[LT] Siūlomas rinkinys cholesterino vizualiniam nustatymui odos paviršiuje susideda iš konjugato, turinčio giminingumą epidermio cholesterinui ir ryškalo tirpalo, kur pastarasis susideda iš (mg/ml):@citrinos rūgšties1000 - 2000@3,3',5,5'-tetrametil-4,4'-diaminodifenilo70 - 83@vandenilio peroksido250 - 300@dinatrio etilendiaminotetraacetato300 - 400@dinatrio divandenilio pirofosfato15 - 30@acetanilido5 - 30@vandenslikusi dalis iki 1 l @@Konjugatą, turintį giminingumą epidermio cholesterinui, siūloma gauti, veikiant N-vinilpirolidono ir maleino rūgšties anhidrido kopolimerą pradžioje digitoninu, po to prijungiant fermentą peroksidazę, modifikuotą glutaraldehido ir 1,6-heksametilendiamino poveikiu.
[EN] The kit for cholesterol vizualization on a skin comprises conjugate affinitive to epidermis cholesterol and the developing mixture consisting of (mg/ml): citric acid 1000 - 2000 3,3',5,5'-tetramethyl-4,4'-diaminodiphenyl 70 - 83 hydrogen peroxide 250 - 300 ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 300 - 400 pyrophosphoric acid disodium salt 15 - 30 acetanilide 5 - 30 water to 1 liter The process for preparing conjugate having affinity to epidermis cholesterol includes the reaction of N-vinylpyrrolidone and maleic acid conjugate with digitonin and labelling the product with peroxidase modified with glutaraldehyde and 1,6-hexamethylene diamine.
[0001] Išradimas priklauso biologinės ir bioorganinės chemijos sričiai, tiksliau diagnostinėms priemonėms, skirtoms nustatymui susirgimų, kuriems būdingas cholesterino koncentracijos odos paviršiuje padidėjimas pvz., aterosklerozės.
[0002] Rinkiniai, skirti vizualiniam cholesterino nustatymui odos paviršiuje susideda iš 2 pagrindinių komponentų: konjugato, turinčio giminingumą epidermio cholesterinui ir ryškalo tirpalo. Be to, rinkinio sudėtyje būna pagalbiniai komponentai: buferinis tirpalas konjugato ištirpinimui, kitos pagalbinės medžiagos, pipetės ir pan.
[0003] Rinkiniai, skirti vizualiniam nustatymui yra labai populiarūs pastaraisiais metais. Jų privalumas - greitas, paprastas ir akivaizdus tam tikros medžiagos nustatymas.
[0004] Paprastai vizualiniam cholesterino nustatymui konjugatas yra ištirpinamas buferiniame tirpale ir gauto tirpalo lašas užlašinamas ant delno odos. Po tam tikro fiksuoto laiko (pvz., 1 min) konjugato perteklius nuplaunamas vandeniu, o surišto su delno cholesterinu konjugato kiekis įvertinamas pridėjus lašą ryškalo tirpalo pagal spalvotos dėmės susidarymą bei jos intensyvumą.
[0005] Pagrindinio rinkinio komponento. - konjugato, turinčio giminingumą epidermio cholesterinui - artimiausias gavimo būdas aprašytas TSRS autoriniame liudijime SU 1675769. Šiame išradime aprašytas iš esmės panašus konjugato, turinčio giminingumą epidermio cholesterinui, gavimo būdas prijungiant prie N-vinilpirolidono ir maleino rūgšties anhidrido kopolimero pradžioje digitoniną, po to fermentą peroksidazę. Deja, taip gautas konjugatas yra nelabai stabilus ilgai laikant.
[0006] Kito esminio rinkinio komponento - ryškalo tirpalo sudėtis žinoma, pvz., iš apžvalgos [Yu. M. Lopukhin, The Skin and Atherosclerosis, Physicochemical Aspects of Medicine, Reviews, 1992, vol. 3, part 4, psl. 46-501] . Tai yra vandeninis tirpalas, kurio sudėtyje yra N,N-dietil-p-fenillen-diamino sulfatas, vandenilio peroksidas, natrio tiosulfatas, stabilizuojantis tirpalas ir kalio bromidas.
[0007] Toks ryškalo tirpalas yra nestabilus ir gali būti panaudotas (išlieka bespalvis) tik 6-8 valandų laikotarpyje.
[0008] Minėti trūkumai žymiu mastu riboja viso rinkinio panaudojimo klinikinėje praktikoje galimybes.
[0009] Pramoninei rinkinių gamybai būtina, kad rinkiniai išlaikytų savo funkcionąlines savybes pakankamai ilgą laiką ( pvz., 6 mėn. ), reikalingą rinkinio transportavimui, saugojimui iki panaudojimo bei panaudojimo metu. Naudojant šiame išradime pasiūlytos sudėties ryškalo tirpalą ši problema išsprendžiama.
[0010] Tikslu pagerinti komponentų ir viso rinkinio stabilumą, ryškalo tirpalu siūloma naudoti tirpalą, gaunamą "tirpinant vandenyje šiuos komponentus nurodytais kiekiais (mg/l):
[0011] Konjugatą, turintį giminingumą epidermio cholesterinui siūloma gauti, veikiant N-vinilpirolidono ir maleino rūgšties anhidrido kopolimerą pradžioje digitoninu, po to prijungiant fermentą peroksidazę, modifikuotą glutaraldehido ir 1,6-heksametilendiamino poveikiu.
[0012] - konjugatas t.y. N-vinilpirolidino ir maleino rūgšties anhidrido kopolimeras su prijungtais digitoninu ir peroksidaze arba modifikuota glutaraldehido ir 1,6-heksametilendiamino poveikiu peroks-ida-ze; - ryškalo tirpalas; - buferinis tirpalas konjugato ištirpinimui. Ryškalo tirpalas paruošiamas taip: Citrinos rūgštis ištirpinama distiliuotame vandenyje, pridedama koncentruotos druskos rūgšties iki pH 2,5, ištirpinamas 3,3', 5,5'-tetrametil-4,4'-diaminodifenilas, pridedama 10%-nio natrio šarmo tirpalo iki pH 3,5 ir gautame mišinyje ištirpinama 90% viso dinatrio etilendiaminotetraacetato kiekio. Atskirai paruošiamas tirpalas, turintis vandenilio peroksidą, 10% viso dinatrio etilendiaminotetraacetato kiekio," dinatrio divandenilio pirofosfatą ir acetanilidą. Abu tirpalai gerai sumaišomi. Ryškalo tirpalo sudėties įtaką jo stabilumui iliustruoja lentelė.
[0013] Konjugato su modifikuota peroksidaze peroksidazi-nis aktyvumas stabilizuojasi.Tai yra labai svarbu rinkinio naudojimo laikui, kadangi abiejų komponentų stabilumo terminas praktiškai susilygina.
[0014] 200 mg peroksidazės ištirpinami 15 ml 0,2 M fosfatinio buferio, pH 7,0. \ tirpalą lašais pridedami 9,0 ml 25% glutaraldehido tirpalo. Mišinys maišomas 24 vai, po to praplaunamas 6 kartus 0,2 M fosfatiniu buferiu pH 7,0 ultrafiltracijos aparate. Tada į tirpalą pridedamas 1 ml 30% - nio vandeninio 1,6-heksametilendiamino
[0015] tirpalo ir mišinys maišomas 24 vai. Toliau reakcijos mišinys praplaunamas 8 kartus 0,2 M fosfatiniu buferiu ultrafiltracijos aparate. Gautas modifikuotos peroksidazės tirpalas inkubuojamas su N-vinilpirolidono
[0016] ir maleino rūgšties anhidrido kopolimeru, prie kurio prijungtas digitoninas. Gautas tokiu būdu konjugatas išlaiko daugiau 80% peroksidazinio aktyvumo saugojant 6 mėn.
[0017] Šio išradimo panaudojimas suteikia sekančius
[0018] 1. Siūlomo ryškalo stabilumas (laikas per kuri tirpalas išlieka bespalvis) padidėja nuo 6-8 vai iki 6 mėnesių, t.y. 540-720 kartų, o konjugato stabilumas (laikas per kurį išsilaiko ne mažiau 80 % peroksidazinio aktyvumo) padidėja nuo 2-3 mėn. iki 6 mėn., t.y. 2-3 kartus. 2. Konjugato peroksidazinio aktyvumo ir ryškalo tirpalo stabilizavimas pagerina rinkinio ekspluatacines savybes.
1. Rinkinys cholesterino vizualiniam nustatymui odos paviršiuje, susidedantis iš konjugato, turinčio giminingumą epidermio cholesterinui ir ryškalo tirpalo, besiskiriantis tuo, kad ryškalas susideda iš (mg/l):
2. Konjugato, turinčio giminingumą epidermio cholesterinui gavimo būdas prijungiant prie N-vinilpirolidono ir maleino rūgšties anhidrido kopolimero digitoniną ir po to peroksidazę, besiskiriantis tuo, kad peroksidazę modifikuoja, veikiant ją glutaraldehidu ir 1,6-heksametilendiaminu.