[LT] Išradimas aprašo naują mikrobiologinį būdą, skirtą gaminti azotą turinčias hidroksi-heterociklines karbonines rūgštis arba jų tirpias druskas pradedant nuo atitinkamų azotą turinčių heterociklinių karboninių rūgščių, bei naujus šiam būdui tinkamus mikroorganizmus.
[EN]
[0001] Išradime aprašomas naujas mikrobiologinis būdas, skirtas gaminti azotą turinčias hidroksiheterociklines karbonines rūgštis arba jų tirpias druskas, kuriu bendroji formulė
[0002]
[0003] pradedant nuo atitinkamų azotą turinčių heterociklinių karboninių rūgščių, bei šiam būdui tinkami nauji mikroorganizmai. ;
[0004] Azoto turinčiomis heterociklinėmis karboninėmis rūgštimis, kurios gali būti hidroksilintos ar nehidroksilintos, taip pat laikomos ir jų tirpios. druskos, pavyzdžiui, šarminės arba amonio druskos.
[0005] Azoto turinčios 2-hidroksi-heterociklinės karbonines rūgštys yra svarbūs biologiškai aktyvių medžiagų, sintezės tarpiniai produktai. Pavyzdžiui, 2-hidroksinikotino rūgštis yra pradinė medžiaga 2-chlornikotino rūgšties (US-PS 4 081 451) gamybai, kuri
[0006] yra svarbus tarpinis produktas, skirtas gaminti vaistus . (Ann. Eharm. Fr., 1980, 38 (3), 243-252) .
[0007] Ligšiol azotą turinčių hidroksi-heterociklinių karbo-ninių rūgščių mikrobiologiniai gamybos būdai nežinomi.
[0008] Šio išradimo tikslas buvo sukurti paprastą ir ekologiškai švaių mikrobiologini, būdą cheminiu požiūriu
[0009] sunkiai prieinamos azotą turinčios 2-hidrokslbete-rociklinės karbonines rūgšties gamybai.
[0010] Šis tikslas buvo pasiektas išradime aprašytu būdu pagal išradimo apibrėžties 1 punktą, naudojantis naujais mikroorganizmais pagal c išradimo apibrėžties 6 punktą.
[0011] Pagal šį išradimą šio būdo esmė yra tai, kad azotą turinti feeterociklįnė karbojoinė rūgštis* formulės
[0012]
[0013] kurioje Rx ir 12 yra tokie patys arba skirtingi ir reiškia vandenilio atomą, halogeno atomą arba Cj-C^-alkilinę grupę, o X - azoto atomą arba . CR3 funkciją, kur R3 reiškia vandenilio arba halogeno atomą,, yra 6-metilni kotino rūgštį naudo j ančių mikroorganizmų.;, turinčių specifinę hidroksilazę, substratas, kuris paverčiamas i, azotą turinčią hidr oks i - he te roc i k li nę karboninę rūgšti,, kurios bendra formulė yra
[0014] i
[0015]
[0016] Sąvoka n6-metilnikotino •rūgštį naudojantys mikroorganizmai, turintys specifinę Mdroksilazę" reiškia:.
[0017] jei pavyzdžiui, išvalytų nutekamųjų vandenų inoJculiate su 6-metilnikotino rūgštimi auginti biomasę, tai gaunami 6-raetilnikotino rūgštį naudojantys mikroorganizmai, kurie auga naudodami 6-metilnikotino rūgštį
[0018] kaip vieninteli, anglies, azoto bei energijos šaltini,. Jei pagal įprastinius, specialistų taikomus metodus selekcionuoti mikroorganizmus, kurie 6-metilnikotino rūgšti, per 2-hidroksi-6-metilnikotino visiškai suskaldo kaip tarpini, produktą, tai' gaunami mikroorganizmai, turintys specifinę hidroksilazę, t.y., mikroorganizmai, kurie hidroksilina specifini tarp rūgštinės funkcjjos ir azoto atomo esantį vieninteli, anglies atomą.
[0019] Iš esmės metodui tinka visi mikroorganizmai, kurie selekcionuojami pagal ši, principą, pavyzdžiui, iš valytų nutekamųjų vandenų arba iš dirvožemio mėginių. Šie mikroorganizmai neaprašyti literatūroje ir yra šio / išradimo sudėtinė dalis.
[0020] Šiam būdui tikslinga naudoti mikroorganizmus, žymimus Ki 101 (DSM 6920), taip pat jų palikuonis bei mutantus. Jie yra 1992. 03. 25 deponuoti firmoje Deutsche • Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg lb, D-3300 Braunschweig.
[0021] ki
[0022] Atliekant 16S rRNA sekos analizę, rūšis nebuvo nustatyta.
[0023] Šių mikroorganizmų selekcija ir auginimas, naudojant 6-metilnikotirio rūgšti, atliekama pagal . įprastus, specialistų taikomus metodus.
[0024] , t
[0025] Selekcijos metu tikslingai vyksta mikroorganizmų skriningas aerobinėmis sąlygomis.
[0026] Pirmenybė teikiama mikroorganizmų auginimui skriningo metodu ramybės būsenoje ( nepurtant).
[0027] t Selekcijos ir auginimo metu naudojamos 6- metilnikotino rūgšties kiekis yra iki 1 svorio %, labiau tinka kiekis iki 0, 5 svorio %.
[0028] Selekcija ir auginimas vyksta esant pH nuo 5 iki 9, ypač tinka reikšmės nuo 6 iki 8.
[0029] Selekcijos ir auginimo metu temperatūra turi būti tarp 15 ir 50°C, ypač tinka temperatūra tarp 25 ir 40°C.
[0030] Paprastai selekcija ir auginimas vyksta mineralinių druskų terpėje, labiau tinka tokia mineralinių druskų terpė, kurios sudėtis aprašyta lentelėje I.
[0031] Jei pasiektas tikslinis optinis tankis esant 650 nm ( OD650) nuo 0, 5 iki 100, tai mikroorganizmai gali būti surinkti arba įprastiniais specialistų naudojamais metodais, arba substratas, azoto turinti heterociklinė karboninė rūgštis, tiesiogiai pridedama prie mikroorganizmų, kad vyktų norima reakcija ( biotransformacija).
[0032] Norima biotransformacija tada vyksta pagal įprastus, specialistų taikomus metodus su neaugančiomis ląstelėmis.
[0033] Substratai, kurių bendroji formulė II, gali, pavyzdžiui, būti nikotino rūgštis, pirazinkarboninė rūgltis arba jų halogeniniai arba alkilinti Cj-Cį dariniai.
[0034] Halogenintų nikotino rūgšties arba pir-azįnd karboninės rūgšties darinių tarpe ypač tinka hidroksilinimui 6-chlor-nikotino rūgštis, 5,6-dichlor-nikotino rūgštis ir 5-chlor-pirazinkarboninė rūgštis.
[0035] C1-C4 Pirazinkarboninės rūgšties darinių ta.rpe ypač hidroksilinimui tinka 5-metilpirazinkarboninė rūgštis.
[0036] Substratas į biotransformacijos mišinį gali būti dedamas nuolatos arba vienu kartu. Tikslinga substratą dėti taip, kad jo koncentracija maitinamoje terpėje neviršytų 10 svorio %, o ypač 7 svorio %. / . Biotransformacijai naudotinos įprastinės, specialistų naudojamos terpės. Ypač tinkamas biotransformacijai žemo molingumo fosfatinis buferis.
[0037] Paprastai biotransformacija atliekama "naudojant jnikroorganizmų suspensiją, kurios optinis tankis esant
[0038] 650 nm (OD650) yra nuo 0,5 iki 100, ypač tinka optinis tankis nuo 5 iki 50.
[0039] Biotransformacija vyksta esant temperatūrai nuo 15 iki 50°C, ypač tinka temperatūra nuo 25 iki 35°C, esant pH nuo 5 iki 9, ypač tinka pH nuo 6,5 iki 7,5.
[0040] Po įprastinės transformacijos trukmės nuo 5 valandų iki 3 dienų, hidroksilintas produktas, turintis' formulę I,
[0041] gali būti išskirtas 131 kari t; įprastinius specialistų naudojamus metodus, pavyzdžiui, parūgštinant sterilų supernatantą.
[0042] Pagal ši, metodą pagamintos literatūroje neaprašytos azoto turinčios hidroksi-heterociklinės karboninės rūgštys, kurių bendra formulė yra
[0043]
[0044] kurioje, tuo atveju, kai X yra azoto atomas, ir R2 yra vienodi arba skirtingi ir gali būti vandenilis, halogėnas arba C1-C4-alkilinė . grupė, tačiau išimtį sudaro tai, kad Rx ir R2 Vienu motu • negali būti vandenilis, taip pat jei X reiškia CH funkciją, Rj ir R2 reiškia halogeno atomą.
[0045] Ypač tinkami šių naujų junginių atstovai yra 5,6-dichlor-2-hidroksi-nikotino rūgštis, 3-h.idroksi-5-metil-pirazinkarboninė rūgštis ir 3-hidroksi-5-chlor-pirazinkarboninė rūgštis.
[0046] Pavyzdys 1
[0047] Mikroorganizmų, naudojančių 6- me t il- nikotino rūgšti,, išskyrimas
[0048] 300 ml talpos Erlenmejerio kolba buvo pripildyta 100 ml mineralinių druskų terpės su 1 mmol 6-metilnikotino rūgšties (1 lentelė) ir sumaišyta su 10 ml valytų nutekamųjų vandenų, paimtų iš firmos LONZA AG Vispe, Šveicarijoj e, arba LONZA gamyklos grunto mėginiais, Vispe ir statiškai inkubuota esant 30°C temperatūrai. Po 10 dienų kai kuriuose mėginiuose spektrofotometriniu būdu buvo aptikta 2-hidroksi-6-metilnikotino rūgštis. šios kultūros vėliau buvo keletą kartų * persėtos į šviežią mineralinių druskų terpę. Po to 2-hidroksi-6-metilnikotino rūgštį gaminančių ląstelių suspensijos buvo persėtos i, tą pačią terpę, turinčią 1,6 % (s/t)
[0049] agaro. Po to agaro lėkštelės esant 30°C buvo inkubuotos atmosferoje, turinčioje 4 % 02 ir 96 % N2. Tada pavienės kolonijos perkeltos i, skystą terpę ir inkubuotos statiškoje būklėje. Bakterijų štamas, žymimas Ki101 ( DSM 6920), augimo metu 6- metil- nikotino rūgšti, pavertė 2- hidroksi- 6- metil- nikotino rūgštimi.
[0050] Nikotino rūgšties mikrobinė oksidacija i . 2 - hidroksi - nikotino rūgš t i ,
[0051] Mikroorganizmai, žymimi KilOl ( DSM 6920), buvo inkubuoti 800 ml mineralinių druskų terpėje ( lentelė I), pridedant 8 mmol 6- metil- nikotino rūgšties 1 1 talpos Fernbacho kolboje, esant 30°C temperatūrai, purtyklėje, esant 100 rpm.' Inokuliatas sudarė 5% ( t/ t) . Po 5 dienų OD6t, 0 siekė apie 0, 5. Po to ląstelės surinktos ir vieną kartą praplautos 50 molių fosfatinio buferio ( pH 7. 0).
[0052] Tada ląstelės buvo resuspenduotos 20 ml 50 mM fosfatinio buferio, esant pH 7. 0, kuriame yra 200 mg ( 1. 38 mmol) nikotino rūgšties natrio druskos. OD650 buvo lygu 20. Po 6 vai. trukusios inkubacijos purtyklėje prie 30°C, atlikus plonasluoksnę chromatografiją, nikotino rūgšties nerasta. Po to biomasė nucentri-fuguota ir supernatantas parūgštintas iki pH 2. 5, siekiant išsodinti 2- hidroksi- nikotino rūgštį.
[0053] Atlikus :H- NMR ( DUSO) analizę, išskirtame produkte nerasta priemaišų. Iš viso buvo išskirta 140 mg ( 1 mmol) 2- hidroksinikotino rūgšties, tai atitinka 72% išeigą, skaičiuojant pagal nikotino rūgšti,.
[0054] Mineralinių druskų terpės tirpalai Koncentruotas tirpalas I:
[0055] Koncentruotas tirpalas II:
[0056] Koncentruotas tirpalas III:
[0057] Koncentruotas tirpalas IV:
[0058] Koncentruotas tirpalas V:
[0059]
[0060] Po sterilizacijos pridedama
[0061] Pavyzdžiai 3 - 7 ' '? \ ?' . ? .
[0062] Pavyzdžiai 3- 7 atitinka aprašytąjį 2 pavyzdį. Apibendrinti rezultatai pateikti lentelėje 2.
[0063] Analitiniai duomenys pavyzdžiui 6:
[0064] 2.4, s; 2.6, s; 3.8, s; 7.8, s.
[0065] .. " ' v)
[0066] 20, t; 40, m; 130, s; 134, s; 155, s; 164, s; 170, s.
[0067] Analitiniai duomenys 7 pavyzdžiui:
[0068] 1H--NMR: (D20 ir dioksanas, '400 MHz) cheminiai poslinkiai (m.d.)
[0069] 3.8, s; 4.7, s; 8.0, s.
[0070] 13C-NMR: (D20 ir dioksanas, 100.5 MHz) cheminiai poslinkiai (m.d.)
[0071] 132, s; 133, s; 149, s; 164, s; 172, s.
. c1. Mikrobiologinis būdas, skirtas gaminti azotą turinčias hidroksi-heterociklines karbonines rūgštis arjų tirpias druskas, kurių bendroji formulė