[LT] Lovastatinas yra gaminamas fermentacijos būdu panaudojant grybelinį transformantą, kuris yra gaunamas pernešus DNR iš lovastatiną gaminančio Aspergilius terreus kamuieno į lovastatino negaminantį Asperilius oryzae kamieną.
[EN]
[0001] Išradimas liečia grybelinius kamienus, gautus fermentacijos būdu ir jų panaudojimą antibiotikų gamyboje; konkrečiai liečia " Aspergillus " kamienus ir jų panaudojimą gaminant vaistą lovastatiną ir jo analogus.
[0002] Lovastatinas yra / IS- [ Ia( R*), 3a, 7{ 3, 8{ 3 ( 2S*, 4S*), 8 a $ /- 2- metilbutaninės rūgšties 1, 2, 3, 7, 8, 8a- heksahidro-3, 7- dimetil- 8-( 2-( tetrahidro- 4- hidroksi- 6- okso- 2H-piran- 2- il)- etil] - I- naftalenilo esteris, o jo struktūra gali būti pavaizduota šia chemine formule:
[0003] Lovastatino tipo antibiotikai yra metabolitai, kurių
[0004] sintezei reikia kelių fermentų grupių. Jų gamyba antibiotikus gaminančių mikroorganizmų molekulinio klonavimo būdu reikalauja tiems fermentams atitinkamų
[0005] genų išskyrimo, analizės ir, galbūt, modifikacijos-d
[0006] kas davė klonus, turinčius arba atskirus grupės genus arba tik nepilnas genų grupes ( žr. Malpartida' and Hopvood, " Molecular Cloning of the Whole Biosynthetic
[0007] i_ n a Heterologous Host", Nature ( 1984, 309 pp 462- 464) .
[0008] Lovastatino gavimas fermentacijos būdu, naudojant Aspergillus terreus grybelinės rūšies kamienus, aprašomas kitame Kanados patente Nr. 1161380.
[0009] Tačiau abiejų procesų metu lovastatinas yra gaunamas kartu su dideliais kiekiais kitų, labai panašių cheminių junginių, iš kurių' lovastatiną reikia išskirti. Naudojant Monascus ruber , lovastatinas gaunamas kartu su monakolinu J. Naudojant Aspergillus
[0010] * terreus , jis gaunamas kartu su dihidrolovastatinu ir hidroks_ i- rūgštimi. Hidroksi- rūgštis gali būti lengvai laktonizuojama į lovastatiną, tačiau nuo jo reikia atskirti dihidrolovastatiną.
[0011] Šio išradimo tikslas yra pateikti genetiškai sukurtus jnutantinus grybelinius kamienus, kuriuos galima būtų panaudoti lovastatino gamyboje ' fermentacijos būdu, ir pateikti lovastatino gavimą fermentacijos būdu, pašalinant aukščiau minėtus trūkumus.
[0012] 0
[0013] Pagal vieną iš šio išradimo krypčių yra gaunami Aspergillus geno atitinkamų rūšių nauji mutantiniai grybeliniai kamienai, galinantys išreikšti ir išskirti lovastatiną.. Tie kamienai turi funkcionaliniame sąryšyje lovastatiną gaminančių fermentų'- grupės genus, išvestus iš lovastatiną gaminančio Aspergillus terreus kamienų DNR. Jie yra gaminami DNR protoplasto transformacijos procese iš lovastatiną duodančio Aspergillus terreus kamieno, taip pat turinčio atitinkamą atrinkimo žymę, su kita, lovastatino neduodančia Aspergillus rūšimi, parinkta iš A . oryza ^, A . fumigatus ,. A . niger , A . nidulans ir A . f lavus . Transformantų atranka vykdoma pagal atrinkimo% žymę;
[0014] lovastatiną duodantys transformantai yra identifikuojami ir išskiriami, o po to subklonuojami.
[0015] Pagal kitą išradimo krypti, yra pateikiamas lovastatino gavimo būdas. Jis apima maitinimo terpės fermentavimą su Aspergillus mikroorganizmo transformantu, turinčiu iš Aspergillus terreus išvestų genų, užkodavimą lovastatiną gaminančių fermentų grupei bei taip gaunamo lovastatino išskyrimą. Pagal, ši, išradimą yra gaunamas lovastatinas su žymiai mažesniais kiekiais teršalų iš dihidrolovastatino ir hidroksirūgšties darinių, negu naudojant Aspergillus terreus.
[0016] Šio išradimo transformantų gamybos procese galima naudoti įprastas metodikas gauti protoplastus iš atrinkto, lovastatino negaminančio, Aspergillus kamieno bei įprastas metodikas išgauti DNR iš lovastatiną gaminančio Aspergillus terreus kamieno. Šios metodikos yra gerai žinomos patyrusiems specialistams ir čia jų nereikia detaliai > aptarinėti. Protoplasto transformacijos metodika bei procedūros . taip pat yra žinomos ir standartinės.
[0017] Iš lovastatino negaminančių Aspergillus kamienų dažniausiai pasirenkamas Aspergillus oryzae kamienas, tačiau tai nėra būtina sąlyga tam, kad šio išradimo panaudojimas būtų sėkmingas. Galima naudoti ir kitas Aspergillus rūšis, būtent A . niger , A . nidulans , A ., fumigatus ir A . flavus . Pirmenybė A . oryzae rūšiai teikiama dėl jos inertiškumo, su ja lengva ir saugu dirbti laboratorijoje bei gaminant fermentacijos komerciniu mastu.
[0018] Kad po protoplasto transformacijos proceso būtų galima atskirti mikroorganizmų transformantus .. nuo netrans-formantų, rėkia, kad DNR iš A . terreus turėtų atrinkimo žymę. Patyręs darbuotojas turi dideli, atrinkimo žymių pasiri- nkimą ir konkretus parinkimas nėra lemiamas faktorius tam, kad išradimas veiktų sėkmingai. Galima naudoti atsparumo antibiotikams žymes, kaip antai, ampicilinui, ripamficinui, streptomicinui ir t.t. Gautą transformantų ir netransformantų mišinį, galima kultūrinti terpėje su atitinkamu antiobiotiku taip," kad išskyrimui išliktų tik tie transformantai, kurie turi atrinkimo žymę.
[0019] Patogumo dėlei atrinkimo žyme ypač dažnai pasirenkamas atsparumas cikloheksimidui. Cikloheksimidas slopina proteino sintezę, todėl yra lengva aptikti, ar kultūros 'sultinyje yra cikloheksimidui atsparus kamienas arba transformantas.
[0020] Po transformantų atranjcos pagal atrinkimo žymę tiriama, kurie transformantai gali išreikšti ir išskirti lovastatiną. Tik sąlyginai mažas skaičius iš visų transformantų, pagamintų protoplasto transformacijos būdu, turi šią savybę. Jie atpažįstami atskirai auginant standartinės kultūros sultinyje ir tiriant, pvz., chromatografijos (ASSC) pagalba, ar gautoje terpėje yra lovas*tatino. Tie, kurie davė teigiamą lovastatino buvimo rezultatą, yra subkultūrinami ir auginami, kad duotų lovastatiną gaminančių grybelinių mikroorganizmų Aspergillu3 geno ir, pageidautina, Aspergillus oryzae rūšies transformantų kolonijas.
[0021] Dėl iliustracijos, išradimas yra toliau aprašomas eksperimentų ataskaitose, pateikiamose žemia^. Fig. 1 grafiškai vaizduoja nesubrendusių grybe-linių ekstraktų, pagamintų pagal žemiau aprašytus Pavyzdžio 1 eksperimentus, čhromato-graf inę (ASS ,C) analizę; Fig. 2 - yra lovastatino mišinio, gauto ir \išgry-ninto iš hidrido kamieno, ^-BMR spektras; Fig. 3 - yra to- paties mišinio bendras spektras; Fig. 4 - vaizduoja naujo transformanto' AoAt/ NBJ- V morfologines charakteristikas;
[0022] GRYBELINĖ KULTŪRA - grybeliniai izoliatai Aspergilus terreus ir A . oryzae , naudojami šiame darbe, išskirti iš orchidėjų dirvožemio pavyzdžių, parinktų iš Agricultifre Canada, Research Station, Beaverlodge, Alberta, Canada.
[0023] Paauginus abu Aspergilli izoliatus Czapek doks terpėje, turinčioje cikloheksimido' { kone. 0, 1- 5 mM), 6 dienas 28±2°C temperatūroje, kiekvieno izoliato. A. terreus ir A. Oryzae sporos ( 10s) buvo pateiktos ant 10 mM cikloheksimido Czapek doks terpės. ( 50 ml) ir inkubuojamos 30 min., centrifuguojamos po 10, 000 g 10 min., o po to vėl buvo suspenduojamos steriliame distiliuotame vandenyje. Sporos buvo tris kartus plaunamos maišant ir vėl nusodinamos centrifugavimo būdu. Po to sporos buvo suspenduojamos steriliame 1% Triton X- 100 tirpale ir hemocitometru buvo nustatomi jų skaičiai mėginiuose. Atitinkamas skiedinys pateikiamas 10 mM cikloheksimido atrankos terpę ir po 10 dienų inkubacijos 28±2°C temperatūroje buvo išskirti atsparūs mutantai. Izoliatai buvo tiriami, ar jie gali gaminti lovastatiną. Cikloheksimidui atsparus lovastatinas, gaminantis A . terreus izoliatą, buvo atrenkamas tolimesniems transpormacijos tyrinėjimams..
[0024] Aspergillus oryzae ir cikloheksimidui atsparus, lovastatiną gaminančio A. terreus (čia žymimas JAG-4703) izoliatas buvo atskirai kultūrinami 50 ml Czapek doks sultinyje. Kultūros inkubuojamos 58 vai. 28±23C temperatūroje besisukančiame plaktuve (New Brunswick Scientific Inc.) prie 200 aps/min., po to surenkamos ir plaunamos steriliu distiliuotu vandeniu, pakartotinai 'centrifuguojant.
[0025] Abiejų rūšių kultūrų protoplastai buvo gauti naudojant Novozimą 234 (Novo-Nordisk, Novo Alle, DK 2880, Ęagsvaerd, Denmark), kad per 12-14 vai. ardymo būtų pašalintos ląsteių sienelės.- Dažniausiai buvo naudojamas metodas, aprašytas Dickinson and Isenberg, J.Gen. Microbiol. 128, p. 651-654(1982). Kiekvienos rūšies protoplastų mėginiai regeneravo gyvybingas vienaląsteiines sporas su siene]ėmis 28°C temperatūroje po 24 vai. regeneracinėje terpėje (R), turinčioje 0,1 -g agaro (Difco) 5 g sorbozės ir 0,35 g EDTA 50 ml distiliuoto vandens kiekyje. Sudygusios sporos turėjo visas savo motininių kultūrų charakteristikas.
[0026] Visas DNR buvo išskirtas iš ■ A spergillus terreus protoplastų pagal metodiką aprašytą Schlief and Viensink, " Practical Methods in Molecular Biology" , 33, 21-29 (1981). Protoplastai suspenduojami tirpale iš 10 mg/ml SDS, 0,1 M NaCl ir 0,1 M tri-HCl, pH 9,0. Buvo pridedamas toks pat kiekis fenolio, prisotinto tris-HCl buferiu. Mišinys centrifuguoja/mas 10 min. po 12,000,g Eppendorf Centrifuge vamzdyje (Brinkman Instruments, Canada Ltd., Rexdale, Ontario). Viršutinė fazė, gurinti DNR, buvo pašalinta, sumaišyta su 95% etanolu, laikoma
[0027] -20°C temperatūroje 60 min., po to 10 min. centrifuguojama kaip ir anksčiau. Gumulas buvo vėl suspenduojamas buferyje, pH 7,0 ir inkubuojamas su
[0028] RNaze (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.), apdorota fenollu, o DNR nusodinama iš vandeningo sluoksnio. Išskirta DNR gryninama adsorbuojant ir plaunant ant DEAE-celiuliozės (DE-52, Whatman), prieš tai išmirkius 10 mM tris-HCl buferyje, pH 7,5 ir 0,3 M NaCl, ir laikoma pastėro pipetėje. DNR skiedžiama su 10 m tris-HCl buferiui, pH 7,5, turinčiu 1,5 M NaCl. Tas tirpalas' atskiestas iki 0,2 M NaCl ir DNR nusodinama dviem etanolo kiekiais. DNR grynumas nustatomas iš 200-300 nip spektrų, apskaičiuojant A2€0/A280 absorbcijos proporciją. Tiktai DNR su proporcijomis tarp 1,50 ir 2,00 buvo panaudojamos transformacijose. Šeši pavyzdžiai, kiek-vienas turintis 0,1 mg išskirtos DNR, inkubnojami regeneracinėje terpėje, siekiant įsitikinti, ar nėra gyvybingų protoplastų - nė vienas iš jų nedavė jokios kolonijos.
[0029] Apytikriai 5.2 x 104 A. oryzae protoplastų pagal hemoci-tometrinius paskaičiavimus inkubuojami su 10-100 ng A. terreus DNR 5 ml regeneracinėje terpėje, terpės sudėtis ir regeneracijos procesas aprašyti aukščiau. Siekiant ištirti DNR galimą po-veiki, cheminei lovastatino išraiškai, 10-100 ng veršio krūtinės liaukų DNR (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., U.S.A.)# DNR (Bethesda Research Laboratories, Gaitherberg, MD, U.S.A.) ir homologiška A. oryzae DNR inkubuojami.su panašiais kiekiais A. oryzae protoplastų. Kai DNR buvo įjungta i, inkubacjas,- p.rotoplasto regeneracija sulėtėjo iki mažiau nei 10% ir panašūs kiekiai taip apdorotų protoplastų (105,) neparodė jokio atsparumo cikloheksimidui.
[0030] Sporų, išaugintų inkubuojant A. oryzae protoplastus kartu su A. terreus DNR, suspensija įterpta po 1 ml i, lėkštelę i, Czapek doks agaro terpę, turinčią 10 mM cikloheksimido. Po 48 vai. inkubacijos 28±2?C
[0031] i
[0032] temperatūroje kultūros išaugo iki 6-8 mm diametro. Kiekviena kultūra išaugo' atskirai iš vienos sporos šiomis sąlygomis. Kiekviena kultūra, išaugusi cikloheksimido terpėje, atskirai Įterpta i, Czapek doks terpės -sultini (50 ml i, 500 ml Erlenmeyer kolbą), .inkubuojama besisukančiame maišytuve (200 aps./min.) 28±2°C temperatūroje 3^. dienų. Kiekviena auginimo terpė 'hiriama lovastatino gamybai pagal žemiau aprašytą procedūrą ir chromatografinę (ASSC) analizę.
[0033] Fermentuotas sultinys (50 ml) parūgštintas 17 N HC1' iki pH 4,0, o po to frukcionuotas etilacetatu (100 "ml.f 3 x). Sujungtos etilacetato frakcijos džiovinamos vakuume 30°C temperatūroje, nuosėdos ištirpintos acetonitrile (5 ml) ir po to pateiktos chromatografinei (ASSC) analizei.
[0034] CHROMATOGRAFINĖ ( ASSC) ANALIZĖ
[0035] Chromatografijos (ASSC) įrangą (Beckman Model 420) , susidedančią įš Atex pompos (Model 110 A) ir injekcijos ventilio, parūpino Beckman Instruments, Toron.to, Canada. LC-UV detektorius 237 nm bangai. Naudojamas hipersilo C-18 ODS kvarco kolonėlė (25 x 0,46 cm) bei tirpinimo sistema iš acetonitrilo ir vandens (55,.: 45), tėkmės greitis 1,0 ml/min. Pagaminto lovastatino kiekis lyginamas ir apskaičiuojamas pagal sukurtą standartinę lovastatino kreivę.
[0036] 79 cikloheksimidui atsparūs izoliatai, įskaitant 4 lovastatiną gaminančius izoliatus, gauti iš 5,2x 105 A. oryzae protoplastų, inkubuotų su DNR iš cikloheksimidui atsparaus, lovastatiną gaminančio A. terreus mutanto. Transformacijos ' eksperimentai vykdomi šešis" kartus.
[0037] Rezutatai pateikiami lentelėje 1.
[0038] Viena iš transformuotų kultūrų, AO-11, išlaikė savo transformuotas charakteristikas šešis mėnesius. Fig. 1 iliustruoja ASSC analizę ekstraktų, gautų iš A . oryzae recipiento ir donoro kultūrų ir ekstraktų apdirbtų su A . terreus DNR. Kaip transformuoti izoliatai gamina lovastatiną yra parodyta lentelėje 2.
[0039] Izoliatas Nr. AO- I subkultūrinamas penkis kartus ir davė transformantą AoAt - NBJ/ 5, kuris 1992 II 25 buvo patalpintas i, American Type Culture Co- llection kaip gyvybnga, nekintama kultūra, nuorodos numeris ATCC 74135.
[0040] Lovastatinas yra gaunamas kartu su hidroksi- rūgšties analogu, kuri, lengva paversti i, lovastatiną, pvz., perplaunant toluole, kad būtų baigta laktonizacija ir tokiu būdu padidintas lovastatino kiekis. Šiuose eksperimentuose laktonizacija nebuvo vykdoma.
[0041] Lovastatino, pagaminto motininės kultūros A . terreus Czapek doks sultinyje, kiekis sudaro 166, 72±5, 92 mg/ l, o motininė A . oryzae kultūra lovastatino nepagamino. Fig. 2 vaizduoja ASSC būdu iš hibrido kamieno išgryninto lovastatino mišinio ^- BMR spektrą. Lyginant su žinomu, standartiniu lovastatino • speKtru, šis spektras patvirtina produkto tapatybę. Fig. 3 yra to paties produkto bendras spektras ir rodo, kad gautas lovastatinas yra 99% grynumo.
[0042] DNR koncentracijos nuo 5 iki 20 ng i, terpės ml nepaveikė nei A . oryzag protoplastų regeneracinio pajėgumo, nei cikloheksimidui atsparių ir lovastatiną gaminančių izoliatų išgavimo iš inkubacijų su A . terreus DNR. Gauti duomenys rodo, kad tos koncentracijos nebuvo lovastatino gamybą ribojantis faktorius. Panašiai, DNR iš veršio krūtinės liaukų, DNR bei homologiška A . oryzae DNR prire" koncentracijų nuo 5 ng iki 5 ng i, terpės ml nepaveikė A. oryzae protoplastų regeneracijos, lyginant
[0043] i
[0044] su neapdorotais kontroliniais pavyzdžiais. Tačiau DNR prie 10 ir 100 ng i, terpės ml sulėtino regeneraciją iki atitinkamai maksimalių dydžių 2* 5 % ir 1 %. Toks DNR apdorojimas nedavė lovastatino išraiškos.
[0045] i Regeneracinė terpė davė protoplastų kiekius, palygi-namus su tais, kuriuos gavo Acha et al J. Gen. Microbiol., 45, 515^- 523 ( 1966), naudojant sudėtingesnę mineralo terpę. Konidai ir šviežiai sudaiginti konidai davė geresnius gyvybingų protoplastų ir DNR derlius negu micelijos. Pagal šią sistemą, protoplasto regeneracijos metu nebuvo pastebėta ląstelinių agregatų formavimosi, aprašyto Acha et' ?1. ( 1966). Aiškus faktorių, atsakingų už atsparumą ckloheksimidui ir lovastatino išraišką, perėjimas iš A . terreus į A . oryzae rodo tarprūšinę DNR transformaciją. Kartu vykstanti atsparumo ciJcloheksimidui ir lovastatino gamybos transformacija buvo netikėtai patenkinama ir teikė vilčių, jog genai, susiję su šių charakteristikų išraiška, yra fiziškai artimi ir gali jungtis i, grupes.
[0046] Naujo transformanto, AoAt- NBJ/ 5, morfologija yra pavaizduota Fig. 4 ir gali būti apibūdinta tokiu būdu:
[0047] Konidinės galvutės strypo formos, šviesiai rudos'. Konidioforai lygūs, bespalviai. Pūslelės pusrutulio formos, iki pusės ar dviejų trečdalių padengtos fialidų, išsidėsčiusių dviem sluoksniais. Konidai rutulio pavidalo arba elipsiniai, jų kolonijos ant Czapek agaro auga lygiai ir labai greitai, spalva flokozinė arba švelniai einamo rusvumo dėl' konidų gamybos. Eksudatas oranžinis, atvirkščioj i pusė g«ltona iki rudumo.
[0048] Šie eksperimentai rodo, kad, iš principo, genetiškai apibrėžtos, vienos grybelinės rūšies antibiotikus gaminančios charakteristikos gali. būti išreikštos kitoje rūšyje.
[0049] Grybelinė kultūra: lovastatino gamybai buvo naudojama transformuota Aspergillus oryzae (ATCC Nr. 74135) AoAt/NBJ-V kultūra.
[0050] Sėklų ruošimas: grybelinė kultūra (liofilizuotas buteliukas) aseptiškai perkelta ant bulvių dekstrozės agaro nuožulnumos ir jai leista augti 4-5 diena? 25°C temperatūroje. Inkubacijos pabaigoje paruošta konidinė suspensija, pridedant '10 ml tritono X-100 (0,01 %) tirpalo, smarkiai plakant, konidinė suspensija perkelta ant sterilių ryžių (50 g), laikomų Erlerimeyer kolboje (250 ml talpos) . Į kolbą papildomai i,pilta 10 ml sterilaus vandens, smarkiai plakama ir inkubuojama 5-7 dienas 28°C temperatūroje. Inkubacijos periodo pabaigoje i,pilta sterilaus vandens (50 ml) .
[0051] Konidinė suspensija filtruojama per sterilų muslino audeklą ir filtratas ( lxlOft konidų/ ml) perpiltas i, s^ klų fermentuotuvą ( 50 1 talpos), turinti, 30 1 sėklų terpės. Naudotos sėklų terpės sudėtis buvo tokia:
[0052] pH 6, 8— isu 10% - NaOH) . Terpė sterilizuojama 121°C temperatūroje 30 min. ( 103 kPa). Sėkloms leista augti 17- 20 valandų 28°C temperatūroje ( vėdinimo greitis 0. 3-0. 5 vv/ min.) su 80- 100 % suskaidytu deguonimi ( 200 aps./ min.).
[0053] Sėklos ( 30 1) buvo perpiltos i, fermentavimo indą
[0054] ( darbinis tūris l.C' OO 1) su gaminimo terpe. ' Terpės sudėtis buvo tokia:
[0055]
[0056] pH 6, 8 ( prieš sterilizavimą, sukoreguota $ u 105 NaOH/ H2S04), sterilizuoja 121°C temperatūroje vieną valandą prie 103- 138 kPa.
[0057] Po inokuliacijos kultūra auginama 7- 8 dienas ž. 8°C temperatūroje su pH kontrole prie 6, 0- 6, 2 ( su 10 % H2S04) .
[0058] Vėdinimo greitis buvo palaikomas tarp 0, 7- 1, 0 vv/ min.
[0059] Septynių dienų senumo fermentuotas sultinys (. 50 1) steriliai perpiltas d, sėklų fermentuotuvą ( darbinis tūris 2, 000 1), turinti, 1, 500 1 sėklų terpės ( sudėtis aprašyta- aukščiau). Sėkloms leista augti 24 valandas 28°C temperatūroje ( 200 aps./ min., suskaidytas deguonis 80- 100 %) . Sultinys ( 200 1) buvo steriliai perkeltas i, gamybos fermentuotuvą ( 30, 000 1 talpos su darbiniu tūriu 20, 000 1) turinti, į 18, 000 1 gamybinės terpės. Kultūrai buvo leista toliau augtj. 7- 9 dienas 28°C temperatūroje su pH kontrole prie 6, 0- 6, 2. Po 60 valandų fermentacijos pH nebebuvo kontroliuojamas. I fermentuojamą sultini, buvo ' pridėta maitinimo terpės ( greitis 10 1/ val.) penkioms dienoms. Maitinimo terpės sudėtis buvo tokia:
[0060] pH 6, 8 ( prieš sterilizavimą) - sterilizuojama 121°C temperatūroje 30- 45 min. Fermentavimo pabaigoje sultinys rūgštinamas iki pH 4, 0 su- ION- HC1 ir centrifuguojamas. Grybelinis. briketas džiovinamas 55°C temperatūroje ir ekstrahuojamas.
[0061] Išdžiovintas grybelinis briketas (20 kg) homogeni-zuojamas šaltu etilo acetatu (10-15 min.), o homogenizuota medžiaga virinama su grįžtamu šaldytuvu 80°C-85°C temperatūroje 4-6 valandas, atvėsinta medžiaga filtruojama. Filtratas džiovinamas vakuume iki juodos dervingos medžiagos (2,5-3-kg). Juoda dervinga medžiaga sumaišyta su silikageliu (2,5 kg) įr CHjClj (5 litrai).
[0062] * CH2C12 išgarintas vakuume, o dervingas medžiagos mišinys su silikageliu išpiltas i stikline silikagelio kolonėlę
[0063] (100 cm ilgio x 22,5 cm diam.), apdorotą su EtOAc : heksanu (1:2). Buvo surinkti pavyzdžiai (2,000 jl, 12x). Po,24 valandų eliuojančio tirpiklio mišinys buvo pakeistas į EtOAę : heksaną (1:1) ir leidžiamas dar 24
[0064] .valandas. Pavyzdžiai, turintys produkto, surinkti, išdžiovinti (280 g) ir kristalizuojami iš metanolio
[0065] Geltonas išdžiovintas produktas (280 g) ištirpinamas 2,8 litro metanolio ir virinamas 40-60 min. 60-65°C temperatūroje. Karštas metanolio mišinys filtruojamas, o filtratas inkubuojamas 4-6 vai. 4°C temperatūroje. Baltos kristalinės adatėlės atskiriamos" nuo motininio tirpalo ir perplaunamos šaltu metanoliu. Kristalai išdžiovinami vakuume, pasveriami (190 g) ir laikomi eksihatoriuje 4°C temperatūroje.
[0066] Šiame išradime aprašytas būdas įgalina pasiekti pakankamai dideles lovastatino išeigas, sukeliančias naujojo Aspergillus oryzae transformanto ląstelių sienelių įrimą, ir tokiu būdu galima išvengti ląstelių lizavirao stadijos, išskiriant lovastatiną. Tai žymiai supaprastina galimo ir gryninimo būdą. Kaip aprašyta anksčiau, lovastatiną pagal šį būdą ' galima gauti ekstrahuojant tirpiliu be būtinybės sufoimucti
[0067] esterius, druskas ir 1. 1, gavimo metu. Ekstrahavimas tirpikliu yra žymiai paprastesnis ir ekonomiškesnis gavimo ir gryninimo būdas negu chromatografja.
1. Lovastatino gavimo būdas, kuri, sudaro maitinimo terpė3 fermentavimas su transformuotu Aspergillus kamieno grybeliniu mikroorganizmu, /.atrinktu iš rūšių A. oryzae, A. niger, A. nidulans, A. fumigatus ir A. f lavųs- grupės, besiskiriantis tuo, kad ši kamieną transformuoja taip-, kad jis turėtų svetimos DNR užkodavimą fermentų grupei, galinčiai sintetinti lovastatiną, su atrinkimo žyme, bei lovastatino išskyrimu iš maitinimo terpės.
- grupės, besiskiriantis tuo, kad ši kamieną transformuoja taip-, kad jis turėtų svetimos DNR užkodavimą fermentų grupei, galinčiai sintetinti lovastatiną, su atrinkimo žyme, bei lovastatino išskyrimu iš maitinimo terpės.2. Būdas pagal 1 punk.tą, besiskiriantis tuo, kad transformuotas mikroorganizmas turi svetimą DNR, išvestą iš lovastatiną gaminančios Aspergillus• terreus rūšies.
• terreus rūšies.3. Būdas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas Aspergillus kamienas yra rūšies A.ory d zae kamienas.
4. Būdas pagal bet kuri, ankstesnį punktą,- besiskiriantis tuo, kad svetima DNR, įvesta i, transformantą, turi cikloheksimidui atsparių genų, kaip atrinkimo žymę.
5. Būdas pagal bet kurį ankstesni, punktą, besiskiriantis tuo, kad transformantas yra AoAt - NBJ/5 taip, kaip či§ aprašyta ir apibrėžta.
6. Būdas pagal bet kurį ankstesnį punktą, b e s i s k,i-r i a n t i s tuo, kad apima papildomą hidroksi-rūgšties analogo laktonizaci jos stadijąf so tas hidroksi-rūgšties analogas fermentacijos procese pavirsta į lovastatiną.
7. Būdas pagal bet kuri, ankstesni, punktą, besiskiriantis tuo, kad lovastatiną išskiria ekstrahuojant tirpikliu.
8. Grybeliniai transformantai, galintys sudaryti fermentų, pajėgiančių sintetinti lovastatiną, grupę, yra Aspergillus rūšies kamienai,' atrinkti iš Aioryzae,A. niger, A. nidulans, A. fumigatus ir A. flavus, besiskiriantys tuo, kad turi svetimą DNR .su genų užkodavimu fermentų grupei, sugebančiai sintetinti lovastatiną.
A. niger, A. nidulans, A. fumigatus ir A. flavus, besiskiriantys tuo, kad turi svetimą DNR .su genų užkodavimu fermentų grupei, sugebančiai sintetinti lovastatiną.9. Grybeliniai transformantai pagal 8 punktą, besiskiriantys tuo, kad Aspergillus rūšis atrenkama iš A. oryzae, A. niger, A. nidulans ir A. fumigalis.
10. Grybeliniai transformantai pagal 9 punktą, besiskiriantys tuo; kad Aspergillus rūšis yra A. oryzae.
11. Grybeliniai transformantai 'pagal 8 punktą, besiskiriantys tuo, kad svetima DNR yra gaunama iš Aspergillus terreus • rūšies lovastatiną išreiškiančio kamieno.
12. Grybeliniai transformantai pagal 10 ir. 11 punktus, besiskiriantys tuo, kad apima visą DNR iš minėto A. terreus kamieno i, minėtą A. oryzae kamieno protoplasto transformacijos produktą.
13. Grybeliniai transformantai, pagal 8-12 punktus, besiskiriantys tuo, kad yra AoAt - NBJ/5, kaip aprašyta ir apibrėžta.