[LT] Siūlomas transformuotos prokariotinės ląstelės recepientės, turinčios dvi ar daugiau DNR sekos kopijų, stabiliai besilaikančių jų chromosomoje. Minėta DNR seka turi geną, koduojantį norimą peptidą, ir sekos kopijos atskirtos endogeninėmis chromosominėmis DNR sekomis.Taip pat siūlomas minėtų transformuotų recepientinių kamienų paruošimo būdas. Minėti transformuoti recepientiniai kamienai pasižymi žymiai didesne norimo polipeptido produkcija negu žinomi polipeptidiniai kamienai, jau produkuojantys norimą peptidą. Pristatomas recepientinės ląstelės yra Bacillus novo species PB 92, produkuojančios aukšto šarmingumo proteolitinį fermentą ir Bacillus licheniformis T5, produkuojančios termostabilą alfa-amilazę, o taip pat išvardintų kamienų mutantai ir variantai. Pasiūlyti polipeptidai ir proteazė, koduojama geno, kilusio iš Bacillus PB92, ir alfa-amilazė, koduojama geno, kilusio iš Bacillus licheniformis T5 kamieno.
[EN]
[0001] Šio išradimo sritis priskiriama prokariotinėms ląste-lėms, kuriose gauta stabili geno amplifikaciją panaudojant ne mažiau dviejų tam tikros sekos DNR kopijų išsklaidytą netandeminį įterpimą i, aukščiau paminėtos prokariotinės ląstelės chromosomą.
[0002] Bacilos plačiai naudojamos pramoninių fermentų, tokių kaip alfa-amilazė, neutrali proteazė ir šarminė ar serino proteazės, gamybai (žr. Debado "Bacilų panaudojimas pramonėje" knygoje "Bacilų molekulinė biolo-gija", Acad. Press, New York, 1982) .
[0003] Bacillus fermentų gamybos tobulinimas galimas tiek panaudojant klasikinius genetinius būdus, tokius kaip mutacijos ir po jų sekanti selekcija, tiek ir šiuo-laikinius molekulinius-biologinius būdus. Paskelbta keletas homologinių ir heterologinių genų aukšto lygio ekspresijos tam tikruose prokariotiniuose ir eukario-tinDuose organizmuose pasiekimo būdų, tam tikslui panaudojant genetinę inžineriją.
[0004] Vienas iš geno aukšto lygio ekspresijos pasiekimo būdų yra geno papildymas efektyviomis reguliacinėmis sekomis. Kitas būdas, dažnai naudojamas derinyje su pir-muoju, yra reikiamo geno kopijų pagausinimas. Pirmiau-sia amplifikacija gaunama įterpiant daugiakopijinę ne-chromosominę DNR molekulę tokią kaip plazmidė. Tačiau norint panaudoti plazmides kaip vektorius genetinės informacijos ekspresijai ir amplifikacijai žymia kliū-timi yra jų nestabilumas. Amplifikuoto geno stabilumas yra būtina sąlyga norint išlaikyti ekspresijos produkto, kuri, koduoja amplif i kuotas genas, aukštą produkcijos lygį, kadangi ląstelės turi daugeli, kartų pasi-dalinti, kol susidarys pakankama biomasė, reikalinga norimo produkto didelei gamybai.
[0005] Yra dvi nestabilumo formos: segregacinis nestabilumas, kuomet plazmidė prarandama kultivavimo metu, ir struk-tūrinis nestabilumas, kuomet Įvyksta kai kurių plaz-midės rajonų delecija. Segregacinis nestabilumas gali pasireikšti, pavyzdžiui, tada, kuomet ląstelė-recipien-tė turi vektorių, nešanti, geną, pasižymintį stipria ekspresija. Apskritai, tokiu atveju pasireikš selekcinis spaudimas ląstelems, prarandančiom, sugebejimą superekspresuoti geną, kadangi superekspresi]a yra ne-pageidautina transformuotos ląstelės-recepientės savy-bė. Geno superekspresuotam produktui išeikvojama daug metabolines energijos, o tai neigiamai veikia ląstelės konkurentinį sugebėjimą (augimo greitis) palyginus su ląstelėmis-recipientėmis, kurioms tokia superekspresija nebūdinga.
[0006] Būdas, kuri panaudoja segregacinio nestabilumo išven-gimui, grindžiamas atranka ląstelių, turinčių daugiako-pijines plazmides, nešančias genus, suteikiančius plaz-midę turinčiai ląstelei pirmenybę, pavyzdžiui, atspa-rumą antibiotikui. Tuomet d, fermentinę terpę pridėjus atitinkamo antibiotiko, galima atrinkti šias atsparias ląsteles. Tačiau stambiamastės pramoninės gamybos pro-cesuose antibiotikai paprastai nėra naudingos atrankos priemonės, kadangi jie gali neigiamai veikti fermentini, procesą ar pati, produktą.
[0007] Kitas būdas, naudojamas plazmidės praradimo, kurį sąly-goja segregacinis nestabilumas, sumažinimui, grindžia-mas svarbaus ląstelei-recipientei funkciniu požiūriu geno įterpimui į vektorinę molekulę (Ferrari ir kt., Biotechnology, 3 (1985) 1003-1007). Tačiau šis metodas nelaiduoja vektoriaus struktūrinio stabilumo.
[0008] Būdai, naudojami struktūrinio plazmidės nestabilumo problemai išspręsti, grindžiami geno ekspresijos ekspo-nentinėje augimo fazėje išvengimui. Pavyzdžiui, tam tikslui panaudojamos reguliacinės sekos, tokios kaip temperatūrai jautrios reguliacinės sekos, o taip pat galima įterpti egzogeninę DNR į ląstelės-recipientės chromosomą. Kiti naudojami būdai grindžiami tuo, kad vengiama panaudoti autonomiškai besireplikuojančias vektorines molekules, o vietoje to naudojami būdai, palengvinantys įvestos DNR įsiterpimą į ląstelės-re-cipientės chromosomą.
[0009] Svetimos DNR įterpimo į ląstelės-recipientės chromosomą būdai grindžiami homologme rekombinacija ir netai-syklinga rekombinacija. Yra du DNR sekų įterpimo atitinkamą vietą chromosomoje būdai, panaudojant ho-mologinę rekombinaciją: Campbell tipo ir dviguba reciprokinė rekombinacija. Šie būdai parodyti atitinkamai Fig. 1A ir Fig. 1B. Trečias DNR sekų įterpimo į chromosomą būdas - tai būdas, naudojantis dviejų stadijų pakeitimo mechanizmą. Jis parodytas Fig. 1C. Iš esmės čia panaudojama Campbell tipo rekombinacija, tačiau jos galutiniu rezultatu yra chromosoma, ne-turinti duplikuotų sekų. Tuo pačiu metu chromosomos rekombinuotoje dalyje nėra amplifikuoto vieneto. Tokiu būdu šis procesas panašus į dvigubą reciprokinę re-kombinaciją .
[0010] Svetimos DNR įterpimui į chromosomą be homologinės rekombinacijos galima naudoti netaisyklingą rekombi-naciją. Integruotos vektorinės molekulės gali būti at-rinktos parenkant tokias sąlygas, kurios slopintų ne-integruotų vektorinių molekulių replikaciją. Netaisyklingos replikacijos panaudojimas įterpimui pavaizduotas Fig. 1D. Tai, kad gautuose chromosominiuose dariniuose nėra tandeminių duplikacijų, būdams, parodytiems Fig. 1B, C ir D, suteikia privalumą naudojant juos stabiliam DNR sekų įterpimui į genomą. Genai, įterpti chromosomą, gali būti tiek homologiniai, tiek ir he-terogeniniai genai. Įterptos į chromosomą DNR amplifikacija vykdoma tandemine tvarka. Skelbiama, kad šie chromosomoje amplifikuoti genai yra nestabilūs, nors kartais pasitaiko darbų, rodančių šių genų stabilumą. Tokiu būdu, pageidautina surasti metodus, kurių pagalba DNR, įterpta į chromosomą, liktų stabili.
[0011] Egzogeninės DNR įterpimas d, Bacillus subtilis chro-mosomą homologinės rekombinacijos būdu aprašytas Duncan ir kt. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7 5 (1978) 3664-3668, o į Anacystis hidulans - Williams ir Szalay, Gene, 24,
[0012] (1983) 37-51 ir Tarptautinėje patento paraiškoje W0084/0G381. Paraiškoje EP-A-0127328 aprašytas hetero-loginio geno, negalinčio stabiliai išsilaikyti plaz-midinio vektoriaus sąstate, įterpimas į mikroorganizmo chromosomą panaudojant homologinę rekombinaciją.
[0013] Paskelbti duomenys apie tiek homologinių, tiek hete-rologinių genų, įterptų į chromosomą, amplifikaciją. Žr., pavyzdžiui: Saito ir kt. Ketvirto tarptautinio simpoziumo pramoninių mikroorganizmų klausimais medžiaga, Kioto, Japonija, 1982, p.125-130; Youny, J. Gen. Microbiol., 130 (1984) 1613-1621; Jeanniere ir kt. Gene 4_0, (1985) 47-56; Surgent ir Benett, J. Bacteriol. 161, (1985) 589-595; Gutterson ir Koshland, Proc. Natl. Acad, Sci, USA, 80, (1983), 4894-4898; Hashiguchi ir kt. , Agric. Biol. Chem. 4J3, (1985) 545-550; Wilson ir Morgan, J. Bacteriol. 163, (1985), 445-453; prancūzų patentinė paraiška Nr. 84.06701; ir EP-A-0134048.
[0014] Taip pat aprašyta spontaninė amplifikacij a prokanoti-nėse ląstelėse. Žr., pavyzdžiui, apžvalgą Anderson ir Roth, Ann. Rev. Microbiol. 31, (1977) 473-505.
[0015] Visais aukščiau aprašytais atvejais į chromosomą įterp-tos DNR amplifikacija vykdyta tandemine seka. Skelbiama, kad šio tipo chromosominė sekos amplifikacij a yra nestabili, nors kai kuriais atvejais -stebėtas žymiai didesnis stabilumas negu aprašyta Janniere ir kt., Gene, 4_0, (1985), 47-55.
[0016] Yra duomenų apie gamtinių amplifikuotų prokariotinių genų stabilizaciją, kuri atsiranda dėl svarbių genų, esančių tarp šių amplifikuotų sekų. Pavyzdžiui, B. subtilis esantys du tandemiškai išsidėstę ribosominės RNR geno 9-10 kopijų rinkiniai yra atskirti tRNR genų klasteriu (Waumausen ir Hansen, J. Biol. Chem. 258,
[0017] (1983), 291-298. Kitais atvejais tiek E. coli, tiek B. subtilis sutinkami gamtiniai tandemiškai pasikarto-jantys ribosominės RNR operonai buvo deletuoti, ir tai turėjo nedidelę įtaką organizmo fenotipiniams ypa-tumams: atitinkamai Elwood ir Momura, J. Bacteriol. 14. 3, (1 980), 1077-1080 ir Houghney ir kt. J. Bacteriol. 1_5_4, (1983) 525-532.
[0018] Hofemeister ir., Mol . Gen. Genet. 18 9 (1983) 58-63 ir Prozorov ir kt. Gene 34, (1985), 39-46 aprašė plazmidės įterpimą i, B. subtilis chromosomą tam tikslui panaudojant netaisyklingą rekombinaciją.
[0019] Sėkmingai klonuoti keletas bacilų ekstraląstelinių fer-mentų genų, tokių kaip alfa-amilazės genai, išskirti iš B. amyloliguefaciens (Pulva ir kt. Gene, 15, (1981), 43-51), iš B. licheniformis (Ortlepp, Gene 23 (1983), 267), iš B. stearothermophilus (Mielenz ir kt. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, (1983), 5975-5979; EP-A-0057976) ir iš B. subtilis (Yang ir kt. Nucleic Acids REs. 1A, (1983), 237); levansukrazės genas, išskirtas iš B. subtilis (Gay ir kt. , J. Bacteriol. 153, (1983), 1424); genai, koduojantys neutralią proteazę, išskirti iš B. stearothermophilus (Fuji ir kt. J. Bacteriol., 156, (1983), 831), iš B. amyloliguefaciens (Honjo ir kt. , J. Biotech., 1, (1984), 165) ir iš B. subtilis
[0020] (Yang ir k t., J. Bacteriol. , 160, (1984), 115); genai, koduojantys serininę ar šarminę proteazę, išs.kirti iš B. subtilis (Wong ir kt. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, (1984), 1184), iš B. licheniformis (Jacobs ir kt. Nucleic Acids Res., _1_3, (1985), 8913) ir iš B. amyloliguefaciens (Wells ir kt., Nucleic Acids Res. 11,
[0021] (1983), 7911).
[0022] Paskelbti duomenys apie kai kurių gramteigiamų mikro-organizmų protoplastų transformaciją. Chang ir Cohen (Mol. Gen. Genet. 168, (1979), 111-115) aprašė B. subtilis protoplasto transformaciją, kuri šiuo metu plačiai naudojama. Aprašytas panašus sėkmingas B. megaterium protoplasto transformacijos būdas (Vorobjovą ir kt. , FEMS Microbiol. Letters, 1_, (1980), 261-263), B. amylcliguefaciensis (Fisher ir kt., Arch. Microbiol. 139, (1981), 213-217), B. sphaericus (McDonald, J. Gen. Microbiol., 130, (1984), 203), ir B. larvae (Bachiet ir kt. , Appl . and Env. Microbiol. 4_9, (1985), 577) . Toje pačioje publikacijoje pranešta apie neigiamus rezultatus, gautus dirbant su B. papillae. Šis būdas buvo sėkmingas taikant ji, B. polymyxa, B. lichenif ormis, B. macerans, B. laterosporus, tačiau nedavė teigiamų re-zultatų B. coagulans, B. cereus ir B. pumilus atvejais, nors ir buvo stebimas geras protoplastų susidarymas (Mann ir kt. , Current Microbiol. 1_3, (1986), 131-135).
[0023] Kiti DNR įterpimo i, protoplastus būdai grindžiami suliejimu su liposomomis, turinčiomis DNR (Holubova, Folia Microbiol. 3_0, (1985), 97), arba protoplasto suliejimu su lengvai transformuojamu organizmu kaip tarpine ląs-tele-recipiente (EP-A-0134048).
[0024] Siūlomos prokariotinės ląstelės-recipientės ir jų pa-ruošimo būdai, kurių pagrindą sudaro DNR sekos, koduo-jančios norimą peptidą, ne mažiau dviejų kopijų stabilus įterpimas i, ląstelės-recipientės chromosomą. Svetimos DNR sekos stabilus išlaikymas pasiekiamas Įter-piant 1 ląstelės-recipientės chromosomą dvi ir daugiau sekos kopijas, kurios tarpusavyje atskiriamos endoge-ninės chromosominės DNR sekomis.
[0025] Fig. 1A-D schematiškai pavaizduoti keturi nechromoso-minės DNR sekų įterpimo i, prokariotinių organizmų chro-mosomą būdai.
[0026] T - seka-taikinys, tai yra chromosomoje ir plazmidėje esančios DNR sekos, tarp kurių gali vykti homologinė rekombinacij a.
[0027] M - rekombinantinio kamieno atrankai naudojamo markerinio geno seka. Fig. 2A ir 2B schematiškai pavaizduoti du geno stabi-lios amplifikacijos prokariotinėj e chromosomoje gavimo būdai. Fig. 3 parodyti histidin/MOPS gel-elektroforezės rezultatai, gauti tiriant B. subtilis DB104, turinčios pnBUO arba pM58, kultūros supernatantą ir lyginant su kai kuriais subtilizinais:
[0028] 2 takelis: Bacillus PB92 proteazė
[0029] Fig. 4 pavaizduota plazmidės pM58 restrikcinė karto-grama. Be to, paveikslėlio viršutinėje dalyje parodyta sekvenavimo strategija. Ištisinės linijos su strėlė-mis - tai fragmentai, klonuoti fago M13 vektoriuose mp 10, mp 11 ir mp 18. Apatinėje paveikslėlio dalyje pavaizduota sekvenavimo strategija, panaudojant dešimt oligonukleotidų, išdėstytų proteazės gene vienodais tarpais. Fig. 5 pavaizduota koduojančios grandinės nukleotidinė seka, atitinkanti Bacillus PB92 serininės proteazės aminorūgščių seką. Taip pat parodyti promotoriai (PI, P2) , ribosomų surišimo saitas (rbs) ir DNR sekos terminacijos rajonai (term). Sunumeruotos ištisinės linijos nurodo sekvenavimui naudotų dešimties oligonukleo-tidų išsidėstymo vietą. Fig. 6A pavaizduotas plazmidės pE194-neo konstravimas. Fig. 6B pavaizduotas plazmidės pMAX-4 konstravimas. Fig. 7A pavaizduotas radioautografas, gautas atlikus sekanti, tyrimą: kamienų PB92, PBT109 ir PBT108 chromosominės DNR skal-domos Hind 111, po elektroforezės 0,5 % agarozės gelyje produktai pernešami ant nitroceliuliozės ir hibridinami pagal Southern su nik-transliacija 32P pažymėta pM58
[0030] DNR.
[0031] Fig. 7B ir 7C parodoma integracija, gauta panaudojant homologinę (B) rekombinaciją ir netaisyklingą (C) re-kombinaciją tarp pMAX-4 ir Bacillus PB92 chromosomos. Fig. 8 parodytas integracinio vektoriaus pElatB konstravimas. Fig. 9A iliustruoja plazmidės pElatB įterpimą į B. licheniformis kamieno T9 chromosomą, tuo būdu gaunant B. licheniformis kamieną TB13. Fig. 9B iliustruoja B. licheniformis kamienų TB13 ir T5B rekombinaciją, suliejant šių kamienų protoplastus ir po to gaunant B. licheniformis kamieną T13F. Fig. 10 parodoma devynių skirtingų kolonijų, gautų po kamieno T13 poveikio fermentais, aprašyto 11 pavyzdyje, chromosominė analizė. Išskirta chromosominė DNR vei-kiama Eco Rl, elektroforetiškai frakcionuojama 0,8 % agarozės gelyje ir pernešama ant nitroceliuliozės. Po to hibridinama su nik-transliacij a 32P pažymėta pEiatB DNR. Piešinyje - radioautografas. Viršutinė strėle rodo poziciją, i kurią migruoja 15000 bazių porų ilgio Eco Rl DNR fragmentas, turintis pilną pElatB seką, kuri buvo įterpta i, chromosomą dalyje, nesančioje šalia pra-dinio alfa-amilazės geno, priešingai tam, kaip tai buvo padaryta kamieno TB13 atveju, kuris pavaizduotas Fig. 9A. Apatinė strėlė rodo poziciją, i, kurią migruoja 33000 bazių porų ilgio Eco Rl DNR fragmentas, turintis visą alfa-amilazės geną, iš pradžių buvusį B. licheniformis T5 kamiene (žr. taip pat Fig. 9B) . Analizuoti sekantys DNR pavyzdžiai:
[0032] 4 takelis: DNR, išskirta iš neomicinui jautraus Bacillus licheniformis kamieno T390, paveikto fermentais, kaip tai aprašyta 12 pavyzdyje.
[0033] 6-14 takeliai: 9 skirtingų kolonijų, išskirtų iš kamieno T13F paveikus fermentais, kaip tai aprašyta 12 pavyzdyje, DNR.
[0034] Šis išradimas siūlo prokariotines ląsteles, jų paruo-šimo būdus, pagal kuriuos dvi ar daugiau DNR sekų ko-pijų stabiliai įterpiamos į chromosomą. Ląstelė-reci-pientė, i, kurią įterpiama DNR seka, koduojanti norimą polipeptidą, yra transformuojama panaudojant DNR konst-rukciją, turinčią aukščiau paminėtą DNR seką. Po to atrenkamos transformuotos ląstelės, kuriose įterptos DNR sekos atskirtos endogeninėmis chromosominėmis sekomis.
[0035] Paprastai endogeninės tarpinės sekos yra svarbios ląs-telei-recipientei. Amplifikuotų sekų praradimas dėl ho-mologinės rekombinacijos bus letališkas ląstelei-recipientei. Tokiu būdu pasireikš selekcinis spaudimas ląs-telėms, turinčioms amplifikuotas sekas, ir nereikės naudoti antibiotikų ar kitų panašių atrankos priemonių. Įterpti galima panaudojant homologinę rekombinaciją ar-ba netaisyklingą rekombinaciją. Fig. 2A ir 2B pavaizduoti būdai, kuriuos galima panaudoti norimų ląs-telių gavimui.
[0036] Naudojant homologinę rekombinaciją, vektorinėse mole-kulėse gali būti tarpai, homologiški ląstelės-recipien-tės chromosomai, ypač jeigu viena ar daugiau amplifikuoto geno kopijų jau įterpta į ląstelę-recipientę. Tokiu būdu, vektorinė molekulė gali turėti savo su-detyje norimą DNR seką, seką-DNR taikinį ir marketinę DNR seką.
[0037] Reikia atkreipti dėmėsi, i, tai, kad atrenkamos tik norimos rekombinantinės chromosominės struktūros. Tai pa-siekiama naudojant rekombinacijai linijines DNR molekules. Žiedinė vektorinė molekulė, kurią reikia įterp-ti, skaidoma restr ikcimais fermentais homologijos su seka-taikmiu srityje, tokiu būdu rekombinacija ir įterpimas vyks pasirinktinai šioje specifinėje vietoje. Be to, kai norima DNR seka yra vektorinėje molekulėje, ji taip pat gali būti ir ląstelės-recipientės chromosomoje. DNR seka gali būti ląstelei-recipientei en-dogeninė arba gali būti įterpta į recipientės chro-mosomą pradinėje transformacijos stadijoje.
[0038] Sekas-taikinius netandeminei genų amplifikacij ai geriau parinkti iš nereikšmingų genų tarpo. Pavyzdžiui, kai recipientiniai organizmai yra Bacilli, tuo atveju sekomis-taikiniais galima panaudoti genus, koduojančius ekstra ląstelinius fermentus arba sporuliacijos genus. Kaip taisyklė, DNR sekų įterpimas į šiuos genus iššauks pastarųjų inaktyvaciją. Geno ekspresijos netekimas gali būti patikrintas ir panaudotas norimų rekombinantinių kamienų atrankai.
[0039] Chromosominio geno amplifikacijai naudojant netaisyk-lingą rekombinaciją, kaip tai parodyta Fig. 1D ir 2A, geriau parinkti tokias įterpimo ir atrankos sąlygas, kuriose homologinė rekombinacija neviršija netaisyklingos rekombinacijos. Homologinės rekombinacijos galima išvengti transformuojant pirmą ir antrą ląsteles-recipientes, neturinčias norimo struktūrinio geno. Tam tikslui panaudojamas vektorius, turintis DNR seką, ko-duojančią norimą polipeptidą ir markerinį geną. Po to pirmoji ir antroji ląstelės-recipientės, kuriose DNR seka yra skirtingose chromosomos vietose, gali būti at-rinktos ir sujungtos suliejant. Tokiu būdu gaunama transformuota ląstelė, turinti ne mažiau dviejų DNR sekų, koduojančių norimą struktūrini, geną, išdėstytą skirtingose antrosios ląstelės recipientės genomo vietose. Norint palengvinti atranką, pirmoji ląstelė-re-cipientė prieš suliejimą turi būti užmušta.
[0040] Interesuojantis genomas (kuriame yra norimi genai) gali būti iš prokariotines arba eukariotinės ląstelės. Šie genai gali būti: bakteriniai genai, vienaląsčių mikro-organizmų genai, žinduolių genai ir pan. Struktūrinius genus galima paruošti i,vairiais būdais, panaudojant ta-me tarpe sintezę, genominės DNR išskyrimą, cDNR pa-ruošimą arba jų rekombinaciją. Įvairūs manipuliacijų su genais būdai gerai žinomi. Tai: restrikcija, iškirpi-mas, ligavimas, mutagenezė in vitro, pirminė repara-cija, linkerių ir adapterių panaudojimas ir pan. Tokiu būdu gautos DNR sekos gali būti apdorotos įvairiais bū-dais, parinktais pagal DNR konstrukciją (Maniatis ir kt., "Molekulinis klonavimas", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982).
[0041] Struktūriniai genai gali ekspresuoti daugeli, polipep-tidų ir baltymų, tokių kaip fermentai, hormonai, lim-fokinai, paviršiaus baltymai, kraujo baltymai, staty-biniai baltymai, imunoglobulinai ir pan., priklausančių žinduoliams, vienaląsčiams mikroorganizmams, pvz., gry-bų bakterijoms tokioms kaip mielės, hifiniai grybai, jūrų dumbliai, pirmuonys ir 1.1., o taip pat jie gali būti augalinės bei kitokios kilmės. Ypatingo dėmesio susilaukia fermentai, tame tarpe proteazės ir amilazės. Tokių fermentų pavyzdžiu gali būti serininės ir neseri-ninės proteazės. Pastarųjų tarpe - labai šarmingos se-rininės proteazės, alfa- ir beta-amilazės ir pan. Se-rininių proteazių geras šaltinis yra Bacillus novo species PB92, o alfa-amilazės- T5 B. licheniformis, bei šių kamienų variantai ir mutantai.
[0042] Geną kaip sudėtinę atitinkamo vektoriaus dali, galima gauti Įvairiais žinomais šiuolaikiniais būdais. Paprastai, iš organizmo, ekspresuojančio labai šarmingą proteazę, paruošiama genominė biblioteka. Pastarąją patogu paruošti liguojant donorinio kamieno DNR fragmentus prie tinkamo vektoriaus.
[0043] Terminu "Tinkamas vektorius" Įvardinamas DNR darinys (konstrukcija), savo sudėtyje turintis struktūrini, ge-ną, koduojantį norimą baltymą arba polipeptidą. Struk-tūrinis genas sujungiamas teisingai orientuojant su kontroliniais rajonais, tokiais kaip promotorinė seka, seka, formuojanti ribosomų surišimo sritį ir sekos, kontroliuojančios struktūrinio geno transliacijos ir transkripcijos terminaciją, t.y. su tokiais kontro-liuojančiais rajonais, kurie funkcionuoja recipien-tinėje ląstelėje.
[0044] Kuomet ląstelė-recipientė pasižymi per žemu transformacijos ir integracijos dažniu, kaip tai būna, pvz. , pramoninių Bacillus kamienų atveju, tam, kad būtų iš-spręstas tiesioginės įterpimo atrankos klausimas, ne-naudojant tarpinio ląstelių, turinčių plazmides, išsky-rimo, reikia i, vektorių papildomai įjungti replikacijos pradmens vienetą, sąlygojantį autonominę replikaciją ląstelėje-recipientėje.
[0045] Tuo atveju, kai genas gaunamas iš donorinės ląstelės, turinčios transkripcijos ir transliacijos, iniciacijos ir terminacijos reguliacinius signalus, kuriuos atpa-žįsta recipientiniai prokariotinių ląstelių kamienai, patogu išsaugoti struktūrinio geno pradines regulia-cines sekas. Be to, transkripcijos reguliacijos gali sąlygoti konstitucinę arba indukuojamą ekspresiją ir todėl, esant atitinkamai situacijai, recipientą galima kultivuoti iki didelio tankio, kol bus pasiektas tiks-linių struktūrinių genų aukštas ekspresijos lygis.
[0046] Tuo atveju, kai struktūriniai genai gauti iš šaltinio, kurio reguliacinių signalų ląstelė-recipientė. neatpa-žįsta, reikia turėti reguliacinius signalus, kuriuos atpažįsta recipientinė ląstelė. Struktūrinis genas turi būti įterptas tarp iniciacijos ir terminacijos regu-liacinių signalų. Kartais egzogeninį struktūrinį geną, turintį nuosavą stopkodoną (kodonus), galima įterpti skaitymo rėmelyje po išsaugojusio savo reguliacinius signalus endogeninio struktūrinio geno N-galinių ko-donų.
[0047] Pageidautina, kad ekspresijos produktas būtų sekretuojamas. Tai nesudėtinga realizuoti tuo atveju, kai ekspresijos produktas išsiskiria natūralia eiga ir reci-pientinė ląstelė atpažįsta lyderinius ir procesingo (brendimo) signalus. Tačiau tuo atveju, kai produktas neišskiriamas todėl, kad ląstelė-recipientė neatpažįsta sekrecijos lyderinių signalų ir/arba procesingo signalo (signalų), arba šie signalai nepakankamai veiklūs reci-pientėje, tuomet reikia išskirti arba susintetinti DNR sekas, koduojančias ląstelės-recipientės sekrecijos lyderinius ir polipeptido procesingo signalus ir pri-jungti jas taisyklingame skaitymo rėmelyje prie struk-tūrinio geno 5' galo.
[0048] Papildomai į vektorių galima įjungti markerinį geną, suteikiantį atsparumą antibiotikui, kuriam ląstelė recipiente yra jautri. Naudojant vektorių chromosominei integracijai, markerinis genas privalo atitikti išgyve-namumo atrankos galimybės reikalavimus, nežiūrint to, kad recipientėje bus tik viena ar keletas markerinio geno kopijų. Markeriniu genu laikomas struktūrinis genas, galintis ekspresuotis ląstelėje-recipientėj e ir sąlygojantis pastarosios išgyvenamumą selekcijos sąly-gomis. Tai gali būti fototrofiškumo suteikimas aukso-trofinei recipientei, atspariai biocidams arba viru-sams. Fototrofiškumo suteikimui gali būti panaudoti įvairūs genai, tokie kaip lui, his, trp ir pan. Mar-keriais gali tarnauti atsparumas sunkiesiems metalams, imunitetas ir pan. Įvairias DNR sekas galima gauti iš įvairių DNR šaltinių, sujungti jas kartu į vektorių, turinti, vieną ar daugiau patogų, pageidautina, unikalų restrikcijos saitą. Tai leidžia i, šiuos saitus įterpti arba pakeisti struktūrinius genus, arba juos įterpti į paprastų fragmentų vietą, tuo būdu konstruojant plaz-midinį darinį.
[0049] Plazmidę su replikacijos pradmens vienetu, turinčiu mutaciją, sąlygojančią šio geno veiklos recipientinėj e ląstelėje priklausomybę nuo temperatūros, galima panaudoti chromosominio įterpimo atrankai (Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 (1978) 1433).
[0050] Sukonstruotą plazmidinį darinį galima klonuoti tam tikslui panaudojant tinkamą klonavimo šeimininką. Galima panaudoti bet kokį šeimininką, kuris patogus, lengvai transformuojasi, leidžia plazmidiniui dariniui replikuotis. Po to pastarąjį darinį galima pernešti į ląstelę-recipientę. Yra daug kamienų, pasižyminčių aukštu transformacijos efektyvumu, auksotrofiškurnu ir/arba jautrumu antibiotikui. Kuomet ląstele-recipiente parenkamas Bacillus pramoninis kamienas, jis turi daug privalumų, tame tarpe ir klonuojant plazmidinį darinį. Jis leidžia panaudoti vieną replikacinę sis-temą, o taip pat vieną ir tą patį markerį išgyvenamumo atrankai tiek klonavimo šeimininke, tiek ir recipien-tiniame kamiene (Europos patentas EP-A-134048).
[0051] Plazmidinį darinį galima įterpti į klonavimo šeiminin-ką, panaudojant patogius būdus, tokius kaip: transformacija, DNR kalcio precipitacij a, konjugacija ir pan. Po to klonavimo šeimininką galima išauginti tinkamoje maitinimo terpėje selekcijos sąlygomis, leidžiančiomis atrinkti šeimininką, turintį plazmidinį darinį. Auksotrofiniams šeimininkams naudojama maitinimo terpė, stokojanti būtinos maitinimo medžiagos. Tuo tarpu bio-cidiniam atsparumui, pvz., atsparumui antibiotikams, patikrinti i, maitinimo terpę pridedami biocido (bio-cidų) citotoksiniai kiekiai.
[0052] Galima naudoti įvairias ląsteles-recipientes, tokias kaip E. coli, Bacillus, ypač Bacillus subtilis, Pseudomonas ir Streptomyces kamienus. Pasirenkant ląs-telę-recipientę atsižvelgiama i, įvairius faktorius, ta-me tarpe ir i, tokius, kurie gali turėti įtakos ampiifi-kuoto geno ekspresijai ir norimo produkto gamybai. Geriausia panaudoti ląstelę-recipientę, kurioje galimas reguliacinių signalų atpažinimas, sekrecijos paleng-vinimas, norimo produkto degradacijos sumažinimas ir 1.1. Tinkamiausia recipientinė ląstelė, kuri jau pro-dukuoja norimą polipeptidą ir gali būti arba laukinio tipo, arba mutantinio tipo organizmas. Recipiente taip pat gali būti organizmo, produkuojančio norimą polipep-tidą, mutantas, kuris liovėsi produkavęs. Kada norimu polipeptidu yra proteazė ar amilazė, tinkamiausi kamienai yra atitinkamai Bacillus novo species PB92 ir T5 Bacillus licheniformis, o taip pat šių kamienų mutantai ir variantai.
[0053] Be to, dar galima panaudoti ir pramoninius kamienus, pasižyminčius norimais privalumais. Kamienų, kuriuos galima panaudoti pavyzdžiais yra kamienai, naudojami pra-moninei fermentų gamybai, tokie kaip B. licheniformis, B. amyloliguefaciens ir bazofilinės bacilos. Pramoniniai kamienai atrenkami iš organizmų, kuriuos galima išskirti iš dirvos arba gauti iš bankų ar kitų šal-tinių, arba gaunami modifikuojant turimus kamienus. Pramoniniai kamienai labai našūs ir stabilūs. Dar daugiau, šie kamienai atsparūs faginei infekcijai ir gene-tiniams mainams, kuriems priklauso ir DNR įterpimas, panaudojant transformacijos būdus. Tinkami pramoniniai kamienai yra taip pat fototrofiški tam, kad nereiktų i, maitinimo terpę papildomas brangias aminorūgštis.
[0054] Kiti pramoninių kamienų ypatumai yra jų aukštas pro-duktyvumas, išsilaikantis iki fermentacijos, kuri gali tęstis net savaitę, pabaigos; stabili ląstelių koncent-racine iki buliiono išsekimo ir specifinio sekretuojamo baltymo aukštas produkcijos lygis (įprastas ne mažiau 5 g/l - 0.5 % (masė/tūris).
[0055] Galima gauti transformantus, turinčius arba tandemiškai išdėstytus genus, arba išsklaidytus išilgai chromosomos. Paprastai galima atrinkti transformantus, turin-čius išsklaidytus genus tam tikslui išskiriant iš abie-jų tipų transformantų mišinio chromosominę DNR iš kiek-vieno transformanto, po to analizuojant šią DNR ir nu-statant genų lokalizaciją, pvz., Southern, J. Mol. Biol. 9_8 (1975) 503-517, metodu ar kokiu kitu būdu.
[0056] Vengiant tandeminio įterpimo, transformantus su iš-sklaidytais genais galima gauti panaudojant DNR linijines konstrukcijas, turinčias DNR seką, kurią reikia amplif ikuoti, markerini, geną ir seką-taikinį rekombinacijai dvigubos reciprokinės rekombinacijos būdu kaip tai parodyta Fig. 1B ir 2B.
[0057] Dar daugiau, transformantus su išsklaidytais genais galima gauti panaudojant netaisyklingą rekombinaciją, pavaizduotą Fig. 2h. Jos metu galima išvengti tanaemi-nių transformantų, panaudojant atranką ir markerinio geno (pvz., koduojančio atsparumą antibiotikui) dife-rencinę ekspresiją, kuomet kamienų su netandeminiu ir tandeminiu geno įterpimu jautrumas antibiotikui skir-tingas. Dažniausiai įterptų endogeninių DNR sekų ilgis - mažiau 10.000 bazių porų.
[0058] Be to, vengiant tandeminės duplikacijos transformantus su išsklaidytais genais galima gauti protoplastus, gautus iš homologinio donorinio kamieno, turinčio DNR kons-trukciją, sudarytą iš struktūrinio geno ir markerinio geno, kurioje, palyginus su akceptoriniu kamienu, struktūrinis genas yra kitoje chromosomos vietoje.
[0059] Recipientinių ląstelių transformacijai geriausiai panaudoti protoplastus, paruoštus iš recipientinio kamieno. Protopiastai ruošiami iš ląstelių įprastiniais būdais, pvz., paveikiant lizocimu arba zimoliaze. Po to protopiastai atsargiai suspenduojami terpėje, kurios osmotiškumas tinkamas protoplastų išsilaikymui. Proto-plastų iš Bacillus pramoninių kamienų paruošimo būdai aprašyti EP-A-0134048, kuris čia pateikiamas kaip lite-ratūros šaltinis. Kuomet recipientinių kamienu parenkamas bazofilinis Bacillus kamienas, protopiastai gali būti paruošti esant šarminiam pH, geriau 8.0. Šis būdas aprašytas Europos patente Nr. EP-A-87200358.7.
[0060] Ląstelė recipiente transformuojama suliejant plazmidinį darini, arba klonavimo šeimininko protoplastą su ląste-lės-recepientės protoplastų tam tikslui panaudojant tinkamą suliejimo reagentą. Galima naudoti bet kuri, pakankamai aktyvų reagentą. Paprastai, polietilengli-kolis sąlygoja pakankamai efektyvų suliejimą: Po trumpo laikotarpio reakcijos mišinys pakeičiamas tinkama maitinimo terpe. Ląstelės regeneruoja selektyvioje terpėje išsėjus i, lėkšteles su agaru.
[0061] Transformantai, gauti suliejus ląstelę-recipientę su tinkama DNR konstrukcija, gali turėti šią visą konst-rukciją arba jos dalį kaip sriti,, įterptą i, chromosomą. Jei DNR konstrukcija turi replikacijos pradmens vie-netą, funkcionuojanti, recipiente j e, tuomet DNR konstrukcija ląstelėje bus laisvos vektorinės molekulės pa-vidalu .
[0062] Transformantų, turinčių DNR konstrukciją, įterptą chromosomą, selekcijos būdas grindžiamas plazmidės, tu-rinčios temperatūrai jautrų replikacijos pradmens vie-netą, panaudojimu. Transformantai auginami selektyvioje terpėje optimalioje temperatūroje, po to temperatūra pakeičiama i neoptimalią. Kolonijos, ekspresuojančios markerini geną neoptimal10j e temperatūroje išskiriamos ir auginamos selektyvioje terpėje optimalioje tempera-tūroje. Plazmidės nebuvimas gali būti patikrintas, pvz., suminės DNR išskyrimu iš kolonijų ir jos elektroforeze agaro gelyje arba transformantų nesugebėjimu transformuoti kompetentines ląsteles. Įsiterpimo i chromosomą tipas gali būti nustatytas chromosominės DNR analize, aprašyta Southern, J. Mol. Biol . 9_8, (1975) 503-517 arba kitais žinomais būdais.
[0063] Kuomet transformantai, turintys papildomas tandemiškai išdėstytas markerinio geno kopijas, palyginus su tran-sformantais, turinčiais išsklaidytą recipientės genome markerini, geną, pasižymi diferenciniu jautrumu selek-tyviam agentui, tada transformantus galima auginti ter-pėje su selektyviniu agentu, tam kad būtų atrinkti transformantai su netandeminiais intarpais.
[0064] Transformantus su išsklaidytai įterptomis norimomis DNR sekomis galima gauti ir kitu būdu, panaudojant protoplastus, paruoštus iš homologinių donorinių ląstelių, turinčių nors vieną norimos DNR sekos kopiją, esančią kitoje negu recipientinės ląstelės chromosomos vietoje.
[0065] Homologinė donorinė ląstelė gali būti paruošta, transformuojant ląstelę, neturinčią norimo struktūrinio ge-no. Tam tikslui panaudojamas vektorius turintis norimą struktūrini, geną. DNR seka i, donorinės ląstelės chro-mosomą gali būti įterpta lengvesniu būdu - panaudojant plazmidę, turinčią temperatūrai jautrų replikacijos pradmens vienetą ir po to auginant transformantą selekcijos sąlygomis iš pradžių optimalioje temperatūroje, o vė-liau neoptimalioj e temperatūroje kaip tai .aprašyta aukščiau. Kolonijos, ekspresuo jančios markerini, geną, išskiriamos.
[0066] Po to, kai įsitikinama, kad nėra plazmidinės DNR, galim išskirti chromosominę DNR ir ištirti ją Southern metodu (žr. aukščiau) hibridizuoj ant su zondu, pažymėtu, pvz., 32P arba biotinilintu nukieotidu. Zondu gali būti cDNR, koduojanti norimą polipeptidą, arba jos fragmentai, o taip pat ir DNR konstrukcija arba jos fragmentai, turintys savo sudėtyje norimą DNR seką, pvz., vektorius. Transformantai, turintys norimą geną kitoje vietoje, palyginus su genu, esančiu donoriniame kamiene, gali būti po to panaudoti kaip homologinė donorinė ląstelė. Recipientiniu kamienu geriau parinkti tą kamieną, kuris naudojamas kaip norimos DNR sekos šaltinis, arba tą kamieną, kuriame norima DNR seka yra kitoje chromosomos vietoje, negu transformuotos donorinės ląstelės.
[0067] Siekiant palengvinti atranką, donorinė ląstelė užmušama citotoksiniu agentu prieš ar protoplasto susidarymo metu. Donorinės ląstelės užmušimui galima naudoti įvai-rius agentus, tame tarpe ir antibiotikus. Pastebėta, kad patogiu efektyviu agentu, neveikiančiu būsimo suliejimo, yra jodoacetamidas. Naudojant klonavimo šei-mininko užmuštus protoplastus, santykis užmuštų proto-plastų su akceptoriniu recipiento kamienu turi būti ne mažiau 1:1 arba galima naudoti užmuštų protoplastų per-teklių .
[0068] Suliejus užmuštos donorinės ląstelės protoplastą su re-cipientinės ląstelės protoplastų, transformantai gali būti atrinkti panaudojant markerini, geną. Po to DNR galima išskirti ir ištirti kaip tai aprašyta aukščiau. Identifikuojami transformantai, kurių genome yra įsi-terpusios daugiau kaip viena norimo geno kopijos, atskirtos tarpusavyje endogeninėmis chromosominėmis sekomis .
[0069] Transformantai su išsklaidytais genais skrininguojami ieškant variantų, pažyminčių norimo polipeptido padidinta ekspresija. Tam tikslui naudojami įvairūs būdai, pvz., naudojami fermentai. Tais atvejeis, kai nėra fer-mentų ar nėra tinkamos ieškojimo sistemos, klonų skri-ningui galima naudoti bioanalizę, antikūnus, DNR ar RNR hibridizaciją, siekiant identifikuoti plazmidinę konst-rukciją ir norimo struktūrinio geno ekspresiją.
[0070] Be to, recipientinė ląstelė, turinti d, chromosomą įterptą plazmidinę konstrukciją arba jos fragmentus, auginama maitinimo terpėje tinkamose fermentacijai sąlygose. Fermentacija tęsiasi, kol išsenka bulijonas. Jeigu produktas sekretuojamas, tai jis išskiriamas iš bulijono, panaudojant atitinkamą būdą, pvz., ekstrahavimą, chromatografiją, elektroforezę ir pan. Jeigu produktas lieka citoplazmoj e, tuomet ląsteles galima surinkti centrifuguoj ant ar filtruojant ir 1.1., jas lizuoti me-chaniškai arba detergentu, lizocimu ar kitokiu būdu ir išskirti produktą kaip tai aprašyta aukščiau. Naudojant šiame išradime aprašytą būdą, galima stabiliai įterpti ne mažiau dviejų DNR sekų kopijų, pasiekiant geno amp-lifikaciją.
[0071] Sekantys pavyzdžiai pateikiami kaip iliustracija, kuri neišsemia visų galimybių.
[0072] Genominės DNR bibliotekos iš bazofilinio Bacillus novo species PB92 kamieno paruošimas ir serininės proteazės geno išskyrimas
[0073] Chromosominė DNR, išskirta iš Bacillus novo sp■ PB92 (saugoma Olandijoje, Delfte, Technikos Universiteto mikrobiologijos laboratorijoje, Nr. OP-6O. žr. patentą JAV Nr. PI 30.602) pagal būdą, aprašytą Saito-Miuva, Biochim. Biophys. Actą, TZ (1963) 619-632, po to paveikta restrikciniais fermentais Sau 3A ir liguota Bam 111 saite į plazmidę puBUO (Gryczan ir kt. , J. Bacteriol. 134 (1978) 318-329) . puBUO plazmidinė DNR paruošta kaip aprašyta Birnboim ir Boly, Nucl. Acids Res., 7, (1973) 1513-1523.
[0074] Liguotas mišinys transformuojamas i, B. subtilis 1A40 (Bacilų saugojimo Genetinis Centras) pagal metodą, aprašytą Spizizen ir kt., J. Bacteriol., 8_1 (1961) 741-746, panaudojant 0,6-1 fig DNR/lml kompetentinių ląs-telių .
[0075] Ląstelės iš transformuojančio mišinio išseiimas i, minimalias lėkšteles su 2,8 % KH2P04; 1,2 % KH2P04; 0,4 %
[0076] (NH4)2S04; 0,2 % tris-Na-citrato-2H20; 0,04 % MgS04*7H20; 0, 00005 % MnS04*4H20; 0,4 % L-gliutaminines rūgšties; 0,5 % gliukozės; 0,02 % kazamininių rūgščių; 50 Įi/ml metionino; 20 (.ig/ml lizino; 20 fag/ml neomicino; 0,4 % kazeino ir 1,5 % agaro. Pc lėkštelių ir inkubacijos per naktį 37°C temperatūroje viena iš 50.000 kolonijų, at-sparių neomicinui, pasižymėjo padidinta proteazės produkcija. Tai buvo nustatyta pagal padidėjusį precipitacijos lauką, atsiradusį aplink koloniją ant agaro ir kazeino skaldymo produktų. Plazmidinė DNR išskirta
[0077] iš šios kolonijos pagal metodą, aprašytą Birnboim ir Doly (Nucleic Acids Res. 1_ (1979) 1513-1523) ir_ pažymė-tą pM58 .
[0078] Bacillus subtilis 1A40, turinti pM58, išauginta minimalioje terpėje (Spizizen ir kt., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 4_4 (1958) 1072-1078), i, kurią pridėta 0,02 % kaza-nininių rūgščių; 50 jag/ml lizino ir 20 |ug/ml neomicino. Po 24 vai. kultūra nucentrifuguojama ir patikrinamas supernatanto proteazinis aktyvumas panaudojant kaip substratą dimetilkazeiną (Lin ir kt., J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793). Kultūra B. subtilis 1A40, turinti plazmidę puBUO, panaudota kaip kontrolė, kurios proteazinis aktyvumas sudarė mažiau kaip 1/60 kultūros, transformuotos pM58, proteazinio aktyvumo. Proteazini, aktyvumą slopino 1 mM fenilsulfonilfluorido (PMSF), bet ne 20 mM EDTA.
[0079] Aukščiau paminėti supernatantai išanalizuoti baltymi-niame gelyje pagal būdą, aprašytą Laemmli, Nature 227
[0080] (1970) 680. Mėginiai šiai analizei paruošiami superna-tantą paveikiant 5 % trichloracto rūgštimi (TChA). Po to centrifuguojama, precipituoto baltymo nuosėdos 2 kartus plaunamos acetonu, po to ištirpinamos 40 p.1 buferio (0,5 M Tris*HCl, pH 7,5; 10 % (tūrio) 2-mer-kaptoetanolio; 50 % (tūrio) glicerino ir 0,05 % brom-fenolio mėlynojo) virinant 10 min. Kultūrų supernatanto mėginiai tiriami elektroforetiškai . Ištirti trys skir-tingi B. subtilis 1A40 kamienai: kamienai, turintys puBUO arba pM58, kamienas be plazmidės ir Bacillus PB92 proteazė kaip kontrolė. Po elektroforezės geliai dažomi Kumasi briliantiniu mėliu ir atplaunami. B. subtilis kamieno 1A40, turinčio pM58, mėginys turėjo 31 kDa baltymą, kuris migravo kartu su Bacillus PB92 pro-teaze. Šis baltymas neaptiktas kontroliniame - kamieno B. subtilis 1A40, turinčio puBUO, takelyje.
[0081] Visos serininės proteazės turi vienodą molekulinę masę. Todėl klonuota Bacillus PB92 serininė proteazė dife-rencijuojama nuo visų kitų žinomų serininių proteazių
[0082] ( B. subtilis subtilizino, Carlsberg subtilizino) transformuojant pM58 ir puBUO i beproteazinį B. subtilis kamieną DB104 (R. Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) 442-444) . Po to analizuojama produkuojama ekstraląstelinė proteazė. Gauti transformantai auginami minimalioje terpėje (Spizizen ir kt. , žr. aukščiau), turinčioje 0,02 % kazamininių rūgščių, 50 (ig/ml histidino ir 20 |ug/ml neomicino. Po 24 vai. paimami mėginiai, cen-trifuguojami ir be papildomo paruošimo analizuojami tam tikslui panaudojant histidino IMOPS gelius, turinčius 75 mM KOH; 40 mM histidino; 100 mM MOPS)3-)N-morfo-lino)-propansulforūgštis) , pH 7,5 ir 5% poliakrilamido. Elektroforezės buferis turėjo 40 mM histidino, 100 mM MOPS, pH 6,6. Mėginiai judėjo katodo kryptimi. Pro-teazės juostos aptinkamos profesionalių juostelių AgFa Pan 100 pagalba (Zuidweg ir kt., Biotechnol. and Bioengin . 1_4 (1972) 685-714) . Šie rezultatai parodyti
[0083] Fig. 3. Iš jų matyti kad PM58 turi geną, koduojanti Bacillus PB92 proteazę.
[0084] Bacillus PB92 serininės proteazės geno nukleotidinių sekų nustatymas
[0085] pM58 Bal I - Hpa I fragmento seka nustatyta panaudojant būdą, aprašytą Sanger, Proc, Natl . Acad. Sci . USA, 77
[0086] (1977) 6463. pM58 restrikciniai fragmentai (žr. 4 pav.) klonuoti fago M13 vektoriuose mplO, mpll ir mpl8 (Meshing ir kt., Nucleic Acids Res., 9 (1981) 309-321). Fragmentų pM558 įsiterpimas skrininguojamas pagal hibridizacijos rezultatus. Sekvenavus paruoštą dešimt nukleotidų, lokalizuotų gelyje lygiais tarpais, ir pa-kartotas sekvenavimas, patvirtinęs seką, parodytą Fig. 5.
[0087] Plazmidės pMAX- 4, turinčios serininės proteazės geną, kons travimas
[0088] Konstruojant plazmidę puCN (Fig. 6A) plazmidė puBUO paveikiama fermentais Tag 1 ir Pvu 11. Fragmentas, turintis atsparumo neomicinui geną, išvalytas panaudojant žemos lydymosi temperatūros agarozę ir po to jo galai paveikti Klenovo polimerazės fragmentu (Maniatis, Molekulinis klonavimas: A laboratory Manual Cold Spring Harbor, 1982) . Plazmidė puC7 (Vilira ir kt. Gene 19
[0089] (1982) 259-268) linearizuota Sal 1 ir galai apdoroti kaip aprašyta aukščiau. Abu fragmentai liguoti Tu ligaze (Maniatis) ir transformuoti i, E. coli IML 03. Atranka atlikta 2xTY lėkštelėse (1,6 % svoris/tūris Bakto triptono; 1 % svoris/tūris mielių ekstrakto; 0,5 % NaCl, 50 fag/ml ampicilino ir 10 Įig/ml neomicino) . Gauta plazmidė, pavadinta puCN710, paveikta restriktaze Bam H1. Plazmidė pE194 (Iordanescu, Plasmio (1978) 468-479) suskaldyta Bcl 1. Fragmentai liguoti T4 ligaze ir transformuoti į B. subtilis 1A40. Atranka atlikta minimaliose lėkštelėse, turinčiose 20 jig/ml neomicino (žr. Fig. 1). Gauta plazmidė pE194-neo (Fig. 6A) turėjo neomicino geną ir temperatūrai jautrų replikacijos pradmens vienetą.
[0090] Proteazės genas subklonuotas i, įterpimo vektorių pE194-neo sekančiu būdu: pM58 (žr. Fig. 7) paveikiama fermentais Hpasl ir Bali ir Bgl 11. Plazmidė pE194-neo paveikiama Hpa 1. Šie fragmentai liguojami T4 ligaze ir transformuojami i, B. subtilis 1A40. Transformantai atrenkami pagal atsparumo neomicinui ir proteazės produkcijos padidėjimo požymius. Apie tai sprendžiama iš precipitacijos arealo, kuri sudaro kazeino skaldymo produktai (žr. Fig. 1), dydžio. Gauta plazmidė puAX-4, kurios struktūra nustatyta restrikcme fermentų analize (ž r. Fig.6B) .
[0091] Bacillus PB92 pMAX- 4 protoplasto transformacija
[0092] Bacillus PB92 augintas per naktį 100 ml NBSG-X tirpale (Thorne etcel., J. Bacteriol. 91 (1966) 1012-1020). Kultūra buvo centrifuguojama 10 min esant 4.500 aps/min rotoriuje Sorvcell modelis CSA. protoplastai buvo pa-ruošti inkubuojant bacilas 1 vai. 37°C temperatūroje 10 ml šarminio tirpalo (ANM), turinčio 0,5 K sacha-rozes; 0,02 M MgCl2 ir 0,02 M Tris-maleat, pH 8,0; steriliame vandenyje, i kuri buvo pridėta 0,4 mg/ml lizocimo. Protoplastai buvo nusodinti per 10 min esant 4.500 aps/min, resuspenduoti 5 ml ANM+ buferinio miši-nio (ANM buferis, i, kuri, pridėta 3,5 % svoris/tūris Bakto Penassay bulijono ir 0,04 % svoris/tūris Merieux albumino), kurio pH 8,0, sumaišyti ir vėl nusodinti kaip aprašyta aukščiau. Po resuspendavimo 5,0 ml ANM, 0,5 ml šios protoplastų suspensijos buvo sumaišyta su 55 (jg demineralizuoto vandens, turinčio 1 |ig plazmi-dinės DNR ir inkubuota 2 min. su 30 % svoris/tūris polietilenglikolio 8.000, pH 8,0. Tris kartus praskie-dus tirpalu ANM+ pH 8,0 ir centrifugavus, nuosėdos resuspenduotos mažame tūryje 1 ml ANM" ir inkubuotos 2-3 vai. Alikvotos po 100 ml buvo išsėtos naujai pa-ruoštose regeneracinėse lėkštelėse su 0,55 M sukcinato-HC1 pH 8,0; 1,55 % svoris/tūris agaro; 0,5 % svo-ris/tūris kazamininių rūgščių; 0,55 % svoris/tūris mie-lių ekstrakto; 0,031 M fosfatinio buferio pH 8,0; 0,5 % svoris/tūris gliukozės; 0,02 mg MgCl2 ir 0,02 % svo-ris/tūris Merieux albumino. Šiose lėkštelėse taip pat buvo 1000 |ig/ml neomicino selekcijai. Po inkubacijos prie 37°C ne mažiau 72 vai. kolonijos perneštos i, lėkšteles su agaru, turinčiu širdies raumens ekstraktą ir 20 ng/ml neomicino.
[0093] pMAX- 4 įterpimas i, Bacillus kamieno pB92 chromosomą
[0094] Transformantas Bacillus pB92, turintis plazmidę pMAX-ė, inkubuojamas Triptono sojos bulijone (TSB) , turinčiame arba 1 Įig/ml, arba 20 jig/ml neomicino, 24 vai prie 37°C .
[0095] Po to po 2 ml ląstelių suspensijos atskiedžiama 100 ml TSB, turinčio atitinkamai 1 jag/ml arba 20 (ig/ml neomicino, ir inkubuojama 24 vai prie 50°C. Po 24 vai. abiejų kultūrų mėginiai po i, ml vėl atskiedžiami, kaip nurodyta aukščiau ir inkubuojami 24 vai. prie 50°C vėl pridėjus atitinkamai 1 ^ig/ml arba 20 Į^g/ml neomicino. Pastaroji procedūra pakartojama dar vieną kartą. Tada ląstelių suspensijos atskiedžiamos 100 kartų ir išsė-jamos į lėkšteles su agaru, turinčiu širdies raumens ekstraktą (Hl-agaras) ir atitinkamai 1 Įig/ml neomicino (kultūrų, augintų terpėje su 20 fig/ml neomicino mė-giniams. Lėkštelės inkubuojamos 16 vai prie 50°C. Re-zistentiškos neomicinui kolonijos išskiriamos ir auginamos 10 ml TBS terpės, turinčios 1 jig/ml neomicino, 16 vai prie 37°C. Iš šių kolonijų išskiriama suminė DNR (Holmes ir kt., Anai Biochem 114 (1981) 193-197). Plazmidės nebuvimas tikrinamas DNR elektroforeze agaro-zės gelyje. Plazmidinės DNR nebuvimas mėginiuose pa-tvirtinamas transformuojant suminę DNR i, B. subtilis 1A40. Nuspręsta, kad mėginiai, negalintys transformuoti B. subtilis, neturi plazmidės.
[0096] Tam, kad būtų nustatyta, kur ir kokiu būdu pMAX-4 įsiterpusi i, chromosomą, išskiriama chromosominė DNR paveikiama Hind III ir analizuojama 0,5 % agarozės gelyje pernešant ant nitroceliuliozės (Southern, J. Md. Biol. , ^8 (1975) 503-517) ir hibridizuoj ant su 32P pažymėta po niktransliacijos pM58 (Maniatis, 1982). Šios analizės duomenys parodyti Fig. 7A.
[0097] Po selekcijos 1 jig/ml neomicinu proteazės genai buvo tandemiškai išsidėstę chromosomoje, o po Campbell-tipo homologinės rekombinacijos šie genai buvo atskirti kamieno PBT109 plazmidinėmis sekomis. Išskyrus 30 ne-priklausomų integrantų, vėl buvo atlikta atranka ter-pėje su 1 jag/ml neomicino. Išskirtas vienas integrantas po netaisyklingos rekombinacijos (kamienas PBT122), turintis plazmidę pMAX-4, įsiterpusią atsitiktinėje chromosomos vietoje. Šis kamienas pažymėtas PBT108. Kamienų PBT109 ir 108 genetinė organizacija parodyta atitinkamai Fig. 7B ir 7C. Chromosominė analizė patvirtina, kad PBT122 ir PBT108 intarpai yra skirtingose chromosomos vietose.
[0098] Kamienuose PBT108 ir PBT109 esančių dvigubų proteazės genų stabilumas
[0099] 500 ml talpos kolbos su 100 ml gamybinės terpės be neomicino (turinčios: 1 % krakmolo, 4 % laktozės, 0,8 % K2HP04; 0,5 % mielių ekstrakto; 2H20; 0,55 % MgS04*7H2P; 0,07 % CaCl2; 0,068 % Fe04*7H20 ir 1 ml/1 skysčio prieš putojimą) pasėjama po 0,2 ml ląstelių suspensijos iš kamieno PBT108 arba PTB109 kultūrų, augintų per nakti, 37°C temperatūroje. Inkubuojama 44 vai. 37°C tempera-tūroje pastoviai aeruojant. Po to klonuojant patikrinamas kultūros atsparumas neomicinui ir jos proteazinis aktyvumas.
[0100] Kamienai PBT108 ir PBT109 patikrinti Eschweiler fermen-tatoriuose, užpildytuose aukščiau paminėta ^gamybine terpe, norint išsiaiškinti tūrio padidėjimo iki 11 efek-tą. Fermentacijos bandymų duomenys suvesti 1 lentelėje.
[0101] Patikrinus kolonijas, gautas iš kamieno PBT109 po jo auginimo 2 dienas Eschweiler fermentatoriuj e, rasta, kad 3-25 % šių kolonijų proteazės aktyvumas buvo kaip kamieno, turinčio tik vieną proteazės geną. Nustatyta, kad aukščiau paminėtos kolonijos yra neomicinui jautrios, kadangi homologinės rekombinacijos metu pMAX-4 yra iškerpama. Tuo tarpu patikrinus kolonijas, gautas iš kamieno PBT108 po jo auginimo fermentatoriuje, rasta, kad visos šios ląstelės yra neomicinui atsparios. Parinkta šimtas neomicinui atsparių kolonijų atsitik-tiniam ir individualiam proteazinio aktyvumo testavi-mui, siekiant nustatyti, kiek proteazės genų - vieną ar du jos turės. Visos 100 individualiai testuotų kolonijų produkavo kamieno, turinčio du genus, lygyje. Tai rodo, kad du, atsitiktiniai įterpti i, kamieną PBT108 pro-teazės genai stabiliai laikėsi naudotose fermentacijos sąlygose.
[0102] Plazmide pB34, aprašyta EPA 0134048 paveikta restrikciniais fermentais bcll, Bgll ir Bglll. Gautų restrikcijos fragmentų galai paveikiami klenovo polimeraze ir po to liguojami i pE194-neo Hpal saitą (žr. fig. 6) . Plazmidės pE194-neo DNR išskirta kaip aprašyta birnboim ir Doly (Nucl. Acids. Res. 7 (1979) 15513-1523.
[0103] Gautas mišinys transformuojamas į B. subtilis 1A40 pagal būdą, kuri, aprašė Spizizen ir kt. (J. Bacteriol. 81 (1961) 741-746), panaudojant 0,55-1 |ig DNR/1 ml kom-petentmių ląstelių. Po to ląstelės išsėjamos i, minimalias lėkšteles, tu-rinčias 2,8 % K2HP04; 1,2 % KH2P04; 0,4 % (NH4)2S04; 0,2 % tris-Na-citrato* 2H20; 0,04 % MgS04*7H20; 0, 00005 % MnS04*H20; 0,4 % gliutamininės rūgšties; 0,555 % gliu-kozės; 0.02 % kazamininių rūgščių; 50 |ng/ml lizino; 20 ng/ml neomicino; 0,4 % kazeino, 0,5 % krakmolo ir 1,5 % agaro.
[0104] Birnboim ir Doly aprašytu būdu iš kolonijų, produkuo-jančių alfa-amilazę, išskirta DNR, paveikta restrikciniais fermentais ir analizuota iš vieno transformanto išskirta plazmidė pElaTB (žr. Fig. 8) .
[0105] pElaTB panaudojimas alfa- amilazę neprodukuojančio kamieno Bacillus licheniformis T9 transformacijai
[0106] Kamienas Bacillus licheniformis T9 transformuotas būdu, aprašytu EP-A-02553455, su nedidele pataisa - procedūra atlikta (30°C, o ne 37°C temperatūroje) . Transformantų atranka atlikta minimaliose lėkštelėse, turinčiose 20 ng/ml neomicino. Visi transformantai produkavo ami-lazę. Birnboim ir Doly aprašytu būdu išskirta DNR, atlikta restrikcinė analizė, kuri parodė, kad visi transformantai turi pElaTB.
[0107] pElaTB įterpimas į B. licheniformis T9 chromosomą
[0108] Bacillus licheniformis kamienas T9, turintis plazmidę pElaTB, išsėjamas i, Triptono sojos bulijoną (TSB) , su 20 fj.g/ml neomicino ir inkubuojama 16 vai. 30°C tempe-ratūroje. 5 ml ląstelių suspensijos atskiedžiama 100 ml aukščiau paminėtos terpės ir inkubuojama 50°C tempe-ratūroje 24 vai.
[0109] Ši procedūra pakartojama. Po to ląstelių suspensija atskiedžiama 100 kartų ir išsėjama d, lėkšteles su agaru, i, kuri, įdėtas širdies raumens ekstraktas ir 10 jj.g/ml neomicino. Inkubuojama 40 vai. 50°C temperatū-roje, po to išskiriamos kolonijos, atsparios neomicinui, ir kultivuojamos 10 ml TSB terpės su 10 jj,g/ml neomicino 16 vai. 30°C temperatūroje. Tada iš kultūrų išskirta šeiminė DNR (Holmes ir kt., Anai. Biochem. 114
[0110] (1981) 192-197) . DNR elektroforezės agarozės gelyje būdu nustatyta, kad ląstelės neturi plazmidžių. Tai patvirtino ir papildomi tyrimai bandant transformuoti B. Subtilis 1A40 i, neomicinui atsparų kamieną.
[0111] Tam, kad būtų patikrinta, ar pElaTB yra įsiterpusi genomą ir kokiu būdu iš transformantų išskiriama chro-mosominė DNR (Saito-Miuva, Biochem. Biophys., Actą, 72
[0112] (1963) 619-632), paveikiama EcoRl, frakcionuojama 0,55 % agarozės gelyje, pernešama ant nitroceliuliozės (Southern, J. Mol. Biol. 98 (197555) 503-517) ir hibridizuojama su 32P pažymėta nik-transliuota p-B33
[0113] {žr. EP-A-0134048) . Šių tyrimų duomenys parodyti
[0114] Fig. 9A. Duomenys rodo, kad yra įvykusi pElaTB netai-syklinga rekombinacija ir dėl to kamienas turi atskirą amiiazes geną kitoje genomo vietoje, palyginus su pradiniu amilaziniu kamienu Bacillus licheniformis T5555. Gautas kamienas, turintis pElaTB, pažymėtas TB1 3 .
[0115] Kamieno T13F, turinčio du amilazės genus, atskirtus endogeninėmis chromosominėmis sekomis, konstravimas
[0116] Tam, kad būtų sukonstruotas kamienas, turintis du amilazės genus atskirtus endogeninėmis chromosominėmis sekomis, atliktas bandymas suliejant Bacillus licheniformis kamieną T5 (amilazinis kamienas, turintis pradina, amilazės geną, žr. EP-A-0134048. Prieš padarant protoplastus, kamienas TB13 užmušamas tam tikslui panaudojant jodacetamidą. Kamienas T5 (jautrus neomicinui) nebuvo užmuštas. Sulietų ląstelių atranka atlie-kama regeneracinėse lėkštelėse, turinčiose 10 (jg/ml neomicino.
[0117] Tam, kad būtų patikrintos ir identifikuotos potencia-lios sulietos ląstelės, buvo išskirta chromosominė DNR, paveikta EcoRl, frakcionuota 0,5 agarozės gelyje, pernešta ant nitroceliuliozės filtrų (Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517) ir hibridizuota su 32P pažy-mėta nik-transliuota pB33 (žr. EP-A-0134048). Šio ty-rimo rezultatai parodyti Fig. 9B. Vienas iš gautų su-lietų ląstelių klonų, T3F, turėjo 2 amilazės genus, atskirtus endogeninėmis sekomis.
[0118] Kamienuose T390 ir TIF esančių dvigubų amilazės genų stabilumas
[0119] Kamieno TIF, turinčio du chromosominius amilazės genus, atskirtus esminėmis chromosominėmis sekomis, stabilumas palygintas su kamieno T390 stabilumu. Pastarasis kamienas turi du chromosominius amilazės genus, lokali-zuotus tandemine seka. Kamieno T390 gavimas aprašytas EP-A-134048 (17 psl. 1 lentelė), kur jis priskirtas B. licheniformis T5 (pGB33) . Kamienai T13F ir T390 patikrinti fermentacijos sąlygomis. Tam tikslui 0,2 ml TSB kultūros, išaugintos per nakti, 37°C temperatūroje, pasėta i, 500 ml talpos kolbas, turinčias 100 ml gamy-binės terpės (žr. Fig. 7) . Po sterilinimo pridedant NaOH pasiekiamas pH 6,9 (neomicinas nepridedamas). Po inkubacijos 6 dienas 40°C temperatūroje pastoviai aeruojant, testuojamas kultūros atsparumas neomicinui ir amilazės aktyvumas. Bandymų duomenys suvesti 2 len-telėje .
[0120] Tam, kad būtų nustatyta, ar kamiene T13F prarastas vienas amilazės genas, išlaikant neomicino geną, išana-lizuota 20 kolonijų, gautų po T13F auginimo fermentatoriuje. Išskirta chromosominė DNR iš 20 atsitiktinai atrinktų kolonijų ir išanalizuota hibridizuoj ant kaip tai aprašyta aukščiau. Fig. 10 parodyti 9 toki.ų tyrimų duomenys. Visi ištirti kamienai turėjo du alfa amilazės genus jų chromosominėje DNR.
[0121] Priešingai genetiškai stabiliam T13F kamienui, kamienas T390 pasirodė besąs fermentacijos metu nestabilus - 12 % kolonijų buvo jautrios neomicinui. Patikrinus vieną ko-loniją aptiktas tik vienas alfa-amilazės genas (Fig. 10, 4 takelis). Tai rodo, kad išsklaidytai įsiterpę genai yra stabilesni fermentacijos sąlygomis negu tandemiškai įsiterpę genai.
[0122] Iš aukščiau pateiktų duomenų akivaizdu, kad galima gauti prokariotines ląsteles, kuriose stabili geno amplifikacij a pasiekta atrenkant transformuotas ląste-les, kuriose įterpta ne mažiau dviejų struktūrinio geno kopijų. Geno įterpimas gali įvykti homologinės rekombinacijos arba netaisyklingos rekombinacijos būdu.
[0123] Šiame išradimo aprašyme paminėtos publikacijos pri-lygsta specialiai ir individualiai paminėtoms kaip nuo-roda .
[0124] Kadangi dabar išradimas pilnai aprašytas, tai įvairių pakeitimų ir modifikacijų galimybė, nenukrypstant nuo išradimo apibrėžties, apimties ir esmės, tėra tik tech-ninis reikalas.
1. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė, turinti savo chromosomoje ne mažiau dviejų koduojančios norimą polipeptidą DNR sekos kopijų, besiskirianti tuo, kad kopijos atskirtos endogeninemis DNR sekomis.
2. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė, turinti savo chromosomoje ne mažiau dviejų koduojančios norimą polipeptidą DNR sekos kopijų, besiskirianti tuo, kad minėtos kopijos atskirtos endo-geninėmis DNR sekomis ląstelės-recepientės genome, o pati ląstelė-recepientė formuojama tokiu būdu:ląstelės-recepientės, turinčios ne mažiau vienos aukš-čiau paminėtos sekos kopijos, įterptos i, chromosomą kombinavimo transformacijos sąlygomis su a) DNR konstrukcija, turinčia ne mažiau vienos aukščiau paminėtos DNR sekos kopijos ir ne mažiau vieno markerinio geno bei temperatūrai jautrų replikacijos pradmens vienetą arba su b) donorine ląstele, turinčia aukščiau paminėtą DNR konstrukciją;transformanto, kuriame minėta DNR konstrukcija įterpta i, jo chromosomą, atrankos;transformuotų prokariotinių recepientinių ląstelių,turinčių ne mažiau dviejų aukščiau paminėtos DNR sekos kopijų, atskirtų endogeninėmis DNR sekomis, išskyrimo iš didelio aukščiau paminėto transformantų skaičiaus.
ląstelės-recepientės, turinčios ne mažiau vienos aukš-čiau paminėtos sekos kopijos, įterptos i, chromosomą kombinavimo transformacijos sąlygomis su a) DNR konstrukcija, turinčia ne mažiau vienos aukščiau paminėtos DNR sekos kopijos ir ne mažiau vieno markerinio geno bei temperatūrai jautrų replikacijos pradmens vienetą arba su b) donorine ląstele, turinčia aukščiau paminėtą DNR konstrukciją;transformanto, kuriame minėta DNR konstrukcija įterpta i, jo chromosomą, atrankos;transformuotų prokariotinių recepientinių ląstelių,turinčių ne mažiau dviejų aukščiau paminėtos DNR sekos kopijų, atskirtų endogeninėmis DNR sekomis, išskyrimo iš didelio aukščiau paminėto transformantų skaičiaus.3. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal 1 ir 2 punktą, besiskirianti tuo, kad minėta prokariotinė ląstelė yra Bacillus kamienas.
4. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepiente pagal 1 ir 2 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtos Bacillus kamienas yra bazofilinis Bacillus kamienas arba Bacillus licheniformis kamienas.
5. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal 4 punktą besiskirianti tuo, kad minėtas bazofilinis Bacillus kamienas yra Bacillus novo species PB92 arba jo mutantas, ar variantas.
6. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal 4 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas recepientinis Bacillus licheniformis kamienas yra Bacillus licheniformis T5 kamienas arba jo mutantas, ar variantas .
7. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal 1 ir 2 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas norimas polipeptidas yra fermentas.
8. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal 7 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas fermentas yra proteolitinis fermentas arba amilolitinis fermentas.
9. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal 8 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas proteolitinis fermentas yra serino proteazė.
10. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal 9 punktą, besiskirianti tuo, kad minėta serino proteazė turi tokią seką:
11. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal 8 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas amilolitinis fermentas yra alfa-amilazė.
12. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal 1 arba 2 punktą, besiskirianti tuo, kad Bacillus novo species PB92 arba jo mutanto, arba variante genomas turi minėtą DNR seką.
13. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal 1 ar 2 punktą, besiskirianti tuo, kad Bacillus licheniformis T5 arba jo mutanto arba varianto genomas turi minėtą DNR seką.
14. Transformuotos prokariotinės ląstelės-recepientės, turinčios ne mažiau dviejų koduojančios norimą polipep-tidą DNR sekos kopijų, atskirtų endogeninėmis chromo-sominėmis sekomis minėtos recepientės genome paruošimo būdas, besiskiriantis tuo, kad recepientinę ląstelę, turinčią ne mažiau vienos minėtos DNR sekos kopiją, įterptą j, jos chromosomą kombinuoja transformacijos sąlygomis su a) DNR konstrukcija, tu-rinčia ne mažiau vienos minėtos DNR sekos kopiją ir ne mažiau vieno markerinio geno bei temperatūrai jautraus replikacijos pradmens vieneto, arba su b) donorine ląs-tele, turinčia minėtą DNR konstrukciją; atrenka transformantą, kuriame minėta DNR konstrukcija įterpta į chromosomą, ir išskiria transformuotas prokariotines recepientines ląsteles, turinčias ne mažiau dviejų minėtos DNR sekos kopijų, atskirtų endogeninėmis sekomis, iš didelio mi-nėtų transfomantų skaičiaus.
15. Būdas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad atranka susideda iš:minėto transformanto, turinčio DNR konstrukciją su markeriniu genu, auginimo terpėje su biocidu, atsparumą kuriam sąlygoja minėtas markerinis genas, irtransformantų, neturinčių plazmidės, identifikacijos ir išskyrimo iš minėtų transformantų.
minėto transformanto, turinčio DNR konstrukciją su markeriniu genu, auginimo terpėje su biocidu, atsparumą kuriam sąlygoja minėtas markerinis genas, irtransformantų, neturinčių plazmidės, identifikacijos ir išskyrimo iš minėtų transformantų.16. Būdas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad atranka susideda iš:minėto transformanto, turinčio markerinį geną ir tem-peratūrai jautrų replikacijos pradmens vienetą, auginimo terpėje su biocidu, permisyvinėj e temperatūroje; irtransformantų, neturinčių plazmidės, atrankos iš minėtų transformantų.
minėto transformanto, turinčio markerinį geną ir tem-peratūrai jautrų replikacijos pradmens vienetą, auginimo terpėje su biocidu, permisyvinėj e temperatūroje; irtransformantų, neturinčių plazmidės, atrankos iš minėtų transformantų.17. Būdas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas išskyrimas susideda iš:chromosominės DNR iš minėtų transformantų išskyrimo; ir minėtos chromosominės DNR hibridizacijos su žymėtu zondu, turinčiu DNR konstrukciją arba jos fragmentą, ko pasekoje pagal aptiktą žymę atrenkamos minėtos transformuotos prokariotines ląstelės.
chromosominės DNR iš minėtų transformantų išskyrimo; ir minėtos chromosominės DNR hibridizacijos su žymėtu zondu, turinčiu DNR konstrukciją arba jos fragmentą, ko pasekoje pagal aptiktą žymę atrenkamos minėtos transformuotos prokariotines ląstelės.18. Būdas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta recepientinė ląstelė gaunama būdu, su-sidedančiu iš:prokariotinės ląstelės, neturinčios DNR sekos, koduo-jančios norimą minėtą polipeptidą, kombinavimo sulie-jimo sąlygomis su DNR konstrukcija;transformuotų ląstelių išskyrimo;minėtų ląstelių auginimo nepermisyvioj e temperatūroje;irtransformuotų ląstelių, kuriose minėta DNR konstrukcija įterpta kitoje chromosomos vietoje negu minėtos rece-pientinės ląstelės, identifikavimo ir išskyrimo.
prokariotinės ląstelės, neturinčios DNR sekos, koduo-jančios norimą minėtą polipeptidą, kombinavimo sulie-jimo sąlygomis su DNR konstrukcija;transformuotų ląstelių išskyrimo;minėtų ląstelių auginimo nepermisyvioj e temperatūroje;irtransformuotų ląstelių, kuriose minėta DNR konstrukcija įterpta kitoje chromosomos vietoje negu minėtos rece-pientinės ląstelės, identifikavimo ir išskyrimo.19. Būdas pagal bet kuri, iš 14-18 punktų, besiskiriantis tuo, kad minėta prokariotinė ląstelė yra Bacillus.
20. Būdas pagal 19 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas Bacillus yra bakteriologinis Bacillus kamienas arba Bacillus licheniformis kamienas.
21. Būdas pagal 20 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas bazofilinis Bacillus novo species PB92 ir minėtas Bacillus licheniformis kamienas yra Bacillus licheniformis T5 kamienas.
22. Būdas pagal bet kuri, iš 14-21 punktų, besiskiriantis tuo, kad minėtas norimas polipeptidas yra fermentas.
23. Būdas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas fermentas yra serino proteazė arba amilazė.
24. Būdas pagal 23 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta serino proteazė, turi ne mažiau 70 % nukleotidinės sekos homologijos su proteolitini fer-mentą koduojančiu genu iš Bacillus novo species PB92.
25. Būdas pagal 23 ar 24 punktą, besiskirian-t i s tuo, kad minėta serino proteazė turi sekančią aminorūgščių seką:
26. Būdas pagal bet kuri, iš 14-25 punktų, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR konstrukcija yra pMAX-4 arba pElaTB.
27. Būdas pagal bet kuri, iš 14-26 punktų, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR seka įterpta netaisyklingos rekombinacijos būdu.
28. Būdas pagal bet kuri, iš 14-26 punktų, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR seka įterpta homo-loginės rekombinacijos būdu.
29. Būdas pagal bet kuri, iš 14-16 punktų, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR konstrukcija turi dar ir temperatūrai jautrų replikacijos pradmens vie-netą .
30. Būdas pagal 29 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta temperatūrai jautri plazmidė yra plaz-midės pE194 darinys.