LT3133B

P0438, NAUJAS KALCIO REGULIAVIMO PROMOTORIUS

PO438, A NEW CALCIUM-REGULATED PROMOTOR

Referatas

[LT] Čia atskleistas naujas kalciu reguliuojamas promotorius, kurį galima panaudoti nelastelinių fermentų arba heterologinių polipeptidų gamybos padidinimui, rekombinato vektoriaus , kuriame yra DNR seka promotoriaus, efektyviai sujungto su DNR seka, užkoduojančia minėtą fermentą arba polipeptidą ir šeimininko organizmą, transformuotą su rekombinato vektoriumi, kuriame yra promotorius, operatyviai sujungtas su DNR, užkoduojančia minėtą fermentą arba polipeptidą. Šis išradimas taip pat skirtas Streptomyces ekspresijos sistemoms ir svetimų DNR sekų išreiškimo iš Streptomyces ir polipeptidų bei proteinų, užkoduotų šiom DNR sekom, išskyrimo į supančią terpę, būdams.

[EN]

Aprašymas

[0001] Išradimas yra iš biotechnologijos srities. Tiksliau, jis skirtas- naujam kalciu reguliuojamam promotoriui, kuris naudojamas neląstelinių fermentų arba heterologinių . polipeptidų gamybps padidinimui, rekombinanto vektoriui, į kuri, įeina promotoriaus, operatyviai sujungto su DNR. (dezoksiribonukleinine rūgštimi),, _-už_ko_duojaⁿčia anksčiau paminėtą fermentą arba polipeptidą, DNR seka, šeimininko organizmui,! transformuotam rekombinanto vektoriumi, i, kuri, įeina sis promotorius, operatyviai sujungtas su PNR, užkoduojančia minėtą fermentą arba polipeptidą. Šis išradimas toliau skirta s Streptomyces ekspresijos sistemoms ir svetimų DNR sekų išreiškimo iš Strepvcmyces ir polipeptidų bei proteinų, užkoduotų, šiomis svetimomis DNR sekomis, išskyrimo i, supančią t e rpę ir.e tonams.

[0002] Streptomyces bakterijos yra gerai žinomos įvairių neląstelinių fermentų, apimančių proteazes, fosfatazes, ksilanazes, celiuliazes, *.- amilazes, • lipazes ir;:;

[0003] nukleazes, gamintojos.

[0004] Dar daugiau, Streptomyces genties nariai gamina daugybę antibiotikų, pigmentų ir kitų antrinių metabolitų ^:if-_/;

[0005] turi .sudėtingą diferenciacijos struktūrą,• besibaigiančią sporų ..susiformavimu. Streptomyces bandinių kultūrose- paprastai yra atitikimas tarp neląstelinių fermentų gamybos, antibiotikų gamybos pradžios, pigmento biosintezės ir sporų susidarymo.. Visi šie procesai , yra slopinami ! maitinimo sąlygų, palankiai veikiančių didelius augimo greičius, ir veikiami priešingai, badaujant P, C arba N šaltiniams. Neįtikėtina,: kad.; fermento išskyrimas, antrinių metabolitų susidarymas ir diferenciacija yra visiškai nepriklausomi, bet . reaguoja į panašius paleidimo mechanizmus-

[0006] Buvo klonuoti keli Streptomyces genai, užkoduojantys neląstelinius fermentus. Jie apima agarazę, iš Streptomyces coelicolor,. • endoglikozidazę H iš Streptomyces plicatus, ksilanazę iš Streptomyces lividans, alf a-amilazę iš Streptomyces hygroscopicus, celiuliazę ■ iš Strep. spA2t beta-galaktozidazę iš Strep. lividans ir beta-laktamazes i š Strep. cacaoi, badius- ir fradiae. .Tačiau reguliavimo mechanizmai,' kurie kontroliuoja šių genų -ekspresiją, yra iš esmės- nežinomi. Be specialių reguliavimo mechanizmų, tokių kaip amilazės ,indukcija dekstrinais ar maltotrioze ir amila'zės ar agarazės anglies metabolinis reguliavimas, turbūt., iškyla bendri kelių neląstelinių fermentų skatinimo mechanizmai, kadangi Streptomyces buvo pastebėtas kelių polimerinio substrato degradavusių fermentų susidarymas tuo pačiu metuĮ, sekant maitinimo poslinki, žemyn. Tokie reguliuojantys genai buvo rasti Bacillus subtilis (J. BACTERIOL 16 9:324-333,1987), Bacillus natto ( J. BACTERIOL 166:20-28,1986) ir Bacillus licheniformis..

[0007] Teigiami reguliavimo genai, veikiantys fermentų sintezę ir/arba išskyrimą, gali būti 'klonuoti, ieškant padidinto neląstelinių fermentų išskyrimo prastuose sekreciniuose kamienuose, tokiuose, kaip S. lividans.

[0008] Svetimų DNR sekų išreiškimo iš Streptomyces sistemos buvo anksčiau aprašytos, pavyzdžiui, E? 148,552 ir W0 88/07o79. Tos sistemos naudoja Streptomyces pagamintus neląstelinių fragmentų endogeninius promotorius.

[0009] Endogeninių promotorių pakeitimas svetimais promotoriais buvo atskleistas W0 90/14426, kur aprašomas naujai izoliuoto geno, saf geno, užkoduojančio naują polipeptidą, vadinamą saf jpolipeptidu, kuris tiesiai arba netiesiai moduliuoja genų .ekspresiją neląsteliniams fermentams iš Streptomyces_f sąveikaujant su struktūrinių genų neląsteliniams fermentams kontrolinę' sritimi,

[0010] klonavimas ir charakterizavimas.

[0011] Buv_© rasta, kad saf geno . promotorius yra daug galingesnis:-/ už neląstelinių fermentų natūralų

[0012] promotorių. Pvz., amilazės genas išskiria daug daugiau amilazės, kai saf promotorius pakeičia natūralų amilazės promotorių Tuo būdu, saf promotorius g_^li būti panaudotas. vietoj proteino natūralaus promotoriaus, kad padidintų bet kurio endogeninio polipeptido arba proteino ekspresiją.

[0013] Saf geno klonavimui ir charakterizavimui plazmidė pi J702 (Katz ir! kt v )..J. GEN .MI GROBIO L. 12 9 -.2703-2714,1983) buvo panaudota kaip klonavimo vektorius. Ši plazmidė turi savyje tirozinazės; - fermento, . atsakingo už melanino susidarymą .iš trįozino keliuose

[0014] . Streptomycas tipuose, geną. ,Buvo sudarytos• mel lokusoplazmidėje pIJ702 sekos ir nustatyt i du atviri skaitymo ;rėmai (ASR): pirmas , ARS(ORF-angl.), atitinkantis mel geną, kuris koduoja polipepridj nę tirozinazės grandinę, ir antras ARS, • išdėstytas mel genui prieš srovę, -kurisbuvo pavadintas 0RF438 (Bernan ir kt. GENE 37:101-110,1985) įr kurio vaidmuo dar neaiškus. Tyrinėjimuose, tiksliai nustatant saf geno vietą, i,pIJ702 BglII vietą buvo' įterptas fragmentas Sstl- Kpnl y (432 r.ukleotidai-saf genas be promotoriaus) . Stebinantis šių tyrimų aspektas buvo šio fragmento ekspresij os nebuvimas, kai įterpiama_' tiesia orientacija, ir jo ekspresija, kai į ORF438 įterpiama priešinga kryptimi (prieš laikrodžio rodyklę). Šis atradimas reiškė fragmento su promotoriaus poveikiu buvimą prieš mel geną ir BglII klonavimo vietoje, esančioje ORF438 viduje, su priešinga orientacija. Pagrindinis šio išradimo tikslas yra pateikti naują promotorių, kuris buvo nustatytas DNR fragmente, ■esančiame pIJ702 plazmidės ORF438 viduje. Promotoriaas poveikis yra teigiamai reguliuojamas kalcio jonų, ir genų ekspresija neląsteliniams fermentams iš Streptomyces, operatyviai sujungtiems su anksčiau minėtu promotoriumi, yra labai padidinama, dalyvaujant CaCl₂ tirpalams. . Kitas šio išradimo aspektas 'yra pateikti klonavimo nešėjus (vektorius), kurie apima aukščiau minėtą promotorių, operatyviai sujungtą su endogeninė arba svetima DNR seka, užkoduojančia polipeptidą arba proteiną, taip pat' šeimininko organizmus arba ląsteles, transformuotas tokių klonuojančių nešėjų, dėl to sukeliančių ekspresiją ir polipeptid'ų, užkoduotų minėta DN^, seka, išskyrimą.

[0015] Kitas šio išradimo aspektas yra tokio klonavimo nešėjo, nešančio svetimą DNR seką, integracija i Streptomyces chromosominę DNR.

[0016] Dar vienas ■ šio išradimo aspektas yra neląstelinio fermento, reikalingo polipeptido arba proteino paruošimas, . kultivuojant transformuotą šeimininko orgtanizmą pagal ši, išradimą ir išskiriant produktą .iš šios kultūros skystos terpės.

[0017] Naujas . promotorius, turėtas rėme ORF438, rodo promo_Loriaus poveiki, priešinga orientacija ORF438 orientacijai ir toliau yra vadinamas Po438 (Promotorius, . priešingas ORF438). Žinios apie laikrodžio rodyklės krypties promotoriaus plazmidėje. pIJ702 veiksmingumą yra labai svarbios, kad išvengtume klaidingų interpretacijų DNR fragmentų, klonuotų šiame vektoriuje, genų ekspresijos tyrimuose. Promotorius Po438 yra . pirmas žinomas kalciu reguliuojamas promotorius, kuris buvo charakterizuotas Streptomyces ir gali būti panaudotas padidinti išrinktų hetorologinių proteinų išskyrimą ' iš Streptomyces, įterpiant DNR fragmentą, turintį savyje promotorių Po438, i, tinkamą suskaidymo vietą prieš' srovę genui, koauojančiam. ■ reikalingą proteiną tinkamame klonavimo nešėjuje, transformuojantį^* Streptomyces šeimininką su tokiais klonuojančiais nešėjais ir kultivuojantį transformuotas, bakterijas, dalyvaujant Ca²⁺ tirpalui, kad išskirtų pasirinktą proteiną arba jo dali,..

[0018] Po43;S promotoriaus .veiksmingumas buvo nustatytas, panaudojant du promotoriaus-bandinio vektorius. DNR fragmentas, apimantis promotorių* Po438, buvo subklonuotas dviejose skirtingose plazmidėse, ' nešančiose atitinkamai ne stimuliuojant d, aminoglikozido

[0019] fosfotrąnsferazės geną (neo) įr ; • nestimuliuojantį katecholo dioks.igenazės geną ( XylE) įl brėž.) . Abu genai išskiria labai .daug kiekvieno . fermento, dalyvaujant didėjančioms kalcio jonų koncentracijoms, tuo būdu, parodydami Po436 kalciu reguliuojamą promotoriaus veiksmingumą..

[0020] Transkripcijos pradinis taškas Po438 promotoriųj e buvo

[0021] nustatytas t SI nuklėazės kartografiniu eksperimentu, kuris nustatė, pradini, tašką C 24 nt. {angį -) nuo SstI vietos {fi g. 4).

[0022] Kuorodos i, pridedamus brėžinius: Fig. 1. Plazmidžių pULADSO ir pULAD51, nešančių pIJ702 (apimančio Po438 242 bp Sstl- Bglll fragmentą, klonuotą _; pfomotoriąus-bandinio vektoriuose piJ487 ( Ward ir kt. 1986) ir pIJ4083, struktūra. Fig. 2. pĮJ702 242 bp Sstl-BglII frgmento promotoriaus veiksmingumas- Kanamicino gradientas (0-180 ug/ml - angį.) buvo nustatytas kietoje MM (minimalioje terpėje)

[0023] (Hopwood, 1967) ir buvo štrichuotas (streaked - angį.) su S. lividans, nešančiais plazmidę pULAD50 (A) arba piJ487 (B) .

[0024] Fig. 3. pULAD50 srities, nešančios pIJ702 242 bp Sstl-Bgl II fragmentą, scheminis išdėstymas ir. strategija, sekanti SI kartcjgrafijai. Diagramoje baras, pažymėtas žvaigždutėmis, vaizduoja pažymėtą fragmentą, o baras su SI vaizduoja gautą apsaugotą fragmentą. Takai A-C-G-T rodo keturias_" sekos reakcijas M13mpl8 vienintelei atsajai DNR (dešinė) ir 242 bp Sstl- BglII fragmentui iš pIJ702 (kairė). 1 - Apsaugotas fragmentas hibridizacijoje tarp pULAD50 270 nt. HindlII-SstI fragmento ir mRNA iš 5. lividans [ pULAD50] .

[0025] 4 - Apsaugotas fragmentas hibridizacijoje tarp pIJ702 242 nt. BglII-SstI fragmento ir mRNA .iš S. lividans [ piJ702] .

[0026] Rodyklių smaigaliai žymi hibridizacijos juostas, atitinkančias apsaugotiems fragmentams.

[0027] Fig. 4 DNR srities mel klasteryje, kuris apima ORF438., nukleotidų seka, pažyminti jos amino rūgšties seką'. Yra parodytos BgilI ir SstI apribojimo vietos, kurios ribojasi su DNR fragmentu, klonuotu pIJ487, kad sudarytų pULAD50.

[0028] oo - » Mel matricos iniciavimas pagal Geistlich ir kt.

[0029] (1989) ir Leu ir kt. (1989)-

[0030] oo » Transkripcijos iniciavimas , iš Po438 pagal Slnukleazės kartografinius eksperimentus (Fig 3).

[0031] Fig. 5. Ekspresijos iš Po438 promotoriaus fosfato slopinimas. Neomicino gradientas (0-180 ug/ml) bu-vo padarytas ant kieto MM+TES (angį.), buferio 825 mM, pH 7,2 (viršutinė plokštelė) ir ant tos pačios terpės, papildytos 20' MM .natrio fosfato buferiu, pH 7,2 (žemutinė, plokštelė). Abi plokštelės buvo štrichuotos

[0032] .su panašiu S. lividans [ pULAD50] sporų kiekiu. Fig. 6. ' Pseudomonas putida nestimuliuojančio XylE geno, patalpinto Po438 promotoriui pasroviui, kalcio, indukciją Streptomyces bakterijose. S. lividans[ pULAD51] buvo auginamos R2YE skystoje terpėje (•) be kalcio ir R2YE terpėje., papildytoje CaCl2 iki 60 mM(A) .■■■■■<: S. lividans, transformuotų su piJ4083 (o), katecholo dioksigenazės aktyvumas (Cat. 0;. azė) nebuvo keičiamas, kai .buvo au^nama R2YE terpėje su arba be CaCl2 -

[0033] Čia aprašomas darbas buvo atliktas, naudojant tokias

[0034] medžiagas ir metodus.

[0035] Bakteriniai -kamienai• ir plazmidės. Streptomyces . kamienai ir plazmidės, naudojami šiame tyrime, yra išvardinti 1-oje lentelėje.

[0036] Terpė ir auginimo sąlygos. Protoplast, Streptomyces kamienų transformacija buvo auginama R2YE, minimalioje terpėje (MM) arba YEME, papildytoje 34% sacharozės ir 5 mM MgCl₂ (Hopvrood ir kt., Genetię m_^nipulation pf Streptomyces. A. LABORATORY MANUAL. The John^ Innes Foundation,- Norvrich, U.K., 1985). Skystos Streptomyces kultūros buvo auginamos kolbose su trimis pertvaromis 28°C temperatūroje besisukančiame kratytuve su 220 rmp (angį.) kratymu.

[0037] S. lividans protoplastų paruošimas ir transformacija buvo tokie, kaip aprašyta (Thompson ir 'kt.., "J. BACTERIOL. 151 :,668~677, 1982). - DNR izoliacija, manipuliacija ir DNR sekų sudarymas. Plaziiiidė DNR buvo atskirta, ' naudojant Kieser būdą

[0038] (Kieser ir kt., PLAZMID 12:19-36,1984). Įsisavinimas ir ligavimas buvo kontroliuojami agarozės helio elektroforeze. Įsisavinimo sąlygos su endonukleazės apribojimu ir ligavimo reakcijos buvo tokios, kokios rekomenduotos gamintojų. DNR fragmentųsubklonavimas buv& atliekamas, įsisavinant 1-2 uc, DNR plazmidės su atitinkamu apribojančiu fermentu(-ais), ir reakcijos produktai buvo atskiriami helio elektrpforeze žemame agarozės lydymosi taške (LMPA - angį.).

[0039] Nukleotidų seka buvo nustatyta Sanger grandinės nutrūkimo metodu' (Sanger ir kt., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 74:5463-5467,1977), naudojant M1 3 klonus (Messing ir kt., NUCL,. ACIDS RES. 9:309-321, 1981).

[0040] RNR (ribonukleininės rūgšties) izoliacija ir SI nukleazės kartografija. RNR buvo atskirta pagal Kirby (Kirby ir kt.., Biochem J. 104:258-262, T 967) iš 50-ties valandos kultūrų MM terpėje. SI kartografijai DNR bandiniai buvo galuose pažymėti (Maxam and Gilbert, METHODS ENZYMOL. 65:499-560/ 1960) . RNR (40 ug) . buvo sumaišyta su 10⁵ c.p .m. [ 32p] -gale pažymėtu ^)NR fragmentu ir denatūruojama 85°C 15 min. (Favalora ir kt., METHODS ENZYMOL. 65:718-749_/ 1980). Hibridizacija buvo atliekama 60°C temperatūroje 3 valandas, apdorota su 60 vienetų SI nukleazės ir SI įsisavinimo produktas buvo uždėtas ant 7% ( w/ v - angl.) poliakrilamido helio, turinčio 7M šlapalo ir lygiagrečiai leistas su M13 mpl8 fagu ir pIJ702 242 bp SglII- SstI fragmentu ( sekos sudaxyto. s Sanger met' odu) .

[0041] Katecholo dioksigenazės veiksmingumas._" Plokštelių bandymuose Streptomyces transformanto kolonijos buvo augintos 28°C temperatūroje 3 dienaus, ir plokštelės buvo apipurkštos 0, 5 M katecholio vandeniniu tirpalu. Skystiems bandiniams Streptomyces kamienai buvo auginti 28°C temperatūroje 50- ty3e ml R2YE skystos terpės be CaCl₂ arba papildytos CaCl₂ ( 60 mM). Įvairiu laiku buvo imami bandiniai ir katecholo dioksigenazės veiksmingumas buvo nustatinėjamas taip, kaip aprašyta ( Ingram ir kt., J. BACTERIOL 171:6617- 6624, " 1989). Proteino, koncentracijos buvo nustatinėjamos Bradfordo • metodu, - panaudojant jaučio serumo albuminą kaip etaloną

[0042] Po 438 preaBtri- nri ma ragTTrn^* ;

[0043] Po 4 38 p- ramotoriaus veiksmingumas buvo nustatytas aminoglikozido fosfotransferazės geno ir katecholo dioksigenazės geno, • turėtų dviejuose skirtinguose promotoriuose- bandiniuose, ekspresija.

[0044] Aminoglikozido fosfotransferazės geno ekspresija pIJ702 plazmidės 242 bp BglII- SstI . fragmentas buvo subklonuotas į pIJ487 ( Ward ir kt., FJOL. GEN. GENET. 203:468- 478, 1986), kuris nešė nestimųliuojanti, aminoglikozido fosfotransferazės geną ( neo). Šio geno ekspresija palygina Kamicino ( km) ir nepmicino atsparumą Streptomyces lividans. Taip buvo sukurta plazmidė pULAD50 ( Fig. 1). S. lividans, transformuotos su pULADSO, galėjo augti minimalioje terpėje. sudarytoje . iš daugiau kaip 15 ug/ml Km, kur S. lividans, transformuotos su pIJ487 (promotoriaus-bandinio vektorius be įterpto promotoriaus), neaugo MM su 10 ug/ml Km, kaip parodyta fig. 2. Šis rezultatas aiškiai parodo, kad pIJ702 BglII- SstI fragmentas turi promotoriaus veiksmingumą Streptomyces' bakterijose su orientacija iš 5stl vietos i, BglII vietą.

[0045] Katecholo dioksigenazės geno ekspresija. 242 bp Bglll-. SstI fragmentas, kaip- aukščiau pateiktame pavyzdyje, buvo • subklonuotas i skirtingą p'romotoriaus-bandini© vektorių, plazmidę pIJ4083, kuri nešė XylE geną iš Pseudomonas putida, koduodama fermentui katecholo dioksigenazę. Hibridinė plazmidė buvo pavadinta pULAD51 (fig. 1). Streptomyces lividans, transformuotos su pULAD51, buvo auginamos R2YE terpėje,' papildytoje CaCl2 iki 60 Mm. Kiekybinis katecholo dioksigenazės veiksmingumo įvertinimas par_©dė, ?a?! Po438- daro įtaką promotoriaus veiksmingumui taip pat, kai įterpiamas genui XylE. prieš srovę (fig. 6) .

[0046] Buvo nagrinėjama įvairių kalcio jonų įtaka Po438 promotoriaus veiksmingumui. Kadangi Katamicino atsparumo lygis priklauso nuo druskos kiekio auginimo terpėje (Hopwood ir kt., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, .U.K., 1985), šiems tyrinėjimams buvo panaudotas neomicinas( neo) minimalioje terpėje. Visais atvejais MM buvo papildyta TES buferiu (25 mM, pH 7.2), kad būtų išvengta pH pasikeitimų. Mg , Fe , Zn²⁺, Cu²⁺ katijonai neturi įtakos Po438 stiprumui (atsparumas 170 ug/ml Neo ant MM plokštelių), tuo tarpu, kai keli vienvalenčiai katijonai (Na', K , Li⁺, Cs⁺, 10 mM) silpnai sumažina promotoriaus veiksmingumą, ir nebuvo augimo MM, sudarytoje iš daugiau kaip 100 ug/ml Neo . Promotoriaus veiksmingumo sumažėjimas buvo pastebėtas taip pat, kai MM buvo papildyta natrio fosfato buferiu (20 mM, pH 7.2), kaip parodyta fig. 5.

[0047] Kalcio jonai teigiamai reguliuoja Po438 promotoriaus aktyvumą. Ca²⁺ žymiai padidino Neo '. S. lividans , transformuotų su .plazmide pULAD50, ..atsparumą, ir buvo parodytas griežtas ryšys tarp ČaCl2 koncentracijos ir i/eo atsparumo lygio (2-a lentelė)..

[0048] Plazmide pULAD60 yra panašios plazmidės su tuo pačiu neo-genu, sujungtu su skirtingu promotoriumi, promotoriumi saf, kaip buvo aprašyta WO 90/1.4426, pavyzdys. Tačiau neo stabilumas S. lividans, transformuotų su pULAD60, nebuvo modifikuotas, auginant MM, turinčioje skirtingas CaČ12 koncentracijas (0,10, 20, 30, 40 mM) , įteigdamas, , kad nėra nei potransliacir.es neo geno produkto' stimuliacijos, nei neomicino kalcic inaktyvacijosJei Ga poveikis nebūtų specifinis, _'stimuliacinis poveikis būtų - stebimas su visomis .struktūromis. Tai rodo, kad Po438 promotoriaus veiksmingumas yra specifiškai reguliuojamas kalcio.;, jon_ų.

[0049] Kalcio indukcija t. p. buvo stebima , S. lividans, transformuotų su plazmide pULAD51, XylE ekspresijoje, kaip parodyta fig. 6. Katecholio dioksigenazės veiksmingumas (Cat 0₂ azė) žymiai padidėjo., kai R2YS kultūrinė terpė buvo papildyta CaCl₂ iki . 60 mM-koncentracijos. S. lividans, transformuotų su pIJ4038 (promotoriaus-bandinio vektorius - be promotoriaus Po438), katecholio dioksigenazės veiksmingumas, priešingai, nesikeitė, kai buvo auginama R2YE terpėje su arba be kalcio chlorido.-

[0050] SI nukleazės kartografiniai eksperimentai buvo atlikti, kad nustatytume transkripcijos pradinį tašką ir Po438 proraotoriaus seką. 270 bp Hlndlll- Sstl fragmentas, atskirtas iš plažmidės pULAD50» buvo pažymėtas HindiII 5r gale ir hitaridizuotas su mRNA, atskirto iš • S. lividans, nešančių pULAD50. Apsaugotas fragmentas pasirodė dydžiu apie 24 nt trumpesnis negu kontrolinis bandinys (fig- 3 J, todėl pradinis transkripeijos taškas buvo nustatytas apie C 24 nt nuo SstI vietos (fig. 4) . Antras SI nukleazės kartografinis eksperimentas buvo atliktas su pirmine plazmide pIJ7D2, kuri taip pat apima Po438 DNR sritį. pIJ702 242 bp BglII-SstI fragmentas buvo panaudotas kaip bandinys. Fragmentas buvo pažymėtas BglII 5* gale ir hibridizuotas su raRNA, atskirtais ii S. lividans, transformuotomis su pIJ702.

[0051] Fig. 3 rodo, kad apsaugotas fragmentas buvo dar 24 nt -trumpesni s negu bandinys, pažymėdamas, kad transkripcijos iniciacija pasirodo pi J70'2 panašiame nukleotide, kaip ir pULAD50.

[0052] Fig. 4 rodo meJ geno ORF 438, išdėstyto apie 30 nt prieš ORF 438 pradini, kodoną, promotoriaus aktyvacijos sritį (Geintlich ir kt., Molecular Microbiology 3:1061-1069, 1989; Leu ir kt., GENE 84:267-277, 1989) kaip ir Po438 promotorių, išdėstytą priešinga orientacija ORF 438 orientacijai ir jo transkripcijas pradini, tašką pagal šio darbo SI nukleazės kartografini, eksperimentą.

[0053] Nors aminoglikozido fosfotransferazės genas ir katecholio dioksigenazės genas buvo apibūdinti pav^yzdžiais* reikėtų suprasti, jog tam, kad padidėtų ekspresija, panaudojant promotorių Po438, genas bet kuriam polipeptidui ar^* proteinui* pagamintas panaudojant Streptomyces tipus, gali būti modifikuotas,, pašalinant , gimtąjį promotorių ir pakeičiant jį Fo438 promotoriumi.. Panašiai svetima DNR, koduojanti polipeptidą ar proteiną, gali būti įtefpta i, bet kurį toki, endogenini, geną. Tačiau geriausia parinkti tokį endogenini, geną, kuris išskiria proteiną per ląstelės sienelę kultūrinėje terpėje, ir tuo atveju svambu išlaikyti sekrecinę signalo seką. Tuo būdu, svetimą DNR geriausia įterpti tokiu būdu, kad išlaikytume sekrecijos signalus kiek -galima daugiau nuo neląstelinio fermento geno. Nors šie signalai dominuoja vyraujančioj sekoj, endogeninių genų neląsteliniams fermentams atžvilgiu akivaizdu, kad terminalinis karboksilo galas yra taip pat svarbus sekrecijai. Tuo būdu.,, būtų geriau sukurti lydymosi, proteiną, įterpiant svetimą DNR seką į endogeninę DNR, negu pašalinti transkripcinę endogeninės DNR dalį, pakeičiant svetima

[0054] DNR.

[0055] Taip pat reikėtų suprasti, kad svetima DNR seka gali būti bet kuri ne iš Streptomyces išvesta DNR seka,

[0056] .^užkoduojanti proteiną arba polipeptidą, ypač eukarictir.ės arba virusinės prigimties - Tokių eukariotinių arba virusinių DNR sekų pavyzdžiai yrasekos, užkoduojančios žmogaus arba gyvulio leukocitų interferonus (INF-alfa) , žmogaus insuliną, žmogaus ir gyvulio augime ir kitus hormonus, tokius kaip kortikotropįno išskyrimo faktorius ( KIF), žmogaus serumo albuminas ir įvairūs žmogaus kraujo faktoriai ir plazminogeniniai aktyvatoriai, audiniai ir urokinazė, virusinis hepatito B branduolys ir paviršiaus antigenai bei kiti žmogaus ir gyvulio virusiniai polipeptidai ir proteinai.

[0057] HOPWOOD. D.A.: Genetic analysis and genome structure in Streptomyces poelicolor. Bacterial. Rev. 31 (1967) 373-

[0058] KA.TZ,: E., Thompson, C. J. and Hopvood, D. A. : Cloning and expression of the tyrosinase gene from Streptomyces antibioticus in Streptomyces lividans. J. Gen... Microbiol. 1_^9 (1983) 27C3-2714.

[0059] LE'J, W.- M.,' Wu, S.- Y., Lin, J.- J., Lo, S. J., and Wu Lee, Y.- H. : Analysis of the promoter region of the melanin locus from Streptomyces antibioticus. Gene 84 ( 1989) 267- 277 ,

[0060] WARD, J. M., Jansen, G. R., Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J. and Bibb, M. J. : Construction and chąracterization of a series of multi- eopy pro^ oter-probe plasmid vectors for Streptomyces using the aminoglycoside phosphotransferase gene from Tn5 as indicator, Mol. Gen. Genet. 203 ( 1986) 468- 478.

Apibrėžtis

1. Kalciu reguliuojamas promotorius,, kurio DNR ^se_?<a yra:

2. DNR seka, kuri hibridizuoja su nukleotidų seka pagal 1 punktą ir turi kalciu reguliuojamą promotoriaus veiksmingumą..3. Klonuojs ntis nešėjas, apimantis DNR seką, užkoduojančią polipeptidą arba proteiną, operatyviai sujungtą su promotoriumi pagal 1 punktą.

4. Klonuojantis nešėjas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad paminėta DNR seka yra endogeninė Streptomyces bakterijoms.

5. Klojuojantis nešėjas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR seka apima visą.arba dali, sekos, užkoduojančios polipeptidą arba proteiną, endogeninį Streptomyces bakterijo-ms, į kurį susiliejo tame pačiame skaitymo rėme DNR seka, užkoduojanti ne Stretftmyces polipeptidą arba proteiną.

6. Streptomyces šeimininko ląstelė, transformuota su klonuojančiu nešėju pagal 3 punktą.

7. Streptomyces šeimininko ląstelė, transformuota su klonuojančiu nešėju pagal 4 punktą. v 8. Streptomyceš šeimininko ląstelė, transformuota ėu klonuojančių nešėju pagal 5 punktą. «9. Svetimos DNR sekos Streptomyceš ekspresijos būdas, b e s i s k i r a, i n t i s tuo, kad apima operatyvų minėtos DNR sekos sujungimą su Streptomyce's ekspresijos kontrolės seka, i, kurią įeina promotorius pagal 1 punktą.10. Būdas pagal 9 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad minėtą svetimą DNR seką ir Streptomyceš ekspresijos, kontrolės seką įterpia i, chromosominę Streptomyceš DNR..11. Būdas pagal 9 punktą, bes i s k* i r i a n t i s tuo, -kad svetimą DNR seką -operatyviai sujungia su 'minėta Streptomyceš■ ekspresijos kontrolės seka per DNR seką, .užkoduojančia bent dali, ■ proteino arba; polipeptido, išskirto iš Streptomyceš signalo sekos, ir.kad minėtą DNR seką, užkoduojančią signalo seką,išreikštą kartu su'minėta DNR seka, • kontroliuoja minėta. Streptomyceš ekspresijos .kontrolės seka, kad būtų išskirtas proteinas arba polipeptidas, užkoduotas svetima-DNR'seka.

Brėžiniai