[LT] Išradimas apima žmogaus ar gyvulių plazmos baltymų atskyrimo būdą.@Pagal šį būdą krioprecipituotos plazmos soliubilizuota frakcija yra vienastadiškai chromatografuojama ant silpnos joninės jėgos anijonų mainų dervos, užtikrinančios hidrofobines sąveikas, kuri neadsorbuoja vienų baltymų, bet fiksuoja kitus baltymus, kurie po to eliuuojami didėjančios joninės jėgos buferiu, pridėjus natrio chlorido.@Būdas leidžia gauti ypatingai aukšto valymo laipsnio VIII faktoriaus koncentratą, kuris gali būti naudojamas hemofilijos A gydymui. Būdas įgalina taip pat gauti fibrinogeno, von Willebrand'o faktoriaus ir fibronektino koncentratus.
[EN]
[0001] Išradimas apima žmogaus ar gyvulių plazmos baltymų atskyrimą anijonų mainų chromatografijos pagalba, naudojant metodiką, įgalinančią per vieną valymo stadiją gauti aukšto valymo laipsnio VIII faktorių, fibrinogeną ir von Willebrand'o faktorių.
[0002] Plazmos baltymų naudojimas terapiniams tikslams reikalauja tokios valymo technikos, kuri leistų gauti aukšto valymo produktus, neturinčius jokių priemaišų, ypač kitų baltymų ar svetimos kilmės komponentų, pav., antikūnių.
[0003] Taip, pavyzdžiui, gydant hemofiliją A, svarbu turėti labai aukšto valymo VIII faktoriaus koncentratus; šiais atvejais pacientai gauna daugkartines pakartotines VIII faktoriaus koncentratų injekcijas ir tuo pačiu metu didelius fibrinogeno ir imunoglobulinų kiekius, kurie gali iššaukti nepageidaujamas imunines reakcijas. Ryšium su tuo nepakankamai išvalyto VIII faktoriaus pakartotinės injekcijos gali būti atliekamos tiktai naudojant vienos kraujo grupės plazmos koncentratus, kad išvengti tipiškų kraujo perpylimo komplikacijų, priklausančių nuo skirtingų kraujo grupių ir imunoglobulinų buvimo.
[0004] Dažniausiai VIII faktoriaus koncentratai yra gaunami iš krioprecipituotos žmogaus plazmos. Valymo laipsnis VIII faktoriaus koncentratų, paprastai gaunamų pramoniniuose žmogaus plazmos perdirbimo centruose, dažnai yra 1 tarptautinio vieneto/mg (TV/mg) lygyje ir paprastai neviršija 10-20 TV/mg. Įprastinė gavimo technologija naudoja nusodinimo stadijas, siekiančias eliminuoti, dažnai nepakankamai, tokias baltymų priemaišas, kaip fibrinogenas, fibronektinas ir imunoglobulinai. Ši technologija gali naudoti ar derinti nusodinimą prie žemos temperatūros (10°C) ir baltymus nusodinančių agentų naudojimą, pav., hidrofilinių polimerų, kaip PEG
[0005] (Newman et. al., Br.J. Haematol 21:1-20, 1971; Hao et al., in Methods of Plazma protein Fractionation, Academic Press 1980, PP. 57-74), polivinil-pirolidonas (Casillas and Simonetti, Br.J. Haemato, 50:665-672, 1982), dekstranas, Fikolis, Perkolis, hidroksietilintas krakmolas ar albuminas, kurie yra pasiūlyti kaip VIII Faktorių nusodinantys agentai (Farrugia et al., Thromb. Haemostas, 51:338-342, 1984). Tas pats liečia gliciną ir natrio chloridą, kurių naudojimą pasiūlė Thorell ir Blomback. Kai kurie autoriai (Ng et al., Thrombosis Res., 42: 825-834, 1986) pasiekė gerų rezultatų, derindami tris nusodinimo agentus, pav., PEG, gliciną ir natrio chloridą, gaudami VIII faktoriaus koncentratus su 10-16 TV/mg specifiniu aktyvumu.
[0006] Norint gauti didelio molekulinio svorio frakciją, turinčią Faktoriaus VIII:C-von Villebrand'o faktoriaus kompleksą (dalinai neturinti, fibrinogeno) , buvo siūloma naudoti sferinę selektyvinę chromatografiją arba gefiltraciją. Šios metodikos įgalina gauti, nors ir nedidele išeiga, produktą, kurio specifinis aktyvumas neviršija 30 TV/mg ir kuriam reikalingas stabilizatorius - albuminas (dėl ko sumažėja specifinis aktyvumas iki apytiksliai 3-5 TV/mg). Ši technologija kelia eilę problemų, susijusių su metodikos adaptavimu stambiapartijinei gamybai, nes yra sunkumų, palaikant gamybinių gelfiltracijos kolonėlių skiriamąją galią tam tikrą periodą.
[0007] VIII faktoriaus koncentratai taip pat gali būti gaunami, įvedant į technologinę schemą adsorbcijos ant poringo silicio dioksido mikrogranulių stadiją, siekiant juos išvalyti nuo žemo molekulinio svorio baltymų priemaišų (Margolis et al., Vox Sang. 46:341-348, 1984). Produkto specifinis aktyvumas palyginti mažas: 1 TV/mg.
[0008] Pastaruoju metu pasirodė nauji aukštai valytų VIII faktoriaus koncentratų gavimo metodai. Taip, pav., Hyland ir Travenol firmos koncentratų gavimui pasiūlė panaudoti imunoafininės chromatografijos metodus ( Zimmerman and Fulcher, Thrombosis Res., Suppl. VII, p. 58, 1987; Berntorp and Nilsson, Thrombosis Res., Suppl. VII, p. 60, 1987; Levine et al., Thrombosis Res, Suppl. VII, 1987). Sutinkamai su šiuo metodu VIII faktoriaus valymui naudojami anti- faktoriaus VIII:C arba anti- von Villebrand' o faktoriaus antikūniai, imobilizuoti chromatografinėje terpėje. Šis metodas duoda gerus rezultatus, bet reikalauja stiprių tirpalų, desorbuojant VIII Faktorių nuo jo ar nuo Villebrando faktoriaus antikūnų. Ryšium su tuo reikalinga papildoma ultrafiltracijos stadija, pašalinant nepageidaujamus cheminius agentus, kas gali neigiamai paveikti VIII faktoriaus biologini, aktyvumą.
[0009] Gamybos metu šio faktoriaus specifinis aktyvumas gali siekti 1000 ar net 3000 TV/ mg, bet jo nestabilumas reikalauja panaudoti stabilizatorių, pav., albuminą, prieš liofilinimo stadiją, kurios metu VIII faktoriaus specifinis aktyvumas sumažėja iki 3- 5 TV/ mg. Pagrindinis valymo imuninės chromatografijos metodu trūkumas yra liekamųjų antikūnių buvimas preparate; kadangi antikūniai yra gaunami imunizuojant peles, pacientams jie gali iššaukti tokias imunines reakcijas, kaip kad įvedus svetimus organizmui baltymus.
[0010] Taip pat buvo naudojama jonų mainų chromatografija, vienok jos pritaikymo sfera apsiribojo laboratoriniais eksperimentais, nes tai susieta su metodikos techniniu sudėtingumu ir žemomis išeigomis.
[0011] J. J. Morgenthaler ( Thromb. Haemostas., Stuttgart, 47( 2) 124- 127 ( 1982)) darbe diskutuojama, pav., apie faktoriaus VIII: C valymą, naudojant glikolio precipitatą, leidžiant ji, per modifikuotą sefarozę
[0012] (Sepharose). Vienok, nepateikta duomenų apie produkto išeigą ar rezultatų patikimumą, naudojant skirtingus metodus.
[0013] Tokiu būdu, svarbu išdirbti naujus baltymų koncentratų gavimo metodus, ypač VIII faktoriaus, kuriuos būtų galima naudoti pramoninėje gamyboje ir gauti aukšto valymo laipsnio produktus, pilnai laisvus nuo svetimų baltymų, pav., nuo gyvulinės kilmės antikūnų.
[0014] Pareiškėjas siūlo valymą atlikti anijonų mainų chromatografijos pagalba, kuri leistų, tinkamai parinkus dervą, atskirti reikalingus baltymus, naudojant vieną chromatografinę kolonėlę sąlygomis, lei-džiančiomis išvengti sekančios procedūros, pav., ultrafiltracijos, kas daro procesą sudėtingesniu ir mažina valyto baltymo aktyvumą.
[0015] Tokiu būdu, išradimas apima plazmos baltymų atskyrimo būdą, konkrečiai - VIII faktoriaus, fibrinogeno, fibronektino ir von Villebrand'o faktoriaus, pasižyminti, tuo, kad žmogaus plazmos krioprecipitato soliubilizuota frakcija yra chromatografuojama ant santykinai silpnos joninės jėgos anijonų mainų dervos, užtikrinančios hidrofobines sąveikas, kurios igalina neadsorbuoti vienų baltymų, o fiksuoti kitus ir kurie tada yra specifiškai eliuuojami didėjančios joninės jėgos buferiui.
[0016] Šitas būdas taip pat yra tinkamas ir gyvulinės kilmės plazmai, pav., kiaulių plazmai, kas aktualu kai kuriais atvejais hemofilija sergantiems ligoniams, kurių serumas turi inhibuoj ančių savybių ir kurių gydymui negalime naudoti žmogaus VIII faktorių.
[0017] Kaip pradinę frakciją galime naudoti krioprecipituotos plazmos frakciją, kuri prieš valymo procedūrą buvo iš anksto apdorota. Tokiu apdorojimu gali būti, pav., nusodinimas aliuminio geliu ir/ar nusodinimas prie žemų temperatūrų įprastais metodais, taikomais tokių frakcijų apdorojimui.
[0018] Išbandant įvairias dervas, naudojamas chromatografiniam atskyrimui, pastebėta, kad geriausi rezultatai gauti, naudojant DEAE grupes, fiksuotas ant vinil-polimerinio gelio, pav., ant Fractogel TSK. Rinkoje tokio tipo derva figūruoja pavadinimu Fractogel TSK-DEAE 650 (M)
[0019] (Merck). Ši chromatografinė terpė duoda žymiai geresnius rezultatus, negu kiti tirti geliai, tokie kaip, pav., DEAE-Sepharose CL-6B, DEAE-Sepharose CL-6B Fast Flow (Pharmacia), DEAE -Sepharose 4B ar DEAE-Trisacril LS (IBF).
[0020] Gelio, panašaus i, Fractogel-TSK-DEAE (M), panaudojimas yra aprašytas Y. Kato et al. (J. Chromato; 245, 1982, 193-211), kurie ji, rekomenduoja naudoti pramoniniam didelio molekulinio svorio baltymų chromatografiniam atskyrimui su vidutiniu efektyvumu. Eliuuojamo produkto užsilaikymas ant šio gelio yra sąlygojamas jo žema jonų mainų galia ir dideliu poringumu.
[0021] Pareiškėjas parodė, kad tokio tipo gelis įgalina adsorbuoti pirmiausia labai didelio svorio kompleksus, kurie susidaro tarp VIII faktoriaus ir von Villebrand'o faktoriaus. Be to, per nulygsvarinančio ir eliuuojančio buferių parinkimą Pareiškėjas parodė galimybę panaudoti silpnus hidrofobinius ryšius, susidarančius ilgai užsilaikius stambiamolekuliniams kompleksams ant polivinilo gelio. Šis aprašomojo gelio privalumas anksčiau nebuvo pažymėtas.
[0022] Taikant tokią dervą darbe su plazmos frakcija, turinčia VIII faktorių, pav., su iš anksto valytu krioprecipitato tirpalu, naudojant atitinkamus buferius, gaunama VIII faktoriaus labai aukšto valymo laipsnio koncentratas su charakteristikomis, būdingomis vienos kraujo grupės plazmos koncentratui. VIII faktoriaus koncentracija tokiuose preparatuose yra 50 TV/ml (specifinis aktyvumas didesnis negu 100 TV/mg), jiems nereiklainga ultrafiltracijos stadija, jie pasižymi aukštu stabilumu, dėl ko jiems nereikalingi baltymų grupės stabilizatoriai. Tos pačios chromatografijos pagalba taip pat galima gauti fibrinogenu, fibronektinu ar von Willebrand'o faktoriumi praturtintas frakcijas su fiziko-cheminėmis savybėmis, kurios patenkintų klinikinius tikslus arba jas naudojant kaip cheminius reagentus. Be to, fibrinogenas gali būti toliau koncen-truojamas ir panaudojamas kaip biologiniai klijai, sutinkamai su Europos patento paraiška Nr. 88 401961.3.
[0023] Būdas sutinkamai su išradimu įgyvendinamas sekančiai. Iš anksto valytą frakciją, turinčią pagrindinius krioprecipitato baltymus, t. y. fibrinogeną, VIII faktorių, fibronektiną ir von Willebrand'o faktorių, leidžia per anksčiau aprašytą anijonų mainų dervą. VIII faktorius, von Willebrand'o faktorius (pilnai ar didesnioji jų dalis, priklausomai nuo pradinio produkto kiekio) ir fibronektinas yra adsorbuojami ant dervos, tuo tarpu fibrogenas yra randamas neadsorbuotų proteinų filtrate.
[0024] Buferio joninę fėgą padidinus pirmą kartą, yra eliuuojami fibronektinas ir didesnioji von Willebrand'o faktoriaus dalis.
[0025] Papildomai padidinus buferio joninę jėgą, yra eliuuojamas VIII faktorius kartu su mažais von Willebrand'o faktoriaus kiekiais, kuris gali būti iš karto liofilinamas, nepridedant i, ji, stabilizatorių ir nenaudojant ultrafiltracijos stadijos.
[0026] Geriausius rezultatus galima gauti, naudojant buferi,, turinti, 2-4 g/ltr lizino ir 8-11 g/ltr glicino. Kitų amino rūgščių ar tik vienos iš šių dviejų paminėtų amino rūgščių panaudojimas duoda žymiai prastesnius rezultatus.
[0027] Buferio joninė jėga yra didinama, pridedant natrio chlorido. Panaudojimas anksčiau minėtos dervos, pasi-žyminčios vidutine jonine jėga ir silpnu hidrofo-biškumu, leidžia naudoti šią druską, desorbuojant von Willebrand'o faktorių anksčiau negu VIII faktorių, kas įgalina atsisakyti kalcio chlorido panaudojimo, kuri, po to reikia šalinti ultrafiltracijos būdu, disocijuojant VIII faktoriui ir von Willebrand'o faktoriui.
[0028] Virusų inaktyvacij a, žinoma, gali būti atliekama įprastu metodu bet kokioje proceso stadijoje. Naudojant virusus inaktyvuojantį chemini, agentą, inaktyvaci ją geriau atlikti iki plazmos frakcijų užnešimo ant dervos. Šiuo atveju chromatografinis procesas įgalina efektyviai eliminuoti inaktyvuojančius agentus.
[0029] Geri rezultatai gaunami inaktyvacijos metodams naudojant tirpiklius - detergentus, kaip aprašyta Europos patento paraiškoje Nr. 0 131 740.
[0030] Norint gauti VIII faktorių, galima chromatografuoti bet kokią ji, turinčią baltymų frakciją, pav., iš anksto valytą plazmos krioprecipitatą, ji, užnešant ant aliuminio gelio, po to nusodinant prie žemos temperatūros, sutinkamai su VIII faktoriaus koncentratų gavimo įprastiniais metodais, kaip aprašyta Europos patento paraiškoje Nr. 86 1042 97 6.
[0031] Pradinėje frakcijoje faktoriaus VIII:C specifinis aktyvumas gali būti labai žemas (1.0 TV/mg). Vienastadijinė anijonų mainų chromatografija pagal šį išradimą užtikrina 400-700 kartų išvalymą. Išeiga šioje stadijoje 75-90 %.
[0032] VIII faktoriaus koncentratas, gautas šiuo būdu, pasižymi - aukštu išvalymo laipsniu, jo specifinis aktyvumas yra daugiau negu 100 TV/mg baltymo. Preparatas neturi fibrinogeno ir imunoglobulinų G, jis žymia dalimi laisvas nuo f ibronektino. Jame nėra žmogaus kraujo grupės antikūnių arba yra labai nežymūs jų kiekiai. Ryšium su tuo jį galima klasifikuoti pagal Europos Farmakopėjos rekomendacijas kaip vienos kraujo grupės plazmos koncentratą netgi tuo atveju, kai pradinė plazma nebuvo atrinkta pagal kraujo grupes. Todėl jį galima sėkmingai naudoti klinikoje, ypač gydant hemofiliją A, kada reikalingos daugkartinės injekcijos. Jį taip pat galima naudoti kaip reagentą įvairiuose testuose ar analizėse, kur reikalingas aukšto valymo laipsnio VIII faktorius.
[0033] Kitos šia chromatografine kolonėle gaunamos frakcijos taip pat kelia susidomėjimą dėl savo baltyminės sudėties: iš vienos pusės - fibrinogenas, kuris randamas pirmame filtrate, o iš kitos pusės fibronektinas ir von Willebrand'o faktorius, kurie yra eliujuojami, pirmą kartą padidinus joninę jėgą.
[0034] Sekantys pavyzdžiai iliustruoja išradimą, neribodami jo apimties.
[0035] Kaip pradinė medžiaga buvo naudojamas žmogaus plazmos krioprecipitatas, resuspenduotas vandeniniame natrio heparino (2 V/ml) tirpale, turintis 0.6-1.1 TV/mg specifinio aktyvumo VIII faktorių.
[0036] 0.1 M acto rūgštimi suspensijos pH yra nureguliuojamas iki 7-7.1.
[0037] Tokia krioprecipitato suspensija yra valoma, naudojant aliuminio gelį ir nusodinimą žemoje temperatūroje. Aliuminio hidroksidas yra sudedamas i, suspensiją (108 g 2 % Al(OH)3 1 kg krioprecipitato) maišant kambario temperatūroje per 5 min. 0.1 M acto rūgštimi pH yra nureguliuojamas iki 6.5-6.6 ir suspensija maišant yra atšaldoma iki 14-16°C. Pasiekus nurodytą temperatūrą, centrifuguojama 14-16°C temperatūroje, supernatantas yra surenkamas ir sterilizuojamas filtracijos būdu.
[0038] Toks iš anksto valytas tirpalas yra inaktyvuoj amas virusų atžvilgiu, naudojant tirpiklį - detergentą, esant Tween - TNBP, pagal metodą, aprašytą Europos patento paraiškoje Nr. 0 131 740.
[0039] B) Chromątografinis atskyrimas ant Fractogel TSK- DEAE
[0040] Paruošiama chromatografinė kolonėlė su Fractogel TSK-DEAE 650 (M) (Merck) derva, imant 0.5 ltr. Fractogel 1 kg krioprecipitato. Kolonėlė yra plaunama 5 tūriais 0,1 M NaCl tirpalu ir tada nulygsvarinama buferiu, susidedančiu iš: trinatrio citrato (2.94 g/ltr), kalcio chlorido (1 mM), natrio chlorido (0.11 M), glicino (9 g/ltr) ir lizino (3 g/ltr).
[0041] Ant kolonėlės yra užnešamas iš anksto valytas, kaip aprašyta A) pavyzdyje, krioprecipitato tirpalas. Gaunami filtratas ir eliuatai yra surenkami ir juose matuojami baltymų kiekiai pagal absorbciją prie 280 nm (toliau žymima O.T. - optinis tankis).
[0042] Pirmas filtratas rodo piką baltymų, neadsorbuotų ant kolonėlės, ir kuris atitinka pagrindinai fibrinogeną
[0043] Išėjus šiam pikui ir O.T. nusileidus iki bazinio lygio, kolonėlė buvo eliuojama tuo pačiu buferiu, padidinus joninę jėgą NaCl pagalba iki galutinės 0.15 M koncentracijos. Šis buferis desorbuoja baltymų piką, kuri, sudaro pagrindinis Villebrando faktoriaus kiekis ir fibronektinas (žiūr. 4 pavyzdi,) .
[0044] Išėjus šiam pikui ir O.T. nusileidus iki bazinio lygio, buferio joninė jėga padidinama antrą kartą, pridedant NaCl iki galutinės 0.25 M koncentracijos.
[0045] Esant šioms sąlygoms, VIII faktorius eliujuojamas 30-40 TV/ml lygyje.
[0046] VIII faktoriaus tirpalas, gautas chromatografijos procese, aprašytame 1 pavyzdyje, yra pakankamai švarus ir koncentruotas, kas leidžia ji, iš karto pilstyti i, flakonus ir liofilizuoti, nenaudojant papildomos ultrafiltracijos stadijos.
[0047] Esant reikalui, galima gauti įvairių koncentracijų tirpalus, skiedimui naudojant tą patį buferi,, kuris buvo naudojamas eliucijai. Tokiu būdu galima gauti preparato fasuotes su specifiniu aktyvumu, atitinkančiu veikiančius standartus.
[0048] Gaunamų tirpalų sudėties vidurkis yra sekantis:
[0049] Po liofilizacijos gaunamas švarus, gerai tirpstantis produktas. Faktoriaus VIII:C kiekis yra stabilus 24 valandas, laikant kambario temperatūroje.
[0050] Injekcijos žmonėms rodo faktoriaus VIII:C kompensaciją, palyginamą su tokia, kuri gaunama naudojant mažiau švarius produktus. Taip pat jo gyvenimo pusperiodis yra ekvivalentiškas kitų preparatų pusperiodžiui.
[0051] Parodytas koncentrato didelis terapinis efektyvumas, ypač pakartotinų injekcijų atvejais gydant hemofiliją A.
[0052] Pirmas filtratas, gautas chromatografijos ant DEAE-Fractogel pagalba, aprašytas 1 pavyzdyje, turi fibrinogeną, taip pat albuminą, imunoglobulinus ir antivirusinius agentus (Tween ir TNBP).
[0053] -L?.
[0054] Fibrinogenas, esantis šiame tirpale, buvo valomas, naudojant papildomą chromatografijos ant heparino-sefarozės dervos stadiją.
[0055] Chromatografija buvo atliekama tame pačiame buferyje, kuris buvo naudojamas ankstesnėje stadijoje, pridėjus NaCl iki 0.0 6 M koncentracijos, kas padėjo išvengti dializės tarp dviejų chromatografijos stadijų.
[0056] Filtratas, gautas pirmoje chromatografijos stadijoje, yra praskiedžiamas iki 280 mOsm osmosinio slėgio prie PH 6.5. Po to jis užnešamas ant antros kolonėlės ir gaunamas naujas filtratas, turintis albuminą, imunoglobulinus, tviną ir TNBP. Fibrinogenas yra adsorbuotas ant kolonėlės.
[0057] Kada filtrato O.T. sumažėja iki bazinio lygio, kolonėlė yra eliuuojama tuo pačiu buferiu, padidinus joninę jėgą NaCl iki galutinės 0.16 M koncentracijos.
[0058] Surinkta fibrinogeno frakcija yra koncentruojama ir dializuojama kasetinėje sistemoje. Koncentruotas produktas yra išpilstomas i, flakonus ir liofilinamas.
[0059] Tokiu būdu gautas fibrinogeno koncentratas patenkina kokybės standartų reikalavimus, nustatytus Europos Farmakopėj os.
[0060] Be to, j d, galima naudoti kaip substratą, ruošiant klijus, sutinkamai su Europos patento paraiška Nr. 88 401961.3.
[0061] 4 Pavyzdys: von Willebrand' o faktoriaus koncentrato paruošimas
[0062] Eliuatas, gautas chromatogfafijos ant DEAE-Fractogel pagalba, naudojant 0.15 M NaCl, kaip aprašyta 1 pavyzdyje, turi didelius von Willebrand'o faktoriaus ir fibronektino kiekius, jame taip pat yra Tween ir TNBP.
[0063] Ši frakcija praskiedžiama iki 385-390 mOsm osmosinio slėgio, naudojant chromatografinį bazinį buferį
[0064] (trinatrio citratas, kalcio chloridas, lizinas, glicinas, pH 7, 18 mOsm osmosinis slėgis).
[0065] Po to ji užnešama ant antros kolonėlės, užkrautos DEAE-Fractogel, nulygsvarintos tuo pačiu buferiu kaip anksčiau ir turinčiu 0.11 M galutinę NaCl koncentraciją, pH 7, 387 mOsm osmosinį slėgį.
[0066] Esant šioms sąlygoms, labai efektyviai pašalinama tvinas ir TNBP.
[0067] Kadangi jau pradinis tirpalas turi labai aukštą von Willebrand'o faktoriaus kiekį, jis užsilaiko ant kolonėlės žymiai didesniu laipsniu, negu pirmos kolonėlės atveju. Kolonėlės adsorbcinis talpumas yra mažiausiai 160 V Ag/ml (von Willebrand'o faktoriaus antigeno vienetas) ar 100 RCO/ml (ristocetino kofaktoriaus vienetai).
[0068] Frakcija, turinti von Willebrand'o faktorių, yra eliuuojama buferiu, į jį pridėjus NaCl iki 0.15 M galutinės koncentracijos.
[0069] Gautas von Willebrand'o faktoriaus eliuatas yra pakankamai koncentruotas, todėl jį galima išpilstyti į flakonus ir liofilizuoti, papildomai neatliekant ultrafiltracijos.
[0070] Gautas koncentratas yra labai aukšto valymo laipsnio, jo specifinis aktyvumas viršija 100 RCO vienetų/mg. Jis turi nedidelį fibronektino kiekį, bet tai nedaro įtakos jo aktyvumui.
[0071] 5 Pavyzdys: Fibronektino koncentrato paruošimas
[0072] Fibronektino koncentratas gali būti taip pat paruošiamas iš to paties pradinio eliuato, kaip 4 pavyzdyje.
[0073] Von Willebrand'o faktorius ir fibronektinas gali būti atskiriami, remiantis jų molekulinių svorių skirtumu. Naudojant gelfiltraciją ant Sephacryl S-400 (R)
[0074] (Pharmacia) kolonėlės, pav., galima atskirti pirmą aukšto molekulinio svorio frakciją, turinčią von Willebrand'o faktorių. Sekanti frakcija turi fibronektiną, kuri, galima iš karto pilstyti i, flakonus ir liofilinti.
1. Būdas žmogaus ar gyvulių plazmos baltymams atskirti, besiskiriantis tuo, kad plazmos krioprecipitato soliubilizuotą frakciją vienstadi-jiškai chromatografuoja ant silpnos joninės jėgos anijonų mainų dervos, sulaikančios labai stambias molekules ir užtikrinančios hidrofobines sąveikas, ir po to kiekvieną baltymą selektyviai atskiria, didinant eliucijos buferio joninę jėgą.
2. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad pradinė frakcija yra plazmos krioprecipitatas, turintis VIII faktorių, von Willebrand'o faktorių, fibrinogeną ir fibronektiną.
3. Būdas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad pradinėje frakcijoje faktoriaus VIII: C specifinis aktyvumas yra didesnis arba lygus 0.1 TV/mg.
4. Būdas pagal vieną iš 1-3 punktų, besiskiriantis tuo, kad pradinę frakciją iš anksto valo, naudojant:- apdorojimą aliuminio hidroksidu,- atšaldymą iki 14-16°C,- centrifugavimą ir supernatanto surinkimą.
- apdorojimą aliuminio hidroksidu,- atšaldymą iki 14-16°C,- centrifugavimą ir supernatanto surinkimą.5. Būdas pagal vieną iš 1-4 punktų, besiskiriantis tuo, kad jis susideda iš sekančių stadijų:a) soliubilizuotos krioprecipitato frakcijos chromatografija ant dervos, turinčios DEAE grupes, fiksuotas ant vinilo polimero gelio, kuri adsorbuoja VIII faktorių, didelę dali, von Willebrand'o faktoriaus ir fibronektino bei užtikrina fibrinogeno perėjimą i, eliuatą,b) buferio joninės jėgos didinimas pirmą kartą, norint eliuuoti fibronektiną ir didesniąją dalį von Willebrand'o faktoriaus, irc) tolimesnis joninės jėgos didinimas, norint eliuuoti VIII faktorių.
a) soliubilizuotos krioprecipitato frakcijos chromatografija ant dervos, turinčios DEAE grupes, fiksuotas ant vinilo polimero gelio, kuri adsorbuoja VIII faktorių, didelę dali, von Willebrand'o faktoriaus ir fibronektino bei užtikrina fibrinogeno perėjimą i, eliuatą,b) buferio joninės jėgos didinimas pirmą kartą, norint eliuuoti fibronektiną ir didesniąją dalį von Willebrand'o faktoriaus, irc) tolimesnis joninės jėgos didinimas, norint eliuuoti VIII faktorių.6. Būdas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad buferis turi liziną ir gliciną.
7. Būdas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad buferis turi 2-4 g/l lizino ir 8-11 g/l glicino.
8. Būdas pagal vieną iš 5-7 punktų, besiskiriantis tuo, kad buferio joninę jėgą didina, pridedant NaCl.
9. Būdas pagal 8 punktą, besiskiriantis tuo, kad natrio chlorido koncentracija a) stadijos atveju yra 0.11 M, b) stadijos atveju - 0.15 M ir c) stadijos atveju - 0.25 M.
10. Būdas pagal vieną iš 1-9 punktų, besiskiriantis tuo, kad plazmos virusų inaktyvaciją atlieka cheminiais inaktyvuojančiais agentais prieš chromato-grafinio atskyrimo stadiją.
11. VIII faktoriaus koncentratas, charakterizuojamas kokybe, kuri sulyginama su vienos kraujo grupės plazmos koncentrato kokybe ir kurios specifinis aktyvumas yra didesnis negu 100 TV/mg, besiskiriantis tuo, kad ji, gauna būdu pagal vieną iš 2-10 punktų.
12. Fibrinogeno koncentratas, besiskiriantis tuo, kad jį sudaro a) stadijos eliuatas pagal 5 punkto būdą, išvalytas papildomos chromatografijos ant heparino-sefarozės dervos pagalba.
13.Von Willebrand'o koncentratas, besiskiriantis tuo, kad jį sudaro b) stadijos eliuatas pagal 5 punkto būdą, išvalytas papildomos chromatografijos ant tos pačios dervos kaip ir a) stadijoje pagalba ir eliuuotas tuo pačiu buferiu, pridėjus NaCl iki 0.15 M koncentracijos.
14. Fibronektino koncentratas, besiskiriantis tuo, kad ji, sudaro b) stadijos eliuatas pagal 5 punkto būdą, išvalytas papildomos gelfiltracijos pagalba.