[LT] Išradimas priklauso ląstelinės biotechnologijos ir veterinarinės imunologijos sričiai. Jis gali būti pritaikytas galvijų leukozės viruso kultivavimui.@Karvės embriono ląstelių kultūra L-BLV pasižymi aukštesniu proliferaciniu aktyvumu nei žinomos kultivuojamos ląstelių linijos Mi ir FLK. Ji gerai auga Rusijos gamybos maitinamose terpėse ir serumuose. Kultūrą galima auginti dideliais kiekiais norint sukaupti žymią viruso masę, kuri reikalinga kaip komponentas, gaminant imunodiagnostikos ir imunoprofilaktikos priemones, o taip pat tiriant galvijų leukozės viruso biologiją bei atliekant retrovirusų antigeninių savybių palyginamąją analizę.
[EN]
[0001] Išradimas priklauso ląstelių biotechnologijos ir veterina-rinės imunologijos sričiai. Jis gali būti pritaikytas galvijų leukozės viruso ( GLV) kultivavimui dideliais kiekiais siekiant pagreitintai sukaupti viruso biomasę, kuri toliau panaudojama kuriant ir gaminant galvijų leukozės imunodiagnostikos ir imu-n©profilaktikos priemones. Pateikta ląstelių kultūra taip pat gali būti panaudota tiriant GLV biologiją, tuo pačiu analizuo-jant retrovirusų antigenines savybes.
[0002] Šiuolaikiniai molekulinės biologijos analizės metodai parodė, kad egzistuoja genetinis heterogeniskumas tarp atskirų to pa-ties viruso štamų, taip pat ir GLV / Burny 17., Bruck C. f Clou-ter Y. et al. Bovine leuker. ia virus as an inducer of bovine leu-kemia // In: Animal models of retrovirus infection and their relationship to AIDS. A. P. llo 4. I& 86. P. 107- 120/. Tokiu būdu, kiekvienos naujos pennisyvinės ląstelių kultūros sukūrimas at-skirų GLV štamų ( izoliatų) reprodukcijai papildo ląstelinių producentų kolekciją ir padeda gauti bei ištirti įvairius uLV genetinius varijantus ir jo antigenus. ( Tai stimuliuoja labiau jautrių imunodiagnostikos ir imunoprofilaktikos priemonių sukū-rimą minėtai retrovirusinei infekcijai.
[0003] Yra žinoma keletas ląstelių linijų, produkuojančių GLV. Svar-biausiu išradimo analogu yra ląstelių linija T3K- MBA- 76 / Ab-TopcKoe CBHfleTeJibCTBO CCCP. 1979. * 702073, kji. C. 12 K 9/ 00/.
[0004] Kūsiniu požiūriu ji pasižymi alogeniškumu, kadangi buvo gauta infekuojant GLV pirminę karvės embriono timuso ląstelių kultūrą. Kultūros trūkumas - GLV genetinis varijabilurxs Štamų atžvil-
[0005] Išradimo analogui galima priskirti ir i' LK ( avies embriono ink-stų) ląstelių liniją. Ji gauta permanentiškai infekavus avies embriono inkstų ląsteles GLV ir intensyviai naudojama kaip GLV producentas ląstelių biotechnologijoje / Van der Ičaaten L. J., Lili e r J. L. Replication of bovine leuke^ iia virus in monolayer cell c ui " bures // JBibl. ilaemstol. i ' ilo . V. '.- 3. P. 3^ 0- 362 (. analogas)/. FLK ląstelių linija infekuota amerikietiškų galvijų leu-kozės virusu. Pagrindinis FLK ląstelių, trūkumas - pačių ląste-lių rūšinis keenogeniškuiaa3, pasireiškiantis sausiu anti^ eni-niu iieterogeniakumu gadinant galutinius produktus. Žinoma, kad galvijų kraujo 3erume gali cirkuliuoti antikūnai prieš avies ląstelių antigenus / Stearii. J., Cutteridge ?. Li., Bufty J. Li. et al. Antiboaies to ovine lymphocytes exist in bovine al-loantisera // Exptl. Glin. Immunogenet. 1566. V. 3. f. Z6- 33/. Šokiu būdu, galima tikėtis, kad naudojantis ksenogeninėnis vi-i- usą produkuojančiomis ląstelėmis galimas galutinio produkto užteršimas rašiniais specifiniais antikūnais, dėl ko gali pa-kisti serologinių teigiamų reakcijų santykis.
[0006] Išradimo prototipu yra ląstelių linija I. Ii 18, kuri naudojama glv produkcijai/ ĄąouaftTeHe A. HeifefticaftTe A. H., Paų-Kyc D. A., CąąaycKac n. B. IIItemm KyjibTHBHpyeuboc KJieTOK iioukh aiitf-pMOHa KopoBbi . iųth KyjibTHBHpoBaHHH BHpyca jiettK03a KpynHoro pora-Toro CKOTa // ABropcKoe cbhfletejibctbo cccp. 1991. * 1652338, kji, c 12 Ii 5/ 00 ( prototipas)/. Ji gauta kokultivuojant pizminę kar-vės embriono inkstų fibroblastų kultūrą su letaliai apšvitinta flk ląstelių linija. Li 18 ląstelių linija, lyginant su ?lk, leidžia gauti galutinį produktą, pasižymintį didesniu lūžiniu antigeniniu hoi. iogeniškumu, kadangi rūšiniu požiūriu yra aloge-ainė. Bet kuriant labiau specifines iir. un o diagnostikos ir inuno-profilaktikos priemones tein tikrų trūkumų gali turėti ir pats ^ nlutinis produktas, gaunamas iš LLi 18 ląstelių linijos, kurios galvijų leukozės virusas yra FLK ląstelių linijos palikuonis, t. y. amerikietiško izoliato. Kaip trūkumas paminėtinas nepakan-kamas proliferacinis linijos aktyvumas.
[0007] Išradimo tikslas - gauti naują ląstelių liniją, produkuojan-čią vietinio ( lietuviško) izoliato gt- lvijų leukozės virusą, kuri pasižymėtų žymiai aukštesniu proliferaciniu aktyvumu ir leistų gauti didesnio imunobiologinio aktyvumo galutinį produktą lyginant su žinomais.
[0008] Prisilaikant aseptikos reikalavimų išimami trijų mėnesių kar-vės embriono plaučiai ir sterilioje Petri lėkštelėje žirklėmis susmulkinami į 1- 3 mm dydžio gabalėlius. Po to atliekama švelni tripsinizacija. Vėliau ląstelės resuspenduojamos Iglo ir 199 terpių mišinyje (1:1), turinčiame lOyė galvijų kraujo serumo, kuris iš anksto buvo patikrintas imunodifuzijos reakcijoje GLV antikūnų atžvilgiu, ląstelių koncentracija skiedžiama iki 5-8x10'* ląst./ml ir inkubuojame esant 37° 0. Pirmas peraėjimas, susiformavus kultūros monosluoksniui, atliekamas po 7 parų, o sekantys - vieną kartą per savaitę. Po trečio peršėjimo (pasa-žo) pirminės kaltūros ląntelės produktyviai infekuojasi GLV. GLV donoru naudojami leukoze sergančios karvės limfocitai (Lietuvos žalųjų veislės). Viruso traiiafekcija atliekama kokulti-vacijos būdu.
[0009] Gautam štamui charakteringas morfologinis' ir kultūrinis stabilumas. Jis pažymimas L- 3LV. L- BLV štamas saugomas specia-lizuotoje ląstelių kultūrų kolekcijoje Rusijoje, Sankt- Peter-burge ( numeris BCKK/ H/ 455$). Ląstelių kultūra yra charakteri-zuojama tokiais požymiais.
[0010] Tai poligonalinės, verpstinės ląstelės, panašios į fibrobla-stus, susisiekiančios viena su kita atšakų pagalba. Turi aiš-kiai išreikštas ribas ir skaidrią citoplazmą. Ląstelės centre -- stambus ovalinės formos branduolys.
[0011] Stacionarinėje kultūroje Iglo ir 199 terpių mišinyje (1:1), kur pridedama I0j& inaktyvuoto galvijų kraujo arba karvės embriono serumo bei antibiotikų įprastinė dozė, ląstelės auga monosluoksnio pavidalu. Optimalus pasėlio tankis - 1-3x10^ ląst./ ml. Ląstelės pasižymi geru adhezyvumu. Tankus nonosluoksnis for-muojasi po 4-5 parų kultivavimo. Persėjant kultūrą monosluoksnio dezintegracija atliekama apdorojant ląsteles 3-5 min 0,25 % tripsino ir 0, 02 % verseno mišiniu (1:1), pašildytu iki 37° C. Ląstelių pasėlio koeficientas 1:3 - 1:5. Persėjimas atliekamas 1-2 kartus per aavaitę.
[0012] L- BLV ląstelių. linijos kariologinė analizė, atlikta. 42 pasa-že parodė, kad chromosomų skaičiaus kintamumo spektras ląstelių populiacijoje gana platus ( 22- 122), aiškiai išreikšta Eneuploi-dija. Hiperdiploidinių l4stelių yra 73 &, chromosomų kiekis mo-dalinėje klasėje 57- 70, modalinės klasės ląstelės sudaro iŠ
[0013] r. krocs.-trinių chro:/osoz.ų - 84 ?, n-aricerinė ra ohravosoinoo r.soire-^.i.at ruot o&.
[0014] L-3L7 ląstelių entivenų imunologinė ęnelizė parodė, kc-d iir-.uno-diifuzijos reakcijoje (IDE) ląstelių ekatraktea reaguoja su triu-šių imuniniu serumu prisS 1-—L7 ląsteles. Imuninis serumas ;rieš L-3LV ląsteles teigiamai re? £ Uoje ILR «u karvės embriono plaučiu ekstraktu, o tai;; pat su galvijų kraujo eerurco baltymais. Viruso
[0015] ir jo antigenų buvimas regiatruojairLFS IDR ^liller Jvsn der Lr.f?wten I." .J. u b e of rlycoprotein anti £ &n in the ir.xiU!iodif funion te*it for bovine leiūe:iic> virus sntibodiea //Surop. J. G«ncer.
[0016] j-177. 7.13. ?• I3cS-I^75/ ir imunofermentinio analizės (IP.0 me-todo pagalba. /r:e«.ssęn^ A«A., Cielkees A.L.J., Qu;jk J. et sl. Stu-dies ori bovine laukomis. Enzyrae-linked imr-iunosorbent a.aaay for the tfetection of mtibodies to bovine leukosis virus //Vetsri-xipr. vjuarter. 1376. V.3. ~o I. P. 31-33/j o taip pat sugebė-jimu sudaryti si^Vbijų in d ik p t o r 3 ji ių ląstelių G2LI kultūroje /ierrer J.P., Gsbracilla G., Gupta P. U> j e of s foline c?. 11 line in tl:e syncytie infectivity aosey for the deteotion of bovine
[0017] le.ukemia virua infeotion in cattle //Amer. J. Vet. Res. I$3I.
[0018] V.42. P. £ -14/. Biocheminių metodų pagalba didžiausias galvijų leukozės virusinių dalelių išėjimas į 1 ąs t e 1 ių - p r o d uc en t ų. kul-tūrinę terpę regis t ruo j ana s 5-6 perą po peršėjimo ir sudaro 10 c -._._ Gc" virusinių dalelių/ml. Tai nustatoma paįal revertazės
[0019] aktyvumą /Jioaca B.II., rpHHfiepr r.M., Meji^paftc fl.A. n ąp. Btmejie-HHe CtPibero BHpyca Jie ft k 03 a H3 npo, ųyųMpyio! HHx KyjibTyp kjistok
[0020] H H3yqeHHe CTa^HJIbHOCTH BHpHOHOB //B KH: PenpOflyKUHH H ( 5hojio-rmiecKHe CBoftcTBa OHKopHpBHpycoB. Pwra: 3nHaTHe. 1979. C. 60-73/.
[0021] Kriokonservavimui buvo naudojamas IeIo ir I9S terpių i.iišinya (1:1), pridedant 10 ji galvijų kraujo arba k ar/ė f., embriono kraujo i.truino. Kaip krioprotektorius naudojamas IC % di^etil'julfok-sidas, esant ląstelių koncentracijai 2-3x10- ląst./:..l. Gyvybin-gų 1ęstelių po atšildymo išlieka 6C-55 %» L-3LV ląstelių sterilumo tyrime (buvo ieškome grybų, bakterijų, mikoplazmų) j/auti nei^iarai rezultatai.
[0022] ■Tiriant !1-- £ LV ląstelių liniją, panaudojant suaugusias ir nau-
[0023] javines beitas peles, patogeninių agentų aptikti nepavyko. L-BLV ląstelių linijos panaudojimas paaiškinamas sekančiais pavyzdžiais.
[0024] I pavyzdys. Proliferacinis aktyvumas. Proliferacinio aktyvumo palyginama jai analizei buvo panaudoti: ląstelių-producen-tų (prototipo) Hi 18 kultūra, vienas iš labai produktyvių ILK ląstelių linijos klonų - FLK 44/2 /Altaner C., JJen J., Zojac V. et al. Isolation and cheracterization of cell clones proou-cinį various amour.ts of bovine leuke-r-ia virus //Folia 3iol.
[0025] (Frague). 1565. V.31. P. 107-114/ (analogas) ir nauja ląstelių kultūra L-BLV. Ląstelės vienodose sąlygose buvo sėjano3 į mst-rasus Iglo ir ISS terpių mišinyje (1:1)» pridedant 10/c įalvi- . jų kraujo serumo bei antibiotikų normali dozė, ir inkubuojenos prie 37° G. Pradinė ląstelių koncentracija visoms kultūroms - 25GCO - 1000 ląst./ml. Vėliau kiekvieną parą, kol kultūra pe-reidavo į stacionarinę augimo fazę, kultūrinis skystis buvo nu-pilamas, raonosluoksnis oezintegruojamas ir ląstelių kiekis skai-čiuojamas Goriajevo kameroje.
[0026] Gauti duomenys parodė, kad ląstelių linija L-BLV pasižymi aukštesniu proliferaciniu aktyvumu. Iš pirmos figūros taetosie, kad L-3LV linijos ląstelės stacionarinę audimo fazę pasiekia viena para ankščiau nei FLK 44/2 ląstelės ir dvi paras - nei Iii 18 kultūros ląstelės. Paraleliai kultūrinėje terpėje, su-rinktoje nuo monosluoksnio, registruojama nepanaudotos gliuko-zės, pagrindinio energijos šaltinio kultūrinėje terpėje, koncentracija ir laktato, ląstelinio metabolizmo produkto, lygis
[0027] /bm0texhojiornh kjiotok smbotiodc //ilofl pefl. P.E.CiiHep, H.b. rpH$-$ HTC M.: ArponponM3flaT. 1969. T. 22. -516 c./, 'j? ar. tikslui yra
[0028] panaudojami -ekspres analizatoriai "Eksanas-6" ir "Eksanas-2"
[0029] (Lietuvos Kokslų akademijos Biochemijos institutas). Antroje a fi&ūroje pateikti rezultatai rodo, kad L-J3LV ląstelės kultūrinė-je terpėje gliukozę sunaudoja 4-tą parą, t.y. viena para anks-čiau nei FLK 44/2 ir trimis paromis anksčiau nei i'.i 16. Iš ant-r ros b figūros mato/.ie, kad L-BLV linijoje laktato sus ik supimas kultūrinėje terpėje vyksta greičiau ir 5-tą parą pasiekiama mak-uir.ie.li koncentracija, t.y. viena para anksčiau nei F La -V4/2 ląs-telių kultūroje ir dviem - nei Iii IS kultūrinėje terpėje.
[0030] Tokiu bucu. naudodami 1- 5LY l* steI3. iį kuitu ra icaip ^ roouce- iitą, lsbiru specifinį galutinį produktą galime įsuti 1- 2 psrom fnka& lau t:ei vertodrrmi kontrolines lustelių kultūras. Tai labsi avarbu atliekant kulti/ aviną dideliais kiekiais* 2 pavyzdys . Anti& eno gavimas IDR. L- BLV ląstelės auginamos kaip ^ prašyt e 1 pavyzdyje panaudojant 1, 5 1 natrsnus arba rolerius. jjąs-;. :elė:. i3 3 J. forr. avus tanki;.. ionoaluokenį ( tai Į/ yksta 0 4- 5 perą), kul-tūrinis skystis . r. uo r. :onoslu. ol:sriio r- iiu- enku^ aa. I^ ur- O'.- luolesnis dezin-te^ ruojp ::as j '- :j . :in 0, 25 triūsiu;; ii* C, 02 ;e verss:io tirpal, :c r. isi-::iu ( 1:1) ir atlieka^- aa oekartetinis p^ rsė jiiaas, persėjinū csnty->is - 1:3- 1:5.
[0031] GL7 antigeno išekyriuv- s iš kultūrinės terpės atliekamas sekan-6 ir. i. Surinktas kultūrinės 11; rpė '* ukystis nuevisainaiasn o n t r ifu-.v- iojant 20 į.. 3 n esant 5000 b os ,/ ao. r-, ir 4° C. 5 up r r, : a t ant a s sure^ ka-į i% leipor. iskai deda^ aa ( ITTI^) 230,^ iki 3l ;■ » ker. centracijos, isuto tirpalo pll ?uly?i?a?a? iki C, 0 - 7»5 pripileat ilsOK ir e;it liayif& inėa naisiklės r:. aiso- na 30 :ziii, po to vėl centrifuįuo^ crr- 20 r. in e.-. ;n. nt 5000 aps./^ in ir 4° C. Susidariusios n;osėdos reauspen-duojai- os :: iz i ol o įini. ?c. s tirpale ( 1/ 100 kultūrinio terpės pradinio tūrio). Gp. utea tirpnl.- fl ?;upil?riao į dializės maišelius ir oiali-y. ucjr- iM.' pvieš fiziologinį tirpalą l parą o s ant 4° 0.
[0032] I'- R>ix, ta-' i a.- tipenąs praskiestai; _ iz3ol-- fliiu tirprlu '. Z:23 įsi. 1. V. :' ;) ttri- kūcjfiuafo IDR, ^. maudojsr. t tęijviprvcie ir r.& i £ , 3 f:.* u3 se-ruii-. us prieš GLV ( Kursko L- 3 ofVoriko £ a"" oybr.). ?. er>kcijOB rezultatai c. pake iviuoįer. d po 48 v/ l. Antigeio titru lrikcaea psakutinis pra-. skiedimss, čuodrmtIf ..- :<.- eoipitptą nu tniįięa:: :% e- ru:au. I- lū»ių rtveįu t itr?i p- pr( ?r;tfi ' o vv o 1:. - 1:0. 15 7 ljtro kultūrinėn tsr. ja \ jl-1.l wr. i- ti iki 1050 oosiiį čir^ outiki^ o, ! cvjį w' li'^ pw;0?H • t•-^ t-.^ ntiįerią serologinėje i;lU' indir^ nohtin&^ e reekcijcat ti-.•.• is>vfc ■■ n ■ :■ ikūn uc prie S 3LV.
[0033] 3 [ F - ryzir3 . :in tipeno ^ r/ ines IPA. Virusą ^ o/ o^ ukaoj- uičioij I.-" iLV Irstei i ct& c3o." if. 2"- iEi kultivuojplokšuif:dUį, n3.'.- ose / iicįr^ auose p. r b - v :>ler:> u<. >se k^ i^' rpr- šyve 1 _ >» e. ourinkte i t- r-jv .-." m * ir* o?ij2* e i edžisi/ : oentrifu^, uoj20 ■„ ?. a \ - c =t 50CO r j, z,/ i.- 51> ".' š°C. i' o ^ o /- iruj- n iil- sck inGi' i~. o est ntrif u^ aojrLnt :;i;pc- rn- = f;.- ntą 2
[0034] ■ c 1. 2CCG0 r- :< c;. / r. in. virš 20 % o p ch? ros ša paęslvėii, ^. ruoštoji oh i' i ii ( Cj C-l.. IG1 j Oj— a i1 O^l Oj- 1.. ..H ou— " erj/ je. " Tusodintss v i rus--' 3 y e s j. s peri duo i zhisu 5 i-' l ?I? buferio ir
[0035] 15 * sachereaės mlsia^je. Viruso suopenaiįoa alikvotea užneštuos tat linijinio 25 - iO 55 g ach aro zi a paciento. Visi aaoharozįn tir-palai ruoSia!-..i tfilE bv-ezyje. Po t c vėl centrifuguojaina 3,5 vai eoent 32000 aps./i'.ln ir 4° G. ZFA par.sudo^a^OB tarybinės i&yboa polisti-rolinSa pazielSs ou ^5 -aicriis plokSe iadiiįnėniis duobutdidLa. Jo.« jr-i"(;ii^iasios vii'tffli.iiu preparatu (0,1 e1 į duobutę), o pr.ti^on^b imo-bilizuojar.:as inkubuojent 12 vai esant 4" C. 3il?nai afiaortuotea br.ltji.iaa nujlauaaraae per 3-5 k.^rtua foB±etiniu buferiniu tirpalu (I'BT), turiičiu C ,05 n T^in-žG, o IV:-f# blokuoja-ias 1 u 2uo«au3 rlbui-o tirpalu p*-r I vai escnt 37° O, po tc duobutis'vėl plrais-s-o.'1 lo'l1. i'-rliav. inkub'jOjaz'ie :ju tiriei.'aif5 £ r-lvi;Jiį ivp.ujo Berūko pc-vy s d šiais, praskieateis I'BT (CaI iii į duobutę).. Kai:> kontrolė pa-naudojasi Kursko biofabriko įja-iyboa teiįiEEi ir nei^ierd Q'?^i;i«i /ries GL7. Po 2 vel inkubavimo e«ent 37° C duobutė3 ttidžisi pra-pleunaaco ir įpilami- po 0,1 ;:?1 carbir.io praaiisc.i:-o rntrJLiiai an-z ikūnai (ciiitiaeruEiaB prieš wL7 ir-uno^lobuliiiiį), p £ žydėti perokai-deze (Rusijos i'.ediclnos mokslų ckEdeiiijoa II.?. GsMalėjos vardo epidemiologijos ir ; i'crob j.ol3. Vos JLnotitutaa). Vėl inkubuo j cm I vol esent 37' C, Po iSpluviso pridedama po 0,1 lO . o-fenilendie-miiio (0,^4 aį/nl ir V0iideni?u3o peroksido (0,05 r^/il). Ksut'-erlo te^iierntCroje lukub jojama 15-25 Itepkeijc ouat-.bfionr. pridėjus
[0036] į kiekvieną duobutę po 0,1 a-1 8 K sieros rūįS-ies. Fcn.entlnėa i-eakciįob produktai nustatomi spektrofotosr.etri5kpi. įeiti?!'■«.■: IFA įeskcijsi (ntikūnr prieS GI7 eptikJiaes) infekuotiem £ .alvij*iis įvertinę.'ie jsgal o:ti".io tenkio a^ni^kį testr.cje'- f j*'.6 ir .lel^ia-vifce (konts-olinia^e) aerraiuose, eesnt 450 n.Ti. Ea»=r.t tei^icrapi IFii ofekei.Vi, -'Kiitirkig „.•cpr-'fit'.-i būn? didesnis nei 2. 133 si: iBąl^&or.iB vc-ata,-crd' toiįi?.iie reflkoije su ■r-eivęnSio leiikoze rr.-lvijo eerir.w
[0037] ■L'o'clu būdu, ciūlOMF 'cr.rv&s esfti'ion^-leufilii ląutelių, kultūrr L-3L7, onmenentiSkei infekuota SLV- produkuoja virusą į kultū-viną tf:rpę žy.!.if:i r-ktyviru. kiiiftto prooucento kt-.ltoriDė tor;.5 ^e-7t.i būti p^-udota, k,-ip viruso ;jurinki:no erl^iuin j-iošisnt įeRt-ęntigenĄ i: u}i o diegti ostinį:-:; rvekciįoįriS (IDH ir IrA) ta.a, k?d fp-^ikti .'..atikūnuG prieš C-L7. L-3L7 l^ttliiį-Tįi-oduoent^ .-io^eniSku-maa ir Jiį produ'cuojenas vietinio isollato GL7 į^ellne sui-inkti ^n 1 utinį į-roduktą, pasižymintį aukštesniu ir.:unobioloįiniij ektyvu-nu. 3«i leis efektyviai panaudoti jį veterinarijoje įeiin-nt ls-'.- £ .3u fjneclfineB i.iunoprofll £ ktines ir ircunoditgr-oatineo ^rie: onea.
[0038] Tuo psčiu ;Jiiėtą oroducentą galim?- nriteikyti kzlj modelį ls-boratoriniams tyrin-ens virusologijoje, t? ir. e tarpe ir į-^rovirusų anti^er.inių savybių p^lyglrie.-eisi analizei.
Karvės embriono plaučių ląstelių kultura BCKK/n/ 455fl, skir-ta galvijų leukozės viruso kultivavimui.