[LT] Mielės Saccharomyces cerevisiae, produkuojančios didelius kiekius žmogaus hepatito B viruso paviršiaus antigentų HBsAg, HBpreS2Ag ir HBpreS1AG, sukonstruotos panaudojant genų inžinerijos metodus. Efektyvi antigenų biosintezė mielėse pasiekia panaudojus hibridinį reguliuojamą mielių promotorių, susidedantį iš genų GAL1 ir PYK1 promotorių dalių. Rekombinantinių plazmidžių stabilumui užtikrinti bei produktyvių kamienų atrankai panaudotas mielių Candida maltosa genas, apsprendžiantis atsparumą formaldehidui. Šio geno panaudojimas leidžia auginti rekombinantinius kamienus bet kokios sudieties maitinamose terpėse.
[EN]
[0001] Išradimas priklauso biotechnologijos sričiai ir apibrėžia žmogaus hepatito B viruso paviršiaus antigenų producentų gavimo būdą mielese Saccharomyces cerevisiae. Hepatito B viruso antigenai gali būti naudojami efektyvių rekombinantinių vakcinų ir diagnostikumų kūrimui.
[0002] Dauguma iš žinomų žmogaus hepatito B viruso paviršiaus antigenų gavimo būdų remiasi rekombinantinių mielių kamienų panaudojimų. Mielės naudojamos nes jose vyksta 22nm dalelių, sudarytų iš imunologiškai aktyvaus baltymo, susidarymas. Šios dalelės analogiškos 22 nm dalelėms aptinkamoms žmonių-hepatito B viruso (HBV) nešiotojų kraujo plazmoje.
[0003] Žmogaus hepatito B viruso paviršiaus antigenų sintezė mielese pasiekama panaudojant rekombinantines plazmides, turinčias efektyvius reguliacijos elementus (reguliuojamus promotorius, transkripcijos terminatorius), o taip pat priklauso nuo recipientinio mielių kamieno.
[0004] Patentuose aprašyta visa eilė plazmidžių apsprendžiančių žmogaus hepatito B viruso paviršiaus antigenų HBsAg,HBpreS1Ag ir HBpreS2Ag sintezę: Pyki-6, GAP1-6 ir kt.pagal EP 0164556,tarp.kl.C12N 15/00,1985; pHBSGAP 347/33T ir pHBpreSGAP 347/33T pagal EP 0174444,1986; pYGAP/pSSA, pYGAP/pSSC, pYGAL/pSSA,pYGAL/pSSC,
[0005] pYADH2/pSSA ir pYADH2/pSSC pagal EP 0244924,1987;
[0006] pGG6, pGG61/Tn-1 ir pGG63 pagal EP 0248410, 1987;
[0007] pHBpreSGAP 347/19T ir pYGpreS2S1 pagal EP 0312159,1989;
[0008] pT305A ir pHBS pagal EP 0339567,1989 ir EP 0341746,1989;
[0009] pPHO P31-R, pPHO P31-W, pGLD P31-R ir pPKT P31-R pagal EP 0401941, 1990.
[0010] pagal AU-B-16750/83,1983; pAH201,pAH203 ir pAH205 pagal SU 1387878, 1988 ir pNMVG 39-54 pagal SU 1380207.
[0011] Šių plazmidžių panaudojimas neužtikrina labai efektyvaus HBV paviršinių antigenų sintezės lygio. Be to, patentuose neminima visų trijų baltymų HBSAg, HBpreSIAg ir HBpreS2Ag, aptinkamų žmonių HBV nešiotojų kraujo plazmos 22nm dalelėse, sintezė.
[0012] Artimiausias čia aprašytam žmogaus hepatito B viruso paviršiaus antigenų gavimo būdui yra EP 0164556, tarp. kl.
[0013] C 12 N 15/00, 1985 aprašytas Pyk5 plazmidės konstravimo būdas. Pyk5 plazmidė sudaryta iš mielių markerinio geno LEU2, 2mkm Saccharomyces cerevisiae plazmidės ori srities, geno, koduojančio atsparumą ampicilinui ir S geno, koduojančio žmogaus hepatito B viruso paviršiaus antigeną, kurio ekspresija reguliuojama hibridiniu GAL 1-10-PYK promotoriumi ir ADH1 transkripcijos terminatoriumi.
[0014] Toliau pateikiamas Pyk5 konstravimo būdas. pLGSD5 plazmidė buvo suskaldyta XhoI resitriktaze, paveikta Klenovo fermentu, liguoti EcoRI linkeriai (GGAATTCC), po to pilnai suskaldyta EcoRI ir Sau3A restriktazėmis ir išskirtas 370 b.p. fragmentas. Šis fragmentas buvo klonuotas pBR322 plazmidėje perskeltoje EcoRI ir BamHI restriktazėmis, gauta plazmidė pBRGAL4.pBRGAL4 plazmidė buvo suskaldyta Sau3A restriktaze, paveikta Klenovo fermentu, liguoti Salį linkeriai(CGTCGACG), po to apdorota Salį ir XhoI restriktazėmis, izoliuotas 370 b.p. fragmentas kuris klonuotas į plot5 plazmidės restriktazės Salį skėlimo saitą ir gauta plot 5GAL4/370. Gautą plazmidę perskelė BamHI ir Salį, išskirtą fragmentą klonavo į pC1/1 plazmidę apdorotą
[0015] BamHI ir Salį ir gavo plazmidę pC1/1GAL4/370. Plazmidę plot5 PyksAg57 perskėlė Salį ir Xbal restriktazėmis, išskyrė
[0016] fragmentą, turintį geno PYK1 promotorių ir geno 3 5' galą ir ligavo su Xbal-Sall fragmentu gautu iš plot 5s AgtADH plazmidės ir turinčiam S geno 3' galą ir geno ADH1 transkripcijos terminatorių. Gautą produktą skaldė restriktaze Salį ir klonavo į plazmidės pC1/1GAL4/370 Salį saitą ir gavo Pyk5 plazmidę.
[0017] Pagrindinis duotos žmogaus hepatito B viruso paviršiaus antigenų ekspresijos mielėse Saccharomyces carlsbergensis sistemos trūkumas yra būtinumas naudoti leu2 mutaciją turinčius kamienus ir to pasekoje šių kamienų, turinčių rekombinantinę PYK5 plazmidę, kultivavimui panaudoti minimalias mitybines terpes. Mielių kamienai produkuojantys žmogaus hepatito B viruso paviršiaus antigenus tokiose terpėse auga lėtai, ląstelių biomasės ir rekombinantinio baltymo išeiga yra maža. Maksimali imunologiškai aktyvaus baltymo HBsAg išeiga apsprendžiama Pyk5 plazmidės sudaro 1,4 mg/g tirpaus baltymo. Maksimalus produktyvumas šioje sistemoje naudojant kitus promotorius sudaro 2,1mg/g.
[0018] Mūsų išradimo tikslas yra žmogaus hepatito B viruso paviršinių antigenų HBsAg, HBpreSIAg ir HBpreS2Ag biosintezės padidinimas mielėse S. cerevisiae.
[0019] Viruso antigeninių baltymų biosintezės padidėjimas yra pasiekiamas panaudojant naujas rekombinantines plazmidės pFS19, pFpS2-48 ir pJLFdSI, koduojančias HBV paviršiaus antigenų sintezę, ir naujus S.cerevisiae kamienus (FH4C[pFS19], FH4C[pFpS2-48] ir FH4C[pJLFdSI]) produkuojančius 40-80 mg antigeninio baltymo 11.kultūros (0,4-0,8% imunologiškai aktyvaus baltymo nuo bendro tirpaus ląstelinio baltymo).
[0020] Rekombinantinė plazmidė pFS19, koduojanti HBsAg baltymo sintezę, pasižymi šiomis savybėmis:
[0021] - Kpnl-Xbal plazmidės pTZl9R fragmento, turinčio geną, apsprendžiantį atsparumą ampicilinui ir E.coli ori sritį; - XbaI-BamHI Candida maltosa DNR fragmento,turinčio geną FOR-R, apsprendžiantį atsparumą formaldehidui; - Eco1471 - HindiI fragmento, turinčio geno GAL1-10 transkripcijos aktyvatorių, PYK1 geno promotorių, žmogaus hepatito viruso S geną, PGK1 geno transkripcijos terminatorių; - HindlII-Eco911 2mkm mielių plazmidės fragmento, turinčio mielių ori sritį; - atsparumą formaldehidui koduojančio geno FOR-R, reikalingo transformantų atrinkimui; - turi unikalias restriktazių BamHI, BglII ir Salį atpažinimo vietas.
[0022] Rekombinantinė plazmidė pFpS2-48, koduojanti žmogaus hepatito B viruso HBpreS2Ag paviršiaus antigeno sintezę, pasižymi šiomis savybėmis: - yra 10,8 tūkst.b.p. dydžio;
[0023] - Kpnl-Xbal pTZ19R plazmidės fragmento, turinčio geną, apsprendžiantį atsparumą ampicilinui; - XbaI-BamHI Candida maltosa DNR fragmento,turinčio geną FOR-R, apsprendžianti atsparumą formaldehidui; - Ncol-HindlII fragmento, turinčio GAL1-10 geno transkripcijos aktyvatorių, geno PYK1 promotorių, žmogaus hepatito B viruso preS2 geną ir PGK1 geno transkripcijos terminatorių; - HindlII-Eco91I mielių 2mkm plazmidės DNR fragmento, turinčio mielių ori sritį; - turi atsparumo formaldehidui geną FOR-R, reikalingą transformantų selekcijai; - turi unikalias restriktazių BamHI, BglII ir Salį atpažinimo vietas.
[0024] Rekombinantinė plazmidė pJLFdSI, koduojanti žmogaus hepatito B viruso HBpreSIAg paviršiaus antigeno sintezę, pasižymi sekančiomis savybėmis:
[0025] - Xbal-Pstl C. maltosa DNR fragmento, turinčio geną FOR-R, apsprendžiantį atsparumą formaldehidui; - Eco91I-HindIII mielių 2mkm plazmidės fragmento, turinčio mielių ori sritį; - HindlII-EcoRI fragmento, turinčio PGK1 geno transkripcijos terminatorių, PYK1 geno promotorių ir žmogaus hepatito B viruso preSl geną; - EcoRI-Bsp68I fragmento, turinčio geno GAL1-10 transkripcijos aktyvatorių, mielių URA3 geną, atsparumo ampicilinui geną ir E. coli ori sritį; - turi geną FOR-R, apsprendžiantį atsparumą formaldehidui; - turi unikalias restriktazių BamHI ir BglII atpažinimo vietas.
[0026] Pagrindinis plazmidžių pFS19, pFpS2-48 ir pJLFdSI konstravimo principas yra sujungimas vienoje plazmidėje dominantinio, transformantų atrinkimui skirto FOR-R geno kartu su pre-Si, preS2 arba S genais, kurių ekspresija reguliuojama hibridiniu, galaktoze indukuojamu GAL1-10 - PYK1 promotoriumi ir PGK1 transkripcijos terminatoriumi, bei su 2mkm mielių plazmidės ori sritimi ir E.coli genu, koduojančiu atsparumą ampicilinui. Dominantinio, transformantų selekcijai skirto FOR-R geno klonavimas apima Candida maltosa genų banko gavimą panaudojant bifunkcinį mielių vektorių, mielių Saccharomyces cerevisiae transformaciją šiuo genų banku selekcijai naudojant LEU2 markerį, transformantų, galinčių augti terpėje su formaldehidu, selekciją, plazmidžių išskyrimą iš formaldehidui atsparių transformantų, geno FOR-R subklonavimą ir pirminės sekos nustatymą.
[0027] Pagrindiniai žmogaus hepatito B viruso paviršiaus antigenų producentų konstravimo etapai yra šie: 1. Dominantinio, transformantų selekcijai reikalingo geno FOR-R, apsprendžiančio atsparumą formaldehidui, klonavimas. 2. Piruvatkinazę koduojančio PYK1 ir fosfogliceratkinazę koduojančio PGK1 genų klonavimas. 3. Ekspresijos kasetės, sudarytos iš PYK1 ir GAL1-10 genų promotoriaus ir PGK1 geno terminatoriaus konstravimas. 4. Plazmidžių, koduojančių žmogaus hepatito B viruso paviršiaus antigenų sintezę mielėse konstravimas. 5. Saccharomyces cerevisiae kamienų su sumažintu proteolitiniu aktyvumu ir superprodukuojančių žmogaus hepatito B viruso paviršinius antigenus paieška.
[0028] Naujų S. cerevisiae kamienų, žmogaus hepatito B viruso paviršiaus antigenų superproducentų gavimas pagrįstas laukinio tipo kamienų transformacija pFS19, pFpS2-48 ir pJLFdSI plazmidėmis, panaudojant FOR-R markerinį geną, po to atrenkant geriausius producentus tarp jų.
[0029] Saccharomyces cerevisiae FH4C[pFS19] (bkum y1831) kamienui, produkuojančiam žmogaus hepatito b viruso paviršiaus antigeną, būdingi šie požymiai: Morfologiniai požymiai. Ląstelės ovalios formos.
[0030] Kultūros požymiai. Ląstelės gerai auga ant YEPD terpės (2% peptono, 2% gliukozės, 1% mielių ekstrakto, 2% agaro). Auginant ant kietos terpės - lygios baltos kolonijos, kurios ilgiau laikant tampa raukšlėtomis. Gerai auga skystoje YEPD terpėje, turinčioje 2% peptono, 2% gliukozės ir 1% mielių ekstrakto.
[0031] Biologiniai-fiziologiniai požymiai: Ląstelės auga nuo 10t iki 37 °C temperatūroje, pH optimumas nuo 5.0 iki 6.0.
[0032] Azoto šaltyniu - amonio druskas, peptoną, triptoną.
[0033] Neįsisavina laktozės, celobiozės, citrinos rūgšties, o-ksilozės, L-arabinozės, D-ribozės, L-ramnozės.
[0034] Atsparios formaldehidui iki 10mM kone. Pasižymi sumažintu proteolitiniu aktyvumu.
[0035] S. cerevisiae FH4C[pFpS2-48] (bktim Y1833) kamienui, produkuojančiam žmogaus hepatito B viruso HBpreS2Ag baltymą, ir FH4C[pJLFdSi] (BKnM Y1832), produkuojančiam HBpreSI baltymą, būdingos analogiškos kultūrinės-morfologinės ir fiziologinės-biocheminės savybės.
[0036] Fig.1 pavaizduota geno, apsprendžiančio atsparumą formaldehidui, klonavimo schema. Fig.2 - FOR-R geno nukleotidinė seka. Fig.3 pateikta pPT plazmidės, turinčios PYK1 promotorių ir PGK1 geno transkripcijos terminatorių, konstravimo schema. Fig.4 plazmidės p37pS2-2 konstravimo schema. Fig. 5,6,7 - pFpS2-48, pFS19 ir pJLFdSI plazmidžių, koduojančių žmogaus hepatito B viruso paviršiaus antigenų sintezę, konstravimo schemos.
[0037] 1 pavyzdys. Dominantinio FOR-R geno, reikalingo transformantų selekcijai, klonavimas.
[0038] Candida maltosa mielės buvo auginamos iki vėlyvosios logaritminės fazės YEPD terpėje ir iš ląstelių buvo išskirta chromosominė DNR, Chromosominę DNR dalinai restriktavome Sau3A restriktaze ir gautus fragmentus ligavome su pL3 plazmide perskelta BamI restriktaze ir paveikta šarmine fosfataze. Liguota DNR buvo panaudota kompetentinių Escherichia coli HB101 kamieno ląstelių transformacijai. Rekombinantinės DNR išskyrėme iš E. coli ir tokiu būdu gautu C. maltosa genų banku transformavome S.cerevisiae DBY746 (his3 leu2 trp1 ura3). Po transformacijos ląsteles išsėjome ant minimalios terpės, turinčios po 50mkg/ml histidino, uracilo ir triptofano. Leu+ transformantai buvo pernešti ant pilnavertės YEPD terpės, turinčios 3-10 mM formaldehido. Atrinkti S. cerevisiae transformantai, augantys ant terpės su formaldehidu. Analizuojant plazmides, išskirtas iš mielių transformantų, atsparių formaldehidui ir retransformuotų į E.coli, buvo pastebėta, kad visos plazmidės turi bendrą Candida maltosa DNR fragmentą. Subklonavimo būdu buvo izoliuotas 3.6 tūkst.b.p. XbaI-BamHI C. maltosa DNR fragmentas, koduojantis atsparumo formaldehidui geną FOR-R ( pRA1 plazmidė, Fig.1). BanrH)-XbaI fragmentas buvo sekvenuotas ir aptiktas 1 ilgas atviras skaitymo rėmelis, turintis introną ir koduojantis baltymą susidedantį iš 381 amino rūgšties (Fig.2). FOR-R genas, klonuotas gaugiakopijinėse plazmidėse, turinčiose 2mkm mielių DNR ori sritį, apsprendžia transformantų atsparumą 3-10 mM formaldehido ir leidžia transformuoti laukinius S. cerevisiae kamienus.
[0039] Norint klonuoti PYK1 (piruvatkinazės) ir PGK1 (fosfogliceratkinazės) genus, S. cerevisiae genų banku, sukonstruotu pL3 plazmidės pagrindu, buvo transformuoti DFY331 (leu2 pgkl) ir Pyk1-5(ade1 leul met14 ura3 pyki-5) S. cerevisiae kamienai ir išsėti ant sintetinių terpių be leucino su gliukoze kaip anglies šaltiniu. Kamienai su mutacijomis pyki ir pgkl negali augti terpėje su gliukoze. Iš išaugusių transformantų buvo išskirtos plazmidinės DNR ir subklonavimo būdu buvo izoliuoti PYKI ir PGM genai ( Fig.3 pL3-pyk ir pL3-pgk plazmidės). 3 pavyzdys. Ekspresijos kasetės, susidedančios iš PYK1 promotoriaus ir PGK1 terminatoriaus, konstravimas.
[0040] Klonuoti PGK1 ir PYK1 genai panaudoti reguliatorinių elementų šaltiniais konstruojant ekspresijos vektorius. pL3-PGK plazmidę restriktavome BglII ir HindlII restrikazėmis. Išskirtą 0.38 tūkst.b.p. fragmentą, turintį PGK1 geno transkripcijos terminatorių, klonavome į pIC19R plazmidę (March ir kt., Gene, 1984, t32, 481-485p.) perskeltą BglII ir HindlII restriktazėmis. Naujai gautą plazmidę pavadinome pPGKT. pL3-PYK plazmidę restriktavome EcoRI ir BglII, išskyrėme 1.0 tūkst.b.p. fragmentą, turintį PYK1 geno promotorių ir ligavome su pPGKT plazmidę, perskeltą EcoRI ir BglII restriktazėmis. Gavome pPT plazmidę (Fig.4). pPT plazmidė turi ekspresijos kasetę susidedančią iš PYK1 geno promotoriaus (EcoRI-XbaI) ir PGK1 transkripcijos terminatoriaus (BglII-HindlII).
[0041] 50 mkg plazmidės pH320 ( nyMneH H flp. HAH CCCP, 1983. T.271 c.230-235) restriktavome DraI restriktaze (100 vnt.) 200mkl buferio B ( 10mM tris-HCl, 10mM MgCl, 1mM DTT; pH 7.50) 2val. 37°C, po to restriktazę inaktyvavome inkubuodami 70°C 20min. DNR išsodinome pridėję 2 tūrius etanolio, centrifugavome 3min. 15000 aps/min, DNR ištirpinome 200 mkl ligavimo buferio (50mM tris-HCl, 10mM MgCl, 10 mM DTT; pH 7.5) pridėjome adenozintrifosfato (ATP) 0.01 opt. vnt. BglII linkerių ir 50 vnt. T4 DNR ligazės, ligavome 16 vai. 12° temperatūroje.
[0042] Gauta. DNR mišinį išsodinome etanoliu, ištirpinome 200 mkl buferio 0 (50mM tris-HCl, 10 mM MgCl, 100 mM NaCl, imM DTT;pH 7.5) ir paveikėme 50 vnt. BamHI restriktazės ir 100 vnt. BglII restriktazės 2 vai. 37° temperatūroje.
[0043] Po elektroforezės 1% agarozės gelyje išskyrėme 1.68 tūkst.b.p. dydžio BamHI-BglII fragmentą ir ligavimo buferyje ligavome su 3mkg pIC19R plazmidės, perskeltos BglII restriktaze.
[0044] DNR mišiniu po ligavimo transformavome kompetentines E. coli HB101 kamieno ląsteles, transformaciją vykdėme inkubuodami 1 vai. 0°C ir 5 min. 42° C temperatūroje. Po to ląstelių mišinį 10 kartu atskiedėme LB terpe (1% triptono,0.5% mielių ekstrakto, 1% NaCl) ir inkubavome 37° C 1 vai., po to išsėjome ant agarizuotos LB terpės su ampicilinu (100 mkg/ml). Tarp transformantų restrikcinės analizės būdu buvo atrinkti klonai, turintys pICl9RS plazmidę. 50mkg pIC19RS plazmidės skaldėme Eco147I restriktaze (100vnt.) 2 vai. 37° C 200 mkl buferio B. Gautą reakcijos mišinį veikėme fenolo-chloroformo 1:1 mišiniu, centrifugavome, DNR persodinome etanoliu, tirpinome 200 mkl ligavimo buferio su ATP ir pridėjome 0.1 opt.vnt. sintetinio oligonukleotido iš 53 b.p., homologiško 5' preS2 geno galui:
[0045] Ligavome 16 vai. 12° C temperatūroje. Reakcijos mišinį, po ligavimo 20 min. kaitinome 70° C temperatūroje. DNR persodinome etanoliu, ištirpinome 200 mkl buferio 0, pridėjome 10 vnt. restriktazės BglII ir 200 vnt. restriktazės Xbal ir inkubavome 2 vai. 37° C temperatūroje.
[0046] Šį mišinį frakcionavome 1% agarozės gelyje, išskyrėme 0.85 tūkst.b.p. XbaI-BglII fragmentą, kurį ligavome su 3 mkg pP-T plazmidės, perskeltos Xbal ir BglII restriktazėmis.
[0047] Po ligavimo gautu mišiniu transformavome E. coli HB101 kamieno kompetentines ląsteles ir išsėjome ant LB terpės su ampicilinu. Atrinkti klonai,turintys plazmidę p37-pS2-1.
[0048] 50mkg p37-pS2-1 ištirpinome 200 mkl buferio G (10mM tris-H.C1, 10mM MgCl, 50mM NaCl, 1mM DTT; pH 7.5) pridėjome po 100 vnt. KpnI ir HindlII restriktazių ir inkubavome 2 vai. 37° C temperatūroje. Gautą mišinį frakcionavome 1% agarozės gelyje ir išskyrėme 1.5 tūkst.b.p. KpnI - HindlII fragmentą, kurį ligavome su 3 mkg pTZ19R plazmidės ( Pharmacia, Švedija ), suskaldytos KpnI - HindlII restriktazėmis.
[0049] Gautu mišiniu transformavome E. coli DH5a kamieno kompetentines ląsteles ir išsėjome ant LB terpės su ampicilinu. Tarp transformantų buvo atrinkti klonai, turintys p37-pS2-2 plazmidę (Fig. 4).
[0050] 50mkg p37-pS2-2 ištirpinome 200 mkl buferio R (10mM tris-HC1, 1OmM MgCl, 1OOmM KC1, 1mM DTT; pH 8.5), pridėjome 100 vnt. EcoRI restriktazės ir inkubavome 2val. 37° C temperatūroje.
[0051] DNR persodinome etanoliu ir ištirpinome 200 mkl Klenovo fermento buferio (50 mM tris-HCl, 6 mM MgCl2 ,1mM merkaptoetanolio;
[0052] pH 7.6 ) pridėjome iki 0.1 mM koncentracijos dezoksi-nukleotidtrifosfatų, 3 vnt. Klenovo fermento ir inkubavome 30 min. 20° C temperatūroje. Po to reakcijos mišinį 20 min. inkubavome 70° C, DNR persodinome etanoliu, ištir-pinome 200 mkl buferio R, pridėjome 100 vnt. restriktazės ir inkubavome 2 vai. 37° C temperatūroje.
[0053] Gautą mišinį frakcionavome 1% agarozės gelyje ir išskyrėme I.5 tūkst.b.p. EcoRI-HindlII fragmentą , kurį ligavome su 3mkg YepSecl plazmidės (Baldari ir kt., EMBO J.,1987, t.6, p 229-234) restriktuotos HindlII ir XhoI restriktazėmis ir paveiktos Klenovo fermentu.
[0054] Po ligavimo gautu mišiniu transformavome E.coli HB101 kamieno kompetentines ląsteles ir išsėjome ant LB terpės su ampicilinu. Atrinkti klonai, turintys p6pS2 plazmidę. 50 mkg p6pS2 plazmidės ištirpinome 200 mkl buferio 0, pridėjome po 50 vnt. Ncol ir Eco91I restriktazių ir inkubavome 2 vai. 37° C temperatūroje, po to inaktyvavome fermentus 20min. 70° C. DNR persodinome etanoliu, ištirpinome 200 mkl Klenovo fermento buferio, pridėjome dezoksinukleotidtrifosfatų, 3 vnt. Klenovo fermento ir inkubavome 1 vai. 20°C temperatūroje. Gautą mišinį frakcionavome agarozės gelyje, išskyrėme 4.3 tūkst.b.p. Ncol-Eco91I fragmentą ir jį ligavome su 3 mkg pRA1 plazmidės, perskeltos SmaI restriktaze.
[0055] Po ligavimo gautu mišiniu transformavome E. coli HB101 kamieno kompetentines ląsteles ir išsėjome ant LB terpės su ampicilinu. Tarp gautų klonų buvo atrinkti turintys pFpS2-48 plazmidę (Fig. 5 ).
[0056] 1. Atsparumo ampicilinui geno buvimas įrodomas E. coli kamieno, turinčio plazmidę pFpS2-48, sugebėjimų augti agarizuotose terpėse, turinčiose nuo 50 iki 100 mkg/ml ampicilino. 2. Atsparumo formaldehidui geno FOR-R buvimas įrodomas S. cerevisiae kamieno, turinčio plazmidę su FOR-R genų, sugebėjimu augti agarizuotose terpėse, turinčiose 3-10 mM formaldehido. 3. Plazmidės pFpS2-48 sugebėjimas koduoti žmogaus hepatito B viruso paviršiaus antigeno HBpreS2Ag sintezę įrodomas transformuojant šia plazmidę S. cerevisiae FH4C kamieną, atrenkant atsparius formaldehidui transformantus, po to tikrinant antigeno produkciją gautuose transformantuose radioimunologiniu metodu. Duomenys pateikti šio kamieno aprašyme. 4. Skaldant pFpS2-48 plazmidę EcoRI restriktaze gauname 1.0, 4.8 ir 4.9 tūkst.b.p. dydžio fragmentus. Skaldant BamHl ir BglII restriktazėmis - 2.1 ir 8.7 tūkst.b.p. dydžio fragmentus. Skaldant PstI restriktaze - 0.5, 2.2 ir 8.1 tūkst.b. p. dydžio fragmentus.
[0057] 50 mkg p37pS2-2 plazmidės, gautos kaip aprašyta 4 pavyzdyje, ištirpiname 200 mkl buferio R, pridėjome 100 vnt. Hin6I restriktazės, inkubavome 2 vai 37° C.
[0058] DNR persodinome etanoliu, ištirpinome 200 mkl Klenovo fermento buferio, pridėjome dezoksinukleotidtrifosfatų, 3 vnt. Klenovo fermento ir 30 min inkubavome 20°C, po to inaktyvavome 20 min. 70° C.
[0059] DNR persodinome etanoliu,ištirpinome 200 mkl buferio 0, pridėjome 100 vnt. BglII restriktazės ir inkubavome 2 vai. 37° C temperatūroje.
[0060] Po elektroforezės 1% agarozės gelyje išskyrėme 0.68 tūkst. b.p. dydžio fragmentą, kurį ligavome su 3 mkg p6pS2 plazmidės, paeiliui apdorotos Xbal restriktaze, Mung Bean nukleaze ir restriktaze BglII. Naujai gautą plazmidę pavadinome pS-6S. 50 mkg p6-6S plazmidės ištirpinome'200 mkl buferio Y (33 mM tris-acetato, 10 mM magnio acetato, 66 mM kalio acetato, 0.5 mM DTT; pH 7.9), pridėjome po 100 vnt. Eco147I ir Eco91I, inkubavome 2 vai. 37° C temperatūroj e.
[0061] DNR išsodinome etanoliu ir ištirpinome 200 mkl Klenovo fermento buferio, pridėjome nukleotidtrifosfatų, 3 vnt. Klenovo fermento ir inkubavome 30 min. 20° C temperatūroje.
[0062] Po elektroforezės išskyrėme 3.9 tūkst.b.p.dydžio Eco147I-Eco91I fragmentą ir ligavome jį su 3 mkg pRA1 plazmidės perskeltos SmaI restriktaze.
[0063] Po ligavimo gautu mišiniu transformavome E.coli HB101 kamieno kompetentines ląsteles ir išsėjome ant LB terpės su ampicilinu. Tarp transformantų buvo atrinkti klonai,turintys pFS19 plazmidę (Fig.6).
[0064] Plazmidės analizę atliekame 4 pavyzdyje aprašytu būdu.
[0065] ir 5.5 tūkst.b.p. dydžio fragmentus. Skaldant BglII ir BamHI restriktazėmis - 1.8 ir 8.6 tūkst.b.p., o skaldant PstI-0.5, 2.2 ir 7.7 tūkst. b.p.
[0066] 50 mkg pHB 320 plazmidės ištirpinome 200 mkl buferio G, pridėjome po 100 vnt.BamHI ir Xbal restriktazių ir inkubavome
[0067] Po elekroforezės agaroziniame gelyje išskyrėme 0.53 tūkst.b.p. dydžio fragmentą, turintį virusinės DNR preSl ir preS2 rajonus ir ligavome jį su 3 mkg pTZl9R plazmidės perskeltos BamHI ir Xbal restriktazėmis.
[0068] Gautu mišiniu transformavome kompetentines HB101 E.coli ląsteles. Tarp transformantų atrinkome klonus, turinčius pTZSl plazmidę.
[0069] 0.001 mkg pTZSl plazmidės ištirpinome 100 mkl amplifikacijos buferio (67 mM tris-HCl, 6.7 mM MgCl, 1 mM merkaptoetanolio, 50 mM KC1, 0.17 mg/ml jaučio serumo albumino; pH 8.8 prie 25° C), pridėjome dezoksinukleotidtrifosfatų iki 0.2 mM koncentracijos, 5 vnt. Taql DNR polimerazės ir po 0.01 opt.vnt. sintetinių oligonukleotidų 5' -ATGGAGAACATCACATCAG-
[0070] Su gautu mišiniu atlikome 35 amplifikacijos ciklus (1 min. 95° C, 2 min. 50° C, 3 min. 72° C). Gautą po polimerazinės grandininės reakcijos 3.4 tūkst.b.p. dydžio fragmentą apdorojome fenolo-chloroformo mišiniu ir persodinome etanoliu.
[0071] 5 vnt. T4 fago polinukleotidkinazės ir 50 vnt. T4 fago DNR ligazės. Gautą mišinį inkubavome 1 vai. prie 37° C. Gautu mišiniu transformavome HB101 E. coli ir tarp transformantų atrinkome turinčius pTZdSI plazmidę. 50 mkg pTZdSI plazmidės ištirpinome 200 mkl buferio R, pridėjome po 100 vnt. BamHI ir EcoRI restriktazių ir inkubavome 2 vai 37° C temperatūroje. Gautą mišinį apdorojome fenolo-chloroformo mišiniu ir DNR persodinome etanoliu. 10 mkg pTZdSI plazmidės, suskaldytos BamHI ir EcoRI restriktazėmis ištirpinome 100 mkl ligavimo buferio, pridėjome ATP, 0.01 opt. vnt. sintetinio DNR fragmento, turinčio preSl geno 5' dalį:
[0072] Po elektroforezės 1% agarozės gelyje išskyreme 0.49 tūkst.b.p. dydžio Xbal-Xbal DNR fragmentą ir ligavome jį su 8.9 tūkst.b.p. dydžio fragmentu, gautu iš p6-pS2 plazmidės, suskaldytos Xbal restriktaze.
[0073] Gautu mišiniu transformavome HB101 E. coli ir tarp transformantų atrinkome turinčius pJLdSI plazmidę. 50 mkg pJLdSI plazmidės ištirpinome 200 mkl buferio 0, pridejome po 100 vnt. Bsp68I ir Eco91I restriktazių ir inkubavome 2 vai.37° C. DNR persodinome etanoliu, ištirpinome 200 mkl Klenovo fermento buferio, pridėjome NTP, 3 vnt. Klenovo fermento ir inkubavome 30 min. 20° C. DNR persodinome etanoliu, ištirpinome 100 mkl ligavimo buferio su ATP, pridėjome 50 vnt. T4 fago DNR ligazės .ir ligavome su 2.2 tūkst.b.p. dydžio Xbal - PstI pRAI plazmidės fragmentu, apdorotu Mung Bean nukleaze. Gautu mišiniu transformavome HB101 E. coli ir tarp transformantų atrinkome turinčius pJLFdSl plazmidę (Fig.7 ).
[0074] pJLFdSl plazmidės analizė atliekama kaip nurodyta 4 pavyzdyje.
[0075] URA3 markerinio geno buvimas įrodomas šios plazmidės sugebėjimu kompensuoti ura3 mutaciją.
[0076] Skaldant pJLFdSl plazmidę EcoRI restriktaze gauname 3.8 ir 7.6 tūkst.b.p. dydžio DNR fragmentus. Skaldant BglII ir BamHI restriktazėmis gauname 1.0 ir 10.4 tūkst.b.p. dydžio DNR fragmentus. Skaldant HindlII restriktaze - 0.25, 0.35, 2.0, ir 8.8 tūkst.b.p. dydžio fragmentus.
[0077] Siekiant padidinti HBsAg, HBpreS2Ag antigeninių baltymų produkciją buvo patikrintas didelis skaičius laukinio tipo S. cerevisiae kamienų. Pasirodė, kad geriausiu produktyvumu pasižymi greitai augantys, poliploidiniai kamienai, turintys sumažintą proteolitinį aktyvumą (1 lentelė). Tolimesniam darbui buvo pasirinktas FH4C kamienas.
[0078] pFS19 plazmide transformavome S. cerevisiae FH4C kamieną pasinaudodami Ito metodu (Ito ir kt.,J.Bacteriol.,1983, T 153 p.163-168).
[0079] FH4C[pFS19] kamieno ląsteles auginome 30° C temperatūroje 100 ml YEPD terpės 24 vai. kratyklėje 200 aps/min. Po 24 vai. pridėjome 4% galaktozės ir toliau auginome ląsteles 8-12 vai. analogiškose sąlygose. Po 8-12 vai. buvo imami ir analizuojami mėginiai. 1 ml ląstelių kultūros centrifugavome 10 min. 3000 aps/min, ląsteles suspendavome 1 ml buferio (0.05 M Na-fosfa-tinio buferio, 0.05% Tritono X-10Q., pH 7.2), pridėjome 1 g 0.5 mM dydžio stiklinių šratų ir ardėme 4 min., periodiškai šaldydami lede, po to centrifugavome 10 min. 3000 aps/min.
[0080] Žmogaus hepatito B viruso paviršiaus antigeno HBsAg kiekio nustatymą atlikome radioimunologiniu metodu,panaudodami rinkinius HBsAg nustatymui ("Radiopreparat", YaCCP ) Standartinius preparatus, gautus iš Medicininės kontrolės
[0081] instituto, naudojome kalibracinei kreivei gauti. Duomenys pateikti 2 lentelėje.
[0082] 8,9 pavyzdžiai. S. cerevisiae FH4C[pFpS2-48](BKnM Y1833) ir S. cerevisiae FH4C[pJLFdSI] (BKnM Y1832) buvo gauti ir patikrinti analogiškai 7 pavyzdžiui, tik transformacijai buvo panaudotos pFpS2-48 ir pJLFdSI plazmidės. Duomenys pateikti 2 lentelėje.
[0083] 2 lentelė Paviršiaus antigeninių baltymų HBsAg, HBpreSIAg ir HBpreS2Ag ekspresijos lygis mielėse (nurodytas % rodo imunologiškai aktyvaus baltymo kiekį lyginant su visu tirpiu baltymu).
[0084] Iš 2 lentelės matome, kad pareikšta išradimų grupė pagal žmogaus hepatito B viruso paviršiaus antigenų išeigą procentais nuo bendro ląstelinio baltymo viršija žinomus analogus S. cerevisiae mielėse iki 20 kartų, o pagal išeigą iš 1 1 kultūros - iki 100 kartų. Pagal antigenų sintezės produktyvumą duota sistema nežymiai viršija efektyviausią iš dabar žinomų - Pichia pastoris sistemą. S. cerevisiae mielės yra patogios,nes seniai naudojamos maisto pramonėje, neturi toksinų bei pirogeninių medžiagų.
[0085] Didelė antigenų išeiga pareikštoje sistemoje pasiekiama panaudojant indukuojamą hibridinį GAL1-10-PYK1 promotorių,PGK1 geno transkripcijos terminatorių ir dominantinį geną FOR-R, leidžiantį vykdyti laukinių S. cerevisiae kamienų su padidintu antigenų produktyvumu selekciją. Dominantinio geno panaudojimas leidžia panaudoti laukinio tipo kamienus, kurių kultivavimui galima naudoti pilnas, pigias terpes, tai yra svarbus pranašumas vykdant pramoninį mielių auginimą.
[0086] Pilnų terpių panaudojimas padidina biomasės išeigą iš to paties kultūrinio skysčio tūrio, be to sutrumpina fermentacijos laiką, nes sutrumpina mielių ląstelių generacijos laiką.
[0087] Mielių FH4C kamieno su sumažintu proteolitiniu aktyvumu panaudojimas sumažina heterologinių baltymų degradaciją, tai palengvina natyvių hepatito B viruso antigenų valymą. Dominantinio geno panaudojimas leidžia vykdyti kamienų su padidintu heterologinio baltymo produktyvumu atranką.
1 . Rekombinantinė pFS19 plazmidė, koduojanti žmogaus hepatito B viruso paviršiaus S antigeno sintezę, yra 10.4 tūkst.b.p. dydžio ir sudaryta iš sekančių elementų:Kpnl-Xbal 2.9 tūkst.b.p. dydžio pTZ19R plazmidės fragmento, turinčio geną, apsprendžiantį atsparumą ampicilinui ir E. coli ori sritį;XbaI-BamHI 3.6 tūkst.b.p. dydžio C. maltosa DNR fragmento, turinčio geną FOR-R, apsprendžiantį atsparumą formaldehidui (dominantinis genas);Ecol471-HindIII 2.16 tūkst.b.p. dydžio fragmento, turinčio GAL 1-10 transkripcijos aktyvatorių,piruvatkinazės PYK1 geno promotorių, žmogaus hepatito B viruso S geną, fosfogliceratkinazės PGK1 geno transkripcijos terminatorių;HindIII-Eco91I 1.74 tūkst.b.p. dydžio mielių 2 mkm plazmidės fragmento, turinčio ori sritį.
Kpnl-Xbal 2.9 tūkst.b.p. dydžio pTZ19R plazmidės fragmento, turinčio geną, apsprendžiantį atsparumą ampicilinui ir E. coli ori sritį;XbaI-BamHI 3.6 tūkst.b.p. dydžio C. maltosa DNR fragmento, turinčio geną FOR-R, apsprendžiantį atsparumą formaldehidui (dominantinis genas);Ecol471-HindIII 2.16 tūkst.b.p. dydžio fragmento, turinčio GAL 1-10 transkripcijos aktyvatorių,piruvatkinazės PYK1 geno promotorių, žmogaus hepatito B viruso S geną, fosfogliceratkinazės PGK1 geno transkripcijos terminatorių;HindIII-Eco91I 1.74 tūkst.b.p. dydžio mielių 2 mkm plazmidės fragmento, turinčio ori sritį.2. Rekombinantinė pFpS2-48 plazmidė, koduojanti žmogaus hepatito B paviršinio preS2 antigeno sintezę, yra 10.8 tūkst.b.p. dydžio ir susideda iš sekančių elementų:Kpnl-Xbal 2.9 tūkst.b.p. dydžio pTZ19R plazmidės fragmento, turinčio geną, apsprendžiantį atsparumą ampicilinui ir E. coli ori sritį;XbaI-BamHI 3.6 tūkst.b.p. dydžio C. maltosa DNR fragmento, turinčio geną FOR-R, apsprendžiantį atsparumą formaldehidui (dominantinis genas);Ncol-HindlII 2.56 tūkst.b.p. dydžio fragmento, turinčio GAL 1-10 transkripcijos aktyvatorių,piruvatkinazės PYK1 geno promotorių, žmogaus hepatito B viruso preS2 geną, fosfogliceratkinazės PGK1 geno transkripcijos terminatorių;HindlII-Eco91I 1.74 tūkst.b.p. dydžio mielių 2 mkm plazmidės fragmento, turinčio mielių ori sritį.
Kpnl-Xbal 2.9 tūkst.b.p. dydžio pTZ19R plazmidės fragmento, turinčio geną, apsprendžiantį atsparumą ampicilinui ir E. coli ori sritį;XbaI-BamHI 3.6 tūkst.b.p. dydžio C. maltosa DNR fragmento, turinčio geną FOR-R, apsprendžiantį atsparumą formaldehidui (dominantinis genas);Ncol-HindlII 2.56 tūkst.b.p. dydžio fragmento, turinčio GAL 1-10 transkripcijos aktyvatorių,piruvatkinazės PYK1 geno promotorių, žmogaus hepatito B viruso preS2 geną, fosfogliceratkinazės PGK1 geno transkripcijos terminatorių;HindlII-Eco91I 1.74 tūkst.b.p. dydžio mielių 2 mkm plazmidės fragmento, turinčio mielių ori sritį.3. Rekombinantinė pJLFdSI plazmidė, koduojanti žmogaus hepatito B paviršiaus preS1 antigeno sintezę, yra 11.4 tūkst.b.p. dydžio ir susideda iš sekančių elementų:Xbal-Pstl 2.2 tūkst.b.p. dydžio C. maltosa DNR fragmento, turinčio FOR-R geną, apsprendžiantį atsparumą formaldehidui (dominantinis genas);HindIII-Eco91I 1.74 tūkst.b.p.dydžio mielių 2 mkm plazmidės fragmento, turinčio mielių ori sritį;HindlII-EcoRI 1.74 tūkst.b.p. dydžio fragmento, turinčio piruvatkinazės PYK1 geno promotorių, žmogaus hepatito B viruso preS1 geną, fosfogliceratkinazės PGK1 geno transkripcijos terminatorių;EcoRI-Bsp68I 5.63 tūkst.b.p. dydžio fragmento, turinčio GAL 1-10 transkripcijos aktyvatorių, mielių URA3 geną, atsparumo ampicilinui geną ir E. coli ori sritį.
Xbal-Pstl 2.2 tūkst.b.p. dydžio C. maltosa DNR fragmento, turinčio FOR-R geną, apsprendžiantį atsparumą formaldehidui (dominantinis genas);HindIII-Eco91I 1.74 tūkst.b.p.dydžio mielių 2 mkm plazmidės fragmento, turinčio mielių ori sritį;HindlII-EcoRI 1.74 tūkst.b.p. dydžio fragmento, turinčio piruvatkinazės PYK1 geno promotorių, žmogaus hepatito B viruso preS1 geną, fosfogliceratkinazės PGK1 geno transkripcijos terminatorių;EcoRI-Bsp68I 5.63 tūkst.b.p. dydžio fragmento, turinčio GAL 1-10 transkripcijos aktyvatorių, mielių URA3 geną, atsparumo ampicilinui geną ir E. coli ori sritį.4. Plazmidžių pFS19, pFpS2-48 ir pJLFdSI , koduojančių paviršinių antigenų HBsAg, HBpreS2Ag ir HBpreSIAg sintezę, konstravimo būdas, besiskiriantis tuo, kad apima dominantinio geno FOR-R sujungimą vienoje plazmidėje su S, preS2 arba preS1 genais, kurių ekspresija reguliuojama hibridinio, galaktoze indukuojamo GAL1-10-PYK1 promotoriaus ir PGK1 transkripcijos terminatoriaus, o taip pat su mielių 2 mkm plazmidės fragmentu, turinčiu mielių ori sritį, bei atsparumo ampicilinui genu ir E. coli ori sritimi, o dominantinio geno FOR-R klonavimas apima Candida maltosa genų banko konstravimą panaudojant bifunkcinį mielių vektorių, transformaciją į Saccharomyces cerevisiae ir transformantų, komplementuojančių leu2 mutaciją, parinkimą, transformantų, galinčių augti ant terpių su formaldehidu, atranką, plazmidžių išskyrimą iš šių transformantų, FOR-R geno subklonavimą ir jo pirminės sekos nustatymą.
5. Būdas pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad konstruojant pFpS2-48 plazmidę, pHB320 plazmidę skaldo DraI restriktaze, liguoja BglII linkerius, skaldo BglII ir BamHI restriktazėmis, išskirtą 1.68 tūkst.b.p. dydžio fragmentą liguoja su pIC19R plazmidę, suskaldyta BglII restriktaze, gautą pICl9RS plazmidę skaldo Eco147I restriktaze ir prijungia sintetinį oligonukleotidą
6. Būdas pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad konstruojant pFS19 plazmidę, pHB320 plazmidę skaldo DraI restriktaze, liguoja BglII linkerius, skaldo BglII ir BamHI restriktazėmis, išskirtą 1.68 tūkst.b.p. dydžio fragmentą liguoja su pIC19R plazmide, suskaldyta BglII restriktaze, gautą pIC19RS plazmidę skaldo Eco147l restriktaze ir prijungia sintetinį oligonukleotidą
7. Būdas pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad siekiant sukonstruoti pJLFdSI plazmidę, pHB320 plazmidę skaldo BamHI ir Xbal restriktazėmis, išskirtą 0.53 tūkst.b.p. dydžio fragmentą liguoja su pTZl9R plazmidę, suskaldyta BamHI ir Xbal restriktazėmis, gautą pTZS1 plazmidę panaudoja matricos vietoje polimerazinėje grandininėje reakcijoje, šioje reakcijoje pradmenimis naudojant 2 sintetinius nukleotidus
5' -ATGGAGAACATCACATCAG-31 ir 5'-GCCACCAGCAGGGAAATAC-3'; šios reakcijos produktą - 3.4 tūkst.b.p.dydžio DNR fragmentą paveikia polinukleotidkinaze ir ligaze, gautą pTZdSl plazmidę skaldo BamHI ir EcoRI restriktazėmis ir liguoja su sintetiniu DNR fragmentu, koduojančiu 5' preS1 geno dalį,
8. Saccharomyces cerevisiae FH4C[pFS19] (BKnM Y1831) kamienas - žmogaus hepatito B viruso paviršiaus S antigeno producentas.
9. Saccharomyces cerevisiae FH4C[pFpS2-48] (BKI1M Y1833) kamienas - žmogaus hepatito B viruso paviršiaus preS2 antigeno producentas.
10. Saccharomyces cerevisiae FH4C[pJLFdS1] (BKnM Y1832) kamienas - žmogaus hepatito B viruso paviršiaus preSl antigeno producentas.