[LT] Šis išradimas yra iš imuninės biotechnilogijos srities. Jo esmė - naujų hibridomų sukūrimas ir monokloninių antikūnių prieš žmogaus augimo hormoną gavimas. Hibridomos skiriasi nuo anksčiau aprašytų analogų pagal motininių ląstelių kilmę, hibridizacijos būdą bei produkuojamų monokloninių antikūnų specifiškumą. Monokloniniai antikūniai gali būti pritaikyti žmogaus augimo hormono nustatymui.
[EN]
[0001] Išradimas yra iš imuninės biotechnologijos srities. Jo esmė - naujų hibridomų sukūrimas ir monokloniniu antikūnų (MA) prieš žmogaus augimo hormoną gavimas.
[0002] Hibridinių ląstelių linijos (hibridomos GH-1 ir GH-2) - tai MA prieš žmogaus augimo hormoną producentai. Abi šios ląstelių linijos gautos tuo pačiu metodu, charakterizuojamos tais pačiais požymiais. Jos skiriasi pagal vieną savybę - GH-1 ir GH-2 produkuojami MA atpažįsta skirtingus epitopus žmogaus augimo hormono mo1ekulė j e.
[0003] Hibridomų GH-1 ir GH-2 analogais gali būti laikomos hibridinių ląstelių linijos, produkuojančios MA prieš žmogaus augimo hormoną - A64-D/E3, A64-E/C8, A64-E/B12 ir A64-D/F2 [DD 263537, A61K39/395, 1987] ir prieš jaučio augimo hormoną - HMB 2/3 [SU 1564184, A61K39/395, 1988]. Hibridomos GH-1 ir GH-2 skiriasi nuo hibridomos MMB 2/3 pagal produkuojamų MA specifiškumą
[0004] (MME 2/3 produkuoja MA prieš jaučio augimo hormoną), o nuo hibridomų A64-B/E3, E/08, E/B12, D/F2 - pagal imunisacijai naudoto antigeno struktūrą, hibridizacijos būdą ir motininių ląstelių
[0005] Sio išradimo tikslas - sukurti hibridomas, kurios produkuoja specifinius antikūnus prieš žmogaus augimo hormoną. Tam tikslui pelės buvo imunizuotos rekombinantiniu žmogaus augimo hormonu, po to imunizuotų pelių blužnies limfocitai sukryžminti su pelių mieloma NSO/ 1 pagal Kiolerio ir Milšteino metodą [Kohler, Milstein, Eur. J. Immunol., 1976, 6, 511-919]. Atlikus hibridiniu, ląstelių tikrinimą ir klonavimą, buvo gautos hibridomos GH-1 ir GH-2.
[0006] Hibridomos deponuotos Biotechnologijos institute "Fermentas": GH-1 deponavimo numeris H 0304, GH-2 deponavimo numeris - H 0305.
[0007] Hibridomas GH-1 ir GH-2 apibūdina šie požymiai.
[0008] Morfologiniai požymiai. Hibridinės ląstelės yra sferinės formos, su lygiais kraštais, turi stambų branduolį. Dauginasi suspensijoje, pasižymi silpna adhezija ant stiklo arba plastiko paviršiaus.
[0009] Ląstelių kultūros požymiai. Kultivavimo sąlygos standartinės: terpė DMEM su 10% embrioninio karvių serumo, 2 mM L-gliutamino, 20 mM HEPES buferio, 200 Įlg/ml gentamicino, auginama 37°C temperatūroje, 5% C02 atmosferoje. Ląstelių auginimui naudojami stiklo arba plastiko indai, persėjama kas 3~4 dienos, peršėjimo dozė - 100 tūkst. ląst./ml.
[0010] Auginimas gyvūnų organizme. Singeninių pelių BALB/ c organizme hibridomos GH-1 ir GH-2 100% atvejų sukelia ascitą, suleidus į pilvo ertmę 1-2 mln. ląstelių. Likus 7-10 dienų iki ląstelių injekcijos, pelės sensibilizųojamos 0,5 ml pristano. Ascitas formuojasi, praėjus 8-12 dienų po hibridinių ląstelių injekcijos.
[0011] Kriokonservavimas. Ilgalaikiam saugojimui ląstelės užšaldomos embrioniniame karvių serume su 10% dimetilsulfoksido. Užšaldymo režimas - 1°C/min. iki -70°C, po to ląstelės perkeliamos i skystą azotą. Atšildymas - vandens vonioje 37°0. Ląstelių gyvybingumas po atšildymo - 70-80%.
[0012] Kontaminacija. Bakterijų ir grybų kultūrose nerasta, mikoplazmos testas neigiamas.
[0013] Ląstelių produktyvumas. 3-4 kultivavimo dieną MA sekrecijos lygis terpėje - 10-15 Įlg/ml, ascitiniame skystyje - 5-10 mg/ml, MA titras ascitiniame skystyje - 1:30000. MA produkcija išlieka iki 15 pasažų kultūroje ir iki 5 pasažų ascite.
[0014] Produktų charakteristika. Hibridomos GH-1 ir GH-2 produkuoja TgG klasės, IgG1 poklasio MA, specifiškus žmogaus augimo hormonui. Dviepitopinės analizės metodu buvo nustatyta, kad šie MA atpažįsta skirtingus epitopus (amino rūgščių sekas) žmogaus augimo hormono molekulėje.
[0015] 1 pavyzdys. Hibridomu gavimas. Linijos BALB/ c pelės imunizuojamos rekombinantiniu žmogaus augimo hormonu, turinčiu pirmosios N-galinės amino rūgšties deleciją (dez-Phe-1-STH). Sis hormonas pagamintas Biotechnologijos institute "Fermentas".Pelės imunizuojamos, suleidžiant antigeną i pilvo ertmę. Pirmos 3 imunizacijos atliekamos kas 10 dienų, suleidžiant kiekvienai pelei po 100 Įig augimo hormono, suspenduoto pilname Froindo adjuvante. Paskutinė imunizacija atliekama po 5 savaičių - likus 5, 3 ir 2 dienoms iki hibridizacijos, suleidžiama po 100 }j.g augimo hormono fiziologiniame tirpale.
[0016] Hibridizacijai naudojama pelių mielomos linija NSO/ 1 logaritminėje augimo fazėje ir imunizuotos pelės blužnies limfocitai. Hibridizacijos agentas - 50% polietilenglikolio (PEG-4000) tirpalas DMEM terpėje su 15% dimetilsulfoksido, mielomos ir blužnies ląstelių santykis hibridizacijos metu - 1:7. Hibridizacija vykdoma 1 min., po to ląstelės atplaunamos nuo PEG beserumine DMEM terpe, centrifuguojamos, suspenduojamos HAT terpėje ir išsėjamos į plokšteles, po 10 c . ląstelių į šulinė Ii,. Prieš tai plokštelėse pasodinami makrofagai iš pelės pilvo ertmės. Hibridinių ląstelių selekcija atliekama HAT terpėje, kuri 7-tą kultivavimo dieną palaipsniui keičiama HT terpe (hipoksantinas, timidinas), o po to - normalia kultivavimo terpe su dviguba serumo koncentracija (20%). Hibridiniai producentai klonuojami didelių praskiedimų metodu, išsėjant po 1 ląstelę į šulinėli,. Atrinkti klonai padauginami ir toliau auginami pelių BALB/ c pilvo ertmėje, kur formuojasi ascitas.
[0017] 2 pavyzdys. MA specifiškumo tikrinimas netiesioginės IFA metodu. Teigiamų hibridų atrinkimui naudojamas netiesioginės imunofermentinės analizės (IFA) metodas. Plokštelėse sorbuojamas žmogaus augimo hormonas: į šulinėlius įpilama po 0,5 |JLg antigeno 100 įj,1 0,05 m Na-karbonatinio buferio (pH 9,5) ir inkubuojama 16 vai. 4°C temperatūroje. Po to plokštelės šulinėliai blokuojami 1% albumino tirpalu, atplaunami vandeniu ir užpildomi 100 p,l hibridų auginimo terpės. Po inkubacijos (1 vai. kambario temperatūroje) ir atplovimo i, šulinėlius įpilama po 100 jj.1 triušio antikūnų prieš pelės imunoglobulinus, konjuguotų su krienų peroksidaze. Po inkubacijos (30 min. kambario temperatūroje) ir atplovimo
[0018] išryškinama fermentinė reakcija: i šulinėlius ipilama po 100 įj.1 o-fenilendiamino tirpalo (0,5 mg/ml) 0,05 M Na-acetatiniame buferyje (pH 5,5) su 0,03% vandenilio peroksido. Reakcija sustabdoma po 10-15 rain., pridedant po 50 (J.1 10% sieros rūgšties tirpalo. Optinis tankis matuojamas fotometru Tttertek Multtscan ('Tlow"), esant bangos ilgiui 492 nm. Šulinėliuose, kuriuose buvo hibridomų GH-1 ir GH-2 auginimo terpė, optinis tankis viršijo 2 op t. vnt., o tuose šulinėliuose, kuriuose buvo MA neprodukuojančiu, hibridu auginimo terpė - mažesnis nei 0,3 opt. vnt. 3 pavyzdys. MA specifiškumo tikrinimas dviepitopinės IFA metodu. Plokštelės šulinėliuose sorbuojami MA GH-1 (po 1 jig i šulinėli). Po blokavimo ir atplovimo (žr. 2 pvz.) į šulinėlius ipilama po 100 Įil žmogaus augimo hormono tirpalo (20-200 ng/ml) fosfatiniame buferyje su 0,05% detergento Tween - 20 . Po inkubaeijos (1 vai. kambario temperatūroje) ir atplovimo pridedama po 100 įjlI konjugato - MA GH-2, konjuguotų su krienu peroksidaze. Inlmbuojama 1 vai. kambario temperatūroje. Po to plokštelė atplaunama ir išryškinama fermentinė reakcija, kaip nurodyta aukščiau (žr. 2 pvz.). Sios analizės rezultatai parodė, kad MA GH-1 ir GH-2 reaguoja su skirtingais žmogaus augimo hormono epitopais, t.y. buvo stebima tiesioginė optinio tankio priklausomybė nuo antigeno koncentracijos. Naudojant tokioje analizės sistemoje vienodo specifiškumo arba konkuruojančius antikūnus (pvz., GH-1 su GH-1 konjugatu), augimo hormonas nereaguoja su konjugatu ir optinio tankio padidėjimo nestebima. 4 pavy z d y s. Žmogaus augimo hormono nustatymas dviepitopinės IFA metodu. Analizė atliekama tokiu būdu, kaip aprašyta 3 pavysdyje.Augimo hormono koncentracija tiriamuosiuose tirpaluose nustatoma pagal kalibracinę kreivę, kuri atspindi optinio tankio priklausomybę nuo hormono koncentracijos.Tiesinė priklausomybė stebima, esant hormono koncentracijai 5-100 ng/ml. Kalibracinęi kreivei naudojamas standartinis augimo hormono tirpalas (1 fig/ml), kuris atitinkamai atskiedžiamas. Metodo jautrumas - 10 ng/ml augimo hormono. Siuo metodu buvo nustatyta, kad MA GH-1 ir GH-2 vienodai gerai reaguoja su rekombinantiniu ir natūraliu (išskirtu iš hipofizio) žmogaus augimo hormonu, bet nereaguoja su jaučio augimo hormonu. Metodas gali būti panaudotas technologinio proceso kontrolei, gaminant tiek rekombinantini,, tiek natūralu, žmogaus augimo hormoną, o taip pat ir galutinio produkto analizei. Metodas gali būti pritaikytas ir medicininėje diagnostikoje - tais atvejais, kai augimo hormono koncentracija kraujo serume būna padidėjusi (virš 10 ng/ml).
[0019] Hibridomos GH-1 ir GH-2 skiriasi nuo anksčiau aprašyto analogo - hibridomos PTMB 2/3 - pagal šiuos požymius: 1 ) hibridoma I1MR 2/3 produkuoja antikūnus prieš jaučio augimo hormoną; 2) hibridoma MMB 2/3 gauta kitos mielominių ląstelių linijos - X-63 Ag8653 - pagrindu.
[0020] Hibridomos GH-1 ir GH-2 skiriasi nuo anksčiau aprašytų analogų - hibridomų A64-D/E3, AČ4-E/C8, A64-D/F2, A64-E/B12 pagal šiuos požymius: 1 ) minėtos hibridomos gautos, naudojant imunizacijai natūralų žmogaus augimo hormoną, 2) ląstelių hibridizacijai panaudotas sudėtingas elektrofusijos metodas, 3) teigiamų hibridų atrinkimui panaudotas radioimuninis metodas, reikalaujantis ypatingų atsargumo priemonių, 4) hibridizacijai panaudota mielominių ląstelių linija X-63 Ag8653.
[0021] Hibridomų GH-1 ir GH-2 palyginimas su analogais apibendrintas 1 lentelėje.
Hibridomos, produkuojančios pelės monokloninius antikūnus prieš žmogaus augimo hormoną (deponuotos Biotechnologijos institute "Fermentas", deponavimo numeriai H 0304 ir H 0305).