[LT] Atrasta, kad rekombinatinio ŽIV-1 gp 160 apvalkalo baltymas ("rgp 160"), ypač adsorbuotas ant tokio adjuvanto, kaip alumas (pvz. aliuminio fosfatas), yra labai tinkamas vakcinai prieš AIDS. Vienas šio išradimo aspektų yra AcNPV ekspresijos vektorius, turintis ŽIV-1 apvalkalo geno koduojančios sekos dalį, kuri apima 1-757 amino rūgštis, randamas rekombinatiniame klone Nr.3046. Kitas šio išradimo aspektas yra šio rekombinatinio ŽIV-1 apvalkalo baltymo (ir baltymo kaip tokio) gamyba vabzdžių lastelėse - ypač baltymo rgp 160, atitinkančio 1-757 (t.y.03046) aminorūgščių seką.@Kiti šio išradimo aspektai apima gryninimą ir rekobinantinio apvalkalo baltymo dalelių formavimą iš rekombinatinio bakuloviruso, gaminančio 3046 baltymą, geno produkto bei 3046 baltymo dalelių adsorbciją ant aliuminio fosfato agregatų.@Išradimas taip pat apima profilaktines ir/ar gydomąsias vakcinas prieš AIDS ir ŽIV infekcijas.
[EN]
[0001] Ši paraiška yra paraiškos JAV patentui, serija Nr. 151,976, užpildytos 1988 m. vasario 3 d., tęsinys. Paraiška Nr. 151,976 yra paraiškos JAV patentui, serija Nr. 920,197, užpildytos 1986 m. spalio 3 d. (dabar serijos Nr. 585,266), tęsinys. Šios paraiškos ir cituojami darbai yra itraukti i šį patentą nors jie tik cituojami. 1 tipo žmogaus imunodeficito virusas (ŽIV-1) yra retrovirusas, sukeliantis patalogiją imuninėje sistemoje. Žmogaus imunodeficito virusas yra įgyto žmogaus imunodeficito sindromo (AIDS) sukėlėjas. Barre-Sinoussi, et al., Science, 220: 868-871 (1983); Popovic et al., Science, 224: 497-500 (1984); Klinikiniai ŽIV-1 izolatai be to buvo priskiriami asocijuotam su limfadenopatij a virusui (Feorino, et al., Science, 225: 69-72 (1984) ir AIDS giminingam virusui (Levy et al., Science 225: 840-842 (1984)).
[0002] AIDS įgavo pandeminį pobūdį, todėl vakcinos prieš AIDS sukūrimas tapo viena iš pagrindinių sveikatos apsaugos užduočių. Didelis procentas žmonių, užsikrėtusių ŽIV-1, sparčiai praranda imuninę funkciją dėl T4 limfocitų sumažėjimo. Šios T4 ląstelės, taip pat kaip ir tam tikros nervinės ląstelės, savo paviršiuje turi molekulę, vadinamą CD4. ŽIV-1 atpažįsta CD4 molekulę dėka receptoriaus, esančio ant virusinių dalelių apvalkalo, patenka į ląstelę, replikuojasi ir galiausiai ją nužudo. Manoma, kad efektyvi vakcina prieš AIDS turėtų sukelti antikūnų prisirišimą prie ŽIV-1 viruso apvalkalo, tuo būdu apsaugodama T4 limfocitus bei kitas jautrias ląsteles nuo ŽIV-1.
[0003] Paprastai vakcinomis, kaip imunoprofilaktikai skirtomis priemonėmis, skiepijami sveiki asmenys, dar nesirgę nurodyta liga. Tačiau visiškai priimtina efektyvią vakciną prieš AIDS vartoti po užsikrėtimo, kaip imunoterapinę priemonę. Salk, J., Nature, 327; 473-476 (1987).
[0004] Šiuo metu plačiai paplitusi nuomonė, kad tinkamiausias kandidatas vakcinos prieš AIDS sukūrimui yra ŽIV-1 apvalkalas (" env"). Francis and Petricciani. New Eng. J. Med., 1586-1559 (1985); Vogt and Hirsh, Rewiews of Infectious Disease, 8: 991-1000 (1986); Fauci, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 9278-9283. Iš pradžių ŽIV-1 apvalkalo baltymas yra susintetinamas kaip 160000 molekulinio svorio glikoproteinas (gpl60). Tada gpl60 pirmtakas suskaidomas į 120000 molekulinio svorio išorinį glikoproteiną (gpl20) ir 41000 molekulinio svorio transmembraninį glikoproteiną (gp41). Šitie apvalkalo baltymai yra svarbiausi antikūnų taikiniai-antigenai ligonių, sergančių AIDS, organizme. Barin, et al., Science, 228; 1094-1096 (1985). Buvo parodyta, kad natyvus ŽIV-1 gpl20 yra imunogeniškas ir sugeba indukuoti neutralizuojančius antikūnus graužikuose, ožkose, rėzus beždžionėse ir šimpanzėse. Robey, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7023-7027 (1986).
[0005] Dėl labai žemo natyvaus ŽIV-1 apvalkalo baltymo lygio užkrėstose ląstelėse ir pavojaus, susijusio su AIDS vakcinos paruošimu iš ŽIV-1 užkrėstų ląstelių, ŽIV-1 apvalkalo antigenų, skirtų vakcinos prieš AIDS gamybai, buvo pradėta naudoti rekombinantinės DNR metodus. Pasirodo, kad rekombinantinės DNR technika suteikia geriausias galimybes vakcinos prieš AIDS viruso subvienetų gamybai, nes įgalina saugiai ir pigiai gaminti imunogenus dideliais kiekiais. ŽIV-1 apvalkalo baltymo genas buvo ekspresuotas genetiškai pakeistuose rekombinantiniuose vakcinijos virusuose. Chakrabarti, et al., Nature, 320: 535-537 (1986); Hu, et al., Nature, 320: 537-540 (1986); Kieny, et al., Biotechnology, 4: 790-795 (1986). Be to, apvalkalo baltymo genai buvo ekspresuojami bakterijų ląstelėse
[0006] ( Putney, et al., Science , 234: 1392- 1395 ( 1986)), žinduolių ląstelėse ( Lasky, et al., Science , 23: 209- 12 ( 1986)) bei vabzdžių ląstelėse. Sintetiniai peptidai, atitinkantys ŽIV- 1 gp41 amino rūgščių seką, irgi buvo laikomi tinkamais vakcinų prieš AIDS gamybai. Kennedy, et al. ( 1986). Deja, naudojant tokius metodus bei medžiagas nepavyko sukurti efektyvios vakcinos prieš AIDS.
[0007] Vienas iš išradimo aspektų yra bakuloviruso - vabzdžių ląstelės vektorinės sistemos naudojimas rekombinantinio ŽIV- 1 apvalkalo baltymo gamybai, aprašytas kartu paduotoje ir pasirašytoje paraiškoje JAV patentui gauti, serijos Nr. 920, 197, užpildytoje 1986 m. spalio 16 d., ( dabar serijos Nr. 585, 266) aspektų. Taip pat žr . serijos Nr. 151, 976.
[0008] Buvo parodyta, kad bakuloviruso sistema, apskritai, yra naudinga gaminant ŽIV- 1 bei kitus baltymus. Pavyzdžiui, bakulovirusas - Autographa californica branduolinės polihedrozės virusas ( AcNPV) buvo panaudotas, kaip vektorius viso ilgio gpl60 ir atskirų ŽIV- 1 apvalkalo geno dalių ekspresijai užkrėstose Spodoptera frugiperda ląstelėse ( Sf9 ląstelės). Be to, ankstesnėse paraiškose patentui yra aprašytas sutrumpintas gpl60 genas ( rekombinanto numeris Ac3046) ; baltymas, pagamintas rekombinantiniame Ac3046, ir Ac3046 geno produkto gryninimo būdai, kuriuose naudojama lęšių lėktino afininė chromatografija bei gelfiltracinė chromatografija. Buvo nustatyta, kad šiuo būdu išgrynintas ir agreguotas i, daleles gpl60 baltymas yra labai imunogeniškas graužikams ir primatų rūšims.
[0009] Ideali vakcina prieš AIDS turėtų būti ne tik biologiškai gryna bei apirogeniška, bet viena ar kelios jos injekcijos turėtų visam gyvenimui apsaugoti nuo ŽIV-1 infekcijos. Tai yra būdinga gyvoms susilpnintoms vakcinoms. Kai vakcinų gamybai yra naudojamos užmuštos bakterijos ar virusai, arba iš jų išskirtos medžiagos, pvz. : toksoidai, baltymai, dažniausiai sukeliamas silpnas imuninis atsakas ir įgyjamas tik trumpalaikis imunitetas. Siekiant įveikti arba sumažinti šiuos vakcinų trūkumus, paprastai i vakciną įdedama papildoma medžiaga, vadinama adjuvantu. Adjuvantai - tai medžia-gos, kurios padeda sukelti imunini, atsaką. Apskritai vakcinose, skirtose žmonėms, naudojami adjuvantai yra aliuminio druskų geliai (aliuminio fosfatas arba aliuminio hidroksidas), paprastai vadinami alumo adjuvantais. Bomford, et al., "Adjuvants", Animal Cell Biotech. Vol. 2: 235-250, Academic Press Inc. (London: 1985).
[0010] Šis išradimas - tai vakcina prieš žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV). Tinkamiausioje vakcinos paruošimo schemoje apvalkalo baltymas yra gryninamas, agreguojamas ir sumaišomas su adjuvantu (pvz., alumu).
[0011] Šio išradimo detalės ir nuorodos i, pridedamus brėžinius yra pateiktos žemiau: Fig. 1 iliustruoja klonavimo strategiją, panaudotą
[0012] ŽIV-1 apvalkalo geno ( env) išskyrimui iš E. coli plazmidės pNA2. Užtušuotos dalys rodo ŽIV-1 seką, neužtušuotos - klonavimo vektoriaus DNR
[0013] seką. Tamsus plazmidės pl774 regionas yra sukonstruotas iš sintetinių oligonukleotidų ir įstatytas į plazmidės 01614 Smal-KpnI saitus kaip Smal-KpnI fragmentas. Parodyta šio sintetinio oligonukleotido seka.
[0014] Fig. 2 iliustruoja rekombinantinės plazmidės vektoriaus (p3046) konstravimo strategiją, šis vektorius savo ruožtu buvo panaudotas bakuloviruso ekspresijos vektoriaus Ac3046 konstravimui.
[0015] Plazmidė pMGS3 turi bakuloviruso AcNPV sekas (užbrūkšniuotos skersai) kiekvienoje klonavimo saitų pusėje, pozicijoje 4.00. Šis regionas turi unikalius restrikcijos endonukleazių SmaI, KpnI ir BglII saitus. AcNPV polihedrino promotorius yra 5' galo kryptimi nuo 4.00 pozicijos. Seka 5'-TAATTAATTAA-3' yra 3'kryptimi ir turi transliacijos terminacijos kodoną visuose trijuose skaitymo rėmeliuose. Plazmidė pl774 ir sintetinio oligonukleotido regiono seka yra parodyti Fig. 1. Plazmidė p304 6 turi visą pMGS3, išskyrus sekas tarp SmaI ir BglII saitų, kur yra įterptas pl774 ŽIV-1 apvalkalo genas. Fig. 3 parodytos DNR, supančios Ac3046 gpl60 koduo-jančias sekas, nukleotidų sekos. Fig. 4 yra parodyta 3046 env DNR seka tarp +1 ir +2267. Fig. 4a-4t rodo Ac3046 ŽIV env geno segmento pirminę
[0016] DNR seką kartu su sintetinio oligonukleotido seka, esančia prie 5' env geno galo (tarp +1 ir +2267). Restrikcijos endonukleazių saitai yra surašyti virš DNR sekos, o numatoma amino rūgščių seka - po DNR seka. Bazės sunumeruotos kairėje ir dešinėje. Fig. 5a-5h yra lyginamos Ac3046 env geno ir publikuota LAV-1 env geno DNR sekos. LAV-1 seka yra viršuje, o Ac3046 - apačioje. Linija (1) po LAV-1 seka rodo, kad šioje pozicijoje Ac3046 seka yra ta pati. DNR sekos sunumeruotos tuo pačiu būdu, kaip LAV-1 Wain-Hobson et al., Cell, 40: 9-17 (1985) . Fig. 6 rodo antikūnų prieš ŽIV- 1 titrą, nustatytą imu-nofermentine analize ( IFA), teigiamuose žmonių serumuose ( viršutinis grafikas) ir rėzus bež-džionių, imunizuotų gpl60 ( IJ55, KL55) ar gpl20 ( AB55, CD55, GH55), serumuose ( apatinis grafikas). Serumų titras prieš gerai išgry-nintus baltymus gpl20 ir gpl60 buvo išmatuotas IFA. Specifiškai prisijungę antikūnai buvo išryškinti, naudojant ožkos antikū. ius prieš žmogaus IgG, konjuguotus su peroksidaze iš krienų. Šiame teste titru laikomas didžiausias serumo praskiedimas, kuriam esant gaunamas teigiamas atsakas. Fig. 7 pateikta lentelė, apibendrinanti imuninius atsakus, sukeltus gpl60 vakcinos, pacientams su teigiamais serumais. Fig. 8 ( A ir B) rodo vakcinos sukeltus imuninius
[0017] atsakus i, specifinius ŽIV- 1 apvalkalo epitopus.
[0018] Fig. 9 rodo vakcinos sukelta T ląstelių proliferacini,
[0019] atsaką i, gpl60 paskiepytuose pacientuose su teigiamais serumais.
[0020] Fig. 10 rodo limfocitų skaičiaus didėjimą po skiepijimo
[0021] Fig. 11 yra grafikas, rodantis CD4 ląstelių skaičiaus pokytį procentais laike vakcinai jautriuose ir nejautriuose individuose.
[0022] Buvo atrasta, kad rekombinantinio ŽIV- 1 gpl60 apvalkalo baltymas (" rgpl60" ) > ypač adsorbuotas ant tokio adjuvanto, kaip alumas ( pvz., aliuminio fosfatas), yra labai tinkamas vakcinai prieš AIDS.
[0023] Vienas šio išradimo aspektų yra AcNPV ekspresijos vektorius, turintis ŽIV-1 apvalkalo geno koduojančios sekos dali., kuri yra ekvivalentinė rekombinantinio klono Nr. 3046 1-757 Wain-Hobsono (ibid) sekai ir atitinka 1-752 amino rūgštis.
[0024] Antras išradimo aspektas yra šio rekombinantinio ŽIV-1 apvalkalo baltymo (ir paties baltymo) gaminamas vabzdžių ląstelėse, ypač baltymo rgpl60, koduojamo amino rūgščių 1-757 Wain-Hobson sekos (t.y. 03046, turinčio 752 amino rūgščių liekanas).
[0025] Kiti šio išradimo aspektai - apvalkalo baltymo gryninimas ir dalelių formavimas iš rekombinantinio bakuloviruso, gaminančio 304 6 baltymą, geno produkto bei to produkto dalelių adsorbcija ant aliuminio fosfato agregatų.
[0026] Išradimas taip pat apima vakcinas ir priemones AIDS ir ŽIV infekcijų profilaktikai ir/arba terapijai.
[0027] Tolesni pavyzdžiai iliustruoja išradimą, neribodami jo pritaikymo sferos.
[0028] Rekombinantinis bakulovirusas Autographa californica branduolinės polihedrozės virusas (AcNPV), turintis sutrumpintą ŽIV-1 gpl60 geną, koduojanti, ŽIV-apvalkalo baltymo 1-757 amino rūgštis, yra aprašytas užregistruotoje paraiškoje JAV patentui, serijos Nr. 920,197 (dabar serijos Nr. 585,260). Klonavimo pakopos, naudojamos konstruojant rekombinantini, bakulovirusą, turinti ŽIV-1 genus ar ŽIV-1 genų dalis, irgi yra aprašytos šiame patente ir yra šio patento dalis.
[0029] Toliau pateiktas detalus geno inžinerinių stadijų, panaudotų konstruojant Ac3046 ekspresijos vektorių, aprašymas. Naudotos medžiagos, tarp jų fermentai ir imunologiniai reagentai, buvo gauti iš komercinių šaltinių. Pridedami pavyzdžiai parodo, kaip atlikti ir taikyti išradimą.
[0030] Turimi omenyje taip pat ir kiti rekombinantiniai apvalkalo baltymai, kurie visi priskiriami rgpl60, čia įeina ir rekombinantiniai gpl20 ir gp41 baltymai. Ac3046 kaip tik yra tokio ekspresijos vektoriaus ir rekombinantinio apvalkalo baltymo pavyzdys pagal išradimą.
[0031] Rekombinantinio bakuloviruso Ac3046, turinčio ŽIV-1 koduojančios sekos dalį, atitinkančią 1- 757 amino rūgštis, konstravimas
[0032] Svetimus baltymus koduojančių sekų klonavimui ir ekspresijai bakuloviruso vektoriuje reikia, kad koduojanti seka su polihedrino promotoriumi ir prieš ją esančios sekos būtų išrikiuotos vienoje pusėje, o bakuloviruso koduojančios sekos - kitoje pusėje. Esant tokiam išsidėstymui, homologinės rekombinacijos su bakuloviruso genomu metu svetimos koduojančios sekos yra perkeliamos kartu su polihedrino promotoriumi ir neaktyviu polihedrino genu.
[0033] Todėl ŽIV apvalkalo geno konstravimui buvo sukurti įvairūs insercijos vektoriai. Insercijos vektorius MGS3, aprašytas žemiau, buvo sukonstruotas tam, kad tiektų ATG transliacijos iniciacijos kodoną. Svetimų sekų įterpimas į ši, vektorių turėtų būti toks, kad transliacijos rėmelis, prasidedantis iniciacijos kodonu, tiksliai tiktų svetimoms sekoms.
[0034] Insercijos vektorius MGS3 buvo sukonstruotas iš Eco RI-I restrikcijos fragmento klono, kurio DNR buvo išskirta iš išgryninto AcMNPV izoliato (WT-1). MGS3 buvo sukonstruotas taip, kad turėtų šias struktūrines savybes: (a) 4000 b.p. seką, esančią prieš polihedrino promotoriaus iniciacijos kodoną ATG; (b) polilinkerį, įterptą "sait-specifinės" mutagenezės būdu, kuris turi iniciacijos kodoną ATG pozicijoje, atitinkančioje polihedrino iniciacijos kodono poziciją, ir restrikcijos saitus SmaI, KpnI, BglII, o taip pat universalų "stop" kodono segmentą; (c) 1700 b.p. seką, nusitęsusią nuo Kpn restrikcijos saito (kuris yra polihedrino gene) iki terminalinio EcoRI-I klono EcoRI restrikcijos saito. Žr. pvz. : fig. 2.
[0035] Bakuloviruso rekombinantų, turinčių LAV env koduojančias sekas, konstravimas
[0036] Rekombinantinė plazmidė, pažymėta NA2 (fig. 1), susideda iš viso ŽIV-1 proviruso 21.8 k.b. segmento, įterpto i, pUC18. Buvo duomenų, kad šis klonas yra infekcinis, kadangi gali gaminti virusą, sugebanti, užkrėsti tam tikras žmogaus ląsteles. Adachi, et al., J. Virol. 59: 284-291 (1986). Visos apvalkalo geno sekos, esančios NA2, yra kilusios iš ŽIV LAV štamo. Barre-Sinoussi (1983).
[0037] ŽIV-1 apvalkalo genas buvo išskirtas ir su juo atliekamos genoinžinerinės procedūros taip, kaip aprašyta žemiau ir parodyta pav.l. Pirmiausiai iš NA2 buvo išskirtas 3846 b.p. EcoRI/SacI restrikcijos fragmentas, turintis apvalkalo geną ir klonuotas i, EcoRI//SacI restrikcijos saitą pUCl9. Sukonstruota plazmidė pavadinta p708.
[0038] Apvalkalo genas buvo pakartotinai išskirtas, kaip 2800 b.p. KpnI restrikcijos fragmentas ir klonuotas i, pUC18 KpnI restrikcijos saitą. Sukonstruota plazmidė pavadinta pl614.
[0039] KpnI restrikcijos fragmentas, esantis pl614, turėjo nežymiai sutrumpintą ŽIV apvalkalo geną, kuriame trūko 121 b.p. ilgio N-galą atitinkančios sekos. Ši trūkstama geno dalis, koduojanti signalines peptidų sekas, buvo pakeista, įterpiant dvigrandį sintetini, oligomerą. Įterptas oligomeras buvo susintetintas iš LAV amino rūgščių sekos, naudojant polihedrino genui būdingus kodonus. Siekiant palengvinti tolesnes manipuliacijas, vietoj ATG iniciacijos kodono buvo įterpta nauja Smal restrikcijos seka. ATG iniciacijos kodonas gaunamas iš bakuloviruso insercijos vektoriaus. Sukonstruota plazmidė pavadinta pl774.
[0040] Remiantis fig. 2., restrikcijos fragmentai iš pl774, turintys įvairių ŽIV apvalkalo domenų koduojančias sekas, buvo klonuoti i, MGS insercijos vektorių ( pvz., MGS3) taip, kad insercijos vektoriaus iniciacijos kodonas ATG būtų skaitymo rėmelyje kartu su apvalkalo geno kodonais. Sukonstruota p304 6 susideda iš Smal/BglII restrikcijos fragmento, išskirto iš pl774, įterpto į plazmidės vektoriaus pMGS3 Smal/BamHI saitą. Šis klonas turi sekas, koduojančias baltymo gpl60 1 - 757 amino rūgštis ir MGS3 vektoriaus terminacijos kodoną.
[0041] Rekombinantinio bakuloviruso paruošimas ir selekcija
[0042] ŽIV env geno rekombinantinė plazmidė p304 6 buvo išsodinta kalcio fosfatu su AcMNPV DNR (WT-1) ir įdėta į neužkrėstas Spodoptera frugiperda ląsteles. Tada chimerinis genas homologinės rekombinacijos būdu buvo įterptas į AcMNP genomą. Rekombinantiniai virusai buvo
[0043] indenfikuojami morfologiškai, pagal neigiamą plokštelių okliuziją. Tokiose plokštelėse pastebimas citopatinis efektas, bet be branduolio okliuzijos. Siekiant gauti gryną rekombinantini, virusą, buvo atliktos dvi papildomos, viena po kitos sekančios, plokštelių gryninimo procedūros. Lyginant restrikcijos ir hibridizacijos charakteristikas su atitinkamom "laukinio tipo" virusinės DNR charakteristikom, buvo išanalizuota, ar rekombinantinėje virusinėje DNR įvyko ŽIV env sekų "sait-specifinė" insercija.
[0044] ŽIV env iš rekombinantinio bakuloviruso ekspresija užkrėstose vabzdžių ląstelėse
[0045] ŽIV env sekų iš rekombinantinių virusų ekspresija vabzdžių ląstelėse turėtų baigtis pirminio transliacijos produkto sinteze. Šis pirminis produktas bus sudarytas iš amino rūgščių, transliuojamų nuo rekombinantinio vektoriaus kodonų. Tokiu būdu, gaunamas baltymas, kuris turi visas amino rūgštis, koduojamas regione nuo ekspresijos vektoriaus iniciacijos kodono ATG, esančio už polihedrino promotoriaus, iki transliacijos terminacijos signalo, esančio ekspresijos vektoriuje (pvz.: rgpl60). Pirminis Ac3046 transliacijos produktas turėtų skaityti Met-Pro-Gly-Arg-Val, kur Arg, esantis pozicijoje 4, originaliame LAV klone turėtų būti pozicijoje 2. Met-Pro-Gly kodonai klonavimo strategijos pasekmė.
[0046] gpl60 intarpo ir šoninės DNR nukleotidu seka buvo nustatyta pagal restrikacijos fragmentą, išskirtą iš
[0047] virusinio ekspresijos vektoriaus Ac3046 DNR. Sekos buvo nustatomos tokia tvarka: 3.9 kb EcoRV-BamHI fragmentas buvo išgrynintas, restrikacijos endonukleazėmis suskaidžius Ac3046 virusinę DNR. Ac304 6 virusinė DNR buvo paruošta iš ekstraląstelinio viruso, esančio ląstelių, naudotų vakcinos serijos gamybai, terpėje.
[0048] Kaip parodyta fig. 2, 3.9 kb EcoRV-BamHI fragmentas susideda iš viso gpl60 geno ir 100 b.p. DNR, esančios prieš geną ir 1000 b.p. DNR, esančios už geno.
[0049] Taigi, sekų nustatymo rezultatai parodė, kad gauta chimerinė konstrukcija, kurią nulėmė klonavimo strategija. gpl60 seka iš esmės buvo tokia pati, kaip nurodė Wain-Hobson, et al. (1985). 2256 bazių porų seka tarp tariamų transliacijos iniciacijos ir terminacijos kodonų lemia 752 amino rūgščių kodoną ir 28 potencialus N-glikozilinimo saitus. Šio rgpl60 molekulinis svoris (kartu su angliavandenių liekanomis) apytiksliai yra 145000.
[0050] Kaip matyti Fig. 3,4 ir 5, 200 bazių, priklausančių supančiai DNR, sekų analizė parodė tikslią inserciją.
[0051] Naudojant standartinę automatizuotą Edmano degradaciją ir HPLC buvo nustatyta, kad pirmų 15-kos gpl60 liekanų N-galinė seka yra identiška pagal DNR numatytai sekai. gpl60 baltymas neturi N-galinio metionino. Tai atitinka stebėjimus, kad AcNPV polihedrino baltymas taip pat yra sintetinamas be N-galinio metionino. Analizuojant AcNPV 3046 DNR ir išgrynintą gpl60, nustatyta, kad pirminės gpl60 DNR ir N-galo baltymo sekos tokios (1 lentelė):
[0052] 1 LENTELĖ LAV env AcNPV 3046 ekspresijos vektoriuje Liekana
[0053]
[0054] Vienas šio išradimo aspektų yra procedūra, naudojama rekombinantinio HIV-1 apvalkalo baltymo, koduoto Ac3046 ekspresijos vektoriuje, ekstrakcijai ir išskyrimui. Rekombinantinis HIV-1 apvalkalo baltymas gpl60 yra sintetinamas S. frugiperda ląstelėse 4-5 dienas po užkrėtimo Ac3046. Šio rgpl60 baltymo gryninimas vyksta sekančiom pakopom:
[0055] 5.Dializėšiame pavyzdyje aprašytas rekombinantinio gpl60 gryninimas iš maždaug 2xl09 ląstelių, užkrėstų Ac304 6. 1. Ląstelių plovimas. Užkrėstos ląstelės plaunamos buferyje, turinčiame 50mM Tris'o buferio (pH 7.5), 1 mM EDTA ir 1 % Triton'o X-100. Šiame buferyje ląstelės resuspenduojamos, homogenizuojamos standartiniais metodais ir centrifuguojamos 20 minučių, esant 5000 aps/min. Šis procesas pakartojamas 3 kartus. 2. Ląstelių suardymas. Nuplautos ląstelės suardomos ultragarsu 50mM Tris'o buferio (pH 8.0-8.5), 4 % dezoksicholato ir 1 % beta-merkaptoetanolio mišinyje. Ardymas ultragarsu atliekamas naudojant standartinius metodus. Po ardymo ultragarsu lieka nesuirusios tik branduolio membranos dalelės, kurios pašalinamos centrifuguoj ant 30 minučių, esant 5000 aps/min. Stebė-jimai per šviesini, mikroskopą rodo, kad supernatante, turinčiame ekstrahuotą gpl60, nėra nesuirusių ląstelių. 3. Gelfiltracij a. Gelfiltracij a atliekama stiklinėse 5.0x50 cm kolonose (Pharmacia), užpildytose Sefakrilu (Pharmacia). Bendras sorbento tūris yra apytiksliai 1750 ml. Kolona ir žarnelių jungtys depirogenizuojami bei dezinfekuojami leidžiant per koloną 24 valandas mažiausiai 6 litrus 0.1 N NaOH. Eliuatas, ištekantis iš kolonos, eina per UV-kiuvetę, sujungtą su monitoriumi ir savirašiu (Pharmacia), kolona nulygsvarinama 4 litrais gelfiltracinio buferio. Nevalytas gpl60 yra pakraunamas ant kolonos ir per ją leidžiamas gelfiltracinis buferis.
[0056] Kolonoje nevalytas mišinys susiskirsto į tris dideles UV absorbuojančias frakcijas. Pirmasis pikas nubrėžiamas tarp apytiksliai 500 ir 700 ml, antrasis tarp 700 ir 1400 ml ir trečiasis tarp 1400 ir 1900 ml buferio. Toks pat eliucijos profilis stebimas nedidelėse analitinėse kolonose, pagal kurias buvo nustatyta, kad pirmą piką duoda medžiaga, kurios molekulinis svoris >2 000 000.
[0057] Šio piko frakcija silpnai absorbuojama, nes joje yra didelio molekulinio svorio lipidų bei lipidų kompleksų. Be to, šio piko frakcijoje yra nuo 10 % iki 20 % gpl60, ekstrahuoto iš užkrėstų ląstelių. Neabejotinai, ši gpl60 frakcija sudaro kompleksus pati su savimi ir su kitais ląstelių komponentais, suformuodama didelio molekulinio svorio agregatus.
[0058] Antrojo, plataus, piko frakcijoje, yra didžioji dalis gpl60 ir baltymų, kurių molekulinis svoris apytiksliai yra 18 000 - 200 000.
[0059] Trečiojo piko frakcijoje yra mažai baltymų, ir didžia dalimi UV absorbcija sąlygojama beta-merkaptoetanolio, esančio pavyzdyje.
[0060] Kai tik antrasis pikas užregistruojamas UV detektoriumi, eliuatas, ištekantis iš kolonos, nukreipiamas tiesiai i, koloną su lęšių lėktinu. Kai antrasis pikas išeina iš kolonos, eliuatas atjungiamas nuo kolonos su lęšių lėktinu ir nukreipiamas lauk.
[0061] 4. Lęšių lėktinas. Didelis kiekis lęšių lėktino afininės gelio terpės (Lentil Lectin Sepharose 4B) buvo įsigytas firmoje "Pharmacia". Lęšių lėktinas buvo išgrynintas iki 98 % švarumo afininės chromatografijos būdu ant Sefadekso ir tada imobilizuotas ant Sefarozės 4B, naudojant bromcianą. Ligando kiekis matricoje yra maždaug 2 mg/ ml gelio. Lęšių lėktino kolona - tai 5. 0x30 cm stiklinės kolona ( Pharmacia) kurioje yra 125 ml lęšių lėktino Sefarozės 4B gelio. Rūpestingai praplovus ir pagal gamintojo rekomendacijas regene-ravus, afininę matricą galima naudoti pakartotinai. Nenaudojant gelis yra saugojamas kolonoje, pripildytoje tirpalo, kuri, sudaro 0. 9 % NaCI, 1 mM MnCI2, lmM CaCI2 ir 0. 01 % mertiolato. Prieš kiekvieną naudojimą kolona yra plaunama ir nulygsvarinama 250 ml anksčiau aprašyto lęšių lėktino buferio.
[0062] Nevalytas gpl60 yra leidžiamas tiesiai per koloną, nes nuo gelfiltracinės kolonos jis eliuuojamas anksčiau aprašytu būdu. Kai neišgrynintas gpl60 prisijungia prie kolonos, jis plaunamas 800 ml lęšių lėktino buferio, turinčio 0. 1 % dezoksicholato. Esant šioms sąlygoms, visas gpl60 prisijungia prie kolonos. Prisijungusių glikoproteinų, nustatomų UV detektoriumi, esant 280 nm bangos ilgiui, eliucijai naudojamas lęšių lėktino buferis su 0. 3 M alfa- metil- manozidu. 5. Dializė . Angliavandeniai ir dezoksicholatas pašali-nami įprastos dializės būdu.
[0063] Baltymo gpl60 išgryninimo iš 1 litro užkrėstų ląstelių procedūrą galima reziumuoti sekančioje lentelėje ( lentelė 3) . Kitu atveju, vietoj gelfiltracijos galima atlikti įprastinę jonų mainų chromatografiją ( anijonų ir katijonų). Darbo eiga irgi neturi lemiamos įtakos: pavyzdžiui, gelfiltracinė ar jonų mainų chromatografija gali būti atliekama po lęšių lektininės chromatografijos. Pagal išradimą, galima naudoti ir kitus reagentus. Pavyzdžiui, vietoje dezoksicholato rekombinantinio baltymo gryninimui galima naudoti kitus detergentus, t. y. nejoninius detergentus tokius, kaip Tween 20 ( polisorbatas 20), Tween 80, Lubrol ir Triton X- 100.
[0064] 3 LENTELĖ - gryninimo reziumė
[0065] Vienas šio išradimo aspektų buvo tai, kad gryninimo metu antigenas gpl60 gali būti surinktas i,
[0066] >2000000 molekulinio svorio daleles. Iš ląstelių ekstrahuojamas gpl60 baltymų mišinys, turintis 80-90 % monomerų (160.000 molekulinio svorio) ir 10-20 % polimerų (dalelių forma). Gelfiltracijos pakopoje pašalinamos agreguotos gpl60 formos. Nepavykę bandymai
[0067] išskirti gpl60 iš šios frakcijos ( pirmasis pikas po gelfiltracijos) perša išvadą, kad jis sudaro kompleksus su kitais ląstelės baltymais ir, galbūt, net su membranos fragmentais. Tačiau gpl60 antigenas frakcijoje, duodančioje antrą piką po gelfiltracijos, yra apytiksliai 160000- 300000 molekulinio svorio. Tai rodo, kad dominuoja monomerinės bei dimerinės formos.
[0068] Baltymo gpl60 agregatai ar polimerai susidaro kolonoje su lęšių lėktinu. Buvo nustatyta, kad antigenas sudaro agregatus tiek eliuuojant 0. 5 % dezoksicholatą nuo kolonos su lęšių lėktinu, kai kritinė micelių koncentracija ( KMC) dezoksicholato atžvilgiu yra apytiksliai 0. 2 %, tiek ir eliuuojant gpl60 nuo kolonos 0. 1 % dezoksicholatu.
[0069] Agregatų dydis yra matuojamas didelę skiriamąją galią turinčioje FPLC Superozės 12 kolonoje ( Pharmacija). Tipiškų išgryninto gpl60 serijų pavyzdžiai dažniausiai yra 20000000 ar didesnio molekulinio svorio, lyginant su Dekstran Blue standartu.
[0070] Schwaller, et al . ( 1989) darbuose parodyta, kad vabz-džių ląstelėse susintetintas gpl60, - tai tetramerinės dalelės, sudarytos iš identiškų subvienetų. Be to, šie tyrimai rodo, kad ŽIV užkrėstose ląstelėse ir virusinėse dalelėse gpl60 yra tetramerinis. Taigi, rekombinantinio gpl60 dalelės gali turėti tretinę ir ketvirtinę struktūras, panašias i, natyvaus HIV gpl60.
[0071] Tinkama trimatinė struktūra gali būti svarbi epitopų, reikalaujančių tikslaus gpl60 erdvinio išsidėstymo, formavimui. Kadangi neglikozilinti baltymai atskiriami nuo gpl60 antigeno lęšių lėktino chromatografijos metu, panašu, kad hidrofobinės gpl60 porcijos pradeda formuoti tarpmolekulinius asocijatus. Dezoksicholatas, matyt, neprisijungia prie gpl60, kadangi galima palaikyti didesnę nei KMC jo koncentraciją, o antigenas toliau formuoja kompleksus. Pasirodo, kad toks antigeno agregavimasis yra būdinga šio baltymo savybė, jei jis gryninamas pagal šį išradimą. Gali būti, kad būtent ta hidrofobinė N- galinė seka, kuri yra gpl60 baltyme, prisideda prie natūralaus šio baltymo sugebėjimo formuoti daleles. Po gryninimo galima gpl60 kompleksus steriliai filtruoti per 0. 2 mikronų skersmens celiuliozės acetato filtrą, tokios procedūros metu neprarandama daug baltymo.
[0072] Išgryninto gpl60 dalelių analizė elektroninės mikroskopijos būdu parodė, kad tai yra panašios i, baltymus, sferinės 30- 100 nM dalelės.
[0073] Norint įsitikinti, jog dalelės susidarė, išgrynintas gpl60 papildomai analizuojamas gelfiltracijos būdu.
[0074] Apytiksliai 100 mikrogramų gpl60 buvo praleista per FPLC gelfiltracijos HR 10/ 30 Superozės koloną
[0075] ( Pharmacia, Inc.). Prieš tai kolona buvo kalibruojama, naudojant molekulinio svorio baltyminius standartus. Šioje kolonoje baltymų eliucijos profilis labai gerai atsikartoja; eliucijos tūris yra atvirkščiai proporcingas baltymų standartų molekuliniam svoriui. Kolonoje monomerinis gpl60 atskiriamas nuo polimerinių formų ir pašalinami globuliniai baltymai, kurių molekulinis svoris > 2xl06. Dirbant su šia kolona visas baltymas gpl60 išteka su tuščiu tūriu, taigi molekulinis svoris yra >2xl06 ( 2000000) .
[0076] Netirpių aliuminio junginių, kaip imunologinių adjuvantų, efektyvumas priklauso nuo antigenų adsorbcijos ant kietos fazės. Viena šio išradimo dalis tai atradimas, jog galima padaryti tokius alumo junginius, kurie efektyviai adsorbuotų gpl60. Šiuo atveju, pH turėtų būti toks, kad nesumažėtų gpl60- alumo komplekso imunogeninis aktyvumas. Šio alumo ( aliuminio fosfato gelio) junginio susidarymo metu kontroliuojami tokie faktoriai: 1. Optimalus antigenų adsorbcijos ant alumo pH yra apytiksliai 5. 0. Tačiau buvo atrasta, kad gpl60, esant pH 6. 5. praranda imunogeniškurną labiau nei, esant pH 7. 5. Todėl alumas buvo pagamintas, esant pH 7. 1±0. 1. Buvo atrasta, kad esant šiam pH, visi 100% gpl60 dar adsorbuojasi prie alumo. 2. Joninė jėga, sąlygojama NaCl, yra santykinai maža ir yra mažesnė nei 0. 15 M. 3. Naudojamas moliarinis aliuminio chlorido perteklius, lyginant su natrio fosfatu, užtikrinantis, kad supernatante nėra laisvų fosfato jonų. 4. Baltymas gpl60 įdedamas i, šviežiai pagamintą alumą, kad sustotų kristalų augimas ir sumažėtų dalelių dydis.
[0077] 200 ml alumo ruošiami ir išgrynintas gpl60 adsorbuo-jamas prie alumo taip, kad galutinė antigeno koncentracija būtų 40 įxg/ ml, kaip nurodyta žemiau.
[0078] Toliau nurodytus tirpalus ruoškite 100 ml talpos steriliuose depirogenizuotuose buteliuose ar stiklinėse. Sumaišykite druskas, skirtas tirpalo 1 ir tirpalo 2 paruošimui, su natrio hidroksidu ir filtruokite per 0.2 mikronų skersmens celiuliozės acetato filtrus i, 100 ml talpos sterilius depirogenizuotus butelius.
[0079] Tirpalus autoklavuoti 30 min; lėtai išleisti garą. Atšaldyti iki kambario temperatūros.
[0080] 1. Supilkite 1 tirpalą (aliuminio chloridas-natrio acetatas) i, paruošimo indą, naudodami 25 ml sterilias vienkartines pipetes. Pasižymėkite 1 tirpalo tūri, ir pradėkite maišyti tirpalą. 2. Į indą įpilkite 2 tirpalą (natrio fosfatas), naudodami 25 ml sterilias vienkartines pipetes ir toliau maišykite krentant nuosėdoms. Pasižymėkite tirpalo 2 tūrį. 3. Įpilkite 3 ml 3 tirpalo ( natrio hidroksidas) ir maišykite dar 5 min. Paimkite 0. 5 ml pavyzdi ir pamatuokite pH. Jei pH mažesnis nei 7. 0, papildomai įpilkite 0. 5 ml natrio hidroksido, maišykite dar 5 min ir vėl pamatuokite pH. Tęskite, kol pH nusistovės tarp 7. 0 ir 7. 2. 4. Nustatykite bendrą tūri,, įpiltą i, paruošimo indą ( tirpalas 1 + tirpalas 2 + tirpalas 3), tada įpilkite sterilaus VI iki 100 ml. 5. Skubiai įdėkite 8, 000 mikrogramus išgryninto gpl60 100 ml 1 mM Tris pH 7. 5 tiesiai į paruošimo indą. 6. Plakite dar bent 20 minučių, tada paruoštą vakciną išpilstykite į sterilius mėgintuvėlius.
[0081] Alumo , adsorbuoto ant gp ! 60 , imunogeniškūmas ( specifinis Ab atsakas)
[0082] Tinkamas metodas antigeninio preparato ( vakcinos) imunogeniškumo nustatymui yra specifinio imuninio atsako matavimas pelių, paskiepytų vienkartine antigeno doze, grupėse. Baigiantis 4 savaitei pelės yra nukraujinamos ir antikūnų prieš nurodytus antigenus ( paprastai prieš tuos antigenus, kuriais gyvūnai buvo imunizuoti) lygis serume yra matuojamas standartiniu testu, t. y. IFA ( imunofermentinė analizė).
[0083] Išgryninto gpl60 be adjuvanto, esant pH 6. 0 ir 7. 5, adsorbuoto prie alumo ( kaip aprašyta pavyzdyje 9 ) arba sumaišyto su pilnu Freund' o adjuvantu imunogeniškurnas pelėms yra susumuotas žemiau ( 4 lentelė).
[0084] 4 LENTELĖ
[0085] Pelėse, imunizuotose vienakartine 1.0 mikrogramine gpl60 antigeno doze jokio adjuvanto, kyla imuninis atsakas į gpl60 (žr. lentelę žemiau). Žymiai stipresnis imuninis atsakas stebimas pelėse, imunizuotose vienkartine 1.0 mikrogramine gpl60, adsorbuoto ant alumo adjuvanto, doze. Vienkartinė, mažesnė nei 0.1 mikrogramas gpl60, sumaišyto su pilnu Freund'o adjuvantu arba adsorbuoto alumu, dozė sukels serokonversiją >50% imunizuotų pelių. Nors ir nestipriai, antigenas gpl60 be adjuvanto buvo imunogeniškas pelėms, esant pH 7. 5 ir pH 6. 0. Esant žemesniam pH imunogeniškumas prarandamas.
[0086] Ant alumo adsorbuoto gp ! 60 imunogeniškumas ( serumo tyrimas IFA metodais)
[0087] Vakcinos sugebėjimas sukelti imuninį atsaką yra labai svarbi biologinė savybė. Siekiant patvirtinti, kad gpl60 vakcina, paruošta su alumu, yra imunogeniška gyvūnams, o alumo adjuvantas didina ši, imunogeniškurną, buvo atlikti tokie eksperimentai: Nulinę dieną pelėms ( 10 individų grupėje) buvo suleista vienakartinė dozė ( 0. 5 mikrogramo, 1. 0 mikrogramas ir 5. 0 mikrogramai) vieno gpl60, gpl60 adsorbuoto ant alumo ar gpl60 su pilnu Freund' o adjuvantu ( PFA). 28- tą dieną pelės buvo nukraujintos ir IFA ( praskiedimas 1:10) būdu patikrinti serumai, ar yra antikūnų prieš gpl60.
[0088] Rezultatai, gauti po 28- nių dienų, yra susumuoti lentelėje, pateiktoje žemiau ( lentelė 5) . Visose grupėse daugiau nei 50% pelių buvo stebima serokonversij a. Serokonversijų skaičius ir vidutinė serumo absorbcija ( OT450 nm, esant praskiedimui 1:10, IFA) buvo didesni, suleidus bet kurią gpl60, adsorbuoto ant alumo, dozę, nei imunizavus atitinkama vieno gpl60 doze.
[0089] Šie rezultatai rodo, kad alumo adjuvantas žymiai padidina gpl60 antigeno imunogeniškumą.
[0090] 5 LENTELĖ - 28 dienos po suleidimo
[0091]
[0092] ŽIV neutralizacijos analizė yra pripažintas metodas norint nustatyti ar antikūnų preparatas inhibuoja ŽIV-1 virusą ir apsaugo nuo užkrėtimo jautrias žmogaus limfocitų kultūrų ląsteles. Gyvūnėlių, imunizuotų gpl60, antiserumai buvo tikrinami ŽIV-1 neutralizacijos analizės būdu; rezultatai susumuoti lentelėje, pateiktoje žemiau (6 lentelė) .
[0093] 6 LENTELĖ
[0094] Jūrų kiaulytės, triušiai ir rėzus beždžionės irgi buvo imunizuoti gpl60 (su alumu arba Freund'o adjuvanto). Apskritai, šiuos gyvūnus imunizavus, buvo stebimas geras imuninis atsakas d, ŽIV-1 apvalkalo baltymus.
[0095] Genetiškai šimpanzės yra artimiausi žmogaus gimi-naičiai. Šiuo metu tai vienintelis gyvūno modelis, tinkamas ŽIV-1 infekcijos tyrimams. Toksiškumo/imuno-geniškumo bandymai buvo atliekami su trimis beždžionėmis; dvi buvo imunizuotos 40 mikrogramų arba 80 mikrogramų gpl60 su alumu paruošta vakcina. Po 4 savaičių kiekviena jų buvo papildomai imunizuota, atitinkamai 40 mikrogramų arba 80 mikrogramų gpl60. Kontroliniam gyvūnui tuo pat metu buvo suleistas 1 ml druskos tirpalo. Kiekvieną savaitę buvo imami visų trijų šimpanzių kraujo pavyzdžiai ir tikrinama, ar yra antikūnų prieš gpl60 ir ŽIV- 1 virusinius antigenus. Tam buvo atliktos trys imunologinės analizės: IFA, naudojant išgrynintą gpl60, sukurtą MicroGeneSys, Inc., " Western Blot" analizė ir komercinė ZIV- 1 IFA analizė. Šių analizių duomenys yra pateikti žemiau.
[0096] IFA analizė MGSearch HIV 160 ( MGSearch yra MicroGeneSys, Inc. of Meriden, Connecticut, U. S. A. prekybinis ženklas imunosorbentinei analizei prieš gpl60) yra aprašyta kartu paduotoje ir pasirašytoje paraiškoje JAV patentui, serijos Nr. 920, 197 ( dabar Nr. 585, 266) .
[0097] Serumo pavyzdžiai paimti prieš imunizaciją ir 11 savaičių po pirminės imunizacijos buvo praskiesti nuo 1:10 iki 1:100 000 ir inkubuoti su nitroceliuliozės juostomis, turinčiomis 100 |. ig išgryninto gpl60 kiekviename taške. Galutinis titras - tai didžiausias antikūnų prieš gpl60 praskiedimas, kuriame testas davė teigiamus rezultatus, naudojant ožkos antikūnus prieš žmogaus IgG konjuguotus su šarmine fosfataze.
[0098] Serumo pavyzdžiai, paiimti iš kontrolinių bei bandomųjų gyvūnų prieš imunizaciją buvo neigiami. Šimpanzės, kuriai buvo suleista 80 mikrogramų dozė, serumas buvo teigiamas, praskiedus 1:100, antrą savaitę, o šimpanzės, kuriai buvo suleista 40 mikrogramų dozė, serumas buvo teigiamas, praskiedus 1:10, ketvirtą savaitę. Antikūnų prieš gpl60 titras didėjo iki 5- tos savaitės, kai galutinis titras atitinkamai buvo 1:100000 ir 1:2000000. Antikūnų titrai abiejuose gyvūnuose per 6- 11 savaites nukrito labai nežymiai.
[0099] Toks atsako tipas yra ir kokybiškai ir kiekybiškai panašus į imunini, atsaką, stebimą šimpanzėse, paskiepytose vakcina prieš žmogaus hepatitą B.
[0100] Iš šimpanzių, imunizuotų VaxSyn , serumų analizės MGSearch ŽIV 160 ELISA ir Western blot' o metodais, aišku, kad jose vyko serokonversij a ir buvo antikūnų prieš rekombinantinj, gpl60. Siekiant ištirti, ar jose gaminami ir anti- ŽIV antikūnai, atpažįstantys natyvius virusinio apvalkalo baltymus, serumai prieš imunizacija ir serumai paimti 1- 11 savaitę buvo tikrinami licenzijuotame komerciniame IFA testų rinkinyje. ( LAV EIA™ test kit of Genetic System Corparation, Seattle, Washigton). Gyvūno, imunizuoto 80 mikrogramų gpl60, serumas buvo teigiamas, praskiedus 1:100, 2- rą savaitę; antikūnų lygis jame ir toliau augo visas 6 savaites. Gyvūno, imunizuoto 4 0 mikrogramų gpl60, serumas, praskiedus 1:100, buvo teigiamas 6- tą savaitę.
[0101] Svarbu nustatyti, ar imuninis atsakas į gpl60 paskiepytame gyvūne nukreiptas prieš gp41, gpl20 ar prieš abu. Antikūnų prieš įvairius ŽIV- 1
[0102] VaxSyn yra čia aprašytos MicroGeneSys, Ins.
[0103] vakcinos prieš AIDS prekybinis ženklas.
[0104] apvalkalo baltymo regionus nustatymui ir jų lygio išmatavimui buvo naudojami įvairūs imunologiniai metodai, tarp jų radioimunoprecipitacij a (RIP), imunofluorescencija (IF), "Western blot" analizė (WB) ir kiekybinė IFA prieš tris skirtingus rekombinantinius apvalkalo antigenus.
[0105] 6 fig. susumuoti trijų skirtingų rekombinantinių antigenų imuniniai reaktyvumai: [ART] [ TAB] (1) gpl20 — delta (sutrumpintas ŽIV-1 gpl20, kurio molekulės C-gale trūksta maždaug 40 amino rūgščių) ; [ ART] [ TAB] (2) gpl20 (pilno ilgio rekombinantinis ŽIV-1 gpl20) ir [ART] [TAB] (3) gpl60. 50 žmonių, turinčių antikūnus prieš ŽIV-1, serumai ir 3 sumaišyti žmonių serumai gerai reagavo į gpl60, vidutiniškai - i, gpl20 ir silpnai arba visai nereagavo sutrumpintą gpl20. Panašu, kad sutrumpintas gpl20, kuris sudaro daugiau nei 90% išorinio ŽIV-1 glikoproteino, turi apsauginių determinančių. Tai, kad AIDS teigiami žmogaus serumai turi mažai antikūnų prieš ši, apvalkalo regioną, atitinka faktą, jog imuninis atsakas nevisiškai apsaugo nuo virusinių infekcijų, o teigiami žmonių serumai paprastai rodo žemą neutralizuojančio aktyvumo lygi, in vitro.
[0106] Priešingai, rėzus beždžionių, imunizuotų arba imunogenu gpl60, arba sutrumpintu gpl20, serumuose yra antikūnų, reaguojančių tik su ŽIV-1 apvalkalo sutrumpinta gpl20 dalimi. Gali būti, kad tokie antikūnų atpažinimo saitų pasiskirstymo viruso apvalkale skirtumai ir aukštesni titrai, stebėti beždžionėse, yra aukštų neutralizuojančių titrų beždžionių serumuose priežastis.
[0107] Kiekybinis šių trijų rekombinantinių apvalkalo antigenų imuninio reaktyvumo žmogaus ir imunizuotų rėzus beždžionių serumas įvertinamas yra parodytas 7 fig. Visi testuoti beždžionių serumai, tarp jų ir gyvūnų, imunizuotų gpl60, turėjo aukštą antikūnų prieš sutrumpintą gpl20 titrą (gpl20-delta).
[0108] Šie rezultatai rodo, kad rekombinantinis gpl60 sukelia imunini, atsaką rėzus beždžionėse. Šis atsakas skiriasi nuo to, kuris paprastai atsiranda natūralių infekcijų metu. Baltymo gpl60 regione gpl20-delta yra epitopai, kurie efektyviai atpažįstami imunizuotose beždžionėse ir kurie nebuvo pastebėti žmogaus imuninėje sistemoje infekcijos metu. Šie nauji epitopai gali būti reikalingi apsisaugojimui nuo ŽIV-1 ir turėtų būti svarbi rekombinantinio gpl60 savybė, tinkama ŽIV-1 infekcijos profilaktikai bei gydymui.
[0109] Skiepijimo klonuotu ŽIV gpl60 (susintetintu bakuloviruso sistemoje pagal aukščiau aprašytą schemą) poveikis ŽIV užkrėstiems asmenims, buvo studijuojamas klinikinių bandymų su 30 pacientų, turinčių teigiamus ŽIV serumus, metu.
[0110] Skiepijimas rekombinantiniu gpl60 sukėlė gpl60 ŽIV-specifinio humoralinio ir ląstelinio imuninio atsako sustiprėjimą 19-oje iš 30 (63%) ŽIV-1 savanorių, kurių serumai buvo teigiami ŽIV. Keturiolikai iš 15 (93%) savanorių, kuriems buvo suleistos 6 vakcinos dozės, padidėjo bendras antikūnų prieš gpl60 kiekis. Todėl rekombinantiniai ŽIV baltymai (t.y. rgp41, rgpl20, rgpl60 ir jų priedai) gali būti sėkmingai naudojami pacientų, užkrėstų ŽIV, gydymui.
[0111] Efektyvius ŽIV-1 baltymo kiekius, taikytus šioje išradimo schemoje, galima nustatyti tradiciniais metodais, aprašytais žemiau. Apskritai, šie efektyvūs kiekiai gali kisti tarp apytiksliai 1 mikrogramo ir apytiksliai 100 mikrogramų vienam paciento svorio kilogramui. Vartojimo dažnumą irgi galima nustatyti tradicinėmis priemonėmis. Labiausiai tinkamas vartojimo būdas - parenteralus, t.y. leidžiama j, veną, pilvaplėvę, raumenis, po oda ir t.t., kas gerai žinoma turintiems patirti, šioje srityje.
[0112] Buvo atrinkta trisdešimt savanorių, užkrėstų ŽIV. Registruojami buvo tik tie asmenys, kurių serumas buvo teigiamas ir diagnozuota ankstyva ŽIV infekcijos stadija, vadinama Walter Reed Stage 1 arba 2 (daugiau nei 3 mėnesius CD4 ląstelių kiekis ne mažesnis nei 400: su arba be limfadenopati jos) . (Redfield, et al., New Eng. J. Med. 314: 131-132 (1986). Pagal papildomus kriterijus buvo atrinkti 18-50 metų amžiaus suaugę savanoriai, turintys normalią kraujo formulę, be akivaizdžių pagrindinių organų ligų, nepiknaudžiavę alkoholiu bei narkotikais pastaruosius 12 mėnesių ir nevartoję antiretrovirusinių bei imunomoduliuoj ančių vaistų. Prieš atsitiktiniu būdu paskirstant i, gydomąsias grupes, visų pacientų būklė buvo vertinama 2 mėnesius. Bandymo metu nei vienas savanoris negavo jokių antiretrovirusinių ar imunomoduliuoj ančių vaistų.
[0113] Iš 30 savanorių dvidešimt šeši buvo vyrai, 4 - moterys. Tarp jų buvo keturiolika kaukaziečių, 13 juodaodžių ir 3 ispanų rasės atstovai. Vidutinis amžius 29 metai (intervalas 18-24). Registracijos pradžioje
[0114] 8 savanoriams buvo diagnozuota Walter Reed Stage 1 ir 22 - Walter Reed Stage 2. Pradinis vidutinis CD4 kiekis buvo 668 (intervalas 388-1639). Vidutinis laiko tarpas tarp pradinės diagnozės ir studijų pradžios buvo 24 mėnesiai (intervalas - nuo 3 iki 49 mėnesių).
[0115] Šiame dokumente aprašytą, bandomąją vakciną sudaro neinfekcinis subvienetinis glikoproteinas, kilęs iš gpl60 - bakuloviruse ekspresuojamo rekombinantinio baltymo. Imunogeninis baltymas buvo susintetintas Lepidoptera vabzdžių ląstelėse, išgrynintas biocheminiais būdais ir adsorbuotas prie aliuminio fosfato. Taip buvo gauta galutinė vakcinos forma.
[0116] Buvo naudotos trys gpl60 dozės: 40 mikrogramų mililitrui, 160 mikrogramų mililitrui ir 320 mikrogramų mililitrui. Injekcijos tūris buvo 1 ml tiek 40 [iq, tiek 160 (ig dozėms; (320 (.ig/mililitrui) 640 |ig dozės injekcijoms buvo naudojamos 2 ml tūris.
[0117] Trisdešimt savanoriu buvo suskirstyti i, šešias grupes po penkis savanorius kiekvienoje grupėje. Imunizacijos buvo atliekamos pagal tokias schemas: schema A, kur skiepijimą 0, 30 ir 120 dienomis; ir schema B, kur skiepijama 0, 30, 60, 120, 150 ir 180 dienomis. Skiepijant pagal abi imunizacijos schemas (A ar B), buvo sudarytos trys grupės, kuriose pacientai gaudavo skirtingas vakcinos dozes (7 lentelė). Skiepijama buvo i, trikampius raumenis. Tyrimai truko 10 mėnesių: 2 mėnesius - pradinis įvertinimas ir 8 mėnesius stebėjimai po pirminio paskiepijimo.
[0118] 7 LENTELĖ - iraunizacijos schema
[0119] Suleisto gpl60 kiekis (|ig)
[0120]
[0121] Visi savanoriai buvo apklausti ir ištirti 0, 1, 2, 3, 15 ir 30 dienomis po kiekvienos injekcijos. Savanorių buvo teiraujamasi dėl karščiavimo, peršalimo, šleikštulio, pykinimo, artralgijos (sąnarių skausmų), mialgijos (raumenų skausmų), negalavimų, dilgėlinės, dusulio, galvos svaigulio ar galvos skausmo. Vietinės reakcijos vaistų suleidimo vietoje buvo vertinamos pagal eritemą, patinimą, niežuli,, skausmą ir padidintą jautrumą, odos spalvos pakitimą, odos sutrūkimą, regioninės 1 imf adenopat i j os pakitimus, galūnės, i, kurią buvo injekuota, funkcijos pakitimus, poodinių mazgelinių sustorėjimų atsiradimą injekcijos vietoje. Be to, kas mėnesį buvo vertinama pilna kraujo formulė, serumo cheminiai parametrai, kraujo krešėjimo greitis, atliekama šlapimo analizė.
[0122] Ląstelių imuninė funkcija in vitro buvo įvertinta, fenotipuoj ant T-ląsteles (bendrus limfocitus, CD4 ir CD8 ląstelių fenotipus) pagal Rickman, et al., Clinical Inununo. 52: 85-95, 1989; Birx, et al., J. Acguir. Immune Defic. Syndr. 4:188-196, (1991). T-ląstelių dau-ginimasis, sukeltas mitogenų (amerikietiškoj i fitolaka ir Con A) bei kontrolinių antigenų ( Candida albicans ir stabligės), irgi buvo įvertinatas. Birx et al., supra. Ląstelių imuninė funkcija in vivo buvo į-vertinta sulėtinto hipersensityvumo odos testais prieš kontrolinius antigenus ( t. y. kiaulytės virusas, stabligės toksoidas, Candida albicans ir trichofitonas).
[0123] Periferinio kraujo vienbranduolės ląstelės (PKVL) ir plazmos virusinės kultūros buvo kiekybiškai įvertintos pagal Burke, et al., J. Acguir. Immune Defic. Syndr. 3: 1159-1167, 1991. DNR polimerazinė grandininė reakcija (Wages, et al., J. Med. Virol. 33: 58-63, 1991) ir p24 antigeno lygis serume buvo nustatyti tam, kad būtų galima įvertinti ŽIV viruso kiekį in vivo.
[0124] Nebuvo pastebėta ryškaus sistemos toksiškumo, bet vietinės reakcijos buvo konstatuotos 87 procentams pacientų (13 kiekvienoje skiepytoje grupėje). Vietinės reakcijos apėmė sukietėjimus, padidintą jautrumą, ir laikinų poodinių mazgelių atsiradimą injekcijos vietoje; regioninės adenopatijos sustiprėjimas buvo retas. Nei vienas asmuo neatsisakė nuo pakartotinų injekcijų. Vietinių reakcijų dažnumas nepriklausė nuo pirminės imunizacijos, papildomų injekcijų ir dozavimo.
[0125] Aiškių pašalinių poveikių imuninei sistemai nebuvo konstatuota, nei in vitro matuojant mitogeno ir antigeno specifinius proliferacinius atsakus, nei - in vivo sulėtinto hiperjautrumo odos reakcijoje ar pagreitėjusiame CD4 tipo ląstelių pašalinime. Pirminis vidutinis CD4 ląstelių kiekis buvo 716 ir 605, atitinkamai. CD4 ląstelių kiekio vidurkis jautriuose ir nejautriuose vakcinai asmenyse paskaičiuotas 180-240 dienomis buvo 714 ir 561, atitinkamai. Per 240-ies dienų eksperimentą grynas CD4 ląstelių kiekio vidurkio pokytis buvo minus 0.2 procentai vakcinai jautriuose pacientuose, tuo tarpu nejautriuose CD4 ląstelių kiekio vidurkis sumažėjo 7.3 procentais (11 fig.). Viso bandymo kurso metu nei viename atskirame atvejyje vakcinos sukeltas imunogeniškumas prieš ŽIV nepriklausė nuo pagreitėjusio CD4 tipo ląstelių pašalinimo. ŽIV viruso replikacijos ir viruso susikaupimo galimybės vertinimui po paskiepijimo buvo išmatuotas virusinis aktyvumas, kiekybiškai įvertinus plazmą ir PKLV virusines kultūras, PKLV DNR amplifikavimą polimera-zinės grandininės reakcijos būdu ir p24 antigeno lygį serume. Kiekybinė kultūrų ir DNR amplifikacijos polimerazės grandininės reakcijos analizė neparodė jokių pakitimų viso bandymo metu. Antigenas p24 nebuvo surastas šių asmenų serume.
[0126] Antikūnai prieš bendrus ŽIV baltymus buvo išmatuoti naudojant ir rekombinantiniu būdu pagamintus viruso geno produktus gpl60, p66, p24 ir bendrą prototipinio ŽIV štamo MN virusinį lizatą. Dot blot'as ir Western blot'as buvo atliekami pagal Toubin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76; 4350-4354 (1979) . Be to, buvo išmatuoti imuniniai atsakai į specifinius apvalkalo epitopus (žr. fig. 7).
[0127] Fig. 7 buvo atrinkti epitopai 88 (amino rūgštys 88-89 baltyme gpl20) ir 448C (amino rūgštys 448-514 baltyme gpl20), kadangi yra duomenų, jog antikūnai prieš šiuos gpl20 regionus turi savitarpio ryšį su ankstyvąja ŽIV infekcijos stadija.
[0128] Epitopai 106 (aminorūgštys 106-121 baltyme gpl20), 241 (aminorūgštys 241-272), 254 (aminorūgštys 254-272), 300 (aminorūgštys 300-340), 308 (aminorūgštys 308-322), 422 (aminorūgštys 422-454) ir 735 (aminorūgštys 735-752) buvo atrinkti dėl jų spėjamos funkcinės svarbos. Epitopai 106 ir 422 dalyvavo CD4 prijungime; epitopai 241, 254 ir 735 dalyvavo grupių specifinėje neutralizacijoje, o epitopai 300 ir 308 dalyvavo tipų speci-finėje neutralizacijoje.
[0129] Epitopas 582 (aminorūgštys 582-602) buvo pasirinktas kontroliniu, kadangi jis atstovauja imunodominuojantį apvalkalo domeną natūralioje ŽIV infekcijoje. Papildomai buvo ištirti 49 (aminorūgštys 49-128) ir 342 (aminorūgštys 342-405) epitopai.
[0130] Fig. 7a taškuoti kvadratėliai rodo imuninio atsako, nukreipto į ŽIV apvalkalą, dokumentais patvirtintą pokytį. Kvadratėliai su (-) žymi pirminį humoralinį atsaką; taškuotas kvadratėlis su (+) žymi antrinį humoralinį atsaką; (-) žymi antikūnus, nesąveikau-jančius su specifiniais epitopais nei prieš, nei po imunizacijos; (+) žymi antikūnus sąveikaujančius su specifiniais epitopais prieš imunizaciją ir po jos, bet be kiekybinių pakitimų. Taškuose stulpelis su (.) žymi naują T-ląstelių proliferacinį atsaką į imunizaciją gpl60. Vienas (.) žymi imuninio atsako į gpl60 nebuvimą tuo tarpu hb žymi "high background" (neįmanoma interpretuoti); nd žymi "not done" (nepadaryta).
[0131] Neutralizacijos aktyvumas buvo matuojamas prieš tris prototipinius izoliatus (ŽIV-IIIB, RF ir MN) , analizuojant sincitijų inhibiciją pagal Nara, Nature, 333: 469-470 (1988). ŽIV specifinis ląstelinis atsakas buvo išmatuotas įprasta limfocitų proliferacinės analizės technika, naudojant gpl60, p24 ir bakuloviruso ekspresinės sistemos kontrolinius baltymus (Birx, supra) .
[0132] Individai buvo laikomi jautriais vakcinai tik tuomet, jei atsikartojantis selektyvus ląstelinio bei humoralinio imuninio atsako i, ŽIV apvalkalo specifinius epitopus sustiprėjimas priklausė nuo skiepijimo serijų
[0133] (7 fig.). Vakcinos sukeltas humoralinis imunitetas buvo apibrėžtas kaip serokonversij a prieš ŽIV apvalkalo specifinius epitopus ir/ar antrinis pastiprinantis imuninis atsakas prieš specifinius apvalkalo epitopus. Vakcinos sukeltas ląstelinis imunitetas buvo apibrėžtas kaip naujo, atsikartojančio, vakcinos sukelto proliferacinio atsako i, gpl60, atsiradimas 9. Vakcinai nejautriais asmenimis buvo laikomi tie asmenys, kuriuose neatsirado nei humoralinio, nei ląstelinio proliferacinio atsako, arba išsivystė vien tik humoralinis ar vien tik ląstelinis proliferacinis atsakas i, gpl60 epitopus ar ŽIV apvalkalą.
[0134] Remiantis fig. 7, 19 iš 30 asmenų (63 procentai) buvo stebimas vakcinos sukeltas specifinio humoralinio bei ląstelinio imuninio atsako i, gpl60 ŽIV sustiprėjimas. Šie 19 individų buvo laikomi "jautriais vakcinai". Keturiems iš 11 vakcinai nejautrių asmenų atsirado vien tik humoralinis arba vien tik ląstelinis imuninis atsakas. Visi 7 asmenys, kuriuose nepavyko aptikti jokių vakcinos sukeltų atsakų, buvo gavę tik 3 dozes
[0135] Toks vakcinai jautraus individo apibrėžimas yra labai ribotas šio bandymo mokslinių tikslų šviesoje: pvz., įvertinti imunizacijos po užkrėtimo pagrįstumą.
[0136] (Schema A). Nebuvo rasta pokyčių antikūnams jungiantis prie ŽIV polimerazės (p66), nei struktūriniuose (p24) genų produktuose ar ne-ŽIV kontroliniame stabligės antigene. Nei vieno individo organizme nesusidarė antikūnų prieš bakuloviruso- Lepidoptera sistemos baltymus.
[0137] Apvalkalo baltymų (gpl60) kiekio padidėjimas buvo rastas 13 individų Western blot'o analizės metodu, naudojant bendrą viruso lizatą ŽIV-MN. Pakitimai priklausė nuo imunizacijos schemos. Trys iš 15 individų
[0138] (20 procentų) buvo skiepyti pagal schemą A, o 10 iš 15 individų (67 procentai) - pagal schemą B. Skiepijant pagal schemą B, išaugo antikūnų prieš apvalkalo baltymus kiekis (P=0.025 pagal tikslų Fišerio testą, dviejų sigmų taisyklė). Visi 13 individų irgi serokonvertavo prieš specifinius apvalkalo epitopus.
[0139] Priešingai, iš 10 asmenų, kuriems nepavyko serokonver-tuoti nei prieš vieną specifini, apvalkalo epitopą, nė viename nebuvo pastebėtas padidėjęs apvalkalo baltymų kiekis, analizuojant Western blot'u. Kiti 7 individai, kurie serokonvertavo prieš specifinius apvalkalo epitopus, neparodė pakitimų bendruose antikūnuose prieš viruso apvalkalą, analizuojant Western blot'u. Antikūnai, nukreipti prieš neapvalkalinius ŽIV baltymus, nebuvo pakitę nei vieno individo organizme.
[0140] Keturiolikai iš 15 individų (93 procentai), skiepytų pagal schemą B (6 dozės), padidėjo bendras antikūnų prieš gpl60 kiekis. Tuo tarpu grupėje, gydytoje pagal schemą A (3 dozės) tokie buvo tik 7 iš 15 asmenų
[0141] (47 procentai) (P=0.01 pagal Fišerio testą, dviejų sigmų taisyklė) (7 fig.).
[0142] Iš 8 fig. matyti, kad laiko tarpe nuo prieš imunizacijos iki po paskiepijimo kiekvieno gpl60 specifinio epitopo pasiskirstymas buvo toks: epitopas 49 (27 - 70 procentų), epitopas 88 (28 - 52 procentai), epitopas 106 (50 - 87 procentai), epitopas 214 (0 - 14 procentų) , epitopas 254 (0 -
[0143] 13 procentų), epitopas 300 (47 - 77 procentai), epitopas 308 (42 - 69 procentai), epitopas 342 (0 - 27 procentai), epitopas 422 (3 - 10 procentų), epitopas 448C (73 - 87 procentai) ir epitopas 735 (17 - 30 procentų). Vakcinos sukelta serokonversij a buvo nukreipta prieš visus specifinius epitopus, išskyrus epitopą 582 (7 fig.). Antikūnai (serekonversija) nukreipti prieš epitopus 241, 254 ar 342, buvo aptikti tik po kito skiepijimo.
[0144] Antrinis imuninis atsakas buvo nukreiptas prieš tokius epitopus: 88, 106, 300, 448C ir 582. Prieš skiepijimą antikūnų prieš epitopą 582 paplitimas buvo 100 procentų ir tik vienam individui (3 procentai) buvo stebimas antrinis imuninis atsakas.
[0145] Vakcinos indukuotų antikūnų prieš ŽIV apvalkalo epitopus skalė įvairavo (fig. 7) . Pirminis imuninis atsakas (serokonversija) bent prieš vieną epitopą atsirado 20 individų; 14 iš 15 gydytų pagal schemą B ir 6 iš 15, kuriems atsitiktiniu būdu buvo parinkta schema A (P=0.005 Fišerio testas, 2-jų sigmų taisyklė). Individai, gydyti pagal schemą A, serokonvertavo tik prieš 15 iš 110 (14 procentų) galimų epitopų, prieš kuriuos jie neturėjo priešimunizacinių antikūnų. Individai, gydyti pagal schemą B, serokonvertavo prieš 60 iš 129 (47 procentai) (p<0.0001 Fišerio testas, 2-jų sigmų taisyklė) epitopų. Serokonversija prieš tris ar daugiau apvalkalo epitopų įvyko 9 individams (60 procentų), gydytiems pagal schemą B ir tik 2 asmenims (13 procentų), gydytiems pagal schemą A (p=0.02 Fišerio 2-jų sigmų taisyklė).
[0146] Serumo neutralizuojantis aktyvumas prieš tris skirtingus štamus ( ŽIV- IIIB, MN ir RF) buvo konstatuotas 7 asmenyse 0, 90 ir 195 dienomis. Keturiems iš 5 vakcinai jautrių individų didėjo neutralizuojantis aktyvumas prieš vieną ar daugiau izoliatų. Be to, vakcinai jautrūs individai geriau inhibavo sincitijų formavimąsi,, nei vakcinai nejautrūs individai.
[0147] Pakitimai ląsteliniame imuniniame atsake buvo nustatomi, lyginant vidutinį limfocitų stimuliacijos indeksą ( LSI) prieš skiepijimą ( pradinis) ir po skiepijimo Wilcoxon' o eilės sumavimo metodu.
[0148] Dvidešimt vienam iš 30 individų ( 70 procentų) atsirado naujas T ląstelių proliferacinis atsakas i, gpl60 post-imunizaciją ( 7 fig.). Fig. 9 iliustruoja proliferacinius atsakus i, gpl60, p24 ir bakuloviruso kontrolės baltymą keturiems tipiškiems vakcinai jautriems individams, bėgant laikui. Visiems individams gpl60 sukelta proliferacija išaugo nuo pradinio vidutinio LSI lygaus 3 iki LSI lygaus 10 ( paskaičiuota pagal vidurkį, gautą iš 4 reikšmių po paskutinės imunizacijos) . Priešingai, nebuvo pastebėta proliferacinių atsakų, nukreiptų į ŽIV p24 baltymą ar i, kontrolini bakuloviruso baltymą. Fig. 10. rodo vakcinos sukeltus vidutinių LSI reikšmių pakitimus visiems individams, bei individams, sugrupuotiems pagal jautrumą vakcinai ir pagal imunizacijos schemą.
[0149] Vakcinai jautrių ir nejautrių individų proliferacinio atsako i gpl60 pakitimai aiškiai skyrėsi ( <0. 001, Wilcoxon, vienos sigmos taisyklė). Proliferacinis individų, gydytų pagal schemą B ( 6 dozės), atsakas i, gpl60, buvo stipresnis nei individų, gydytų pagal schemą A ( 3 dozės) ( P<0. 10, Wilcoxon, vienos sigmos taisyklė).
[0150] Devyniolikai iš 21 individo, kuriuose atsirado proliferacinis atsakas i, gpl60, pastebėtas ir humoralinis atsakas ( vakcinai jautrūs individai). Visų vakcinai jautrių individų maksimalus vidutinis limfocitų stimuliacijos indeksas ( LST) į gpl60 buvo 50. 1. Vis dėl to visi vakcinai jautrių individų atsakai buvo variabilūs ( LSI reikšmės kito intervale nuo 3 iki 171)
[0151] ( fig. 7) . Taip pat variabilūs yra laikinas santykis tarp ląstelinio atsako i gpl60 dydžio bei trukmės ( fig.
[0152] Nepaisant ribotos šio bandymo apimties, buvo parodyta, kad keliolika faktorių siejasi su vakcinos imunogeniškumu. Šeši iš 15 ( 40 procentų) individų, gydytų pagal schemą A, lyginant su 13 iš 15, gydytų pagal schemą B, buvo jautrūs vakcinai ( P=0. 02 Fisher' io testas, 2- jų sigmų taisyklė) ( pav. 7). 13 iš 16 individų ( procentais), kuriuose vidutinis pradinis CD4 kiekis buvo didesnis nei 600 viename mililitre, buvo jautrūs vakcinai, tuo tarpu 6 iš 14 ( 43 procentai) individų, kuriems vidutinis pradinis CD4 kiekis buvo mažesnis nei 600/ mililitrui ( p=0. 07 Fisher' io. dvi sigmos) buvo nejautrūs vakcinai. Lentelėje 8 reziu-muojama, kad daugkartinės imunizacijos pagerino imunogeniškumą net tiems pacientams, kurių vidutinis pradinis CD4 kiekis buvo mažesnis nei 600/ mililitrui. Pavyzdžiui, 5 iš 6 individų, imunizuotų pagal schemą B ( 6 injekcijos) buvo jautrūs vakcinai, lyginant su 1 iš 8, gydytų pagal trijų injekcijų režimą ( schema A)
[0153] 8 LENTELĖ Imuninis atsakas i, gpl60 vakciną pagal pradini, CD4 kieki, ir imunizacijos schemą
[0154] Gydymui vakcinas 19-tame amžiuje pradėjo naudoti Pasteras. Jis taikė vakciną ūmios pasiutligės infekcijos gydymui. Tačiau vakcinų tinkamumas kitų infekcijų gydymui nebuvo plačiai tyrinėjimas. Nors yra virusinio specifinio imuniteto postinfekcinės modifi-kacijos pavyzdžių (po Hepatito A ir B), deja, nėra atliktų ir tinkamai dokumentais patvirtintų tyrimų, kurie parodytų, kad tikslinga vakcinas taikyti žmogaus ūmių ar lėtinių virusinių infekcijų gydymui.
[0155] Aktyviai imunizuojant po užsikrėtimo pagal šį išradimą atsiranda virusinė-specifinė imuninė modifikacija. Iš ŽIV apvalkalo geno kilusi gpl60 vakcina sustiprino žmogaus virusini, specifini, humoralini, ir ląstelini, atsakus 19 iš 30 asmenų, kuriems diagnozuota ankstyva ŽIV stadija.
[0156] Šiame darbe buvo kokybiškai lyginami skirtingi imuniniai atsakai i, specifinius ŽIV epitopus natūralioje infekcijoje ir imunizavus po užsikrėtimo. Tuo būdu, tiksliai nustačius vakcinos sukeltą humoralini, imunogeniškumą jau užkrėstuose individuose, buvo dokumentais patvirtinta, kad jis atsirado 70 procentų individų. Pavyzdžiui, dvidešimt individų
[0157] (19 jautrių vakcinai ir 1 nejautrus) serokonvertavo prieš specifinius apvalkalo epitopus. Serokonversij a, priklausanti tik nuo skiepijimo (epitopai 241, 254 ir 342), buvo patebėta 10 individų.
[0158] Be to, humoralinio atsako i, šią vakciną variacijos, nustatytos identifikuojant epitopus, atvers pers-pektyvas tolimesnei eigai ir efektyviai specifinio imuninio atsako analizei bei sudarys unikalias prielaidas galimų imunoreguliatorinių mechanizmų, nesukeliamų natūralios infekcijos metu, charakteri-zavimui.
[0159] Nors serumo neutralizuojančio aktyvumo svarba in vivo kol kas nežinoma, 4 iš 5 vakcinai jautrių individų pastebėtas padidėjęs neutralizuojantis aktyvumas prieš skirtingus ŽIV štamus (IIIB, RF, MN) pasiūlė prielaidą, kad poinfekcinė imunizacija sukėlė pakitimus funkciniuose antikūnuose. Bandomoji vakcina sukėlė serumo neutralizuojančio pajėgumo prieš skirtingus ŽIV štamus padidėjimą ir, matyt, padės nustatyti grupinius specifinius neutralizuojančius epitopus.
[0160] Proliferacinis atsakas i, ŽIV apvalkalo baltymus natūralios ŽIV infekcijos atveju kyla retai. Tačiau po imunizacijos gpl60, specifinis T- ląstelių proliferacinis atsakas buvo užregistruotas 21 ( 70 procentų) individų. Tokio skirtumo priežastis nėra aiški. Viena galima priežastis yra tai, kad naujas proliferacinis atsakas gali būti nukreiptas prieš apvalkalo epitopą
[0161] ( us), kurie yra unikalūs šiai vakcinai ( vakcinos gamybos metodologijos ar alternatyvaus antigeno procesingo in vivo rezultatas). Priešingai, baltymas, naudotas proliferacijos analizėje, negali stimuliuoti pirminio T- ląstelių proliferacinio atsako i, homologinius natūralaus viruso " laukinio tipo" apvalkalus. Tačiau buvo gauti papildomi įrodymai, kad vakcina sustiprina ląstelini, imunini, atsaką: atrinktuose vakcinai jautriuose individuose kilo tipų specifiniai citoksiniai T- ląstelių atsakai i, ŽIV- IIIB po stiprinančios imunizacijos.
[0162] Faktoriai, lemiantys imunini, jautrumą vakcinai ŽIV užkrėstuose individuose, ir toliau turi būti tiriami. Net ankstyvoje ŽIV infekcijos stadijoje individai prasčiau reaguoja j, įvairias vakcinas, lyginant su kontrole. Toks žemas jautrumas siejamas su ankstyvu B ląstelių išsigimimu ir T ląstelių funkciniais sutrikimais. Čia jautrumas vakcinai buvo susietas su pradiniu CD4 ląstelių kiekiu, kuris atitinka hipotezę, kad imunologinė šeimininko būklė yra svarbi determinantė, sąlygojanti jautrumą vakcinai. Tačiau imunizacijos schema ( pagal specifini, T ląstelių kiekio intervalą) irgi turėjo įtakos jautrumui vakcinai: schema B ( 6 injekcijos) buvo pranašesnė. Iš tiesų, sumažėjęs jautrumas vakcinai, stebėtas individams, turintiems mažesni, CD4 ląstelių kieki,, gali būti sustiprintas, padidinus skiepijimų skaičių. Iš to galima padaryti prielaidą, kad toliau keičiant dozavimą, režimą, adjuvantus ar vaistinę formą galima tikėtis imuninio jautrumo sustiprėjimo. Nors ir buvo susirūpinta, ar saugu ŽIV specifiniais vakcinos produktais aktyviai imunizuoti asmenis, užkrėstus ŽIV, imuninis specifinis toksiškumas nebuvo įrodytas. Kiekybinė kultūros, grandininės polimerazinės DNR reakcijos ir serumo antigeno analizė parodė padidėjusi, ŽIV kieki, in vivo. Puikus ŽIV replikacijos in vivo markeris, CD4 ląstelių mažėjimo rodiklis, tinkamai pakito pacientų organizme, ypač tų, kurie laikomi jautriais vakcinai. Vidutinis CD4 ląstelių kiekio pakitimas buvo -0.2 procentai vakcinai jautriems individams ir -7.3 procentai - nejautriems. Duomenys parodė, kad imuninis jautrumas po užsikrėtimo nebuvo susijęs su padidėjusia CD4 ląstelių destrukcija. Buvo padaryta prielaida, kad tai siejasi su padidėjusia HIV replikacija in vivo.
[0163] Šiose stadijose skiepijimo rezultatai taip pat buvo lyginami su pradiniais duomenimis, gautais iš dešimties užsikrėtusių ir negydytų asmenų, sugrupuotų pagal amžių, etninę grupę ir pradini, CD4 ląstelių skaičių. Vidutinis CD4 ląstelių kiekis šioje tyrimų grupėje sumažėjo 8.7 procentais, individuose, gydytuose pagal schemą A sumažėjo 7.2 procentais ir individuose, gydytuose pagal schemą B išaugo 0.6 procentais. Šie rezultatai rodo, kad skiepijimas rekombinantiniu ŽIV apvalkalo po užsikrėtimo yra galimas. Gauti rezultatai teikia vilčių, kad tokias vakcinas galima naudoti profilaktikoje.
[0164] Vakcina prieš įgytą imunodeficito sindromą (AIDS), turinti 1 tipo žmogaus imunodeficito viruso (ŽIV-1) apvalkalo baltymus yra kilusi iš ŽIV-1 apvalkalo geno, klonuoto bakuloviruso-vabzdžių ląstelės vektorinėje sistemoje. Rekombinantiniai ŽIV baltymai yra išgryninti, surinkti i, daleles ir adsorbuoti ant aliuminio fosfato adjuvanto. Gauta adsorbuoto rekombinantinio ŽIV- 1 viruso apvalkalo baltymo forma ( vakcina prieš AIDS) yra labai imunogeniška gyvūnams ir skatina antikūnų, prisijungiančių prie ŽIV- 1 viruso apvalkalo, gamybą, o taip pat neutralizuoja užkrėtimą virusu testuose in vitro . Aukščiau aprašyta vakcina prieš AIDS sukelia naujus humoralinius ir ląstelinius imuninius atsakus ŽIV- užkrėstuose pacientuose ir yra naudinga, kaip gydomoji vakcina, skirta imuninės sistemos irimui išvengti arba j i, sulėtinti.
1. Kompozicija, tinkama taikyti farmacijoje individų, užkrėstų žmogaus imunodeficito virusu (ŽIV) gydymui, besiskirianti tuo, kad i, jos sudėti, įeina:rekombinantinis ŽIV apvalkalo baltymas, kurio kiekis pakankamas ŽIV-specifinio ląstelinio ar imuninio humoralinio atsako padidinimui.
rekombinantinis ŽIV apvalkalo baltymas, kurio kiekis pakankamas ŽIV-specifinio ląstelinio ar imuninio humoralinio atsako padidinimui.2. Kompozicija pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad rekombinantinis baltymas yra gaminamas bakuloviruso-vabzdžių ląstelės ekspresinėje sistemoje.
3. Kombinacija pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad rekombinantinis baltymas yra apytiksliai 145000 molekulinio svorio.
4. Kompozicija pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad ŽIV apvalkalo baltymas yra bent vienas iš gpl60, gpl20 ir gp41.
5. Kompozicija pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad rekombinantinis baltymas yra ekspresuo-jamas bakuloviruso vabzdžių ląstelės vektoriumi Ac3046.
6. Kompozicija pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad rekombinantinis baltymas yra aglome-ruojamas i, daleles, kurių molekulinis svoris mažiausiai apytiksliai 2000000.
7. Kompozicija pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad rekombinantinis baltymas jungiamas prie adjuvanto.
8. Kompozicija, tinkama užkrėstų žmogaus imunodeficito virusu (ŽIV) gydymui, besiskirianti tuo, kad į jos sudėti, įeina rekombinantinis ŽIV apvalkalo baltymas ir alumo adjuvantas, kai rekombinantinis baltymas sudaro daleles, kurių molekulinis svoris mažiausiai yra apytiksliai 2000000.
9. Kompozicija pagal 8 punktą, besiskirianti tuo, kad rekombinantinis baltymas yra gaminamas bakuloviruso-vabzdžių ląstelės ekspresinėje sistemoje.
10. Kompozicija pagal 8 punktą, besiskirianti tuo, kad rekombinantinis baltymas yra atrenkamas iš grupės, susidedančios iš rekombinantinio gpl60, rekombinantinio gpl20, rekombinantinio gp41, rekombinantinio ŽIV apvalkalo baltymo, kurio molekulinis svoris apytiksliai 145000 ir rekombinantinio baltymo, ekspresuoto vektoriuje Ac3046.
11. Kompozicija pagal 8 punktą, besiskirianti tuo, kad rekombinantinis baltymas sudarytas iš apytiksliai 757 gpl60 viena po kitos einančių aminorūgščių ir kuriame visiškai pašalinta apytiksliai 40 viena po kitos einančių galinių aminorūgščių.
12. Terapinė vakcinos prieš ŽIV kompozicija, besiskirianti tuo, kad i, jos sudėti, i,eina rekombinantinis ŽIV apvalkalo baltymas ir alumo adjuvantas, kai rekombinantinis baltymas yra aglomeruo j amas i, daleles, kurių molekulinis svoris mažiausiai apytiksliai 2000000.
13. Kompozicija pagal 12 punktą, besiskirianti tuo, kad rekombinantinio ŽIV apvalkalo baltymo kiekis yra apytiksliai nuo 10 pg iki 4000 ųg dozėje.
14. Kompozicija pagal 13 punktą, besiskirianti tuo, kad rekombinantinis baltymas yra gaminamas bakuloviruso- vabzdžių ląstelės ekspresinėje sistemoje.
15. Kompozicija pagal 13 punktą, besiskirianti tuo, kad rekombinantinis baltymas sudarytas iš apytiksliai 757 gpl60 viena po kitos einančių aminorūgščių, gpl60 baltymas nutrauktas apytiksliai 757 pozicijoje, ir jame visiškai nėra bent 40 gpl60 galinių aminorūgščių.