalba pašalinamas prokariotuose, jei sekanti po metionino aminorūgšties liekana yra alaninas arba kita aminorūgšties liekana, pasižyminti tokiomis pat charakteristikomis (pavyz-džiui, poliaringumas arba hidrofobiškumas) , kurios įga-lina pašalinti N gale esanti, metioniną. Be to, taip pat įtikėtina, kad dauguma prokariotų sugeba pašalinti N gale esanti, heterologinių ir/arba endogeninių poli-peptidų metioniną, jei po metionino, esančio N gale, iš kart seka alaninas.
[0035] Šie prokariotai (pavyzdžiui, įvairios bakterijos, ži-nomos ir prieinamos dėka mikroorganizmų deponavimo ins-titutų, tokių, kaip ATCC ir kitų) tai E. coli ir įvai-rūs jų kamienai (matyt sąrašas neapsiriboja jais). Iš tikrųjų, tikėtina, kad bet koks prokariotas, sugebantis sintetinti polipeptidą, kurio N gale yra alaninas, ko-duojančioje DNR, kuri prasideda nuo vieno iki trijų
[0036] gretimų metionino kodonų, po kurių iš kart seka alanino kodonas, potencialiai gali būti efektyvus šio išradimo realizacijai. Naudojami pramonėje ir kiti prieinami prokariotai gali būti patikrinti, ar sugeba jie produkuoti tokius N-alanininius polipeptidus, įterpiant i šių mikroorganizmų genomą geną, kuriame yra promotorius, funkcionuojantis pasirinktame mikroorganizme, DNR, koduojančią surišimo su ribosomomis sritį, nuo vieno iki trijų, sekančių vienas po kito metionino kodonų, kurie yra ir transliacijos pradžios kodonas ir po to iš kart sekančius N-alanino polipeptido kodonus ir transliacijos pabaigos kodoną, po atliekama minėto geno ekspresija ir nustatoma tokiu būdu gauto heterologinio polipeptido N galinė aminorūgšties liekana. Jei nustatoma, kad prokariotinis organizmas produkuoja toki, heterologinį N-alanininį polipeptidą, tai toks mikroorganizmas yra klasės, vadinamos "išrinkta" patento ir Apibrėžties punktų aprašymui.
[0037] Šio išradimo palankiausiame variante buvo naudojami trys E. coli K12 kamienai, kurie deponuoti Amerikos Kultūrų Kolekcijoje, Rocvilles, Meryland, jų kolekcinis numeris ATCC 39986, 53010 ir 53009, šie kamienai pasi-žymėjo sugebėjimu pašalinti metioniną N baltymų gale, kai po šio metionino sekė iškart alaninas.
[0038] Šis išradimas yra reikšmingas, nes įgalina gauti heterologinius polipeptidus, kurių N gale yra alanino liekana .
[0039] Viename pageidaujamame išradimo būdo realizavime, kuris yra šio išradimo objektas, jis buvo naudojamas gaunant dvi jAH formas: jAH(A, L) ir jAH(A, V) ir vieną kAH formą - kAH(A), šių preparatų sudėtyje nėra kitų jaučio arba kiaulės baltymų ir/arba kitų jAH arba kAH formų. Šis būdas įgalina gauti jAH(A, L), jAH(A, V) arba kAH(A), kaip vieną formą. Sugebėjimas produkuoti vie-nintelę jAH arba kAH formą, kurių aminorūgščių liekanų sekos, homologinės gamtoje sutinkamiems sojnatotro-pinams, labai svarbus, norint įvertinti tikslų jAH arba kAH formų biologini, aktyvumą, nustatant daugumą sustip-rinančių jAH ir kAH efektų, bendru atveju, kaip buvo aprašyta aukščiau. Iš tikrųjų, buvo nustatyta, kad naudojant vieną iš dviejų N-alanininių jAH formų, pa-sireiškia jAH funkcijos sustiprėjimas - pieno išsi-skyrimas. Be to, buvo nustatyta, kad naudojant pieno išsiskyrimo sustiprinančią jAH formą, jAH(A, V), gautą pagal ši, išradimą, pieno primilžis žymiai padidėja (statistiniu požiūriu, pavyzdžiui, p<0.05) palyginus, kai naudojamas jAH(A, L). Iki šiol nebuvo tirta įvairių jAH formų santykinis efektyvumas, norint pakelti pieno primilžius. Be to, nebuvo atlikti tyrimai in vivo arba laboratorinėmis sąlygomis įvertinant įvairių jAH formų biologinio aktyvumo skirtumus. Galima padaryti išvadą, kad jAH valininės alelinės formos įtakoja didesnį pieno išsiskyrimą, nei jAH leucino alelinės formos. Ši išvada yra labai svarbi ir nelaukta. Šios išvados dėka galima padaryti prielaidą, kad galima tokiu pat būdu įvertinti skirtumus tarp jAH formų, tokius kaip pašarų efektyvesnis sunaudojimas ir augimo stimuliavimas. Tokiu bū-du, panaudojant šį išradimą, kurio pagalba galima gauti bakterijose bent dvi atskiras molekulines hipofizinio jAH formas ir/arba panaudojant kitus žinomus metodus, galima gauti jAH formas, kurios efektyvesnės specia-lioms reakcijoms, iššauktoms augimo hormono. Kiti žino-mi būdai yra (bet jais apsiriboja visas jų sąrašas) pilno jAH baltymo arba jo fragmentų cheminė sintezė, ir/arba jų ekspresiją kituose mikroorganizmuose to-kiuose, kaip mielės arba žinduolių ląstelės, panaudojant žinomus rekombinantinės DNR metodus.
[0040] Be to, nustačius visų gamtoje sutinkamų formų biolo-ginius aktyvumus, galima gauti polipeptidinius kiekvienos formos variantus, kurie turėtų dar daugiau padidinti jų somatotropinį aktyvumą. Galima numatyti, kad sudarant somatotropinų variantus, pašalinant nukleotidus arba aminorūgščių liekanas, pakeičiant ir/arba pridedant nukleotidus arba aminorūgščių liekanas, Įga-lina gauti įvairias naudingas ekvivalentines kompozi-cijas, pateikiamas šiame išradime. Tokie jAH variantai yra pakeista jAH(V) forma, kurioje N baltymo gale yra metionino liekana. Šis jAH variantas, sintetinamas ge-netiškai transformuotoje bakterijoje, kaip buvo nustatyta, padidina pieno išsiskyrimą iki labai didelių dydžių, naudojant ji, tokiais kiekiais, kad padidėtų laktacija. Be to, laktacijos padidėjimas, naudojant ši, jAH(V) variantą, kaip buvo nustatyta, žymiai didesnis, nei naudojant identiškus variantus, kuriuose vietoje 126 aminorūgšties liekanos yra leucinas.
[0041] Nežiūrint i, tai, kad pareiškėjas nenorėtų apriboti save žemiau aprašyta mechanizmo teorija, pasirodė, kad pa-keičiant leuciną 126 pozicijoje valinu, žymiai padidina tokių somatotropinių baltymų bioįsisavinimą ir/arba biologini, aktyvumą. Somatotropinių baltymų rentgeno kristalografinė analizė parodė, kad minėtų baltymų sritis, apytikriai nuo 90 iki 136 aminorūgšties liekanos, sudaro santykinai labilią sritį. Tiriant kitus baltymus, buvo nustatyta, kad šiose labiliose srityse daugeliu atvejų yra biologiškai aktyvi sritis (pavyz-džiui, sritis, kuri sąveikauja su biologiniu recep-toriumi ir/arba su kitomis to paties baltymo dalimis, įgaudamas biologiškai aktyvią formą). Tokiu būdu, galima tikėtis, kad papildomi jAH(A, V) variantai, kuriuose yra pakeitimai, pašalinimai, papildymai ir/arba aminorūgščių liekanų inversijos šioje labilioje srityje ir/arba ne šioje srityje, gali būti gaunami, juos naudojant žymiai padidėja pieno išsiskyrimas, nei naudojant identiškus kitais požiūriais jAH arba jAH(A, L) leucino formas. Pavyzdžiui, pakeičiant 126 pozicijoje arba aplink šią aminorūgšties liekaną hidrofiliškes-nėmis ir/arba mažesnėmis aminorūgšties liekanomis (palyginus su leucinu), tokiu būdu, kad pieno išsiskyrimas nesumažėtų iki minimumo.
[0042] Be to, galima tikėtis, kad jAH valino tipai, kurių N gale yra Phe(l) arba Ala(-l), gali užtikrinti aprašytą primilžio padidėjimą, naudojant kartu su pašarais. Taip pat galima tikėtis, kad pakeitus N galą (pavyzdžiui Met(-l)), taip kad jis žymiai nesiskirtų nuo gamtoje sutinkamų jAH baltymų N galo, jAH valininės formos ne-padidins primilžių taip, kaip identiški visais kitais atžvilgiais jAH leucino formos ir jAH(A, L). Be to, taip pat galima tikėtis, kad jAH kompozicija, kurioje jAH valininių formų koncentracija, perskaičiavus visų jAH formų svoriui, žymiai didesnė, nei jAH valininių formų, išskirtų iš jaučio hipofizio, taip pat įgalintų pasiekti reikalingą rezultatą.
[0043] Pagal vieną plačiausią šio išradimo realizaciją šis išradimas yra rekombinantinės DNR technologijos išplė-timas, norint prokariotuose gauti heterologinius polipeptidus. Tokiu būdu, šio išradimo aprašymas susietas su pagrindiniais metodais, kurie naudojami rekombi-nantinėje DNR technologijoje, norint išskirti ir klonuoti DNR sekas, koduojančias polipeptidus, pergru-puojant arba pakeičiant klonuotas DNR sekas ir ekspre-suojant klonuotas arba modifikuotas DNR sekas transformuotuose mikroorganizmuose. Su šiais metodais yra susipažinęs kiekvienas šios srities specialistas, (žiūr., pavyzdžiui Maniatis, Fritsch ir Sambrook, 1982).
[0044] Heterologinės DNR izoliavimas ir/ arba konstravimas
[0045] Pagal vieną šio išradimo realizaciją DNR seka, koduojanti tikslini, heterologini, polipeptidą, kuri, norima ekspresuoti prokariote, pasirenkama ir išskiriama, arba DNR seka, kuri ji, koduoja, konstruojama arba sinte-tinama cheminiu būdu. Daugumoje svarbių realizacijų toks polipeptidas yra eukariotų baltymas. Jei polipeptidas yra nedidelis ir žinoma jo aminorūgščių lie-kanų seka, tai galima sukonstruoti sintetinę DNR mole-kulę arba seką, kuri koduotų ši polipeptidą. Jei polipeptido aminorūgščių liekanų seka nėra žinoma arba jis yra labai didelis, kad būtų galima DNR seką susintetinti, tai atvirkštinės transkripcijos pagalba galima gauti atatinkamą kDNR iš iRNR, kuri gaunama iš audinių arba ląstelių, kurie ekspresuoja ši, polipep-tidą. Pavyzdžiui, viename šio išradimo realizavimame tokia jAH seka žinomais metodais, kurie yra aprašyti Gudmano ir kt., Methods in Enzymology, t. 68, p. 75- 90 ( 1979), buvo gauta iš jaučio hipofizio. Kaip alternatyva kDNR gali būti gaunama iš iRNR, išskirtos iš ląstelių transformuotų genomine DNR, kuri išskiriama iš natyvaus genų banko specialaus zondo pagalba. Genominė DNR gali būti taip pat modifikuojama įvairiuose vek-torių sistemose tokiu būdu, kad DNR gali būti ekspre-suojama prokariotuose. Šie metodai yra žinomi kiekvienam šios srities specialistui.
[0046] Po to, kai gaunama heterologinė DNR seka, kurioje yra tikslinio polipeptido kodonai, gali būti naudinga atlikti kai kurias modifikacijas šios molekulės nukleo-tidų sekoje. Pavyzdžiui, jei ši molekulė buvo gauta atvirkštinės transkripcijos iš iRNR matricos, tai joje daugeliu atvejų bus bent dalis DNR, koduojančios lyde-rinę probaltymo seką. Todėl būtina pašalinti lyderinę seką, esančią prieš pirmą tikslinio baltymo kodoną. Kai kuriais atvejais būtina papildyti arba įterpti valino kodoną vietoje kito kodono sekos, koduojančios tikslini, baltymą, pradžioje, jei šiame baltyme nėra baltymo N gale valino kodono. Po to įterpiamas transliacijos pra-džios kodonas ( jis taip pat yra ir metionino kodonas), prieš ir prie pat alanino kodono. Nežiūrint i, tai, kad yra kompleksas transliacijos pradžios signalų ( metionino kodonas bendru atveju) palankiausiame variante (nukleotidų seka ATG, seka GTG taip pat kartais gali būti transliacijos pradžios signalu) naudojamas metionino kodonas. Be to, tuo atveju, kai yra keli metionino kodonai, pavyzdžiui, du, trys, gali būti ir daugiau gretimų metionino kodonų, reikia vertinti, kaip nežymią šio išradimo būdo modifikaciją.
[0047] Bent vienas transliacijos pabaigos kodonas turi būti įterptas po baltymo C galo aminorūgšties liekanos kodono, jei jo nebuvo iki tol. Transliacijos kodonų pa-vyzdžiai yra: deoksinukleotidiniai tripletai TAA, TGA ir TAG. Iš esmės, naudojami rekombinantinės DNR metodai tam, kad sukonstruoti rekombinantinės DNR seką, kurioje būtų, eilės tvarka, transliacijos pradžios signalas (metionino kodonas), tikslinio polipeptido kodonai (N gale turi būti alanino kodonas, kuris yra prie pat transliacijos pradžios signalo) ir bent vienas transliacijos pabaigos kodonas, esantis iš kart po polipeptido C galo aminorūgšties kodono.
[0048] Buvo nustatyta, kad efektyviai iRNR ekspresijai gali trukdyti antrinės struktūros, susidarančios vandeni-linių ryšių, kurie sujungia dvi komplementarias sekas iRNR viduje, pagalba. Šių komplementarių sekų paša-linimas toje molekulės dalyje, kuri koduoja polipeptido N galą, palengvina iRNR susirišimą su ribosoma, ir to pasekoje, padidėja ekspresijos lygis. Gali būti pageidautina pakeisti kodonus, kurie dalyvauja susidarant tokioms antrinėms struktūroms, tos pačios aminorūgšties liekanos kodonais, bet iš kitų nukleotidinių tripletų. Žiūr. Europos patentą Nr. 75 444 (publikuota 1988 m. kovo 30 d.); Siburg ir kt., (1983) DNR, 2, p. 37-45 ir Šoier ir kt., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, p. 5403-5407.
[0049] Kiti heterologinės DNR sekos konstravimo būdai su-prantami kiekvienam šios srities specialistui. Pavyz-džiui, jei turima DNR molekulė, kuri koduoja polipep-tidą, kuri, norima ekspresuoti, kurio N gale yra seka NH2- Met- X- Y-..., kur X yra bet kokia aminorūgšties liekana, išskyrus alaniną, tai alanino kodonas gali būti įterptas tarp metionino kodono ( transliacijos pradžios kodono) ir X aminorūgšties liekanos kodono. Kaip alternatyva, X aminorūgšties liekanos kodonas gali būti pašalinamas, o alanino kodonas įterptas vietoje jo. Tokiu būdu, šio išradimo būdo pagalba būtų gaunamas baltymas, kurio N gale būtų seka NH2- Ala- X- Y-... arba NH2- Ala- Y-....
[0050] Tokiu pat būdu galima pašalinti, pridėti ir/ arba pakeisti bet kuri, aminorūgšties liekanos kodoną, esantį gene ir šio išradimo būdo pagalba galima ekspresuoti variantinius polipeptidus. " Variantinis" polipeptidas pagal šį išradimą yra polipeptidas, kuriame yra pa-šalintos viena arba kelios amino rūgščių liekanos, pa-keičiant ir/ arba papildant kitomis, palyginus su gamtoje sutinkamo polipeptido seka. Tokių variantų pa-vyzdžiai ( bet tai ne visi), kuriuose aminorūgščių lie-kanų seka šių variantinių jAH formų identiška jAH( L) ir jAH( V), išskirtiems iš jaučio hipofizio ląstelių, iš-skyrus, kad yra papildomas metioninas baltymo N gale. Šie variantiniai polipeptidai konstruojami taip, kad jų aminorūgščių liekanų seka būtų pagrinde tokia pat kaip ir gamtinių polipeptidų ir kad šie polipeptidai turėtų biologinį aktyvumą. Variantinių polipeptidų konstravimas ir ekspresija gali būti naudinga tam, kad pasiekti didesnį ekspresijos lygį, padidinti baltymo sta-bilumą, tam, kad supaprastinti polipeptido išgryninimą ir/ arba optimizuoti jo biologinį aktyvumą.
[0051] Aprašytos aukščiau DNR molekulės, koduojančios tikslinį polipeptidą, modifikacijos gali būti atliktos naudojant restriktazes, egzonukleazes, endonukleazes ir kt. , naudojant žinomus metodus. Taip pat galima naudoti bendrus kryptingos oligonukleotidų mutagenezės metodus specialioje nukleotidų sekos srityje tam, kad atlikti nuro-dytas struktūros arba DNR molekulės sekos modifikacijas; šie metodai taip pat yra žinomi šios srities specialistams. Žiūr., pavyzdžiui, Zoller ir Smit (1982) Nuc. Acids Res., t. 10, p. 6487-6500; Zoller ir Smit
[0052] (1983), Meth. Enzymol., 10, p. 468-500; Norris ir kt.
[0053] (1983), Nucl. acids res., t. 11, p. 5103-5112.
[0054] Pagal žinomus rekombinantinės DNR metodus, po to, kai gaunama tikslinė heterologinė DNR seka, toliau ši seka įterpiama į atitinkamą klonavimo vektorių, kurio pagalba atliekama DNR sekos replikacija. Tam galima pa-naudoti bet kokį tinkamą klonavimo vektorių, palankiausiame variante - vektorių, kuriame yra selektyvumo markeris, pavyzdžiui, E. coli plazmidės vektoriai, kuriuose yra Col EI, Xerifild ir kt., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1974), t. 71, p. 3455; pBR322, Bolivar ir kt., Gene, (1977), t. 2, p. 95; pBR325, Sobersi ir kt., Gene (1978), t. 4, p. 122 ir pKC7, Rao ir kt., Gene
[0055] (1979), t. 7, p. 79; ir E. coli bakterofago vektoriai, kuriuose yra XL 47.1, Šaron, Loenen ir kt., Gene,
[0056] (1980), t. 10, p. 249; ir M13mp8 ir M13mp9, Šessing ir kt., Gene, (1982), t. 19, p. 269. Bendri minėtos DNR sekos įterpimo metodai į klonavimo vektorių, konstruojant rekombinantinį vektorių, žinomi kiekvienam šios srities specialistui. Žiūr., pavyzdžiui knygą "Molekulinis klonavimas; Laboratorinis vadovas" red. Maniatis, Fritsch ir Sambrook, 1982.
[0057] Po to, kai gaunamos kelios tikslinės DNR sekos kopijos, šias sekas galima išskirti iš rekombinantinių vektorių ir įterpti į ekspresijos sistemą tam, kad gauti ir išskirti tikslinį heterologinį baltymą pagal aprašymą, kuris žemiau detaliai pateikiamas. Prieš įterpiant šias DNR sekas i, ekspresijos vektorių, galima atlikti įvai-rias heterologinės DNR sekos modifikacijas, naudojant žinomus kiekvienam šios srities specialistui būdus; ži-nomais metodais modifikaciją galima atlikti ir po mi-nėto įterpimo.
[0058] Šio išradimo realizavimo pavyzdžiuose be Ml3mp9, kuris aprašytas Mėsingo ir kt., Gene, (1982), t. 19, p. 269, taip pat buvo pasirinktas klonavimo vektorius Ml3mp8, aprašytas ten pat, modifikuotas taip, kad jame būtų Xbal skėlimo sritis, tai parodyta Fig. 1. Vektoriai M13mp8 ir M13mp9, kurie kartu vadinami "vektoriai M13", įgalina išskirti rekombinantinius vektorius dvigrandžių
[0059] (ds) arba replikacinėje formoje (RF), taip pat ir vien-grandžių (ss) DNR formoje. RF rekombinantinių DNR vek-torių išskyrimas supaprastina tikslinių DNR sekų įter-pimą po ekspresijos vektorių replikacijos, tai parodyta
[0060] Fig. 5, 6 ir 10. Kaip alternatyva, išskiriant šių re-kombinantinių vektorių viengrandę formą, kurioje yra tikslinė DNR seka su teisinga 5'-3' orientacija, ekspresijai, taip pat ir atliekant bet kokias DNR sekos modifikacijas, tokiais metodais, kaip kryptinga oli-gonukleotidų mutagenezė specialioje srityje, tai parodyta Fig. 3, 4 ir 8. Be to, šie M13 vektoriai gali "suderinti" DNR fragmentus arba genus, kurių ilgis yra iki 4 kilobazių (kb), kurių pagalba galima klonuoti tipinę, pilną, eukariotinę geno seką.
[0061] Markerinė funkcija, naudojama M13 vektoriuose, kaip ap-rašyta Mesing ir kt., Gene, (1982), t. 19, p. 269, pa-sižymi fermentas P-galaktozidazė. Konkrečiu atveju tikslinė heterologinė DNR seka įterpiama į geno lacZ fragmentą, kuris yra M13 vektoriuje, tai pažeidžia nor-malią fragmento lacZ komplektaciją, kuri yra vektoriuje M13, daliniu geno fragmentu lacZ, kuri yra recipiento chromosominėje DNR (pavyzdžiui, JM101 E. coli), taip, kad recipientas nesugeba įsisavinti laktozę, kuri yra bakterijų auginimo terpėje. E. coli po transfekcijos vektoriais M13, kuriuose nėra svetimo geno. sekos, įterptos i, vektorių, kuriame yra lacZ geno fragmentas, gali įsisavinti laktozę, kuri yra auginimo terpėje, su-darydamos charakteringas mėlynas dėmes, jei šios bakterijos auginamos ant agaro, kuriame yra terpė lxYTr jos sudėtis - 0.8% (m/t) triptono, 0.5% (m/t) mielių ekstrakto, 0.5% (m/t) NaCl, spalvinis p-galaktozidazės indikatorius. Kai bakterijos auginamos nurodytoje ter-pėje, E. coli dėmės po transfekcijos rekombinantiniais vektoriais, kuriuose yra įterpta heterologinės DNR seka į vektoriaus M13 fragmento genomą, yra skaidrios ir bespalvės. Todėl, kai įterpiama heterologinė DNR seka į šiuos klonavimo vektorius, tai stebimos bespalvės dėmės po recipiento E. coli transfekcijos rekombinantiniais vektoriais. Įterpimas DNR sekos, koduojančios jAH(L) ir kAH(F), į vektorius M13 pateiktas Fig. 2 ir 9.
[0062] Palankiausiame šio išradimo realizavimo variante DNR sekos, koduojančios jAH(L) ir kAH(F), yra plazmidėse pBGHex_j ir pPGHex_lf atitinkamai, tai aprašyta Siburgo ir kt. , DNR, (1983) 2 (1), p. 37-45, išskiriamos iš šių plazmidžių endonukleazių pagalba specifinėje srityje. Reikia pažymėti, kad po transfekcijos plazmidėmis pBGH^.j arba pPGHg^ ir po kultivavimo tokiose sąlygose, kuriose vyksta ekspresija sekų, koduojančių jAH(L) ir kAH(F), bakterijos produkuoja somatotropinus, kurių baltymo N gale yra metioninas (pavyzdžiui, Met-jAH(L) arba Met-kAH(F), atitinkamai). Atitinkamos sekos po to įterpiamos į RF DNR modifikuotą vektorių M13mp8 M13mp8/Xbal) ir vektorių M13mp9, tai parodyta Fig. 2 ir 7, atitinkamai. Tikslinės DNR sekos, koduojančios jAH(L) arba kAH intarpas RF DNR M13mp8/Xbal ir M13mp9 buvo patvirtinamas naudojant endonukleazes, tai parodyta Fig. 2 ir 7, atitinkamai. E. coli JM101 po to transfekuojamos vienu iš rekombinantinių vektoriumi, kaip aprašyta Messingo ir kt., Methods in Enzymology,
[0063] (1983), t. 101, p. 20 ir rekombinantinių vektorių ss DNR, išskiriama pagal metodą, pateiktą Messingo ir kt., Gene, (1982), t. 19, p. 269. Atitinkami Messingo ir kt. darbai čia pateikiami kaip nuorodos.
[0064] Po šių rekombinantinių vektorių ss DNR išskyrimo atliekama modifikacija kryptingos oligonukleotidų muta-genezės pagalba specialioje srityje, norint gauti ko-duojančias jAH(A, V), jAH(A, L), jAH(V) ir kAH(A) sekas. Konkrečiu atveju, jAH(L) buvo modifikuojamas papildant seką alanino kodonu, pavyzdžiui GCC sekos, ko-duojančios jAH(L), 5' gale, kaip parodyta Fig. 3. Galima tikėtis, kad tokiu būdu galima papildyti bet kuriuo iš keturių alanino kodonu. Pageidautinas alanino kodonas, norint pasiekti ekspresijos sistemoje, pagal ši, išradimo būdą, optimalią somatotropino išeigą, yra GCC. Alanino prisijungimas, konstruojant koduojančią jAH(A, L) seką, patvirtinamas analizuojant pilnos ko-duojančios jAH(A, L) DNR seką, arba jos 5' galą, naudojant metodą: Zanger ir kt., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1977), t. 74, p. 5468.
[0065] Seka, koduojanti jAH(A, V), konstruojama kryptingos oligonukleotidų mutagenezės pagalba specialioje srityje, koduojančioje jAH(A, V), tai parodyta Fig. 4, pakeičiant leucino kodoną 127 pozicijoje (jAH(A, L)) į valino kodoną, pavyzdžiui i, GTG. Vėl galima tikėtis, kad atliekant tokius pakeitimus, galima naudoti bet kuri, valino kodoną. Sekos, koduojančios jAH(A, V), konstrukcijos teisingumas tikrinamas, analizuojant gautos DNR seką.
[0066] Seka, koduojanti jAH(V), kurios pagalba sintetinamas po bakterijų transfekcijos vektoriais, kuriuose yra koduojanti jAH(V) seka, baltymas Met-jAH(V), analogiškai konstruojama kryptingos mutagenezės pagalba, pakeičiant leucino kodoną 126 padėtyje [ jAH(L)] d, valino kodoną, pavyzdžiui, GTG.
[0067] Seka, koduojanti kAH(A), konstruojama kryptingos muta-genezės pagalba specialioje kAH(F) srityje taip pat, kaip parodyta Fig. 8 ir konstravimas detaliai yra ap-rašomas žemiau, konstrukcijos teisingumas tikrinamas analizuojant DNR seką.
[0068] Po tikslinės heterologinės DNR sekos, išskyrimo ir konstravimo, analogiškai kaip ir jAH(A, L), jAH(A, V) ir kAH(A) atvejais, šios sekos gali būti replikuojamos ir gaunama daug jos kopijų, dauginant atitinkamus rekombinantinius vektorius, naudojant metodus, žinomus kiekvienam šios srities specialistui, šie metodai buvo aprašyti aukščiau. Šios heterologinės DNR sekos gali būti įterptos i, bet kokius tinkamus ekspresijos vektorius, norint produkuoti prokariotuose heterologinius polipeptidus.
[0069] Kaip buvo nurodyta aukščiau, tinkamame ekspresijos vektoriuje turi būti reikalingi transkripcijos ir transliacijos signalai tam, kad būtų galima gauti heterologini, baltymą pasirinktame recipiente, taip pat turi būti markeris tam, kad identifikuoti tuos ekspresijos vektorius, kuriuose yra įterpta tikslinė heterologinė DNR seka. Panaudojant prokariotini, ekspresijos vekto-rių, rekombinantinės DNR sekos gali būti įterpiamos transdukcijos, transformacijos arba transfekcijos pagalba (visi šie metodai toliau vadinami vienu terminu - " transfekcija") ir po to minėtas mikroorganizmas kul-tivuojamas tokiose sąlygose (šios sąlygos priklauso nuo pasirinkto promotoriaus ir recipiento), kuriose yra simuliuojama tikslinio polipeptido produkcija. Tokiu būdu, mikroorganizmų, naudojamų pagal ši, išradimą, "ge-nominės" DNR yra kaip chromosominė, taip ir episominė
[0070] DNR.
[0071] Žinoma keletas heterologinio geno ekspresijos ir pro-dukavimo prokariotiniame recipiente vektorių, šie vektoriai dabar yra žinomi kiekvienam šios srities specialistui .
[0072] Palankiausiame šio išradimo realizavimo variante buvo naudojami ekspresijos vektoriai pBGH^.!, žiūr. Siburg ir kt., DNA (1983), 2 (1), p. 37-45 ir pBGH^.^, kuris yra vektoriaus pBGHex.1 modifikacija.
[0073] Ekspresijos vektoriai pBGHex_: yra bakterinė plazmidė pBR322, kurioje yra jAH(L) genas. Šis genas sudarytas iš triptofano promotoriaus (ptrp), Shine-Dalgarno sekos, transliacijos pradžios signalo ATG (metionino kodonas, kuris yra prie pat koduojančios sekos N gale esančio fenilalanino, pirmos jAH(L) amino rūgšties liekanos), sekos, koduojančios jAH(L) ir transliacijos pabaigos kodono.
[0074] Ekspresijos vektoriaus pBGH^.-Į markeris yra atsparumas antibiotikui. Konkrečiu atveju pBGH^.į yra du atsparumo antibiotikams genai: vienas - atsparumo ampicilinui (ampr) ir kitas - atsparumo tetraciklinui (tetr) , kurie suteikia stabiliai transformuotiems ekspresijos vektoriais recipientams atsparumą antibiotikams. Tokiu būdu, stabiliai transformuotos ląstelės gali būti atrenkamos pagal sugebėjimą augti terpėje, kurioje yra arba tet-raciklinas, arba ampicilinas, arba abu šie antibiotikai .
[0075] Šio išradimo realizavimo pavyzdžiuose ekspresijos vektoriai pMON3209 ir pMON3215, kuriuose yra pBGHex_;Į, kuriuose yra sekos, koduojančios jAH(A, L) ir jAH(A, V), atitinkamai, vietoje sekos, koduojančios jAH(L), buvo
[0076] gaunami pagal Fig. 5 ir 6 pateiktą schemą. Po to tokios bakterijos buvo stabiliai transformuojamos ekspresijos vektoriais, transformuotos ląstelės atrenkamos auginant terpėje, kurioje yra atitinkami antibiotikai. Ekspresijos plazmidės, esančios transformuotose bakterijose, buvo restriktazių pagalba analizuojamos, norint patikrinti, ar sekos, koduojančios jAH(A, L) ir jAH(A, V), yra teisinga 5 1 —3 * orientacija.
[0077] Šio išradimo realizavimo pavyzdyje, konstruojant ekspresijos vektorių pMON3213, kuriame yra seka, koduojanti kAH(A), vietoje sekos, koduojančios jAH(L), buvo panaudotas pBGH^.!*, kuriame yra vektorius pBGHex.1, modifikuotas, pašalinant EcoRI skėlimo sritį, kuri yra prieš 5' galą sekos, kuri koduoja ptrp. Gautame vektoriuje pBGHex_1* yra tik viena EcoRI skėlimo vieta, tai parodyta Fig. 9. Sekos, koduojančios jAH(L) pakeitimas seka, koduojančia kAH (A) , vektoriuje pBGHg^!*, konstruojant ekspresijos vektorių pMON3213, pavaizduotas
[0078] Fig. 10. Toliau E. coli kultūra buvo transformuojama aukščiau minėtu vektoriumi ir transformuotos ląstelės buvo atrenkamos auginant terpėje, kurioje buvo anti-biotikas. Ekspresijos plazmidėse, esančiose transformuotose bakterijose, buvo tikrinama, ar yra seka, koduojanti kAH(A), restriktazių pagalba.
[0079] jAH(A, L), jAH(A, V) arba kAH(A) produkavimas buvo vyk-domas E. coli bakterijose, transformuojant kamienus arba E. coli W3110, arba E. coli LK892, arba E. coli 294, kurie yra deponuoti, jų katalogo numeriai yra ATCC 39936, 53010 ir 53009, vektoriais pMON3209, pMON3215 arba pMON3213, metodais, kurie buvo aukščiau detaliai aprašyti. Transformuotos E. coli W3110 ląstelės buvo auginamos tokiomis sąlygomis, kuriose vyksta somatotropino genų ekspresija, ir produkuojami tiksliniai heterologiniai polipeptidai.
[0080] Heterologinio polipeptido išgryninimas priklausys kaip nuo polipeptido prigimties taip ir nuo pasirinkto recipiento. Pavyzdžiui, buvo pastebėta, kad heterologiniai baltymai, gaunami tokiose bakterijose, kaip E. coli, dažnai būna viduj ląstelės netirpioje formoje kaip "intarpiniai kūneliai". Čia naudojamas terminas "intarpiniai kūneliai", nes šiuos kūnelius galima ma-tyti fazinio kontrasto mikroskopu. Būdas, kuris naudojamas heterologinių baltymų išgryninimui, išsaugant jų biologini, aktyvumą, aprašytas paraiškoje Europos patentui Nr. 114506 (publikuota 1984 m. rugpjūčio 1 d.), šiame išradime šis būdas vartojamas kaip nuoroda. Trumpai aprašant ši, būdą, tai producento ląstelių koncent-ravimas, šių ląstelių lizavimas, gaunant ekstraktą arba ląstelių homogenizatą ir intarpinių kūnelių išsisky-rimas, naudojant diferencini, centrifugavimą, visos šios stadijos yra gerai žinomos šios srities specialistams. Išskirti intarpiniai kūneliai ištirpinami stipriame de-natūruojančiame agente tokiame, kaip guanidino hidro-chloridas, ir ištirpintas baltymas toliau dializuojamas tinkamame tirpiklyje (pavyzdžiui, urėjoje), gryninamas chromatografijos pagalba ir pagaliau biologiškai akty-vuojamas, t.y., atstatoma aktyvi baltymo konformacij a, išsaugant disulfidinius ryšius tarp cisteino liekanų pagal paraišką Europos patentui Nr. 114506. Detalesnis heterologinių baltymų išgryninimo aprašymas pateikiamas pateiktose nagrinėjimui paraiškose JAV patentui, viena pateikta S. B. Storros, kurios pavadinimas - "Somato-tropinų soliubilizacijos būdas", ir antra pateikta L.E. Bentl, S.B. Storros ir J.Y. Mitchell, kurios pavadinimas - " Somatotropinų renatūravimo būdas", šios pa-raiškos naudojamos kaip nuorodos. Dvi paminėtos nag-rinėjamos paraiškos JAV patentui ir šis patentas pa-teiktos Monsanta kompanijos vardu. Tolesnis heterologinio baltymo išgryninimas, atskiriant nuo bakterinių baltymų, gali būti atliekamas žinomais chromatogra-finiais metodais tokiais, kaip gelfiltracij a arba jonų mainų chromatografija. Bendru atveju, gautame preparate yra apytikriai nuo 90% iki 99. 5% polipeptido_, kurio N gale yra alaninas ir nuo 0. 5% iki 10% bakterijų arba kito prokarioto baltymų, kuriame buvo sintetinamas baltymas .
[0081] Buvo nustatyta, kad, bendru atveju, bent 80% heterologinio baltymo, ekspresuoto pagal šio išradimo būdą, N gale yra NH2- Ala-... tipo struktūra. Likusi polipep-tidų dalis, paprastai, turi N gale metioniną, jų N gale yra NH2- Met- Ala-... tipo struktūra. Visdėlto, keičiant auginimo sąlygas ir/ arba indukcijos trukmę, galima padidinti polipeptido išeigą, kurio N gale yra alaninas bent iki 95% ir daugiau.
[0082] Palankiausiame šio išradimo realizavimo variante somatotropiniai polipeptidai, produkuojami ir išskiriami pagal ši, aprašymą, pateiktą aukščiau, buvo pademons-truota, kad jie pasižymi biologiniu aktyvumu artimu somatotropino aktyvumui; tai buvo nustatyta analizuojant triušio kepenų receptorių reakciją, atliekant pagal Pišim ir Frizen, J. Cin. Endocrinol. Metab. ( 1973), t. 37, p. 334- 337 ir analizuojant žiurkių priaugimą. Pagal paskutini, somatotropinų, gaunamų E . coli ląstelėse, biologinio aktyvumo analizės metodą biologinis aktyvumas buvo nustatomas pagal žinomą somatotropino partiją ( pavyzdžiui, jaučio arba kiaulės hipof izarini, somatotropiną), palyginant žiurkių, kurioms buvo pa-šalintas hipofizis, priaugimą, įvedant skirtingus jun-ginio kiekius. Konkrečiai, dienos dozės ( nuo 0 iki 60 mikrogramų) žinomo arba iš standartinio šaltinio somatotropino buvo injekcijomis įvedamos žiurkėms ( 95- 135 g) su pašalintais hipofiziais 7 ir daugiau dienas. Panaudojant regresinę analizę, buvo nustatoma gyvūnų, ku-riems buvo įvedamas žinomas ir tiriamas kiekis augimo hormono, svorio priaugimo regresijos lygtis priklau-somai nuo įvesto hormono kiekio logaritmo. Tiesės lyg-ties tga buvo kontroliuojamas, norint išvengti lygia-gretumo ir persidengimo. Biologinis aktyvumas buvo iš-reiškiamas kaip tga santykis padaugintas iš standarto aktyvumo.
[0083] N-alanininių jAH panaudojimas, kuris yra šio išradimo objektas, padidina karvių primilžį ir, matomai, suma-žėja pašarų, reikalingų norimam primilžiui pasiekti, sunaudojimas. Duodant karvėms, kurios auginamos pienui, jAH tas formas, kuriose yra valinas 126 arba artimoje pozicijoje, ypatingai tinkamos pieno primilžiui padidinti. Šie preparatai, kurie yra šio išradimo objektas, gali būti naudojami injekcijomis, įvedant i, ve-ną arba implantuojant ant polimerų arba kitų nešėjų, kurie užtikrina reikalingo augimo hormono kiekio išsi-skyrimą i, kraują. Galima naudoti farmaciškai tinkamas formas, kaip tirpalai, emulsijos arba geliai, kurie yra apvalkale arba be jo. Šiose formose gali būti tik atskiros jAH formos arba jų variantai, o taip pat bet kokia kombinacija natyvaus ir/arba variantinio polipeptido [pavyzdžiui, mišinys jAH(A, V) ir jAH(A, L), ir/arba mišinys jAH(A, V) ir Met-jAH(A)] . Dozės gali kisti nuo 0,005 mg iki 200 mg vienam gyvūnui per dieną, palankiausiame variante - apytikriai nuo 5 mg iki 40 mg vienam gyvūnui per dieną. Labiausiai efektyvus kiekis, norint padidinti primilžius ir/arba padidinti pašarų sunaudojimo efektyvumą, gaunant pieną, galima nustatyti eksperimentu. Realiai pageidautinos jAH dozės priklauso nuo tokių parametrų, kaip gyvūno kūno svoris, bendra gyvūno sveikatos būklė ir šėrimo statusas. Nors jAH poveiki, karvėms galima naudoti primilžio rodikli,, šiam tikslui galima naudoti ir kitus karvių produktyvumo rodiklius - bendras augimo dydis ir gyvo svorio padi-dėjimas. Jeigu tai būtina, tai jAH gali būti naudojamas kartu su kitais stimuliuojančiais agentais, tokiais, kaip biologiškai aktyvūs baltymai, antigenai ir kt., tuo atveju pasiekiamas žymesnis efektas.
[0084] Kaip buvo minėta aukščiau, šiuo išradimu pateikiamas jAH variantų, kurių N gale yra alaninas, kuriuose yra pašalintos, papildytos, sukeistos ir/ arba pakeistos aminorūgščių liekanos polipeptidinėj e grandinėje, gavimo būdas. Įvairios modifikacijos, kurių dėka pasie-kiami tokie efektai, kaip laktacijos ir/ arba augimo greičio padidėjimas, gali būti identifikuoti bandymuose su karvėmis.
[0085] Žemiau pateikiami pavyzdžiai yra šio išradimo pa-lankiausio realizavimo iliustracija ir jie nėra šio išradimo apribojimas. Nežiūrint d, tai, kad pateikiamas išradimas buvo aprašomas palankiausiais šio išradimo realizavimo pavyzdžiais, kiekvienam šios srities specialistui suprantama, kad pagal šio išradimo aprašymą galima atlikti įvairias modifikacijas, neperžengiant šio išradimo Apibrėžties.
[0086] Išvardinti mikroorganizmai gali būti gauti iš Amerikos Kultūrų Tipų Kolekcijos ( ATCC), 12301 Parklawn Drive, rockville, Maryland, 20852 - 1776, JAV.
[0087] Šie deponuoti mikroorganizmai gali būti išduoti po šios paraiškos JAV patento išdavimo firmoje Monsanta Company. Šie deponuoti mikroorganizmai bus prieinami po bet kokio JAV patento, kurio prioritetas bus nustatytas
[0088] pagal pateikimo datą, išdavimo. Bet reikia turėti ome-ny, kad galimybė pasinaudoti deponuotais mikroorganizmais nesuteikia licenzijos šio išradimo naudojimui, pa-žeidžiant teisėtas pareiškėjo teises. Be to, šis išra-dimas neapsiriboja deponuotais mikroorganizmais, nes deponuoti mikroorganizmai tik iliustruoja šio išradimo objektą.
[0089] Visi oligonukleotidai buvo susintetinti firmoje Monsanta Botanikos skyriuje, sintezė buvo atliekama DNR sinte-zatoriumi (Applied Biosystems) pagal procedūrą, pa-teiktą gamintojo - Applied Biosystems Inc., Foster sity, Kalifornija. Restriktazės ir DNR modifikavimo fermentai buvo gauti iš firmos New England Biolabs, Inc.
[0090] (Beverly, MA) , iš firmos New England Nuclea (Bostonas, MA) ir iš firmos Bethesda Reseach Laboratories (BRL)
[0091] (Gavtensburg, Meryland), linkeris Xbal buvo gautas iš firmos Colaborative Reseach, Inc., (Leksington, MA). DNR ligazė T4 buvo gauta iš firmos BRL (Gavtensburg, Meryland), DNR kinazė T4 buvo gauta iš firmos New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA). Žymėti 32P nukleo-tidai buvo gauti iš firmos American (Arlington, IL) . Klenovo fragmentas DNR polimerazė I buvo gauta iš firmos New England Nuclea (Bostonas, MA) . E. coli JM101 buvo gautas iš dr. Joe Mesing, Minesotos Universitetas (Sant Paul, Minesota).
[0092] Skaldymas restriktazėmis, ligavimas DNR ligaze T 4 ir Klenovo fragmentu DNR polimeraze I E. coli gali būti atliekami pagal gamintojų rekomendacijas. Tinkamiausi buferiniai tirpalai aprašytiems žemiau fermentams gali būti sekantys: Xbal:100 mM NaCl, 50 mM TRIS, pH 7.5, 10 mM MgS04; EcoRI, HindlII ir Smal:50 mM NaCl, 10 mM TRIS, pH 7.5, 10 mM MgS04. DNR ligaze T4 reakcija vykdoma bu-feriniuose tirpaluose, kurių sudėtyje yra: 25 mM TRIS, pH 8. 0, 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotrietolio ( DTT), 2 mM spermidino ir 0. 2 mM ATF, Klenovo fragmentas DIJR poli-merazė I E . coli buvo naudojama buferiniame tirpale, kuriame yra: 20 mM TRIS, pH 7. 2, 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotrietolio ( DTT), 1 mM ATF ir po 1 mM kiekvieno dATF, dGTF, dDTF, dCTF. Jei būtina gauti sintetinamą DNR seką pažymėtą, tai vykdant reakciją su Klenovo fragmentu bu-vo pridedama cc- 32P- ATF ( 400 Ci/ mol) .
[0093] Žymėti oligonukleotidai buvo gaunami naudojant y- 32 P- ATF ( specifinis aktyvumas didesnis, nei 5000 Ci/ mol) ir DNR kinazę T4 su 100 mM TRIS, pH 8. 0, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT.
[0094] Plazmidės, kuriose yra DNR sekos, koduojančios jAH ( L) ir kAH( F) ( pBGHe^! ir pPGHex_ 1, atitinkamai), buvo gautos iš firmos Genentex, Inc., SanFrancisko, Kalifornija. Šios plazmidės gali būti gaunamos pagal aprašymą, pa-teiktą paraiškoje Europos patentui Nr. 75444 ( publikuota 1983 m. kovo 30 d.) ; Siburg ir kt., DNR ( 1983), 2 ( 1), p. 37- 45; Geddel ir kt., Nature ( 1979), t. 281, p. 544- 548; Debber ir kt., knygoje " Promotoriai: Struktūra ir funkcijos" ( 1982) ; redaktoriai: M. J. Čemberlin ir R. Rodriges, Sk. 293; Mioccari ir Janothski, J. Bacteriol ( 1978), t. 133, p. 1457- 1466; ir Rozenbegr ir Kurt, Annual Review of Genetic t. 13, p. 319- 353. Pirmieji transliuojami DNR, koduojančios jAH( L), kodonai pateik-ti paraiškoje Europos patentui Nr. 75444 ( DeBoer ir
[0095] kt.) yra ATG TTC CCA GCT ATG TCT GGT CTA TTC GCT AAC
[0096] GCT GTT CTT CGT GCT CAG CAT CTT arba jų funkciniai ekvivalentai. ( Kaip alternatyva, suprantama, galima pa-naudoti funkcinius šių kodonų ekvivalentus). Kita, su-sijusi su nagrinėjamais klausimais, medžiaga pateikia-mose publikacijose taip pat naudojama čia kaip nuorodos .
[0097] M13mp8 ir M13mp9 buvo gauti iš daktaro Joe Mesing iš Minesotos Universiteto ( St. Paul, Minesota).
[0098] Visos terpės bakterijų auginimui ir antibiotikai buvo gaunami arba iš firmos Sigma ( St. Louis, MO) , arba iš firmos Difco Laboratories ( Detroitas, Mičiganas) .
[0099] Pateikiamuose žemiau pavyzdžiuose iliustruojamas trijų koduojančių DNR sekų, kurias ekspresavus, pasiekiama tiesioginė produkcija bakterijose polipeptidų, kurių N gale yra alaninas, konstravimas. Konkrečiu atveju, koduojančios DNR sekos buvo konstruojamos tokiu būdu, kad transliacijos pradžios signalas ( metionino kodonas ATG) buvo prie pat alanino kodono ( pavyzdžiui, GCC) . Šios trys koduojančios DNR sekos, koduojančios jAH( A, L), jAH( A, V) ir kAH( A), buvo konstruojamos kryptingos mu-tagenezės pagalba, naudojant anksčiau išskirtas somato-tropiną koduojančias DNR sekas. Šis pavyzdys iliustruoja taip pat ir DNR sekos, koduojančios jAH( V), kurią ekspresuoj ant bakterijose, sintetinamas Met- jAH( V).
[0100] DNR seka, koduojanti somatotropiną, jAH( L), buvo išski-riama iš pBGHex.!, kaip Xbal fragmentas ir klonuojama Xbal skėlimo sriti, vektoriuje M13mp8 ( M13mp8/ Xbal) . Vektorius M13mp8/ Xbal, kuriame yra Xbal linkeris pra-dinėje SmaI skėlimo srityje, konstravimas pateiktas Fig. 1. Kaip parodyta Fig. 2, Xbal skelia viename DNR sekos, koduojančios jAH( L), " išpjaudama" pilną DNR se-ką, koduojančią jAH( L). Plazmidė pBGHg, ;.!, perskelta Xbal restriktaze buvo sumaišoma, esant DNR ligazei T4, su RF DNR M13mp8/ Xbal, linerizuota restriktazės Xbal pagalba, ir paveikiama šarmine fosfataze, išskirta iš jaučio žarnyno. Po to mišinys buvo inkubuojamas per nakti, 14°C temperatūroje. Paveikus šarmine fosfataze, išvengiama vektoriaus M13mp8/ Xbal recirkuliacijos. DNR sekos, koduojančios jAH( L), įterpimas i, vektorių M13mp8/Xbal, konstruojant rekombinantind, vektorių M1 SmpS/BGHgj^, iš pradžių buvo kontroliuojamas pagal bespalvių dėmių susidarymą, auginant E. coli JM101 bakterijas lxYT terpėje, naudojant minkšto agaro paruošimo procedūrą, aprašytą knygoje "Molekulinis klonavimas: Laboratorinis vadovas" red. Maniatis, Fritš ir Sembruk
[0101] (1982), p. 64, šiame agare yra 10 |il 100 mM IPTGP (izo-propil-p-G-tiogalaktopiranozidas) ir 50 (ii 2% (m/v) X-GAL (5-brom-4-chlor-3-indolil-p-D-galaktopiranozidas) 3 ml viršutinio agaro, ir buvo atliekama transfekcija minėtu rekombinantiniu vektoriumi, aprašytu aukščiau būdu. Sekos, koduojančios jAH(L), įjungimas buvo patvirtintas analizuojant restrikcine analize išskirtą rekombi-nantinio vektoriaus RF DNR restriktaze Xbal, buvo gaunamas 590 bazių porų fragmentas, kuriame buvo įterpta seka ("Molekulinis klonavimas: Laboratorinis vadovas" red. Maniatis, Fritsch ir Sambrook (1982), skyrius 3). 590 bazių porų fragmentas buvo identifikuojamas elekt-roforėzės 1% (m/t) agarozėje pagal aprašytą knygoje "Molekulinis klonavimas: Laboratorinis vadovas" red. Maniatis, Fritsch ir Sambrook (1982) metodiką. Visi kiti restrikciniai fragmentai buvo identifikuojami šios procedūros pagalba. Įterptų sekų, koduojančių jAH(L), orientacija buvo kontroliuojama skaldant rekombinantini, RF vektorių fermentais SmaI ir HindlII. Jei koduo-jančios sekos yra teisingos 5'-3' orientacijos, tai po skaldymo šiais fermentais turi būti gaunamas 207 bazių porų fragmentas. Fago ssDNR išskyrimas buvo atliekamas pagal metodiką, aprašytą Missing ir kt., Gene, (1982), t. 19, p. 269. Po to vektorius MlSmpS/BGHg^ buvo naudojamas kaip matrica atliekant kryptingą mutagenezę iš esmės pagal aprašymą, pateiktą Zoller ir Smith, Nuc. Acids Res., (1982), t. 10, p. 6487-6500, Zoller ir Smith, Methods in Enzymology (1983), t. 100, p. 468-500, Norriss ir kt., Nuc. Acids Res., (1983), t. 11, p. 5103-5112, šie aprašymai čia pateikiami kaip nuorodos. Fig. 3 pateikiama mutagenezės diagrama, konstruojant DNR seką, koduojančią jAH(A, L) iš sekos, koduojančios jAH(L) . Trumpai, tai oligonukleotidų pradmenį (žiūr. Lentelę 1, žemiau), kuriame yra norimos mutacijos seka, naudojamas ciklizuotos DNR matricos M13mp8/BGHex_x iš ssDNR, pradmens sintezei. Tokiu būdu gautos uždaros žiedinės dsDNR molekulės buvo atskiriamos nuo nepilnų ir vienspiralių DNR žiedų, naudojant ultracentrifūga-vimą pašarmintame sacharozės gradiente, pagal metodiką, aprašytą Zoller ir Smith, Methods in Enzymology (1983), t. 100, p. 468-500. Žiedinės dsDNR molekulės toliau bu-vo naudojamos E. coli JM101 transformavimui, kuris buvo atliekamas pagal metodiką, aprašytą Messing ir kt., Gene, (1982), t. 19, p. 269-276, gautos bespalvės dėmės buvo pernešamos ant Pall filtrų, gautų iš firmos Pall Ultrafine Filtration Corp. (Glen Kown, New York), ir buvo tikrinamos hibridizuoj ant su žymėtu 32P oligonukleotidiniu pradmeniu, kuris buvo naudojamas kryptingai mutagenezei. Minėtų dėmių surinkimas buvo atliekamas pagal filtrų gamintojo Pall pateikiamą meto-diką. Išsėjimas hibridizuoj ant buvo atliekamas naudojant nailoninius Biodine filtrus, kurie yra aprašyti Pall Ultrafine Filtration Corp. (Glen Kown, New-York) publikacijoje "Vadovas DNR pernešimui ant nailoninių Pall Biodine™ filtrų" (1983) . Filtrai buvo praplau-nami, didinant temperatūrą, iki tol, kol atsiplaudavo radioaktyvi žymė iš kontrolinio filtro, kuris buvo pa-ruošiamas naudojant fagą MlSmpS/BGH,^.!. Bendras atplo-vimo protokolas: praplovimas kambario temperatūroje su 6xSSC (0.9 N NaCl ir 0.09 M natrio citratas) 10 mi-nučių, po to praplovimas 50°C temperatūroje su 6xSSC 5 minutes ir po to sekantys praplovimai, pakeliant temperatūrą kas 5°C. Dėmės, kurios hibridizavosi su žymėtu oligonukleotidiniu pradmeniu aukštesnėse tempe-ratūrose, nei kontroliniai fagai, buvo įvertinamos, kaip turinčios naujai sudarytą seką, koduojančią jAH(A, L), ir jos buvo toliau vadinamos potencialiai tei-giamomis. Kaip alternatyva, atskiros bespalvės dėmės buvo atrenkamos iš transformuotų E. coli JM101 ląstelių ir buvo auginamos 5 ml terpėje 2xYT (1.6% (m/t) triptono, 1,0% (m/t) mielių ekstrakto, 0.5% (m/t) NaCl) per nakti aeruojant 37°C temperatūroje. Fago DNR, gauta pagal aprašymą, pateiktą Messing ir kt., Gene (1982), t. 19, p. 269, dėmėmis buvo užnešama ant nitroceliuliozės membranos, atliekama hibridizacija su žymėtu pradmeniu ir atplaunama, keliant temperatūrą tokiu pat būdu, kaip buvo aprašyta aukščiau. Fago DNR, kurios hibridizavosi aukštesnėje temperatūroje, nei kontrolinės MlSmpS/BGHe^ dėmės, buvo įvertinamos kaip teigiamos. Potencialiai teigiamos dėmės, atrinktos abiejų metodų metu, buvo auginamos pagal aprašymą, pateiktą anksčiau, ir buvo naudojamos fago ssDNR išskyrimui, šios DNR seka buvo analizuojama pagal metodiką, pateiktą Zanger ir kt., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1977), t. 74, p. 5463, tam, kad patvirtinti, kad jos koduoja jAH(A, L). RF DNR iš MlSmpS/BGHg^ (Ala) taip pat buvo tikrinama, skeliant restriktaze HaelII, norint įsitikinti, kad yra Ala kodonas po transliacijos pradžios signalo (metionino kodono ATG), nes įvedus Ala kodoną, gaunama papildoma HaelII skėlimo sritis. Alanino kodono prisijungimo išeiga prie DNR sekos, koduojančios jAH(L), yra apytikriai 2%.
[0102] Šiuo atveju taip pat buvo naudojama kryptinga mutage-nezė, norint prijungti alanino kodoną prie DNR sekos, koduojančios kAH(F), pagal metodiką, aprašytą Siburg ir kt. DNR, (1983), 2 (1), p. 37-45. Mutagenezė, pagal diagramą, pateiktą Fig. 8, buvo atliekama sekančiai: DNR seka, koduojanti kAH(F), kurios ilgis 590 bazių po-rų, esanti plazmidėje pPGHex_j, buvo išskiriama restrik-tazėmis EcoRI ir HindlII, kurios skelia plazmidę 5'-3'
[0103] galuose, tai parodyta Fig. 7. Perkirpta plazmidė pPGHg^ buvo sumaišoma su RF DNR M13mp9 po skėlimo EcoRI ir HindlII, bet iš anksto paveikta šarmine fosfataze iš jaučio žarnyno tam, kad išvengti pakartotino M13mp9 ligavimosi. Po to i, ši, mišinį buvo pridedama DNR liga-zė T4. Esant lipniems galams fago RF DNR sekoje ir DNR sekoje, koduojančioje kAH(F), kurios gaunamos, panaudojant dvi skirtingas restriktazes, kAH(F) DNR seka ga-li būti selektyviai įterpta į fago RF DNR ir gali būti įterpiama teisinga 5'-3' orientacija, tai pavaizduota
[0104] Fig. 7. Po to buvo atliekama E. coli JM101 transformacija tokiu pat būdu, kaip ir aprašytu aukščiau MlSmpS/BGH^.j atveju, gaunamame rekombinantiniame vektoriuje MlSmpS/PGHgj;.! yra DNR seka, koduojanti jAH (F) . Po to transformuotos E. coli JM101 ląstelės buvo auginamos lxYT terpėje, kurioje buvo chomogeninės medžia-gos, ir atranka buvo atliekama pagal bespalvių dėmių susidarymą, tai aprašyta aukščiau. DNR sekos, koduo-jančios kAH(F), įterpimas buvo patikrinamas sekančiai. Buvo atrenkamos bespalvės dėmės, o RF DNR iš M13mp8/PGHex_1, išskirta pagal aprašytą aukščiau būdą, buvo skaldoma restriktazėmis EcoRI ir HindlII ir, analizuojant elektroforezės agarozėje pagalba, buvo gaunamas 590 bazių porų dydžio fragmentas, kuriame buvo įterpta kAH(F) DNR seka. Po to fagas M13mp8/PGHex_1 buvo padauginamas naudojant E. coli JM101, o fago ssDNR buvo išskiriama pagal aprašytą aukščiau būdą.
[0105] DNR iš MlSmpS/PGHeję.-į buvo naudojama matrica kryptingai mutagenezei, tai pavaizduota Fig. 8, mutagenezė buvo atliekama taip pat kaip ir konstruojant seką, ko-duojančią jAH(A, L), panaudojant specialų pradmenį (žiūr. Lentelę 1, kuri pateikiama žemiau). Alanino kodono, šiuo atveju GCC, prijungimo prie DNR sekos, koduojan-čios kAH(A), tikimybė yra apie 12%. Gauta seka, koduojanti kAH(A), buvo analizuojama sekvenuojant.
[0106] Šis pavyzdys tai ekspresijos vektorių, kurių pagalba pasiekiama tiesioginė heterologinių polipeptidų, kurių N gale yra alaninas, produkcija bakterijose, konstravimo ir ekspresijos iliustracija. Gaunami trys polipeptidai, somatotropinų formos jAH(A, L), jAH(A, V) ir kAH(A). Šis pavyzdys yra jAH(V) konstravimo ir ekspresijos ir jAH(L) konstravimo ir ekspresijos iliustracija. Gaunami polipeptidai, atitinkamai, yra Met-jAH(V) ir Met-jAH(L) .
[0107]
[0108] A. jAH( A, L), jAH ( A, V), jAH( L) ir jAH ( V) ekspresija
[0109] DNR sekos, koduojančios jAH(A, L), jAH(A, V) ir jAH(V), kurios yra rekombinantiniuose vektoriuose M13mp8/BGHex_1 /Ala/, M13mp8/BGHg*.} /Ala, Vai/ ir M13mp8/BGHex_j /Vai/, atitinkamai, buvo panaudotos pakeičiant DNR seką, ko-duojančią jAH(L), kuri yra ekspresijos plazmidėje pBGHg^ (žiūr. Fig. 5 ir 6) . Tai buvo atliekama skeliant RF DNR iš M13 restriktaze Xbal. Ekspresijos plaz-midė pBGHex_1 taip pat buvo skeliama restriktaze Xbal, po to paveikiama šarmine fosfataze iš jaučio žarnyno, norint išvengti pakartotinio ligavimosi. Kiekviena perskelta RF DNR atskirai buvo sumaišoma su perskelta plazmidės pBGH^.j DNR ir buvo atliekamas ligavimas pagal aukščiau aprašytą metodiką, per nakti, 14°C tempe-ratūroje. Gautuose rekombinantiniuose ekspresijos vektoriuose, žymimuose pMON3209, pMON3215 ir pMON3214, yra DNR sekos, koduojančios jAH(A, L), jAH(A, V) ir jAH (V) , atitinkamai. Po to buvo transformuojamos E. coli W3110 ląstelės ligavimo mišiniu, kuriame buvo arba pMON3209, arba pMON3215, arba pMON3214, arba pBGHex_!, po transformacijos bakterijos buvo auginamos Lauria buljone (LB), kuriame buvo 1% (m/t) triptono, 0.5% (m/t) mielių ekstrakto ir 0.5% (m/t) NaCl ir 12.5 ng/ml tetraciklino ir 200 (ig/ml ampicilino. E. coli W3110 kamieno, kuriame yra pMON32Ū9, deponavimo kodas yra ATTC 53024, E. coli W3110 kamieno, kuriame yra pMON3215, deponavimo kodas yra ATTC 53022. Ląstelių transformacija trumpai gali būti aprašoma sekančiai: E. coli W3110 kultūra buvo auginama apie 50 ml LB terpės iki OD€OŪ=0.60. Po to ląstelės surenkamos ir suspenduojamos 10 ml buferinio tirpalo A:25 mM TRIS, pH 7.6 ir 10 mM NaCl . Suspensija centrifūguojama, ląstelės vėl suspenduojamos 1 ml buferinio tirpalo A X kuri, buvo pridedama 14 ml buferinio tirpalo B:25 mM TRIS, pH 7.6, 10 mM NaCl, 50 mM CaCl2 ir ląstelių suspensija buvo išlaikoma lede 30 minučių. Po to ląstelės buvo nucentrifūguojamos ir suspenduojamos 3 ml buferinio tirpalo B. 0.2 ml ląstelių su-spensijos buvo sumaišoma su 0.1 ml buferinio tirpalo B ir su 0.1-0.5 fxg tikslinio ekspresijos vektoriumi (pMC>N3209, pMON 3215, pMON3214 arba su pBGH^) ir iš-laikomos lede 60 minučių. Mišinys per 1 minutę buvo pašildomas iki 37°C temperatūros ir pridedama 3 ml LB terpės; gautas mišinys buvo inkubuojamas 60 minučių 37°C temperatūroje. Po inkubacijos ląstelės buvo nu-centrifūguojamos ir vėl suspenduojamos 300 ml LB terpės ir auginamos lėkštelėse su LB, pridėjus antibiotikus, kaip aprašyta aukščiau. Buvo atrenkamos atsparios antibiotikams bakterijų kolonijos ir iš ekspresijos vek-torių pMON3209, pMON3215, pBGHex_1 ir pMON3214 buvo iš-skiriama DNR pagal metodą, aprašytą knygoje "Molekulinis klonavimas: Laboratorinis vadovas", Maniatis, Fritsch, Sambrook (red.), (1982). DNR iš pMON3209, pMON3215, pMON3214 ir pBGHex_1 buvo patikrinama ar yra 590 bazių porų Xbal fragmentas ir 200 bazių porų HindlI/SmaI fragmentas, jei šie fragmentai yra, tai DNR seka, koduojanti jAH(A, L), jAH(V) ir jAH(A, V), yra teisingai orientuota. Plazmidės pMON3209 ir pMON3215 buvo analizuojamos, skaldant restriktaze HaelII, norint įsitikinti, kad yra nauja HaelII skėlimo sritis, kuri susidaro prijungus kodoną GCC (alanino) . Pagaliau, buvo dalinai analizuojama, pagal pateiktą aukščiau aprašymą, Xbal fragmento, kurio ilgis 590 bazių porų, iš vektorių pMON3209, pMON3214 ir pMON3215, seka tam, kad patvirtinti, kad yra ekspresijos vektoriuose DNR sekos, ko-duojančios jAH(A, L), jAH(V) ir jAH(A, V).
[0110] Kiekviena E. coli W3110 kolonija, kuriose buvo vektoriai pMON3209, pMON3214, pBGHex_1 ir pMON3215, buvo persėjamos atskirai į 5 ml LB, kurioje buvo 12.5 Įig/ml tetraciklino, ir buvo auginamos aeruojant per nakti 37°C temperatūroje. Po išauginimo kiekvienos kultūros 0.5 ml buvo persėjami atskirai i, 250 ml mikrobangines kolbas po 25 ml M9 terpės, jos sudėtis: (litrui terpės) 100 ml 10x druskų mišinio tirpalas [ 70 g Na2HP04, 30 g KH2P04, 5 g NaCl, 10 g NH4C1 iki bendro 100 ml tūrio] , 1.2 ml 1M MgS04 tirpalo, 0.25 ml 0.1% vitamino Bx, 12.5 ml 20% (m/t) gliukozės tirpalo, 0.025 ml 1M CaCl2 tirpalo, ši terpė buvo papildoma 0.5% (m/t) casamino rūgštimis ir 6.25 Įig/ml tetraciklinu. Kiekviena kultūra buvo auginama aeruojant 37°C temperatūroje tol, kol OD600 (optinis tankis 600 nm ilgio bangoje) pasiekdavo 1.0. Iš kiekvienos kolbos buvo paimama 0.2 ml kultūrinio skysčio ir ląstelės lizuojamos buferiniame tirpale su natrio dodecilsulfatu (SDS) ir lizatas buvo ana-lizuojamas SDS PAGE (elektroforezė denatūruojančiomis sąlygomis) pagal metodiką, aprašytą Lemli, Nature
[0111] (1970), t. 227, p. 680-685. Elektroforegramoj e visų E. coli W3110 ląstelių lizatuose buvo matomi dominuojantys baltymai, kurių molekulinė masė 22 000 D. Šie dominuojantys 22 000 D baltymai rišosi su antikūnais F 11-A1-86 (žiūr. Krivy ir Royold, Hibridoma, (1984), t. 3, p. 252-262), kurie yra prieš jaučio hipofizio somato-tropiną, analizuojant Western Blot (žiūr. Krivy ir Royold, Hibridoma, (1984), t. 3, p. 252-262), tai pa-tvirtina, kad gauti polipeptidai yra tokie pat, kaip ir hipofizinis somatotropinas. Kontrolinės E. coli W3110 kultūros ląstelės, kuriose yra tik tėvinė plazmidė pBR322, neprodukavo 22 000 D baltymų, kurie susirištų su antikūnais prieš somatotropiną.
[0112] Bakterijos, kuriose buvo ekspresijos plazmidės pMDN3209, pMON3214, pBGHex_1 ir pMON3215, buvo saugomos sekančiai. Kiekviena E. coli W3110 kultūros kolonija, transfor-muota viena plazmide arba pMON3209, arba pMON3215, arba pMON3214, arba pBGHex_x buvo auginamos aeruojant per naktį 37°C temperatūroje 5 ml LB, pridėjus 12.5 |ig/ml tetraciklino. Kiekvienos išaugintos kultūros 1 ml buvo įpilamas i, atskiras kolbas, kuriose buvo 25 ml LB ir 12.5 Įig/ml tetraciklino, ląstelės buvo auginamos kol OD600 pasiekdavo 1.0. Ląstelės buvo surenkamos 5 minutes centrifūguojant 6 000 xg, esant 4°C temperatūrai. Ląstelės buvo atskirai suspenduojamos 12 ml IJ3, pri-dėjus 7.5% (m/t) DMSO ir greitai užšaldomos sausame le-de porcijomis po 1 ml. Ląstelės buvo saugomos skystame azote. Be to apie 10 mikrogramų išgrynintos plazmidės DNR buvo saugoma minus 80°C temperatūroje.
[0113] E. coli W3110 kultūra, kurioje yra pMON3213, buvo depo-nuota Amerikos mikroorganizmų muziejuje (ATCC), jos kodas - ATCC 53023. Sekos, koduojančios kAH(L), pakeitimas seka, koduojančia kAH(A), ekspresijos vektoriuje pBGHex_x* buvo patvirtintas išskiriant DNR pMON3213 ir skaldant ši, ekspresijos vektorių fermentais EcoRI ir HindlII, norint patikrinti, ar susidaro 590 bazių porų fragmentas, o skeliant restriktaze HaelII, turi būti gaunamas papildomas fragmentas, kuris susidaro DNR sekoje, koduojančioje kAH(A), papildomai įvedus alanino kodoną. Galutinis įrodymas, kad tikrai ekspresijos vektoriuje pMON3213 yra DNR seka, koduojanti kAH(A), buvo gaunamas dalinai nustatant 590 bazių porų EcoRI/HindlII fragmento nukleotidų seką, naudojant būdą, aprašytą aukščiau.
[0114] DNR sekos, koduojančios kAH(A), ekspresija ir kAH(A) produkcija E. coli W3110 kultūroje buvo atliekama taip pat kaip jAH(A, L) ir jAH(A, V) atveju, kuris yra aprašytas aukščiau. Taip pat buvo stebima dominuojančio 22000 D baltymo produkcija, analizuojant SDS PAGE, šis analizės metodas buvo aprašytas aukščiau.
[0115] E. coli W3110 ląstelės, transformuotos ekspresijos vektoriumi pMON3212, buvo saugomos taip pat, kaip buvo aprašyta aukščiau, jos buvo naudojamos gaunant didelius kAH(A) kiekius (fermentacijos buvo vykdomos nuo 10 iki 100 1) auginimas buvo atliekamas taip pat, kaip buvo aprašyta aukščiau. kAH(A) išeiga auginant 100 1 fermen-tatoriuje apytikriai buvo 1 g tikslinio baltymo 1 litre kultūrinio skysčio; tai buvo nustatyta, analizuojant radioimuninės analizės pagalba (Rozner ir kt. , J. Immunol. Methods, (1982), t. 52, p. 175-181.
[0116] Šis pavyzdys buvo atliktas, norint nustatyti heterolo-ginių baltymų jAH(A, L), jAH(A, V), Met-jAH(V), Met-jAH(L) ir kAH(A), produkuotų bakterijose, būdu, apra-šytu šio išradimo realizavimo pavyzdžiuose, kuris yra šio išradimo objektas, N baltymų galų aminorūgščių lie-kanų sekas.
[0117] Somatotropiniai polipeptidai, produkuojami E. coli ląs-telėse, buvo gryninami iš ištirpintų intarpinių kūne-lių, kuriuose buvo vienas iš baltymų arba jAH(A, L), arba jAH(A, V), arba Met-jAH(V), arba Met-jAH(L), arba kAH(A), panaudojant imunoafininę chromatografiją, šis gryninimo metodas aprašytas Krivy ir Rould, Hibridoma,
[0118] (1984), t. 3, p. 151-161. Visi trijų formų somatotropinai buvo išgryninami imunoafininės chromatografijos pagalba iki 95%; tai buvo nustatoma SDS PAGE, naudojant gradientini, poliakrilamido gėli, nuo 7.5 iki 15%, užne-šant 1 įxq išgryninto baltymo, tai buvo atliekama pagal Lemli, Nature (1970), t. 227, p. 680-685. Išgrynintų jAH formų baltymų koncentracija buvo nustatoma, naudojant aukšto efektyvumo skysčių chromatografiją. Baltymai, prieš nustatant aminorūgščių liekanų sekas N ga-le, išgryninti imunoafininės chromatografijos pagalba, buvo dializuojami prieš vandeni, ir po to buvo liofi-lizuoti. Prieš analizuojant N galų sekas, išgryninti baltymai buvo ištirpinami 50 mM amonio bikarbonato buferiniame tirpale su 0.1% (m/t) SDS (natrio dode-cilsulfato) ir dializuojami šiame buferiniame tirpale tam, kad pašalinti TRIS (tris-oksimetilaminometaną) ir gliciną. Po to N galo sekos buvo nustatomos, panaudojant Baltymų aminorūgščių liekanų sekų Analizatorių, modelis 470A, firma Applied Biosystems (firma Applied Biosystems, Inc., Foster Sity, Kalifornija), pagal me-todiką, aprašytą Chankapiller ir kt., (1983), Methods in Enzymology, t. 91, p. 399-413 ir Chankapiller ir kt., (1983), Methods in Enzymology, t. 91, p. 486-493.
[0119] Lentelėje 2 pateikiami jAH(A, L), jAH(A, V), Met-jAH(V), Met-jAH(L) ir kAH(A) kelių preparatų sekų analizės duomenys. Baltymo, kurio N gale yra metioninas, kiekis lentelėje 2 pateikiamas procentais nuo bendro somatotropino kiekio bandinyje. Metionino nustatymui buvo naudojami du metodai. Naudojant netiesiogini, metodą, NH2-Met-Ala-Phe-... kiekis dominuojančioje populiacijo-je NH2-Ala-Phe-... buvo skaičiuojamas pagal lag-signalų skirtumą. Kadangi ši procedūra priklauso nuo "norma-lios" sekos lag įvertinimo, kuris kinta ciklas nuo cik-lo, tai šis metodas tinka tik grubiam NH2-Ala-Phe-... sekos įvertinimui. Tiesioginis metodas, kurio metu baltymas skaldomas Edmano reakcijos pagalba, paremtas PTH-Met signalų dydžių sulyginimu su PTH-Ala, atskyrus PTH-Met signalą nuo triukšmų, naudojant didelio efektyvumo skysčių chromatografiją (HPLC). "PTH" - pažymėta fenil-tiochidantoinas. Konkrečiai, Edmano degradacijos prin-cipas yra reaktyvo, kuris nuskelia N gale esančią ami-norūgšties liekaną, sąveika su šia aminorūgšties liekana, susidarant laisvam PTH ir aminorūgšties liekanos junginiui. Šio metodo pagalba galima gana tiksliai nustatyti seką Met-Ala-Phe-... tuo atveju, kai yra nežy-mus užterštumas laisva aminorūgštimi.
[0120] Iš duomenų, pateiktų lentelėje 2, kuri yra pateikiama žemiau, matome, kad metioninas nėra nuskeliamas, jei po jo seka fenilalaninas. Bet, virš 80% molekulių, kurios produkuojamos, naudojant genetines konstrukcijas MBS(A, L) ir MBS(A, V), N gale yra alaninas. Metionino, esančio baltymo gale, nuskėlimo laipsnis kinta įvairiose fer-mentacijose, bet visada yra didesnis, nei 80% nuo visų somatotropino molekulių. Somatotropinų, produkuojamų transformuotuose mikroorganizmuose, ekspresijos lygis buvo pasiektas 10-15% nuo bendro bakterijų baltymo kiekio.
[0121]
1. Kiaulės augimo hormono gavimo būdas, apimantis kDNR, koduojančios kiaulės augimo hormoną, gavimą, kDNR įter-pimą i, bakterinę plazmidę, Escherichia coli kamienų transformaciją gauta rekombinantine plazmide, klonų, kuriuose yra rekombinantinės plazmidės, atranką ir kDNR iš šių plazmidžių įterpimą i, ekspresijos vektorių, po to sekančą Escherichia coli kamienų transformaciją gauta rekombinantine plazmide, transformuotų kamienų at-ranką, kultivuojant terpėje, galutinio produkto išsky-rimą ir gryninimą, besiskiriantis tuo, kad siekiant gauti kiaulės augimo hormoną, kurio N-gale yra alaninas, į kDNR fragmentą, išskirtą iš rekombinantinės plazmidės pPGHgj^, vietoje DNR sekos, koduojančios kAH(F), įterpia alanino kodoną prie pat vieno arba ke-lių, esančių greta, ATG kodonų.
2. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad kiaulės augimo hormonas yra kAH(A).
3. Heterologinio polipeptido, kurio N gale yra alaninas, gavimo bakterijose būdas, besiskiriantis tuo, kad vykdo genominės DNR ekspresiją pasi-rinktose bakterijose, paminėtoje DNR aukščiau minėto polipeptido kodonai yra iškart po vieno - trijų, greta esančių, metionino kodonų, ir išskiria sintetinamą mi-nėtų bakterijų viduje polipeptidą, kurio N gale yra alaninas.
4. Būdas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad ne mažiau 80 % (pagal svorį) susintetinto aukščiau minėtoje bakterijoje po aukščiau minėtos DNR ekspresijos polipeptido sudaro polipeptidas, kurio N gale yra alaninas.
5. Būdas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad naudoja E. coli bakterijas.
6. Būdas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo,kad aukščiau minėto, gauto polipeptido amino rūgš-čių liekanų seka iš esmės yra tokia pat, kaip sutinkamo gamtoje eukariotinio polipeptido.
7 . Būdas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad eukariotinis polipeptidas turi somatotropini, aktyvumą.