[LT] Sukurtas naujas fermentinis preparatas, gautas iš Streptomyces flavus 197 (deponuotas UAB "Biocentras" mikroorganizmų muziejaus kolekcijos numeris K-91) kultūros skysčio, jį filtruojant, koncentruojant ir iš koncentrato išsodintą organiniais tirpikliais fermentinį kompleksą džiovinant. Gautas fermentinis preparatas yra lizuojančių fermentų kompleksas, pasižymintis proteolitiniu, peptidaziniu, kolagenaziniu bei elastaziniu aktyvumu, efektyviai lizuojantis kai kuriuos gramteigiamus ir gramneigiamus mikroorganizmus, jų tarpe ir patogeninius. Fermentinis preparatas gali būti taikomas medicinoje ir veterinarijoje.
[EN]
[0001] Išradimas priskiriamas mikrobiologijos sričiai. Jis gali būti taikomas biotechnologijoje, veterinarijoje bei medicinoje. Žinomi lizuojančių fermentų kompleksai, gaunami giluminiu būdu auginant Actynomyces kamienus, pvz. fermentinių kompleksas, sintetinamas Actinomyces levoris Nr. 96, lizuoja A grupės streptokokus, taikomas streptokokinių antigenų gavimui. Esminis šio fermentų komplekso trūkumas - siauras lizuojančio veikimo į mikroorganizmus spektras ir gana ilgas jo biosintezės laikas (2-6 paros). (Su aut. 1. Nr.528340)
[0002] Artimiausias siūlomam fermentiniam preparatui yra lizuojančių fermentų kompleksas, sintetinamas Streptomyces griseus 205, kuris lizuoja streptokokus ir stafilokokus, naudojamas veterinarijoje streptokokinių, stafilokokinių infekcijų gydymui bei profilaktikai. Šio fermentinio komplekso trūkumas - ribotas lizuojantis veikimas į mikroorganizmus. Jis lizuoja tik gramteigiamas bakterijas (streptokokus ir stafilokokus) ir ši savybė mažina jo panaudojimo galimybes. (Su aut. 1. Nr.1112778)
[0003] Išradimo tikslas - sukurti naują kompleksinį fermentinį preparatą, efektyviai lizuojantj gramteigiamus ir gramneigiamus, jų tarpe ir patogeninius mikroorganizmus, tinkamą naudojimui medicinoje ir veterinarijoje.
[0004] Išradimo tikslas pasiekiamas sukuriant kompleksinį fermentinį preparatą, kuris gaunamas kultivuojant giluminiu būdu aktinomicetą Streptomyces flavus 197 (UAB "Biocentras", mikroorganizmų muziejaus kolekcinis numeris K-91). Fermentų komplekso išskyrimui kultūrinis skystis filtruojamas, filtratas garinamas, koncentratas džiovinamas purkštuvinėje džiovykloje arba fermentų kompleksas iš koncentrato išsodinamas acetonu santykiu 1:3 ir džiovinamas. Gautas fermentinis preparatas susideda iš lizuojančiu vekimu pasižyminčio fermentų komplekso, kuris naudojamas kovai su patogeniniais mikroorganizmais, ypatingai tais atvejais, kai infekcija atspari antibiotikams.
[0005] Kultūra Streptomyces flavus 197, sintetinanti lizuojančių fermentų kompleksą, išskirta iš dirvos Pietryčių Lietuvoje ir charakterizuojama sekančiomis savybėmis: Morfologinės. Kultūros paviršinis micelis baltas arba bespalvis, vidutinis hifų storis 0,6-0,8 mikronų. Sporos ovalios arba pailgos, paviršius lygus.
[0006] Kultūrinės. Auginant kultūrą Streptomyces flavus 197 ant agarizuotos kukurūzinės terpės Nr.2, susiformuoja gausus micelis (paviršinis - baltas, o substratinis - šviesiai rudas). Ant agarizuotos avižinės terpės formuojasi baltas paviršinis ir smėlio spalvos substratinis micelis.
[0007] Fiziologinės. Aerobas, optimali augimo temperatūra + (28-30) °C, pH 7,0-7,5. Silpnai hidrolizuoja krakmolą, pieną sutraukia ir peptonizuoja, želatiną suskystina. Asimiliuoja gliukozę, sacharozę, fruktozę, ksilozę, neįsisavina arba tik silpnai - manitą ir rafinozę.
[0008] Auginant Streptomyces flavus 197 giluminiu būdu sekančios sudeties terpėje (%): mikroorganizmų baltyminis-vitamininis koncentratas (BVK) - 0,75; fermentinis mikroorganizmų baltyminio-vitamininio koncentrato hidrolizatas - 0,25; natrio chloridas - 0,5; magnio sulfatas - 0,05; kreida - 0,5, po 24-36 kultivavimo valandų 28-30°C temperatūroje išsiskiria lizuojančių fermentų kompleksas, kuris ardo kai kurių gramteigiamų ir gramneigiamų (jų tarpe ir patogeninių) mikroorganizmų ląstelių sieneles; kompleksas pasižymi proteolitiniu, peptidaziniu, kolagenaziniu bei elastaziniu aktyvumu. Fermentų komplekso išskyrimui kultūrinis skystis Streptomyces flavus filtruojamas, filtratas koncentruojamas, 25-30°C temperatūroje, 2,5 karto tūrio atžvilgiu. Fermentų preparato gavimui fermentinis kompleksas iš koncentrato išsodinamas acetonu santykiu 1:3, dializuojamas ir džiovinamas.
[0009] Siūlomo fermentinio preparato - mikroorganizmų ląsteles lizuojančių fermentų komplekso iš Streptomyces flavus 197 veikimo į atskirus mikroorganizmus ir komplekso fermentinio aktyvumo palyginimas su žinomu fermentiniu kompleksu Streptomyces griseus 205 pateiktas 1 lentelėje.
[0010] Preparato fermentinis aktyvumas buvo nustatomas sekančiais metodais: preteolitinis (GOST 202664.2-74), peptidazinis (VVachsmuth E.D., Fritze I., Cleidere G. (1966) Biochemistry, 5, p.179-182.), kolagenazinis (Kundu AK., ir kt. (1974) Indian I.Exper. Biol., t. 17, p.441-443,; Leach A.A, (1960) Biochem. J. Biol. Chem., t. 240, p. 3295-3304.), elastazinis (Norichara K. ir kt. (1965) J. Biol. Chem., t. 240, p. 3295-3304.) ir mikroorganizmų ląstelių lizavimas (Gascon, ir kt. (1968) Arch. Microbiol, t. 51, p. 155-162.).
[0011] Iš pateiktų 1 lentelėje rezultatų matyti, kad fermentų kompleksas Streptomyces flavus 197 pasižymi platesniu lizuojančio vekimo į mikroorganizmus spektru, lizuoja kai kurias gramteigiamas ir gramnegiamas bakterijas, jų tarpe patogeninius mikroorganizmus - ligų sukėlėjus. Tuo tarpu fermentų kompleksas Strepomices griseus 205 lizuoja tik streptokokų ir stafilokokų genties atstovus.
[0012] Ištirtas kamieno Streptomyces flavus 197 kenksmingumas su žiurkėmis, linijos Vistar ir pelėmis, linijos CC57W. Vidutinė virulentinė dozė VD50 nustatyta įvedant mikroorganizmų masę
[0013] (105, 106, 107, 108, 109 ir 1010 ląstelių vienam gyvuliukui) į pilvo ertmę ir į skrandį. Kiekvienoje grupėje buvo 12 pelių ir 12 žiurkių (6 patelės ir 6 patinai). Gyvuliukus stebėjo 30 dienų. Vidutinė virulentinė dozė VD50 Streptomyces flavus 197 pelėms ir žiurkėms sudaro daugiau 1010 mikroorganizmų vienam gyvuliukui. Pagal mikroorganizmų kamienų klasifikaciją Strptomyces flavus 197 yra nekensmingas ir gali būti priskirtas mažai pavojingų mikroorganizmų klasei (4 klasė), t.y. neturinčio bendro toksinio poveikio.
[0014] Ištirtas ir fermentinio preparato iš Streptomyces flavus 197 aštrus toksiškumas. Aštraus toksiškumo tyrimai atlikti su pelėmis linijos CC57VV. Preparatą įvedėmę į skrandį ir stebėjome 30 parų. Nustatyta, kad preparato LD 5o, yra 5000 mg/kg. Sutinkamai su GOST 12.1.007-76 preparatas priskiriamas 4 pavojingumo klasei, t.y. mažai pavojingoms medžiagoms.
[0015] Atsižvelgent į siūlomo kompleksinio fermentinio preparato, išskirto iš Strptomyces flavus 197, fermentinį aktyvumą bei lizuojantį veikimą į mikroorganizmus, jis buvo taikomas patogeninių mikroorganizmų, išskirtų iš ligonių nosiaryklės, dantų, pūlinių žaizdų, ardymui ir gauti teigiami rezultatai, taip pat preparatas efektyviai buvo taikomas nudegimų gydymui, nekrotinių audinių pašalinimui, pooperacinių randų lyginimui ir t.t.
[0016] Gydymui preparatas paruošiamas sekančiai: 4-20 g preparato ištirpinama 100 ml distiliuoto vandens, po to praskiedžiamas 500 ml glicerolio ir gerai sumaišomas. Toks fermentinio preparato tirpalas buvo naudojamas ligonių gydymui.
[0017] Jis buvo naudojamas sekančiai: setonų arba tamponų pagalba buvo dedamas ant žaizdos paviršiaus arba įvedamas į pūlinio ertmę. Gilios pūliojančios žaizdos buvo setonuojamas marliniais tvarsčiais, sumirkytais fermentinio preparato tirpale. Ant nekrozių ir paviršinių žaizdų buvo dedami tirpalu sutepti marliniai tvarsčiai arba tepamas žaizdos paviršius. Ligoniai buvo perrišami kiekvieną dieną. Gydymo efektyvumas fermentiniu preparatu pateiktas 2 lentelėje.
[0018] Jokių alerginių reakcijių ligonių gydymo metu nepastebėta. Tokiu būdu siūlomas fermentinis preparatas gali būti taikomas medicinoje bei veterinarijoje.
1.Kamienas Streptomyces flavus 197 (deponuotas UAB "Biocentras" Nr. K-91) - lizuojančiu veikimu pasižyminčio fermentų komplekso producentas.
2.Fermentinis kompleksas, išskirtas iš mikroorganizmų kamieno Streptomyces flavus 197, pasižymintis- fermentiniais aktyvumais:proteolitiniu (pH - 7,2 - 9,5),peptidaziniu,kolagenaziniu,elastaziniu;- substratiniu specifiškumu:lizuoja sekančių mikroorganizmų sieneles:Clostridium perfringens,Candida utilis,Pseudomonas aerogenosa,stafilokokus,streptokokus.
- fermentiniais aktyvumais:proteolitiniu (pH - 7,2 - 9,5),peptidaziniu,kolagenaziniu,elastaziniu;proteolitiniu (pH - 7,2 - 9,5),peptidaziniu,kolagenaziniu,elastaziniu;- substratiniu specifiškumu:lizuoja sekančių mikroorganizmų sieneles:Clostridium perfringens,Candida utilis,Pseudomonas aerogenosa,stafilokokus,streptokokus.lizuoja sekančių mikroorganizmų sieneles:Clostridium perfringens,Candida utilis,Pseudomonas aerogenosa,stafilokokus,streptokokus.Clostridium perfringens,Candida utilis,Pseudomonas aerogenosa,stafilokokus,streptokokus.3.Fermentinio komplekso, gaunamo auginant mikroorganizmą giluminiu būdu, gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad augina mikroorganizmą Streptomyces flavus 197 terpėje su mikroorganizmų sienelėmis ir mikroorganizmų hidrolizatais, kultūrinį skystį kultivuoja 24-36 vai. 28-30°C temperatūroje, po to kultūrinį skystį filtruoja, filtratą koncentruoja, iš susidariusio fementinio koncentrato fermentinį kompleksą išskiria nusodinant acetonu, po to dializuoja ir džiovina.
4.Būdas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad fermentinį kompleksą išskiria iš kultūrinio skysčio filtrato koncentrato, nusodinant acetonu santykiu 1:3.
5.Fermentinio preparato , skirto kovai su patogeniniais mikroorganizmais, gavimo būdas besiskiriantis tuo, kad fermentinį kompleksą, gautą pagal 3-4 punktus, ištirpina vandenyje santykiu 1:5 iki 1:25, ir gautą praskiestą fermentinio komplekso tirpalą vandenyje skiedžia gliceroliu santykiu 1:5.
6.Fermentinis preparatas gautas pagal 5 punktą, skirtas panaudoti dujinės gangrenos, nekrotinių žaizdų, šautinių žaizdų, randų, pragulu ir nudegimų gydymui.