[LT] Išradimas apima žmogaus von Willebrand'o faktoriaus, išskirto iš krioprecipituotos plazmos frakcijos, valymo būdą.@Būdas susideda iš trijų chromatografinių atskyrimo stadijų derinimo. Gautas koncentratas turi labai aukštą specifinį aktyvumą ir didelį procentinį kiekį didelės molekulinės masės multimerų.@Koncentratas skirtas, ypatingai, terapiniam naudojimui.
[EN]
[0001] Išradimas liečia labai aukšto švarumo laipsnio standartizuoto žmogaus von Willebrand' o faktoriaus koncentrato, turinčio specifini, aktyvumą, dideli, kieki aukšto molekulinio svorio multimerų ir skirto terapiniam, naudojimui, pramonini, gavimo būdą.
[0002] Von Willebrand' o faktoriaus ( vWF) yra didžiausia žinoma molekulė, cirkuliuojanti plazmoje. Ji sudaro multimerų eilės, sujungtos disulfidiniais ryšiais; bazinė subvieneto molekulinė masė yra apytiksliai 260 kilodaltonų ( KDa). Mažiausia plazmoje egzistuojanti vWF forma yra apytiksliai 440- 500 KDa dimeras; didžiausios formos - dimerų multimerai, kurių molekulinė masė siekia 20 milij. onų daltonų. Sujungtų subvienetų lokalizavimosi vieta gali būti specifinės ląstelės, sintetinančios ir polimerinančios vWF megakariocituose ir endotelio ląsteJ^ se.
[0003] * i
[0004] šis faktorius atlieka pagrindinį vaidmenį hemostazėje, vykdydamas skirtingas funkcijas; jis transportuoja ir stabilizuoja VIII faktorių kraujo srovėje ir, kaip rišąs baltymas, jis užtikrina kraujo trombocitų išplitimą, pririšimą ir susikaupimą ant kraujagyslių subendotelijaus, taip prisidedant prie greito sužeistų kraujagyslių užgijimo.
[0005] įgimtas vWF nepakanKamumas arba šio faktoriaus struktūrinė anomalija sukelia von Willebrand' o ligą, kuri iš pradžių pasireiškia ypač odos ir gleivinės membranų kraujavimu, šios ligos klinikinės formos yra labai įvairios ir sukelia daug problemų chirurginės intervencijos atveju. Von Willebrand' o ligos gydymas reikalauja pirminės hemostazės ( kraujavimo laikas) ir
[0006] f kdaguliac. įjos ( aktyvuoto cef alino laikas ir VIII faktoriaus aktyvumas) anomalijų korekcijos.
[0007] /
[0008] Ši liga gydoma pakaitų terapija, fjaudojąnt žmogau^ plazmos darinius, praturtintus vWF ( pav., plazmos krioprecipituotą frakciją ar VIII fąktoriaug koncentratus, turinčius pakankamą vWF kieki,) . Vienok,
[0009] t
[0010] Šie produktai nėra standartizuoti von Willebrand' o ligos gydymui. Be to, nepakankamai valytos kraujo plazmos frakcijos, ypač krioprecipitatas, turi virusinio užkrėtimo galimybę, kadangi dažnai jos nėra efektyviai inaktyvuotos virusų atžvilgiu. Dar daugiau, jos turi užteršiančiųjų baltymų, kurie nereikalingi pacientams ir kurie p© daugkartinių injekcijų sąlygoja imunines reakcijas.
[0011] Priešingai, valytas VIII faktorius gali būti efektyviai apdorotas virusų atžvilgiu, vienok jo valymo procesas buvo optimizuotas hemofilijos A, o ne vWF nepakankamumo gydyimi. Iš tikrųjų, neseniai surasti ir vis labiau efektyvūs būdai, kaip imunoafininiai ir jonų mainų valymo . būdai, naudojami VIII faktoriaus gavimui, leidžia gąuti koncentratus, kuriuose pakanka vW f kiekio, kad efektyviai gydytų vor. Willebrand' o ligr. • •
[0012] Būtent tam, kad,, efektyviai gydyti von Willebrand' o ligą, pareiškėjas sukūrė naują pramonini, vWF valymo būdą, kuris ypač efektyvus, atskiriant įvairias plazmos molekules. Jo pagalba per vieną stadiją galima gauti VIII faktoriaus koncentratą ( pagal būdą, aprašytą Europos patento paraiškoje Nr. 0 359 593) ir išskirti vWF frakciją iš tos pačios krioprecipitato partijos, tai leidžia rentabiliai panaudoti žmogaus plazmą. Tokiu būdu gauta vWF frakcija yra valoma dviejų papildomų chromatografinių stadijų pagalba, tai leidžia gauti labai švarų vWF koncentratą. >
[0013] vWF molekulės kompleksiškumas sąlygoja labai sunkų jo valymą. Metodai, apimantys nedideles ąpitatis, pav., 5-2000 ai r ir naudojami analitiniams tikslams, jau buvo
[0014] aprašyti ( Thorell ir kt., Thromb. Res. 1984, 35: 431-450), bet jie negali būti pritaikomi pramoniniu būdu gaminant vWF. Be to, krioprecipitato maksimalaus rentabilumo idėja, gaunant vienu metu vWF ir FVIII, nebuvo svarstyta.
[0015] vWF buvo valomas, atsižvelgiant j, skirtingus sulfatuotų junginių tirpumus, esant glicinui ( Berntrop ir kt., Vox Sang. 1989, 56: 212), i, sulfotuotus junginius ( Winkelman ir kt., Vox Sang. 1989, 57: 97) bei naudojant įvairius chromącografinius atskyrimo metodus, kaip, pav., molekulinio sieto ( Perret ir kt., Haemostas 1984, 14: 2890 ir jonų mainų metodus ( Austen ir kt., Thromb. Haemostas, 1982, 48: 295). Tačiau šie metodai duoda arba nedideles vWF išeigas, arba turi žemą gelio imlumą, arba neužtikrina vienalaikio FVIII . ir vWF atskyrimo; kas daro juos mažiau tinkamais pramoniniam naudoj imui..
[0016] Be to, Berntorp ir kt. ( Vox Sang. 1989, 56: 212) gauna nedidelio švarumo laipsnio vWF: 45 V Ag/ mg baltymo ( p. 213), kai tuo tarpu pareiškėjas gauna 205 V Ag/ mg baltymo. Panašiai, Winkelman ir kt. ( Vox Sang. 1989, 57: 97). gauna 1- 0 V Ag/ ml baltymo ( p. 101) .
[0017] Perret ir kt. ( Haembstasis 1984, 14; 289) atlieka defibrinacijos stadiją, pašalinant fibrinogeną fibrino molekulių pavidale, naudojant kale j, tokiu pat būdu, kaip gyvatės nuodų fermentus. Tai daro gavimą akivaizdžiai netinkamu terapiniams tikslams. Be to, gelfiltracijos sistemos, kaip jos naudojamos, yra sunkai suderinamos su pramoniniais mastais, užtikrinančiais tik lOcm/ val. ar mažesnį tekėjimo greiti, ir turinčiais didelę užsikimšimo riziką, ypač esant fibrinogenui ir fibronektinui. Be to, išvalymo laipsnis dažniausiai yra žemas, kas priklauso nuo menko frakcionavimo šioje chromatografI inėje sistemoje. Austerv ir kt. ( Thromb. Haemostas. 1932, 48: 46) taip pat gavo žemo švarumo laipsnio koncentratą ( 8 V Ag/ mg baltymo) ir santykinai žemą išeigą, tikriausiai sąlygojamą griežtų chromatografijos sąlygų ( pH 5. 5).
[0018] Harrisson ir kt. ( Thromb. Res. 1988, 50:295) naudoja dekstrano sulfat- sefarozę kaip chromątografinę matricą; įi medžiaga turi nedideli užlaikymo talpumą vWF atžvilgiu ir taip pat gaunamas vWF preparatas turi žemą specifinį aktyvumą: 2- 4 V/ mg baltymo ( p. 301).
[0019] Pagaliau šie produktai turi pakankamai didelę dalį vWF denatūruotų ir inaktyvių formų, ką liudija ristocetino kofaktoriaus aktyvumo ( RCo)/ antigeno santykis, svyruo-jantis nuo 0. 008 iki 0. 8 ( Lawrie ir kt., Br. J. Haemotol. 1989, 73: 100). Tai sumažina jų efektyvumą, naudojant Willebjfand ligos terapijai. Priešingai, pareiškiamas būdas užtikrina vWF atstatymą su RCo/ antigeno santykiu, aukštesniu už vienetą, tai prilygsta normalios kraujo plazmos natyvinio vWF rodikliui.
[0020] Šis išradimas liečia vWF koncentrato, skirto terapijai, gavimo pramoninį būdą, gaunant jį kaip pašalinį produktą gerai išvalyto FVIII gavimo metu; kai galima gaminti standartizuotas partijas, charakterizuojamas dideliu kiekiu aukšto molekulinio svorio multimerais, iš labai didelių plazmos i kiekių ( 4000 ir daugiau ltr). Būdas leidžia optimaliai panaudoti krioprecipitatą.
[0021] Konkrečiai šis išradimas liečia vWF koncentrato gavimo būdą, kuris susideda iš trijų sekančių viena paskui kitą chromatogrfinių stadijų, leidžiančių vWF praturtinti aukšto molekulinio svorio multimerais, kurie sąlygoja jo biogeninį aktyvumą. Pradinė medžiaga yra žmogaus plazmos krioprecipituota frakcija, prieš tai apdorota įprastinėje valymo stadijoje, apimančioje absorbciją ant aliuminio oksido. Po to ši medžiaga prieš jos valymą inaktyvuojama virusų atžvilgiu, pa v., naudojant tirpiklį- detergentą.
[0022] Valymo būdas pagal ši išradimą susideda šių trijų sekančių viena paskui kitą chromatbgrafinių stadijų kombinacijos, naudojamos gaunant vWF kaip pašalini produktą FVIII- gavimo procese; pirmos dvi stadijos apima jonų mainų chromotografiją, o trečioji - afiriinę chromotografiją.
[0023] Atliekamos dvi jonų main \ chromatografijos, naudojant tą pačią vinil- polimerinę dervą, ant kurios fiksuotos dietilaminoetilo grupės ( DEAE), ypač ant DEAE-Fractogel* TSK 650 ( Merck) kolonėlių, nulygsvarinant buferiu, turinčiu 0. 01 M trinatrio citrato, 0. 11 M natrio chlorido, 0. 001 kalcio chlorido, 0. 12 M, glicino ir 0. 016 M lizino, p<H 7.
[0024] DEAE- Fractogel* TSK 650 yra sintetinis hidrofilinis gelis. Nešėjas yra oligoetilenglikolio, glicidinmetak-rilato ir pentaeritritoldimet- akrilato kopolimeras, prie kurio yra prijungtos dietilaminoetilo grupės, t. y. - 0- CH2- CH2N+ ( C2H5) 2HC1, kas sąlygoja silpnai šarmini, anijojitą. DEAE- FractogelR TSK 650 būna dviejų rūšių pagal dalelių dydžius ( kada brinkinama vandenyje) : tipo s ( 0. 025- 0. 050 mm) ir- tipo M ( 0. 045- 0. 090 mm). šiame išradime yra naudojami abu tipai.
[0025] Krioprecipituotos plazmos frakcija, prieš tai valyta ir inaktyvuota virusų atžvilgiu panaudojant įprastinius būdus, buvo panaudota pirmoje chromatografinėje kolonėlėje, kuri užlaiko didelę dalį vWF. Tada vWF buvo eliuojamas, didinant natrio chlorido koncentraciją bufėryje iki 0. 14- 0. 15 M.
[0026] Po to eliuota frakcija, praturtinta vWF, yra naudojama antroje chromatografinėje kolonėlėje, esant tokioms pat sąlygoms, kaip pirma. Kadangi frakcija, ulneSta ant .
[0027] antros kolonėlės, yra laisva nuo daugelio baltymų (ypač nuo FVIII, ir fibronektino), kurie konkuravo dėl absorbcinių centrų pirmos chromatografinės stadijos metu, tai antrojoje kolonėlėje absorbcinis imlumas vWF atžvilgiu yra žymiai didesnis. Po filtrato pašalinimo ir kolonėlės praplovimo nulygsvarinimo buferiu adsorbuotas vWF eliuojamas, padidinant buferio natrio chlorido koncentraciją iki 0.15-0.17 M. Dėl aukštos DEADE-Fractogel dervos adsorbcinio imlumo ir efektyvumo vWF atžvilgiu, vWF gali būti eliuojamas iš kolonėlės su aukštu aktyvumu {>150 p RCo/ml), taip galima išvengti ultrafiltracijos mechaninio slėgio, koncentruojant produktą.
[0028] Tokiu būdu eliuota frakcija yra. naudojama afininės chroirafcografijos stadijoje (ant geliQ su želatinos pagrin4u) imant tą patį fiulygsvarinimo buf&rį, kas leidžia išvengti dializės ar ultrafiltracijos stadijos, pEšalinant druskas; ši kolonėlė sulaįJco liekamojo fibronektino molekules, kurios dar teršia ,vWF. Gelio, asocijuoto su želatina, pasirinkimas nėra ribojamas: šiam tikslui tinkami yra -Gelatin-Sepharose/ Gelatin-UtrogelR, Gelatin-Spherode.xR bei .Gelatin-Fractogel*. Gelatin-Sepharose gali būti geriausias pasirinkimas,
[0029] i kadangi fiksuoja 5-10 mg fibronektino/ml gelio sąlygomis, taikomomis šiame išradime.
[0030] Šiose sąlygose labai gerai valytas vWF oesusiriša su geliu ir pereina i, filtratą; kadangi chromatografinė stadija, naudojant želatiną, nesąlygoja didelio vWF frakcijos praskiedimo, produktas gali būti tiesiogiai paskirstomas, nenaudojant' koncentravimo 3tadij0s, pav., ultrafiltracijos. Kadangi galutinis produktas neturi proteolitinių fermentų, jis labai stabilus filtruojant ir liofi.linant bei nereikalauja stabilizuojančių agentų.
[0031] vWF koncentratas, gautas šio išradimo būdu, turi išskirtinai aukštą valymo laipsni, - >10, 000 kartų, lyginant su pradine plazma; jo specifinis aktyvumas yra 345 V CBA/mg baltymo (kolageno surišimo aktyvumo vienetais) ir > 100 V RCo/mg baltymo, (ristocetino kofaktoriaus aktyvumo vienetais). kiekvienos chromatografinės stadijos įnašas, valant vWF, parodytas 1 fig.
[0032] Produkto kokybės gerėjimas sekančiu viena paskui kitą stadijų metu žymiai priklauso nuo aukšte molekulinio svorio multimerų kiekio (vWF molekulinės formos, turinčios aukštą biologini, aktyvumą), tai buvo stebima elektroforetinių tyrimų metu.
[0033] Įdomu, jog šie , tyrimai parodo didėjanti, praturtinimą multimerais > - 4 1'2 fig.), kurie atstovauja 79% vWF polimerų, tuo tarpu krioprecipitacija pusę iš jų pašalina. Netikėtai pasirodė, jog būtent chromatografija ant DEAE-Fractogel TSK 650 padeda selektyviai užlaikyti ~abai didelius multimerus ir pašalina su filtratu nedideliss formas, anomalios struktūros (patyrusias dalinę proteolizę) ir žemo aktyvumo formas.
[0034] Standartizuotas vWF koncentratas, pasižymintis aukštu išvalymo laipsniu, aukštu specifiniu aktyvumu ir dideliu kieku aukšto molekulinio svorio lįultimerų, gautas šio išradimo būdu, yra ypač gerai tinkamas \vairių von Hillebrand ligos formos terapijoje, tai" patvirtino preliminariniai klinikiniai tyrimai.
[0035] Preliminariniai klinikiniai tyrimai parodė, jog šis koncentratas efektyviai sutrumpina kraujavimo laiką, esant kraujoplūdžiui. >
[0036] Tyrimai in vitro patvirtino, jog biocheminės ir "fiziologinės savybės yra identiškos natyvių molekulių ,savybėms, ypatingai savo sugebėjimo surišti kraujo trombocitus perfuzijos aparate ir savo sugebėjimu surišti in vivo endogenini, VIII faktorių.
[0037] Dėl savo aukšto valymo laipsnio vWF, gautas šio
[0038] išradimo būdu, taip pat gali būti naudojamas įvairiems laboratoriniams tikslams ( smulki struktūrinė analizė,
[0039] funkcionalumo tyrimai, diagnozė ir t.t.) ir specifinių antikūnų gamyboje.
[0040] Koncentratas pagal ši, išradimą taip pat gali būti naudojamas kaip stabilizatorius, gaunant VIII faktorių ląstelių, transformuotų genuose inžinerijos metodų pagalba, ir stabilizuojant VIII faktorių valymo metu.
[0041] Sekantis pavyzdys iliustruoja vieną išradimo įgyvendi-nimo formą, neapribojant jo apimties.
[0042] Krioprecipitatas yra paruoštas iŠ šviežios plazmom, surinktos esant natrio citratui (4%) ar antikoagulian-tiniam tirpalui CPD (citratas, fosfatas, dekstrozė) ir užšaldytos ne vėliau kaip praėjus 6 valandoms po jos surinkimo. Plazma užšaldoma prie -60° C, po £ o laikoma prie -35° C. Plazmos partijas sudaro 1800-2000 1, kurios yra sujungiamos į 4000 1 partijas kiekvienam proceso taikymui. Atšildant, plazma apie 12 vai. patalpinama į kamerą sū reguliuojama temperatūrsa, kur užtikrinamas lėtas reguliarus atšildymas iki -7° C, tada atitirpinama termostatiškai reguliuojamame inde iki 0 -2° C, pastoviai maišant. Po to krioprecipitatas
[0043] (kuria sudaro apytikriai 9 g/l plazmos) yra surenkamas centrifuguoj ant žemoje temperatūroje.
[0044] Nucentrifugavus, surinktas krioprecipitatas yra resoliubilizuoj amas ir adsorbuojamas ant aliuminio hidroksido kai kurių teršalų pašalinimui, pav., protrombino komplekso komponentų (ypač VIII faktoriaus) ir XII faktoriaus pašalinimui. Sūpernatantas po to yra atvėsinamas iki 15° C . (tas dalinai pašalina fibrinogeną ir fibronektiną).
[0045] Šis apdorojimas leidžia gauti iš krioprecipitato 80-86% VIII faktoriaus/vWF mišinio; VIII faktoriaus specifinis aktyvumas yra 0.7 TV/mg, o vWF specifinis aktyvumas yra 0.6 RCo/mg (ristocetino kofaktoriaus aktyvumas) ir 1.2
[0046] V CBA/mg (kolageno surišimo aktyvumas).
[0047] . Tirpalas, turintis VIIIF/vWF mišini,, yra apdorojamas tirpikliu-detergentu, žinomu savo efektyvumu, . ardant virusus su lipidų apvalkalėliais (Horowitz ir kt., Transfusion, 1985, 25; 516); apdorojama inkubuojant 8 vai. esant 25° c ir 0.3% trin-n-butilfosfatui (TnBP) bei 1% Tween 80.
[0048] Po šio apdorojimo randama, kad išlieka 95% VIII faktoriaus ir vWF aktyvumo, išmatuoto ankstesnėje stadijoje. Elektroforezė gali patvirtinti, jog vWF vis dar yra multimerinėje formoje.
[0049] vWF valymas yra kilęs iš VIII faktoriaus valymo būdo, pareiškėjo aprašytoje paraiškoje Europos patentui Nr.EP
[0050] 0 359 593. . Pirmoji chromatografijos stadija atliekama DEAE-FractogelR TSK 650 (Type S arba M) (Merck) užkrautoje kolonėlėje. Nulygsvarinimo buferi, sudaro trxnatrio citratas (0.01 M), kalcio chloridas (0.001 M), glicinas (0.12 M), L-lizinas (0.016 M) - ir 0.11 M natrio chloridas. vWF, VIII faktorius ir fibronektinas yra užlaikomi kolonėlėje; užteršiantiej i baltymai (pagrin-diniai fibrinogenas ir šiek tiek IgG) silpnai surišami ar nesurišami kolonėlėje, o virusus sterilizuojantys agentai yra pašalinami, keletą kartų nuosekliai tuo pačiu buferio tirpalu.
[0051] Linijinis srovės greitis kolonėlėje yra 100 cm/val. Esant šioms sąlygoms, vWF užlaikymo imlumas kolonėlėje apytiksliai 75% nuo užnešto kiekio (matuojant kaip Ag, antigeną), o likutis pereina i, filtratą. Šis surišimo imlumas atitinka 45 V vWF Ag/mi gelio.
[0052] Nuo kolonėlės vWF desorbuojamas, padidinus NaCl kimcentracij . buferio tirpale iki 0.15 M. Surinkta vWF frakcija turi 30-35% pradinio vWF kiekio, tuo tarp . jo 40% pasilieka adsorbuotų kartu su VIII faktoriumi; jie gali būti kartu eliuoti, padidinus NaCl koncentraciją buferio tirpale iki 0.25 M, o po to kartu išvalyti.
[0053] Frakcija, turinti šios pirmos kolonėlės eliuotą vWF, yra užnešama ant antros identiškos kolonėlės, nežymiai praskiedus nulygsvarinimo buferiu, turint tikslą nustatyti vWF frakcijos joninę jėgą, Skvivąlentišką 0.11 M natrio chlorido joninei jėgai.
[0054] Kadangi teršalai ir VIII faktorius, kurie kartu su vWF varžosi dėl adsorbcijos centrų pirmoje kolonėlėje; yra beveik pašalinti pirmoje chromatografijos stadijoje, antroje kolonėlėje surišimo imlumas yra žymiai didesnis: 320 V vWF Ag/mg gelio.
[0055] vWF yra desorbuojamas, padidinus buferio tirpalo NaCl koncentraciją iki 0.17 M.
[0056] Ši antroji chromatografijos stadija leidžia sukoncen-truoti vWF 8-10 kartų, lyginant su piima stadija, tai atmeta būtinumą papildomai koncantru'oti, pa v., ultrafiltracijos pagalba. Naudojant standartinius metodus, eliuate randami sekantys vWF kiekiai bei aktyvumai:
[0057]
[0058] CBA vienetai (ko^ogeno surišimo aktyvumas) yra nustatomi EL1SA metodu, kaip aprašyta Brown ir Bosak (Throm. Res. 1 986, 43: 303). Standartinė plazma, kalibruota pagal 2-ą Britų Standartą (86/717), buvo naudojama kaip pagrindas išreiškiant reikšmes tarptautiniais vienetais.
[0059] San*|ffcis CBA'Ag, lygus 1.69, rodo, jod vWF aktyvumas yra gerai išsilaikęs. Tai suderinama su aukštu procentiniu kiekiux didelės molekulinės mases multimeru (79%) ir palyginama su natyvinio vWF iš plazmos tokiu pat rodikliu (70%).
[0060] šio vWF eliuato elektroforetiniai tyrimai rodo nežymų užteršimą fibronektinu ir i^ter-alfa tripsino inhibitoriumi, serin-proteazės inhibitoriumi.
[0061] Fibronektinui pašalinti antras vWF eliuatas yra patei-kiamas trečiai valymo stadijai, atliekamai kolonėlėje su želatin-sefaroze CL4B (Pharmacia), nulygsvarintoje tuo pačiu buferiu ankstesnėje kolonėlėje.
[0062] Afininės chromatografijos geli® užlaikymo imlumas fibronektino atžvilgiu yra > 5 mg/ml, tai leidžia šio teršalo kieki, sumažinti iki nedetektuojamų kiekių (< 4 mg/ltr) vWF frakcijoje.
[0063] Pagal ši, išradimą valytas vWF randasi šios paskutinės stadijos filtrate ir gali būti tuojau pat išskirstomas ir liofilinamas.
[0064] Galutinio produkto elektroforetiniai tyrimai neparodo jokių teršalų. vWF kiekis yra 205 V Ag/ml baltymo; jo specifinis aktyvumas yra 345 V CBA/mg baltymo ir 186-220 V RCo/mg' baltymo.
[0065] Bendras išvalymo laipsnis lyginant su pradine plazma yra > 10,000 kartų.
[0066] Elektroforetiniai tyrimai (SDS-agarozė ir juostų išskleidimas) rodo, jog šiuo būdu išvalytas vWF susideda iš 65-80% didelės molekulinės masės multimerų, t.y.,' kiekio, palyginamo su natyviniu vWF atitinkančiu šių multimerų kiekiu, lygiu 70%.
[0067] Koncentrato stabilumas buvo tiriamas skystame būvyje, ji, laikant 24 valandas kambario temperatūroje: neužfiksuotas nei proteolitinis aktyvumas, nei specifinio aktyvumo pakeitimas.
[0068] Trombogeninio aktyvumo nebuvimas koncentrate buvo patvirtintas, naudojant įprastinius testus, kaip, pav., neaktyvuoto dalinio tromboplastino laikas (NAPTT). Trombinas, PKA ir kalikreinas nerasti.
[0069] Todėl nebūtina pridėti stabilizuojančių agentų galutini, vWF produktą.
[0070] I
[0071] Valymo būdo, specialiai skirto vWF išskyrimui, kaip pašalinio produkto gaminant VIII faktorių, sukūrimas pirmą kartą įgalina gauti labai švarų ir labai efektyvų terapini, koncentratą, standartizuotą von Willebrand' o ligos gydymui.
[0072] Fig. l. SDS- PAGE vWF valymo frakcijos. 1 juosta: krioprecipitatas; 2 juosta: SD paveiktas krioprecipitatas; 3 juosta: nesurišta DEAE- fractogel frakcija; 4
[0073] juosta: 1- as vWF eliuatas; 5 juosta: 2- as vWF eliuatas;
[0074] S
[0075] 6 juosta: nesurišta želatinos frakcija; 7 juosta: standartai. Fbn. = fibronektinas; IgG + Imunoglobulinas; Alb = albuminas.
[0076] Fig. 2. Multimerų pasiskirstymas vWF valymo frakcijose. 1 juosta: normali, plazma; 2 juosta: krioprecipitatas; 3 juosta: SD paveiktas krioprecipitatas; 4 juosta: nesurišta DEAE- Fractogel frakcija; 5 juosta: 1- as vWF eliuatas; 6 juosta: 2- as vWF eliuatas; 7 juosta: nesurišta želatinos frakcija.
[0077] \
1. Būdas gauti standartizuotą, labai gerai išvalytą žmogaus von Willebrand' o faktoriaus koncentratą, praturtintą didelio molekulinio svorio multimerais,besiskiriantis tuo, kad koncentratą gamina iš krioprecipituotos plazmos frakcijos, taikant trijų, viena paskui kitą sekančių chromatografijos stadijų serijas, kurių pirmos dvi stadijos yra jonų mainų chromatografija, naudojant stambiai porėtas polimarines dervas su prijungtomis dietilamino etilo grupėmis, o trečioji stadija yra afininė chromatografija ant želatin- sefarozės.
2. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad pradinė medžiaga yra^ krięprecipituota plazmos frakcija, prieš tai išvalyta ant aliuminio hidroksido.
3. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad pirmoji ir antrcji i jonų mainų derva yra DEAE-FractogelR TSK 650, nulygsvarinta buferio tirpalu, turinčiu 0, 01 M trinatrio citrato, 0, 11 M natrio chlorido, 0, 001 M. kalcio chlorido, 0, 12 M glicino ir 0, 016 M L- lizino.. ,
4. Būdas pagal 1 punktą, be. siskiriantis tuo, kad prieš tai išvalytą krioprecipituotą plazmos frakciją užneša ant pirmos jonų mainų chromatografijos kolonėlės, ir pirmąją von Willebrard' o faktorių turinčią frakciją eliuoja, padidii. us buferio natrio chlorido koncentraciją iki 0. 14- 0. 15 M.
5. Būdas pagal . 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad po pirmos chromatografijos gautą von • Willebrand' o faktorių turinti, eliuatą užneša ant antros jonų mainų chromatografijos kolonėlės, ir von Willebrand' o faktorių eliuoja, padidinus buferio natrio chlorido koncentraciją iki . 0. 15- 0. 17 M.
6. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad po antros chromatografijos eliuatą užneša ant želatin- sefarozės chromatografijos kolonėlės, nulygs-varintos eliuacijos buferiu iš " ankstesnės chromato-grafinės stadijos, siekiant selektyviai adsorbuoti kolonėlėje liekamąja, fibronektiną.
7. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad esantį želatin- sefarozės kolonėlės filtrate von Willebrand' o faktorių surenka, išskirsto ir liofilina.
8. Labai gerai išvalytas ir aukšto specifinio, aktyvumo ( RCo ir CBa vienetais) bei daug didelio molekulinio svorio multimerų. turintis von Willebrand' o faktoriaus koncentratas, besiskiriantis tuo, kad jis gautas pagal vieną iš 1- 7 punktų.
9. Von Willebrand' o faktoriaus koncentratas pagal 8 punktą, besiskiriantis tuo, kad aktyvumo ( matuoto CBa vienetais) santykis su antigeno kiekiu yra mažiausiai 1. 5.
10. Von Willebrand' o faktoriaus koncentratas pagal 8 arba 9 punktą, besiskiriantis tuo, kad didelio molekulinio svorio multimerų kiekis yra mažiausiai 65- 80%.