[LT] Išradimas liečia žmogaus XI faktoriaus koncentratą, turintį aukštą specifinį aktyvumą, gautą būdu, kurį sudaro filtracijos-absorbcijos stadija ir vienintelė chromatografijos ant katijonų mainų dervosstadija.@Gautas koncentratas yra puikiai tinkamas terapiniam naudojimui - XI faktoriaus nepakankamumo atvėjais pakaitalų terapijai.
[EN]
[0001] Išradimas apima žmogaus plazmos XI faktoriaus koncentrato, turinčio aukštą specifini, aktyvumą ir skirto terapiniam naudojimui, gavimo būdą.
[0002] XI faktorius arba plazmos tromboplastino pirmtakas yra glikoproteinas, kuris sudaro kontaktinės fazės dali, hemostazės mechanizme dėl savo aktyvuo j ančio veikimo i, IX faktorių ir, iš kitos pusės, sudaro fibrinolitinės sistemos dali, dėl savo aktyvuo j ančio veikimo plazminogeną.
[0003] XI faktoriaus nepakankamumas yra paveldimas ir yra perduodamas kaip recesyvinis autosominis požymis. Šis nepakankamumas yra retas, bet jis paplitęs tarp kai kurių Viduriniųjų Rytų gyventojų.
[0004] Kaip ir kitiems faktoriams, kurių nepakankamumas yra retas (V, XIII, X faktoriai), valyti terapiniai preparatai, gauti iš žmogaus plazmos, yra reti ir neesminiai, o vienintelė pakaitalų terapija naudoja visą plazmą arba krioprecipituotos plazmos frakciją, vienok, tai sąlygoja vienalaiki, kitų plazmos baltymų nenaudingų kiekių įleidimą, taigi ir įvairių antrinių esminių reakcijų riziką po daugkartinių injekcijų.
[0005] XI faktoriaus valymas eksperimentiškai gali būti sunkiai įgyvendinamas ir tik su sąlyga - naudojant stiprius inhibitorius, kas rodo, jog faktoriaus molekulė yra labai labili. Valymas buvo atliekamas jonų mainų bei afininės chromatografi jos 4 arba 5 stadijų pagalba, kaip pradinę medžiagą naudojant plazmą (Bouma ir Griffin, 1977, J. Biol . Chem., 252, 6432-6437) arba trombocitus (Schiffman ir Yeh, 1990, Thromb. Res., 60, 87-97) . Taip pat buvo gautas labai išvalytas jaučio XI faktoriaus preparatas iš 20 1 plazmos, naudojant išsodinimo ir chromatografinius metodus; valymo trukmė
[0006] - 9 dienos (Koide et al . , 1975, Methods in Enzymology-
[0007] Blood clotting enzymes p. 65-73). Vienintelis preparatas, savo kokybe tinkantis terapiniam naudojimui, buvo aprašytas (Winkelman et. al., 1988, Internat. Congress ISBT-BBTS, London) ir buvo gautas adsorbcijos ant heparinosefarozės pagalba, pašalinus VIII ir IX faktorius, bet jo specifinis aktyvumas neviršijo 5 V/mg baltymo, ir jis buvo žymiai užterštas liekamuoju AT III. Pareiškėjai nežinojo kito XI faktoriaus paruošimo būdo, kuris leistų pramoniniu mastu gaminti ir aprūpinti dideliais XI faktoriaus kiekiais, savo kokybe tinkamais plačiam terapiniam naudoj imui.
[0008] Tokiu būdu, išradimo tikslas - sukurti naują valymo būdą, tinkamą labai dideliems plazmos tūriams, kuris per nedideli, lengvai įgyvendinamų pramoniniu mastu stadijų skaičių leistų gauti XI faktoriaus koncentratą, tinkamą naudojimui.
[0009] Taigi, šis išradimas apima žmogaus XI faktoriaus koncentratą, kurio paruošimas susideda iš dviejų stadijų: pirmoji - filtracijos - adsorbcijos stadija, kuri pakankamai selektyviai užlaiko XI faktorių, po to jis desorbuoj amas ir apdorojamas antroje stadijoje, chromatografuoj ant ant katijonų mainų dervos.
[0010] XI faktoriaus preparatas gali būti papildomai apdorojamas tirpikliu-detergentu, norint inaktyvuoti virusus; inaktyvavimas atliekamas prieš chromatografijos stadiją, kuri leidžia pilnai pašalinti likusius po šio nukenksminimo produktus.
[0011] Šis metodas įgalina gauti tinkamą terapijai XI faktorių, ji, išskiriant iš apytiksliai 100 1 žmogaus plazmos per, palyginti, trumpą laiką (apie 28 vai.), kurio 8 vai. skiriamos virusų inaktyvacij ai .
[0012] Pagal ši, išradimą valymo būdas taikomas krioprecipituotos plazmos supernatantui, gaunamam įprastais, gerai žinomais būdais, ir gali būti taikomas 1000-1200 1 tūriams.
[0013] Pirma valymo stadija susideda iš krioprecipituotos plazmos supernatanto filtravimo baterijoje su 3 filtruojančiais elementais, kurių porų dydis 0,5-2 fa ir kurie pagrindinai užkrauti neigiamai (Zeta plus™ CF filtrai, tiekiami Cuno, Process Filtration Products, filialas Commercial Intertech Corp., Meriden, Conn., 06450, žemiau vadinami "Kuno filtrai"), aprašyti JAV patentuose 4,783,262 ir 4,859,340. Šiuos filtrus sudaro perlitai ir valyta celiuliozė, turinti nedidelius teigiamai užkrautos dervos kiekius, kad sulaikyti konkrečias medžiagas; filtrai yra pilnai laisvi nuo asbesto ir stiklo mikrofibri 1ių. Taip pat gali būti naudojamos kitos filtrų sistemos, esančios pardavime.
[0014] Filtrai, adsorbuojantys XI faktorių, plaunami citrat-fosfatiniu buferiniu tirpalu, susidedančiu iš natrio citrato, dinatrio fosfato, kalio fosfato, natrio chlorido ir dinatrio EDTA; pH nustatomas tarp 5.5 ir 6.5, tinkamiausia pH = 6. Ši filtracijos stadija pašalina didelę dali, plazmos baltymų.
[0015] XI faktorius, adsorbuotas ant filtro sluoksnių dėl jų neigiamų krūvių, desorbuoj amas nuo jų, padidinant buferio tirpalo joninę jėgą, reguliuojant galutinę natrio chlorido koncentraciją. Į ši, paskutini, buferio tirpalą taip pat dedama nedidelis III antitrombino kiekis (AT III) - 0.1-0.2 V/ml, kad apsaugoti XI faktorių nuo proteazių veikimo.
[0016] Po to desorbuota, dializuota ir koncentruota frakcija užnešama ant katijonų derva užkrautos kolonėlės (dažniausiai, sefarozės sulfato geliu), nulygsvarintos buferio tirpalu, susidedančiu iš natrio citrato, natrio chlorido, lizino ir arginino, turinčio pH 5.5-6.5, tinkamiausia pH = 6.
[0017] Ši kolonėlė praleidžia likusius užteršiančiuosius baltymus ir virusus inaktyvuojančius agentus.
[0018] Šiame išradime buvo atrasta, kad sefarozės sulfato gelis, nelauktai, turi labai dideli, XI faktoriaus užlaikymo talpumą (nuo 300 iki 450 v/ml gelio) , kas leidžia išvengti sekančios ultrafiltracijos stadijos, mažinančios išeigą. dar daugiau, adsorbcija ant sefarozės sulfato leidžia atlikti eliuciją praktiškai fiziologiniu tirpalu, kai tuo tarpu kitos dervos (aprašytos aukščiau), kurių pagrindą sudaro sulfopropilo grupės, reikalauja griežtesnių eliucijos sąlygų.
[0019] Po to, kai kolonėlė yra praplauta citrat-fosfatiniu buferiu, turinčiu natrio citratą, dinatrio fosfatą, kalio fosfatą, natrio chloridą, liziną ir argininą, kurio pH yra 6.1-6.9, tinkamiausia pH = 6.5, XI faktorius yra desorbuoj amas, padidinus buferio pH iki 7-8, tinkamiausia pH = 7.5, ir padidinus natrio chlorido koncentraciją iki 0.15-0.20 M, tinkamiausia iki 0.17 M.
[0020] Nuo XI faktoriaus eliuavimo momento, jis stabili-zuojamas, pridedant 0.5-3 v/ml gerai valyto AT III ir 0.5-4 v/ml heparino. Po to tirpalas sterilizuojamas filtracijos būdu, išpilstomas i, flakonus ir liofilinamas įprastu būdu.
[0021] Gautas šiuo būdu XI faktorius yra išvalytas daugiau kaip 10,000 kartų pradinės plazmos atžvilgiu.
[0022] Pagal ši, būdą gauto XI faktoriaus specifinis aktyvumas yra mažiausiai lygus 100 v/mg baltymų.
[0023] Gauto XI faktoriaus aukštas išvalymo laipsnis yra patvirtinamas elektroforeze SDS - poliakrilamido gelyje, biocheminiais tyrimais, o jo nekenksmingumas - biologiniais testais su gyvuliais.
[0024] Taigi, XI faktoriaus koncentratas, gautas šiuo būdu, yra ypač tinkamas terapiniam naudojimui, ypatingai, pakaitalų terapijoje - įgimto ir įgyto XI faktoriaus nepakankamumo atvejais.
[0025] Sekantis pavyzdys iliustruoja šio išradimo įgyvendinimo variantą, neapriboj ant, vienok, išradimo apimties.
[0026] Kiekviena XI faktoriaus partija yra paruošiama iš apytiksliai 1000 1 standartiniu būdu paruošto žmogaus plazmos krioprecipituoto supernatanto. Krioprecipi-tuotas supernatantas yra paruošiamas iš užšaldytos 60 C temperatūroje šviežios plazmos, ją atsargiai atšildant prie 4 C ir centri fuguojant, kad atsiskirtų krioprecipitatas ir supernatantas.
[0027] Krįoprecipituotas supernatantas yra praleidžiamas per " Kuno filtrų" elementus, baterijose išdėstytus po tris. Naudojami arba 0.5-1 j.i (50 S tipas), arba 1-2 |i (30 S tipas) filtrai.
[0028] Filtruojantys elementai, pašalinus filtratą, turintį daugumą krioprecipituoto supernatanto baltymų, buvo plaunami citratfosfatiniu buferiu, turinčiu 5 mM natrio citrato, 5 mM dinatrio fosfato, 5 mM kalio fosfato, 0. 065 M natrio chlorido ir 0. 5 mM dinatrio EDTA; citrinų rūgštimi nustatomas pH = 6.
[0029] Ant filtro sluoksnių buvo stebima, palyginti, selektyvinė XI faktoriaus adsorbcija.
[0030] XI faktorius nuo filtrų buvo desorbuoj amas, padidinus plaunančio buferio joninę jėgą iki 1 M NaCl koncentracijos. Kad apsaugoti XI faktorių nuo liekamųjų plazmos proteazių veikimo, i, ji, buvo taip pat pridedama 0. 2 v/ ml AT III; buferio EDTA taip pat dalyvauja šiame apsauginiame veikime.
[0031] Tokiu būdu surinktas XI faktoriaus tirpalas yra 30 kartų koncentruojamas ir dializuoj amas, norint pašalinti EDTA, naudojant Millipore™ ultrafiltracijos sistemą, sudarytą iš 10 kasečių su 10 K membranomis.
[0032] Dializės buferio sudėtis: 5 mM natrio citrato, 0. 14 M natrio chlorido, 5. 5 mM L- lizino ir 20 mM L- arginino; pH = 6.
[0033] Dializuotas tirpalas yra leidžiamas per DSLK2NLP ( PALLm) 0. 45 |. i filtrą, norint ji, nuskaidrinti ir pašalinti bet kokius bakterinius teršalus.
[0034] Tirpalas, turintis XI faktorių, yra apdorojamas 11rpikliu- detergentu, žinomu savo efektyvumu prieš virusus su lipidų apvalkalėliais ( Horrowitz et al., 1985, Transfusion 25, 516- 522) ; inkubacija vykdoma 8 vai. 25 C temperatūroje, esant 0, 3 % tri- n-butilfosfato ( TnBP) ir 1 % Tween1 o 80.
[0035] Naudojama chromatografinė kolonėlė su katijonų mainų derva, dažniausiai, su "sefarozės sulfato greitos srovės"™ geliu (tiekiama Pharmacia firmos, Uppsala, Sweden) .
[0036] Kolonėlė yra nulygsvarinama aukščiau aprašytu dializės buferiu.
[0037] Baltymų tirpalu užkrovus kolonėlę, ji, praplaunama praplovimo buferio 10-15 tūriais, kad pašalinti silpnai adsorbuotus baltymus ir virusus inaktyvuojančius agentus. Šis praplovimo buferis susideda iš 10 mM natrio citrato, 5 mM dinatrio fosfato, 5 mM kalio fosfato, 0.12 M natrio chlorido, 27 mM lizino ir 11.5 mM arginino; pH = 6.5.
[0038] Nulygsvarinančio, praplaunančio ir eliucijos buferių srovės linijinis greitis yra 50 cm/val.
[0039] XI faktorius iš kolonėlės yra eliuuojamas, padidinus buferio pH iki 7.5 ir NaCl koncentraciją iki 0.17 M.
[0040] Nuo XI faktoriaus eliucijos pradžios, i, ji, pridedama 2 v/ml AT III (t.y., apytiksliai 1.5-2.5 % nuo f XI kiekio) ir 5 v/ml heparino (t.y., 1.5-2.5 % nuo f XI kiekio), kad ji, stabilizuoti (abu produktai yra labai švarūs ir kokybe tinkami žmonių injekcijoms).
[0041] Taip paruoštas XI faktoriaus tirpalas yra sterilizuojamas filtruojant per DSLK1NFZP(PALL™) 0.22 M filtrą, fasuojamas (10 ml/flakonui) ir 1iofi 1inamas.
[0042] XI faktoriaus koncentrato biocheminiai ir biologiniai tyrimai
[0043] IX faktoriaus specifinis aktyvumas yra 130-150 v/mg baltymų (t.y., f XI + AT III). Prieš pridedant AT III, specifinis aktyvumas yra 210 v/mg.
[0044] XI faktorius, kuris prieš liofilinimą buvo nureguliuotas iki apytiksliai 100-120 v/ml, turėjo 90-110 v/ml koaguliavimo aktyvumą.
[0045] Sekančios 1 ir 2 Lentelės pateikia valyto produkto charakteristikas.
[0046] Kaip parodyta 1 Lentelėje, adsorbcija ant filtro sluoksnių įgalino atskirti XI faktorių nuo daugumos plazmos baltymų, gaunant 12 V XI faktoriaus / mg baltymo. Šis specifinis aktyvumas atitinka maždaug 800 kartų išvalymo laipsni,, lyginant su pradine plazma. Dalinai valyto XI faktoriaus chromatografavimas ant S-Sefarozės padidino specifini, aktyvumą iki > 200 v/mg, kas atitinka > 14000 kartų išvalymo laipsni,, lyginant su plazma. Plovimo stadija prieš XI faktoriaus eliuaciją, atliekama padidinus buferio pH, padeda padidinti išvalymą, pašalinant dali, užteršiančių j ų baltymų, daugiausia fibronektiną. Šiomis sąlygomis gelio imlumas XI faktoriaus atžvilgiu buvo apie 300 v/ml, o baltymų atžvilgiu - apie 36 mg/ml.
[0047] Šie rezultatai yra palyginami su terapiniais Winkelman ir kt . preparatais (Internat. Congr. ISBT-BBTS-London 1988, Abstract No. P. M. 4.15), kurių specifinis aktyvumas yra apie 5 v/mg baltymo ir turi ekvivalentines AT III dozes.
[0048] Mažas užteršiančių baltymų kiekis (išskyrus specialiai pridėtą AT III) yra patvirtintas imunonefelometriškai.
[0049] Elektroforezė SDS-poliakr i 1amido gelyje rodo vieną didelę juostą prie 160 KDa ir vieną mažą juostą prie 62 KDa, kuri atitinka AT III. Po baltymų redukcijos P~merkaptoetanoliu nedetek tuojama jokia juosta 50-30 KDa srityje, kas rodo, kad XI faktoriaus molekulės nebuvo aktyvuojamos valymo proceso eigoje (Bouma ir Griffin, 1986, Blood Coagulation, Ed. Hemker pp 103-128).
[0050] Liekamajam užterštumui, sąlygojamam koaguliacijos faktorių ir kinino sistemos komponentų, kruopščiai kontroliuoti buvo naudojami klasikiniai metodai.
[0051] Sukūrus liofilintą preparatą, buvo atlikti klasikiniai testai su gyvuliais, nustatant leistinas organizmui dozes:
[0052] Testas su triušiais rodo, kad preparatas nėra trombogeniškas, kadangi efektyvi dozė 50 (ED 50) yra didesnė negu 1000 v f XI/kg, tuo tarpu tas pats parametras yra 40-60 v/kg eilės PPSB koncentrato atveju, kuris dėl to yra žymiai daugiau trombogeniškas ir gali efektyviai iššaukti trombozes ir kraujagyslėse paskleisti koaguliaciją, kada žmonės injekuojami didelėmis dozėmis.
[0053] Koncentratas neiššaukia hipotenzijos reiškinio, kada žiurkėms intraveniškai i,vedama 50 V f XI/kg dozėmis. Šis gyvulių modelis yra labai jautrus plazmos komponentų su vazoaktyviomis savybėmis buvimui, kas i,rodo šių komponentų nebuvimą XI faktoriaus koncentrate, gautame pagal aprašytą būdą.
[0054] Jo didelių dozių (2500 v f XI/kg) intraveninis įvedimas pelėms neiššaukia jokio letališkumo ar nukrypimo elgesyje 7 dienų laikotarpyje.
1 . Žmogaus XI faktoriaus koncentratas terapiniam naudojimui, besiskiriantis tuo, kad turi mažiausiai 100 v/mg baltymo specifini, aktyvumą.
2. Būdas XI faktoriaus koncentratui, turinčiam mažiausiai 100 v/mg baltymo specifini, aktyvumą, gauti, besiskiriantis tuo, kad ji, sudaro:a) krioprecipituoto supernatanto kontaktavimas su filtru, galinčiu adsorbuoti XI faktorių, gaunant filtru adsorbuotą XI faktorių;b) minėto XI faktoriaus desorbcija nuo minėto filtro, gaunant XI faktoriaus desorbuotą tirpalą;c) minėto XI faktoriaus praleidimas per vienos stadijos katijonų mainų dervos chromatografinę kolonėlę, užkraunant minėtą kolonėlę XI faktoriumi; ird) minėto XI faktoriaus eliucija, gaunant minėtą XI faktoriaus koncentratą.
a) krioprecipituoto supernatanto kontaktavimas su filtru, galinčiu adsorbuoti XI faktorių, gaunant filtru adsorbuotą XI faktorių;b) minėto XI faktoriaus desorbcija nuo minėto filtro, gaunant XI faktoriaus desorbuotą tirpalą;c) minėto XI faktoriaus praleidimas per vienos stadijos katijonų mainų dervos chromatografinę kolonėlę, užkraunant minėtą kolonėlę XI faktoriumi; ird) minėto XI faktoriaus eliucija, gaunant minėtą XI faktoriaus koncentratą.3. Būdas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtą filtrą sudaro filtro serijos iš celiuliozės ir perlitų elementų, kurių porų dydis 0.5-2 ir kurie pagrindinai užkrauti neigiamai.
4. Būdas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad a) stadiją vykdo kontaktuojant minėtam krioprecipituotam supernatantui su minėto filtro elementais.
5. Būdas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad toliau po a) stadijos XI faktorių adsorbavusi, filtrą plauna buferiu, turinčiu natrio citratą, dinatrio fosfatą, kalio fosfatą, natrio chloridą, etilendiamintetraacto rūgšties dinatrio druską, sukoreguotu iki pH 5. 5- 6. 5.
6. Būdas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad b) stadijoje faktorių XI desorbuoja nuo filtro, didinant buferio, kurj, sudaro natrio citratas, dinatrio fosfatas, kalio fosfatas, natrio chloridas, etilendiamintetraacto rūgšties dinatrio druska ir antitrombinas III, joninę jėgą.
7. Būdas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad joninę jėgą padidina, didinant natrio chlorido koncentraciją iki 0. 5- 2 M.
8. Būdas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad papildomai prideda 0. 1- 0. 2 v/ ml antitrombino III i, desorbcijos buferi,.
9. Būdas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad toliau atlieka XI faktoriaus desorbuoto tirpalo dializę, XI faktoriaus desorbuoto tirpalo koncentravimą ir XI faktoriaus desorbuoto tirpalo antivirusini, apdorojimą.
10. Būdas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad c) stadijoje katijonų mainų derva yra sefarozės sulfatas.
11. Būdas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad po to chromatografinė kolonėlė nulygsvarinama buferiu, susidedančiu iš natrio citrato, natrio chlorido, lizino ir arginino iki pH 5. 5- 6. 5.
12. Būdas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad po c) stadijos užkrautą kolonėlę praplauna buferiu, susidedančiu iš natrio citrato, dinatrio fosfato, kalio fosfato, natrio chlorido, lizino ir arginino, sukoreguotu iki pH 6.1-6.9.
13. Būdas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad stadija apima XI faktoriaus eliuciją, padidinus buferio pH iki 7-8 ir padidinus natrio chlorido koncentraciją iki 0.15-0.20 M.
14. Būdas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad po d) stadijos eliuotą XI faktorių stabilizuoja, pridedant 0.5-3 v/ml antitrombino III ir 0.5-4 v/ml heparino 100-ui v XI faktoriaus ir XI faktoriaus koncentratą liofilina.