[LT] Išradimas priskirtinas medicinai, tiksliau chemijos ir farmacijos pramonei. Išradimo tikslas - technologinio proceso supaprastinimas.@Išradimo esmė yra tame, kad ekstrahuojant augalinę žaliavą etilo spiritu, garinant ištraukas, valant, ekstrahuojant flavonoidus n-butilo spiritu, pakartotinai koncentruojant ir džiovinant, naudoja kanadietiškojo desmodiumo (Desmodium canadense D.C.) žolę, o valymąatlieka 0,3 % želatinos tirpalu ir ekstraktą separuoja.@Pareiškiamas priešvirusinio preparato gamybos būdas supaprastina technologinį procesą, nes vietoj ekstrakto išvalymo dichloretanu naudoja ekstrakto valymą želatinos tirpalu, o laukinį augalą Lespedeza hedysaroides su ribota žaliavos baze pakeičia kultivuojamu augalu kanadietiškuoju desmodiumu. Gatavo produkto išeiga padidėja 2 kartus.
[EN] Process for preparing the antiviral preparation is claimed. The improved technological process includes using the Desmodium canadense plant as a raw material and the step of poduct purification using a gelatine 3 % solution.
[0001] Išradimas priskirtinas medicinai, tiksliau chemijos ir farmacijos pramonei bei susijęs su priešvirusinio preparato gaminimu iš augalinės vaistinės žaliavos.
[0002] Žinomas priešvirusinio preparato "Helepinum" gamybos būdas (žr.buv. TSRS aut. liud. Nr. 648032 TPK A 61 k 35/78, 1977) iš Lespedeza hedysaroides (Pall.) Kitag, antžeminės dalies. Dar žinomas pramoninis "Helepinum" gamybos būdas (žr. Opytno-promyšlennyj reglament na proizvodstvo helepina. //PEZ VILR, No 39-10-077. -M., 1986.-P.86), pagal kurį 20,8 kg Lespedeza hedysaroides ( Pall.) Kitag žolės susmulkina malūnu. Susmulkintą žaliavą patalpina į ekstrahavimo aparatą su maišikliu ir išoriniu šildytuvu, užpila 145 1 trečios spiritinės ištraukos iš ankstesnės įkrovos ir 45 1 50% etilo alkoholio (žaliavos ir tirpiklio santykis 1:7 plius etilo alkoholio tūriui po pseudodugnu užpildyti) ir ekstrahuoja (55-60)°C temperatūroje, nuolat maišant 2 valandas. Ištrauką supila j surinktuvą, žaliavą užpila 50% etilo alkoholio kiekiu, lygiu nupiltam, ir vėl ekstrahuoja 1 valandą. Analogišką ekstrakciją atlieka dar kartą. Pirmos, antros ir trečios ekstrakcijų metu gaunama po 145 1 ištraukų. Pirmą ir antrą ištraukas garina kartu iki 45 1 likučio distiliacijos aparate. Trečią ištrauką panaudoja ekstrahuoti naują augalinę žaliavą. Vandeninį ekstraktą aparate atšaldo ir palieka nusistovėti 12 valandų. Atšaldytą ekstraktą separuoja ir po to valo 2 kartus po 4 1 dichloretanu. Iš išvalyto ekstrakto flavonoidus ekstrahuoja n-butilo alkoholiu, prisotintu vandeniu, 6 kartus po 15 1. Galinama 88 1 n-butilo alkoholio ištraukų, kurias perplauna vandeniu, prisotintu n-butilo alkoholiu. Butanolio ištraukas garina vakuume iki 2,5 1. Gautą likutį laiko 12 valandų (10-12)°C temperatūroje. Preparato "Helepinum" nuosėdas nufiltruoja, praplauna chloroformu 4 kartus po 300 ml ir džiovina. Išdžiovintą "Helepiną" ištirpina 1 litre 50% etilo alkoholio ir džiovina (14-16) valandų (70-75)°C temperatūroje. Preparato išeiga - 40,85% flavonoidų kiekio nuo technologinio proceso pradžios.
[0003] Žinomo būdo trūkumai yra: 1) technologiniame procese naudojami nuodingi sprogimą sukeliantys organiniai tirpikliai chloroformas ir dichloretanas; 2)Respublikoje nėra laukinio augalo Lespedeza hedysaroides ( Pall.) Kitag. žaliavos bazės; 3) Maža preparato "Helepinum" išeiga.
[0004] Nurodytas tikslas pasiekiamas tuo, kad priešvirusinio preparato "Helepinum D" gamybos būdas, ekstrahuojant žaliavą etilo alkoholiu, garinant ištraukas, valant, ekstrahuojant flavonoidus n-butilo alkoholiu, pakartotinai koncentruojant ir džiovinant, naudoja kanadietiškojo desmodiumo žolę
[0005] (Desmodium canadence D.C.), o valymą atlieka 0,3% želatinos tirpalu ir ekstraktą separuoja.
[0006] 15,6 kg kanadietiškojo desmodiumo žolės susmulkina augalinei žaliavai smulkinti skirtu malūnu iki 5 mm didumo dalelių. Susmulkintą žaliavą patalpina į ekstraktorių su maišikliu ir išoriniu šildytuvu. Ją užpila 155 1 trečios ištraukos iš ankstesnės įkrovos ir 45 1 90% etilo alkoholio (santykiu žaliava:ekstrahentas 71:10/ ir 50 1 etilo alkoholio pseudodugnui po ekstraktoriumi užpildyti) ir ekstrahuoja (60-70)°C temperatūroje, nuolat maišant 2 valandas. Ištrauką supila į surinktuvą ir ant augalinės žaliavos užpila 90% etilo alkoholio kiekį, lygų nupiltam, ir vėl ekstrahuoja analogiškomis sąlygomis 1 valandą. Analogišką ekstrakciją atlieka dar kartą. Pirmos ekstrakcijos metu gauna 156 1 ištraukos, antros - 155 1 ir trečiosios -1541. Pirmą ir antrą ištraukas apjungia ir koncentruoja kartu iki 6 1 likučio. Trečią ištrauką naudoja naujos augalinės žaliavos ekstrakcijai. 6 1 koncentruoto ekstrakto maišo su 0,3% želatinos tirpalu, po to separuoja. Flavonoidus iš išvalyto ekstrakto ekstrahuoja n-butilo alkoholiu, prisotintu vandeniu, užpilant 3 kartus po 20 1. Gauna 6 1 n-butanolio ištraukos, kurią praplauna vandeniu, prisotintu n-butilo alkoholiu 2 kartus po 10 1. Gauna 61 n-butanolio ištraukos, kurią garina iki visiško butilo alkoholio pašalinimo. Vandeninį flavonoidų tirpalą sumaišo su 96% etilo alkoholiu ir džiovina vakuuminėje džiovinimo spintoje 5 valandas. Gauna 0,272 kg galutinio produkto "Helepinum D", o tai sudaro 82,07% flavonoidų kiekio nuo technologinio proceso pradžios.
[0007] Preparato "Helepinum D" kiekybinio nustatymo metodika. Apie 0,1 g preparato "Helepinum D" (tiksli masė) suberiama į 250 ml tūrio matavimo kolbą ir ištirpiname 200 ml parūgštinto 95% etanolio. Po to kolbos turinys praskiedžiamas parūgštintu 95% etanoliu iki brūkšnio (tirpalas A). 1 ml gauto tirpalo (tikslus tūris) įpilamas į 25 ml talpos matavimo kolbą ir praskiedžiamas parūgštintu 95% etanoliu iki brūkšnio ir gerai sumaišoma (tirpalas B). Spektrofotometru matuojamas tirpalo B optinis tankis prie 352 nm bangos ilgio 1 cm storio kiuvetėje.
[0008] Palyginimui naudojamas parūgštintas 95% etanolis. Lygiagrečiai matuojamas Valstybinio standartinio liuteolino tirpalo optinis tankis.
[0009] Procentinis flavonoidų kiekis preparate "Helepinum D" (% ), perskaičiuotas absoliučiai sausai medžiagai apskaičiuojamas pagal formule:
[0010] Dc-Valstybinio standartinio liuteolino tirpalo optinis tankis a.\- atsverto preparato masė g aQ- atsverto Valstybinio standartinio liuteolino masė g b- preparato masės netektis džiovinant, procentais
[0011] 1,86 - perskaičiavimo koeficientas į Liuteoliną
[0012] Flavonoidų mišinio kiekis preparate "Helepinum D" turi būti ne mažesnis kaip 55%, perskaičiavus į Liuteoliną ir absoliučiai sausą medžiagą.
[0013] Pastaba 1. Valstybinio standartinio liuteolino tirpalo paruošimas. Apie 0,05 g (tiksli masė) Valstybinio standartinio liuteolino (LFS 42-1709-87) išdžiovinto iki pastovios masės laike 2 vai prie temperatūros nuo 100 iki 105°C, patalpinama į 100 ml talpos matavimo kolbą. Įpilama 50 ml parūgštinto 95% etanolio ir išmaišoma. Po to praskiedžiama parūgštintu 95% etanoliu iki brūkšnio (tirpalas A). 1 ml tirpalo A įpilama į 100 ml matavimo kolbą, praskiedžiama 95% etanoliu iki brūkšnio ir sumaišoma (tirpalas B).
[0014] Pastaba 2. Parūgštinto 95% etanolio paruošimas. 100 ml etanolio sumaišoma su 20 ml 1% vandenilio chlorido rūgšties.
[0015] Tapatybės nustatymas. 1). UV-spektras preparato "Helepinum D" tirpalo, paruošto kiekybiniam nustatymui prie bangos ilgio nuo 230 iki 400 nm turi šviesos sugėrimo maksimumus prie (270±3) nm ir (345±3) nm; minimumus (249 ±3) nm ir (303+3) nm, ekstremumą arba petį prie (261±4) nm. 2). 0,02 g preparato "Helepinum D " tirpina 5 ml 95% etanolyje, įpila 0,15 ml koncentruotos vandenilio chlorido rūgšties ir įberia 0,05 g magnio miltelių. Tirpalas nusidažo raudonai, kas patvirtina flavonoidų buvimą.
[0016] Pareiškiamo būdo privalumai (lyginant su prototipu) : l)Vietoj ekstrakto išvalymo dichloretanu, naudoja ekstrakto valymą želatinos tirpalu. 2)Laukinį augalą Lespedeza hedysaroides su ribota žaliavos baze pakeičia kultivuojamu augalu kanadietiškuoju desmodiumu. 3) Du kartus padidėja gatavo produkto išeiga.
[0017] Atlikus preparato citostatinio aktyvumo tyrimus, panaudojant vištų embrionų fibroblastų kultūrą, nustatyta, kad preparatas "Helepinum D", pagamintas iš kanadinio desmodiumo žolės, kurio koncentracija 62,5 fikg/ml nedavė citostatinių pakitimų.
[0018] Tiriant preparato "Helepinum D" priešvirusinį veikimą, nustatyta, kad prie daugkartinio užkrėtimo 1,10 ir 100 TCDioOj/m^ preparatas "Helepinum D", kurio koncentracija 10 |ikg/ml pilnai inhibavo viruso 1 TCDįoo VPG-1, štamą L2 vištų embrionų fibroblastų kultūroje.
[0019] Preparato, gauto pareiškiamuoju būdu, toksiškumo tyrimai buvo atlikti su 60-čia 3-jų savaičių amžiaus žiurkiukų (patinai, patelės, kūno svoris 34-40 g) ir 50 lytiškai subrendusių žiurkių (patinai, patelės, kūno svoris 150-180 g). Preparatas vieną kartą sugirdomas arba injekuojamas į pilvaplėvės ertmę. Atliekant tyrimus žiurkiukams, jiems buvo sugirdoma 0,5-2,0 ml 5-50% vandeninio preparato tirpalo, žiurkėms buvo sugirdoma 10-80 % vandeninio preparato tirpalo, paruošto prieš naudojimą. Stebėjimai buvo vykdomi 10-15 dienų.
[0020] Suleidus į pilvaplėvės ertmę žiurkiukams vandeninio preparato tirpalo nuo 100 iki 800 |ikg/kg ir žiurkėms - nuo 200 iki 800 )ik/kg intoksikacijos požymių pastebėta nebuvo. Padidinus preparato dozę iki 1000-2000 jik/kg gyvūnai buvo truputį judresni, atsirado dusulys, ausų kaušelio ir uodegos smulkių kraujagyslių hiperemija. Po 20-30 min. sujaudinimo simptomai susilpnėdavo, gyvūnų aktyvumą keitėjų slopinimas. Pavieniai gyvūnai žuvo 2-3 parą.
[0021] Sugirdant preparato dozėmis nuo 10 000 iki 30 000 fjk/ką žiurkiukams ir 10 000 - 50 000 pk/kg žiurkėms, intoksikacijos požymių nepastebėta. Dėl techninių priežasčių daugiau preparato dozių didinti buvo neimanoma.(Lentelė ).
[0022] Tokiu būdu, tyrimų rezultatai, gauti atlikus preparato toksiškumo tyrimus, vieną kartą sugirdant arba injekuojant j pilvaplėvės ertmę preparatą parodo, kad preparatas santykinai nenuodinga medžiaga, statistiškai patikimų nukrypimų preparato jautrumo tarp lytiškai subrendusių žiurkių ir 3-jų savaičių žiurkiukų nepastebėta.
[0023] Su preparato "Helepinum D" gauto iš kanadinio desmodiumo žolės vaistų formomis: Helepinum D 1% ir 5% tepalu ir Helepinum D tabletėmis po 0,25 g atlikti klinikiniai tyrimai su 408 ligoniais, tame skaičiuje su 165 vaikais nuo 2 iki 14 metų amžiaus.
Priešvirusinio preparato "Helepinum D" gamybos būdas, ekstrahuojant augalinę žaliavą etilo alkoholiu, garinant ištraukas, valant, ekstrahuojant flavonoidus n-butilo alkoholiu, pakartotinai koncentruojant ir džiovinant, besiskiriantis tuo, kad preparato gamybai naudoja kanadietiškojo desmodiumo žolę ( Desmodium canadense D. C.), o valymą atlieka 0,3% želatinos tirpalu ir ekstraktą separuoja.