[LT] Atskleidžiamas naujai išskirto geno, vadinamo SAF(antrinio metabolizmo aktyvacijos faktorius), klonavimas ir apibūdinimas. Šis genas koduoja naują polipeptidą, vadinamą SAF polipeptidu, kuris tiesiogiai arba netiesiogiai moduliuoja iš ląstelės išskiriamų fermentų ekspresiją Streptomyces. Aprašyti DNR vienetai arba fragmentai, koduojantys SAF polipeptidą; vektoriai, turintys minėtą DNR; organizmai-šeimininkai, transformuoti tokiais vektoriais, ir iš ląstelės išskiriamų fermentų arba heterologinių polipeptidų gavimo būdai, kultivuojant tokius organizmus-šeimininkus.
[EN]
[0001] Šis išradimas yra iš biotechnologijos srities. Tiksliau jis skirtas naujam polipeptidui, didinančiam iš ląstelės išskiriamų fermentų gamybą, DNR, koduojančiai ši, polipeptidą, rekombinantiniam vektoriui, į kurį įeina ši DNR, ir organizmui-šeimininkui, transformuotam šio rekombinantinio vektoriaus, kurio sudėtyje yra DNR, koduojanti ši, polipeptidą. Be to, išradimas skirtas geno, koduojančio ši, naują polipeptidą, promotoriaus sekai. Toliau šis išradimas skirtas Streptomyces ekspresijos sistemoms ir svetimų DNR sekų ekspresijos Streptomyces ir polipeptidų bei baltymų koduojamų šiomis svetimomis DNR sekomis, išskyrimo i, terpę būdams.
[0002] Streptomyces yra gerai žinomi įvairių iš ląstelės išskiriamų fermentų, įskaitant proteazes, fosfatazes, ksilanazes, celiuliazes, amilazes, lipazes ir nukleazes, gamintojai. Be to, Streptomyces giminės nariai gamina daugybę antibiotikų, pigmentų bei kitų antrinių metabolitų ir pasižymi sudėtinga diferenciacija pasibaigiančia sporų susidarymu. Bandymuose Streptomyces kultūrų serijose paprastai iš ląstelės išskiriamų fermentų gamyba, antibiotikų gamybos pradžia ir pigmentų biosintezė bei sporuliacija sutampa. Visus šiuos procesus slopina maitinimo sąlygos, skatinančios dideli, augimo greitį, ir aktyvuoja P, C ir N kiekio sumažėjimas. Gali būti, kad fermentų išskyrimas, antrinių metabolitų susidarymas ir diferencijacij a vieni nuo kitų nepriklauso, bet reaguoja į tuos pačius paleidimo mechanizmus.
[0003] Klonuoti keli Streptomyces genai, koduojantys iš ląstelės išskiriamus fermentus. Tarp jų - agarazė iš Streptomyces caelicolor, endoglikozidazė H iš Streptomyces plicatus, ksilanazė iš Streptomyces lividans, alfa-amilazė iš Streptomyces hydroscopicus, celiuliazė iš Strept. spA2, beta-galaktozidazė iš Strept. lividans ir beta-lakmatazė iš Strept. cacaoi, badius ir fradiae.
[0004] Tačiau mechanizmai, kurie reguliuoja šių genų ekspresiją, yra iš esmės nežinomi. Prie specifinių reguliavimo mechanizmų, tokių kaip amilazės indukcija dekstrinais bei maltotrioze ir anglies metabolinis amilazės arba agarazės reguliavimas, matyt, atsiras bendri kelių iš ląstelės išskiriamų fermentų aktyvacijos mechanizmai, kadangi, sumažinus maitinimą, Streptomyces tuo pačiu metu stebėta kelių polimerinius substratus degraduojančių fermentų gamyba. Tokie transaktyvuoj antys reguliuojantys genai rasti Bacillus subtilis (J.BACTERIOL. 169:324-333, 1987), Bacillus natto (J.BACTERIOL.166:20-28, 1986), ir Bacillus licheniformis.
[0005] Pozityvūs reguliuojantys genai, veikiantys fermentų gamybą ir/arba sekreciją galėtų būti klonuoti, ieškant padidintos iš ląstelės išskiriamų fermentų sekrecijos menkuose sekreciniuose kamienuose, tokiuose kaip S. lividans.
[0006] Aprašytos sistemos svetimų DNR sekų ekspresijai Streptomyces, pvz., EP 148552 ir WO 88/07079. Šios sistemos naudoja Streptomyces gaminamus iš ląstelės išskiriamų fermentų endogeninius promotorius.
[0007] Pagrindinis šios išradimo tikslas yra pateikti naujo išskirto geno, čia toliau vadinamo saf (antrinio metabolizmo aktyvacijos faktorius) genu, koduojančio naują polipeptidą (toliau čia vadinamą SAF polipeptidu), klonavimą ir apibūdinimą. Šis SAF polipeptidas tiesiogiai arba netiesiogiai keičia Streptomyces iš ląstelės išskiriamų fermentų genų ekspresiją, sąveikaudamas su ekstraląstelinių fermentų struktūrinių genų kontroline sritimi.
[0008] Kitas šio išradimo aspektas yra organizmai-šeimininkai arba ląstelės, transformuotos aukščiau aprašytais klonuojamais vektoriais, tuo būdu padidinant iš ląstelės išskiriamų fermentų arba norimo heterologinio polipeptido gamybą.
[0009] Penktas šio išradimo aspektas yra iš ląstelės išskiriamų fermentų arba norimo polipeptido gavimo būdas, kultivuojant transformuotą organizmą-šeimininką pagal ši, išradimą ir išskiriant produktą iš auginimo terpės.
[0010] Dar vienas šio išradimo aspektas yra saf geno promotorius.
[0011] Ir dar vienas šio išradimo aspektas yra klonuojamų vektorių, kurie apima saf geno promotorių, sujungto su endogeninio iš ląstelės išskiriamo fermento sekrecijos signaline dalimi, abi dalis sujungiant su svetima DNR seka, sukūrimas; šis aspektas taip pat apima organizmus arba ląsteles-šeimininkus, transformuotus tokių klonuojamų vektorių, sukeliančių svetimo polipeptido, koduoto svetimos DNR seka, ekspresiją ir sekreciją.
[0012] Kitas šio išradimo aspektas yra tokio klonuojamo vektoriaus, turinčio svetimą DNR seką, integracija Streptomyces chromosominę DNR. Ekspresijos vektorius, turintis saf geną, taip pat bus įjungtas i, tokius transformuotus organizmus, ir panaudotas gaunant produktą.
[0013] Šie ir kiti šio išradimo objektai bus detaliau aprašyti tolesniuose skyriuose.
[0014] Iš Streptomyces qriseus ATCC 10137 išskirtas DNR fragmentas koduojantis saf (antrinio metabolizmo aktyvacijos faktorius) geną, dalyvaujantis S. lividans ir S. caelicolor mažiausiai penkių fermentų įprastoje reguliacijoje. Saf genas aptiktas visuose tikrintuose Streptomyces, tai leidžia daryti prielaidą, kad šis genas vaidina svarbų vaidmenį metabolizme. Iš tikrųjų, DNR fragmentas, turintis geną, panašų i, saf geną, mūsų buvo klonuotas iš Streptomyces qriseus IMRU 3570, kandicidiną gaminančio kamieno. Tiriant kai kuriuos Streptomyces, pvz., S. lividans ir S. lactamdurans, pagal hibridizacijos pobūdi, daroma prielaida, kad saf genas yra chromosominėje DNR keliose kopijose.
[0015] Toliau aprašomas geno, dalyvaujančio iš ląstelės išskiriamų fermentų gamyboje ir sporuliacij oj e Streptomyces, pirmas pavyzdys.
[0016] Saf genas koduoja 113 amino rūgščių polipeptidą (SAF polipeptidą); transkripcijos- transliacijos tyrimai in vitro E. coli parodė, kad pasigamina taisyklingo dydžio baltymas - apie 15000 daltonų. SAF polipeptidas turi dideli, teigiamą krūvi, (18 teigiamai pakrautų amino rūgščių) ir neturi sudėties, būdingos lyderiniam polipeptidui arba transmembraniniam baltymui, ir todėl mažai tikėtina jo tiesioginė įtaka baltymo išskyrimui. Teigiamo krūvio baltymas gali lengvai sąveikauti su DNR. Iš tikrųjų, SAF polipeptide aptinkama DNR surišanti sritis, būdinga kai kuriems reguliuojantiems baltymams (ANN. REV. BIOCHEM. 53: 293-321, 1984). Netikėtai buvo nustatyta, kad saf promotorius yra žymiai veiklesnis negu natūralus iš ląstelės išskiriamų fermentų promotorius. Pvz., amilazės genas ekspresuoja žymiai daugiau amilazės, kai gamtinis amilazės promotorius pakeičiamas saf promotoriumi. Tuo būdu, saf promotorius gali būti panaudotas vietoj gamtinio baltymo promotoriaus bet kuriuo endogeninio polipeptido arba baltymo ekspresijos padidinimui.
[0017] SAF polipeptidas pasižymi plejotropiniu poveikiu, t. y., veikia daugiau negu viena kryptimi iš ląstelės išskiriamus fermentus, pigmentų gamybą ir diferencijaciją. Pagal ši, išradimą pasiekiama padidinta endogeninių iš ląstelės išskiriamų fermentų gamyba.
[0018] Kalbant plačiau, saf genas ir atitinkamas polipeptidas gali būti panaudoti norimų heterologinių baltymų iš Streptomyces ekspresijos padidinimui, įterpiant geną, koduojanti, norimą baltymą i, tinkamą skaidymo vietą geno, koduojančio iš ląstelės išskiriamą fermentą, kurio ekspresiją didina SAF, arba jo dalies, transformuojant Streptomyces šeimininką, turinti, saf geną, su rekombinantiniu genu ir kultivuojant transformuotas bakterijas, kad jos išskirtų norimą baltymą arba jo dali,. Geriau, kuomet heterologinė DNR, kontroliuojama saf promotoriaus, yra įterpiama chromosominę DNR, ir tuo pačiu metu įterpiamas ekspresijos vektorius, turintis DNR, koduojančią SAF polipeptidą. Ekspresijos vektoriaus nereikia integruoti i, chromosominę DNR.
[0019] Jau rašyta apie plejotropinius genus, veikiančius antibiotikų sintezę ir Streptomyces diferencijaciją. Genas a/sB, teigiamai reguliuojantis A-faktoriaus, aktinorodino ir prodigiozino gamybą Streptomyces caelicolor ir Streptomyces lividans, buvo klonuotas iš S. caelicolor A3(2) (Horinouchi et al., J.BACTERIOL. 155:1238-1248, 1983).
[0020] Saf genas skiriasi nuo afsB, ir iš tikrųjų jie priešingai veikia aktinorodino gamybą. Bendra tarp jų yra tai, kad jų aminorūgščių sekos yra būdingos DNR-rišantiems baltymams. Abu genai, saf ir afsB, turi promotorius be -10 ir -35 suderinimo sekų ir gali jungtis su potencialias transliacijas reguliuojančiais signalais bei stipriu kamienu ir kilpelinėmis struktūromis, galinčiais veikti kaip transkripcijos terminatoriai (Horinouchi et al., J.BACTERIOL. 168:257-269, 1986). Jeigu transkripcinė forma sudaro labai stabilią kilpą, tai ribosomų prisijungimas darosi neįmanomas. Rasta, kad tokie į atenuaciją panašūs genų veiklos kontrolės mechanizmai moduliuoja Streptomyces atsparumo antibiotikams genus (Horinouchi et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 77:7079-7083, 1980). Kadangi saf genas gali būti laikomas "pagrindiniu" genu, įjungiančiu daugybę genų fermentų sekrecijai, jo ekspresija, matomai, griežtai kontroliuojama ląstelėje. Visi fermentai, stimuliuojami saf geno, dalyvauja sudėtingų polimerų skaidyme, ir todėl galima prielaida, kad šis genas yra bendros reguliacijos sistemos dalis, kuri dalyvauja alternatyvių mitybos šaltinių paieškoje, panašiai kaip tai siūloma Bacillus atveju (Henner et al., J.BACTERIOL.170:296-300, 1988). Fig.l Chromosominės DNR fragmentų iš S. qriseus ATCC 10137 klonų pIJ702 Bgl II saite, turinčių genetinę determinantę šarminės fosfatazės supergamybai, restrikcinė analizė. Fig.2 Homologijos tarp pULAD3 1 kb Bql II fragmento ir kitų Streptomyces rūšių genominės DNR analizė Sputhern hibridizacijos būdu. (A) DNR fragmentai, gauti genomines DNR skaidant BamHI (2-7 takeliai) . (B) DNR, parodytų panelyje A, hibridizacija su 1 kb fragmentu kaip zondu. Takeliai: l.DNR, skaidyta Hind III, gaunant 23, 9.59, 6.68, 4.29, 2.28,1.94 ir 0.58 kb dydžio fragmentus; 2.5. lactamdurans; 3. S. acrimycini; 4. S. caelicolor 1157; 5.S.griseus 2212; 6.S.qrriseus 3570; 7. S. lividans 1326. Fig.3 S. lividans, transformuotų pIJ702 (kairėje) ir S. lividans, transformuotų pULAD3 (dešinėje), proteazės (A), amilazės (B) ir lipazės (C) aktyvumų tyrimai Petri lėkštelėse.
[0021] Fig.4 Geno dozės efektas saf geno ekspresijai. S . lividans, transformuotų pIJ702 (kairėje) ir S. lividans, transformuotų pULAD3 (viduryje), ir S. lividans, transformuotų pULAD30 (dešinėje), proteazės
[0022] Fig.5 Saf geno atskleidimas pULAD3 lkb Bql II
[0023] fragmentas panaudotas kaip pradinė medžiaga. Iš ląstelės išskiriamų fermentų gamyba, panaudojant visas plazmidžių konstrukcijas, įvertinta lekštelėse su kieta terpe, kaip pažymėta aprašyme: laukinio tipo producenats; ++; +++ ir ++++ žymi skirtingus supergamybos laipsnius. Trumpos atviros rodyklės rodo tirozinazės geno (mel) plazmidėje pIJ702 lokalizaciją ir transkripcijos krypti,. Užjuodinti ratukai (•—>) žymi mel geno promotorių; Atviri ratukai (° —>) rodo įprastą promotoriaus plazmidėje pIJ702 aktyvumą ir atviri kvadratai (—>) žymi saf promotorių. Transkripcijos kryptis parodyta rodyklėmis. 0RF1 atitinka saf skaitymo rėmelį, išvestą iš nukleotidinės sekos duomenų.
[0024] Fig.6 pULAD3 1 kb Sgl II fragmento nukleotidinė seka ir saf geno produkto aminorūgščių seka. Pabrauktas antras ATG iniciacijos kodonas. Invertuotos komplementarios pasikartojančios sekos parodytos susieinančiomis rodyklėmis. Banguota linija rodo aminorūgščių seką, panašią į žinomą DNR-surišančių baltymų DNR-jungiančius domenus. Fig.7 Saf geno produkto išvesto aminorūgščių sekos srities palyginimas su žinomų DNR-surišančių baltymų DNR-jungiančiais domenais. Fig. 8 Pasikartojančios nukleotidinės sekos prieš srovę ir pasroviui nuo saf geno. Fig. 9 Pasikartojančios nukleotidų grupės, esančios saf gene.
[0025] Fig. ll 11 A ir B brėžiniuose parodyta išskirto iš S. griseus amilazės geno pilna nukleotidų seka ir jo produkto aminorūgščių seka. Manoma, kad BstE II pjūvis yra optimali vieta svetimo geno prijungimui. Fig. 12 Strategija, naudota S . qriseus IMRU 3570 a- amilazės geno klonavimui, panaudojant plazmidę piJ699. Fig. 13 Grafikų serijos rodo įvairių plazmidžių a- amilazės gamybą lėkštelėse priklausomai nuo laiko, esant įvairiai terpei:
[0026] Apatinis panelis dešinėje rodo plazmidės pULVDlO gamybos dydžius, palyginus su pULTVl, S . lividans ir pULTVIOO ( žiūr. Fig. 6a) geriausioje gamybos terpėje ( X). S . lividans ( pIJ699) MM be fosfato+ l% krakmolas+ tio:(•) pULTVl aukščiau aprašytose terpėse; (-) pULTVIOO aukščiau aprašytose terpėse; ir ( a) pULVDlO MM 1 mMP+ l% krakmolas+ tio.
[0027] Fig.14 Rekombinatinės Streptomyces ląstelės, turinčios chromosomini, geną, gaminanti, sulietą baltymą su CRF molekule, ir plazmides, turinčias DNR, koduojančią SAF polipeptidą, konstrukcijos schema.
[0028] Čia aprašomas darbas buvo atliktas su tokiomis medžiagomis ir metodais.
[0029] Bakterijų kamienai ir plazmidės. Šiuose tyrimuose panaudoti Streptomyces ir E. coli kamienai, pateikti 1-oje lentelėje. Plazmidės ir fagai pateikti 2-oje lentelėje.
[0030] Terpė ir auginimo sąlygos. Streptomyces kamienai auginti RZYE, minimalioje terpėje (MM), TSB (Difco) arba IEUE, papildytoje 34% sacharozės ir 5 mM MgCl2 (Hopwood et al., Genetic manipulation of Streptomyces. A LABORATORY MANUAL. The John Innes Foundation, Norwich, U.K., 1985). Streptomyces kamienai auginti induose su trigubomis pertvaromis, esant 2 8°C tempera-tūrai rotaciniame kratytuve, sukant ji, 220 aps/min. greičiu.
[0031] E. coli kamienai auginti Luria terpėje (LB) (Miller et al., EXPERIMENTS IN MOLECULAR GENETICS, p.433. Cold Spring Harbor Laboratories, New York, 1972) arba Luria Agare (LA), esant 37°C temperatūrai.
[0032] Fermentų aktyvumo tyrimai lėkštelėse. Streptomyces kamienų šarminės fosfatazės (AP-angl.) aktyvumo tyrimai atlikti PRMM terpėje (MM) be gliukozės, turinčioje sumažintą fosfatų kieki, (1 mM) , pridėjus 30 mkg/ml 5-bromo-4-chloro-3- indolilfosfato-p-toluidino (XP). Kolonijos, gaminančios AP, buvo mėlynos, o nepajėgios jos pagaminti buvo baltos. E. coli kamienams naudota BXP terpė ( 1 ltr turinti 10 g baktopektono, 12 Trizmą bazės, 10 g NaCl, 20 g Difoagaro, pH 7. 5 ir 40 mkg/ ml
[0033] Streptomyces kolonijų amilazės aktyvumas tirtas MM ( be gliukozės), pridedant 1% krakmolo. Po 3- jų dienų augimo lėkštelės paveiktos jodo garais. Prašviesėjimo zonos aplink kolonijas atsiranda dėl krakmolo suskaidymo. Lipazės aktyvumas matuotas, auginant Streptomyces MM, pridėjus 2% ( w/ v) alyvų aliejaus, 0, 5% ( w/ v) Tween 80 ir 0. 5% Tween 20 ( w/ v).
[0034] Po 20 dienų augimo i, lėkšteles įpilta 1 ml 1 M CaCl2. Lipazės gamyba stebima kaip Ca2+- riebios rūgšties-komplekso nuosėdos. Proteazės aktyvumas tirtas MM ( be gliukozės), pridėjus 0, 5% kazeino ir 10 mM CaCl2. Fermento aktyvumas nustatytas kaip prašviesėjimo zonos apie kolonijas.
[0035] S. caelicolor agarazės aktyvumas tvirtas MM be gliukozės, užliejant lėkšteles Gramo jodino tirpalu. Beta- galaktozidazės aktyvumas stebimas kaip mėlyna spalva kolonijų, augančių MM be gliukozės, pridėjus X-gali ( 36 mkg/ ml) ir IPTG ( 10 mkg/ ml).
[0036] DNR išskyrimas. Visa DNR iš Streptomyces išskirta kaip aprašyta Hopwood ir kt. ( Hopwood et al., Genetic manipulation of Streptomyces A LABORATORY MANUAL. The John Innes Foundation, Norwich, U. K., 1985). Plazmidinė DNR iš Streptomyces arba E. coli išskirta Kieser metodu ( Kieser et al., PLASMID 12:19- 36, 1984).
[0037] Klonavimas. 10 mkg S. qriseus kamieno ATCC 10137 chromosominės DNR ir 0. 5 mkg pIJ702 suskaidyta Bql II ir liguota 12 valandų, esant 14°C, panaudojant T4 DNR ligazę. Ligavimo mišinys naudotas betarpiškai transformacijai. DNR fragmentų subklonavimas atliktas skaidant 1-2 mkg plazmidinės DNR atitinkamu restrikcijos fermentu(-ais), ir reakcijos produktai atskirti panaudojant gelio elektroforezę žemos lydymosi temperatūros agarozėje (LMPA-angl.). Norimos DNR juostos ekstrahuotos, panaudojant CTAB metodą
[0038] (Landgridge et al., ANAL. BIOCH.103:264271, 1980) .
[0039] Transformacijos būdai. Streptomyces kamienai transformuoti, kaip aprašyta (Hopwood et al., Genetic manipulation of Streptomyces. A LABORATORY MANUAL. The John Innes Foundation, Norwich, U.K., 1985). Po transformacijos protoplastai patalpinti i, R2YE terpę ir palikti regeneruotis 15-20 valandų, esant 30°C. Tada po 1 ml vandeninio tiostreptono tirpalo (300 mkg/ml) išpilstyta i, lėkšteles, džiovinta 1 arba 2 valandas ir inkubuota 2-3 dienas. Transformantai pernešti į PRMM terpę, turinčią tiostreptono (50 mkg/ml) ir XP (30 mkg/ml).
[0040] E. coli transformacija atlikta pagal Cohen et al., (PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 69:2110-2114,1972). Transformantų selekcija atlikta lėkštelėse, turinčiose ampicilino (200 mkg/ml). Esant reikalui, pridėta X-gal (36 mkg/ml) ir IPTG (10 mkg/ml) i LA lėkšteles.
[0041] Hibridizacijos tyrinai. DNR pernešta iš agarozės gelio ant nitroceliuliozinių filtrų ir hibridizuota kaip aprašyta (Hopwood et al., Genetic manipulation of Streptomyces. A LABORATORY MANUAL. The John Innes Foundation, Norwich, U.K., 1985) . 7.2 Kb Bgl II fragmentas iš plazmidės pULADl ir 2 Kb Bgl II fragmentas iš plazmidės pULAD3 panaudoti kaip zondai. Hibridizacijos atliktos, esant 79°C 24 valandas. Filtrai plauti dukart po 30 min. 2 g SSC, 0.1% SDS ir tada dar du kartus po 30 min. 0.2 g SSC, 0.1%, esant 70°C.
[0042] Nukleotidinės sekos analizė. Nukleotidinė seka nustatyta grandinės terminacijos metodu pagal Sieger et al., (PROC. NATL. ACAD SCI. USA 74:5463-5467,1977). DNR fragmentai subklonuoti i, M13mpl0 ir M13npll, kad gautųsi bet kurios orientacijos įterpimas. Ligavimo mišiniai transfektuoti i, kompetentines E. coli JM103 ląsteles ir pagal baltas dėmes atrinkti intarpai. Sekos nustatytos grandinėse, naudojant Amersham International plc. (U.K.) ir Seąuenase (United States Biochemical Corporation, USA) rinkinius analizei. Visų fragmentų sekos nustatytos, naudojant dGTP, bet DITP naudotas vietoj dGTP, kai reikėjo. Reakcijos mišiniai atskirti 6% ir 8% poliakrilamidiniuose sekvenavimo geliuose, po to eksponuojant su rentgeno juosta autoradiografij ai.
[0043] Promotorių klonavimas. Fragmentai, pasižymintys transkripcijos iniciacijos aktyvumu, buvo atrinkti, panaudojant daugiakopijinę promotoriaus-zondo plazmidę piJ486 (Ward et al., MOL. GENET. 203:468-478, 1986). Transformantai, atsparūs kanamicinui, (Km) išskirti perkeliant i, MM, turinčią 15 mkg/ml Km.
[0044] Tranakripcija- transliacija iii vitro . Plazmidės pULAD300 ir pUC19 transkribuotos ir transliuotos, panaudojant prokariotinės DNR kryptingos transliacijos rinkini, iš Amersham International plc. L(35S) metioninas naudotas kaip radioaktyvi žymė. 12.5% poliakrilamidiniai geliai, turintys natrio dodecilo sulfato, panaudoti žymėtų baltymų analizei.
[0045] Tolesnis detalus aprašymas iliustruos šį išradimą:
[0046] Tirta dešimties įvairių Streptomyces kamienų (sąrašas 1-oje lentelėje) šarminės fosfatazės gamyba keliose kietose terpėse. S. ęriseus ir IMRU 3570 ir S. griseus ATCC 10137 buvo geriausi producentai visose ištirtose terpėse. Geriausia kieta terpe šarminės fosfatazės gamybai buvo PRMM (turinti 30 mkg/ml XP). Šioje terpėje S. ąriseus IMRU 3570 ir S. ąriseus ATCC 10137 parodė tamsiai mėlyną spalvą po 48 augimo vai. S. lividans 1326 ir S. caelicolor JI 2280 buvo menki šarminės fosfatazės producentai: per 20 augimo valandų PRMM, turinčioje XP, stebėta tik šviesiai mėlyna spalva.
[0047] Geno, dalvyaujančio šarminės fosfatazės gamyboje, klonavimas
[0048] Iš kamieno S. qriseus ATCC 101137 išskirta visa DNR suskaidyta Bql II, ir ligavimo mišinys transformacijos būdu įvestas j, protoplastus S. lividans 1326. Transf ormantai perkelti d, PRMM, turinčią tiostreptono (50 mkg/ml) ir XP (30 mkg/ml). Viena tamsiai mėlyna kolonija rasta tarp 2800 melanino negatyvių S. lividans transformantų. Ši tamsiai mėlyna kolonija turėjo pIJ702 darini, su 7.2 kb Bql II intarpu, kuris pavadintas pULADl (Fig.l).
[0049] Plazmidė pULADl buvo nestabili kamiene S. lividans ir po retransformacijos atsirasdavo baltos ir mėlynos kolonijos. Visos mėlynos kolonijos turėjo pradinę pULADl, o baltos kolonijos - turėjo pULADl su delecija ir toliau nebuvo tirtos. Kadangi nestabilumas galėjo būti dėl per didelio intarpo dydžio tokioje plazmidėje, kaip pIJ702, kuri pasižymi nestabilumu, tai 7.2 kb intarpas buvo subklonuotas i, plazmidės pIJ699 5 kb flgl II fragmentą (Kieser et al., GENE 65: 83-91, 1988). Gautos dvi plazmidės su intarpu, orientuotu priešinga kryptimi. Abi plazmidės buvo stabilios ir genas ekspresavosi abiem orientacijom kamiene S. lividans.
[0050] 7.2 kb Bgl II fragmentas dalinai suskaidytas Sau3AI ir liguotas prie Bql II suskaidytos pIJ702. Ligavimo mišinys transformuotas į S. lividans protoplastus, ir transformantai pernešti i, PRMM, turinčią XP. Plazmidinė DNR išskirta iš kelių mėlynų kolonijų. Smulkiai ištirtos keturios nedidelės plazmidės: pULAD2, pULAD3, pULAD16 ir p(JLAD18, turinčios determinantę šarminės fosfatazės gamybai; jos buvo stabilios, retransformuodavo S. lividans protoplastus ir turėjo atitinkamai 2.4, 1, 2.1 ir 1.9 kb dydžio intarpus (Fig. 1). Plazmidė pULAD3 turėjo pati, mažiausią intarpą 1 kb dydžio, kuris vėl galėjo būti išpjautas Bgl II pagalba. Įvesta i, S. lividans, pULAD3 (deponavimo nr. 1-859 19.0589 CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 28 rue du Docteur Roux, F75724 Paris Cedex 15, France pagal Budapešto sutarti, EPK 28 Taisyklę) padidino šarminės fosfatazės gamybą kaip ir p ULAD1.
[0051] Hibridizacija su kelių Streptomycoa kamienų chromosomine DNR
[0052] Išskirta iš S. ąriseus ATCC 10137 kamieno visa DNR suskaidyta BamHI arba Bgl II buvo hibridizuota su 7.2 kb Bql 1 II fragmentu iš pULADl, pažymėtu (32p) dCTP "niek" transliacijos būdu. Kaip ir tikėtasi, homologinis šiam zondui 7.2 kb Bgl II fragmentas aptiktas S. qriseus ATCC 10137 kamieno DNR, skaidytoje Bgl II. Visą DNR suskaidžius BamHI, tame fragmente rastas vidinis Ba/nEHI saitas, kuris davė dvi aiškias hibridizacijos juostas (7.9 Kb ir 9.4 Kb).
[0053] Tam, kad būtų išsiaiškinta, ar toks pat genas yra kituose Streptomyces kamienuose, visa DNR iš S. acrimycini, S. caelicolor 1157, S. qriseus 2212, S. griseus 3570, S. lividans 1326 ir S. lactamdurans NRRL 3802 skaidyta BamH. 1 ir hibridizuota su 1 Kb pULAD3 Bal II fragmentu kaip zondu. Hibridizuojant su 9. 5 Kb bendra juosta pastebėta tiriant pirmus keturis Streptomyces kamienus, minėtus anksčiau. Tuo tarpu pastebėtos atitinkamai 4 ir 5 silpnos hibridizacijos juostos, tiriant DNR išskirtą iš S. lividans ir S. lactamdurans. Be to, taip pat stebėta hibridizacija su S. albus G, S. caelicolor JI 2280, S. clavuliqerus NRRL 3585 ir S. fradiae ATCC 10475 DNR. Daugiau nieko nadaryta hibridizacijos juostų apibūdinimui.
[0054] Pabandyta patikrinti E. coli phoA mutantų E15 ir AW 1046 komplementaci j ą, kai klonavome struktūrini, šarminės fosfatazės geną iš S. ąriseus ATCC 10137 kamieno. 7. 2 Kb Bgl II fragmentas iš pULADl ir 1 Kb Sgl II fragmenats iš pULAD3 subklonuoti atskirai abiem orientacijomis BaiJiHI- suskaidyto je pUC19. Visos šios plazmidės konstrukcijos buvo patikrintos E. coli kamieno JM103 ląstelėse ir po to panaudotas E. coli E 15 ( Sarthy et al., J. BACTERIOL. 145:288- 292, 1981) ir E. coli AW 1046 transformacijai. B- XP nerasta jokių mėlynų kolonijų, tai leido padaryti prielaidą, kad arba pilno struktūrinio šarminės fosfatazės geno nėra S. ąriseus 7. 2 kb fragmente arba kad šis genas nesiekspresuoj a E. coli. Šarminės fosfatazės struktūrinis genas ( phoA) iš Bacillus licheniformis ( Hullett, F. M., J. BACTERIOL. 158:978- 982, 1984) nesihibridizavo su klonuotu 1 Kb fragmentu ( duomenys neparodyti). Be to, phoB ( reguliacinis) E. coli mutantas H2 ( Kreuzer et al., GENETICS, 81:459- 468, 1975) nebuvo komplementuotas nei pULAD3 1 kb Bgl II fragmentu, nei pULADl 7.2 Bgl II fragmentu.
[0055] Kai pULAD3 naudota S. lividans protoplastų retransformacijai, stebėta aiški pavėluota ir sporuliacija. Šie plejotropiniai poveikiai paskatino mus ištirti šio geno vaidmeni, baltymo išskyrimo arba geno ekspresijos kontrolėje. Kaip parodyta Fig. 3, kai kuriuos iš ląstelės išskiriamus fermentus, tame tarpe amilazę, proteazę ir lipazę, labai gausiai gamino S. lividans, transformuotas pULAD3. (P-galaktozidazės gamyba taip pat padidėjo ir jos gamyba prasidėjo maždaug 24-30 vai. anksčiau negu netransformuoto S. caelicolor. Dėl klonuoto geno plejotropinio poveikio iš ląstelės išskiriamiems fermentams, pigmento gamybai ir diferencijacij ai šis genas buvo pavadintas saf genu (antrinių metabolizmų aktyvacijos faktorius).
[0056] Nustatyta, kad pIJ kopijų skaičius yra 100-200/chromosomai. Nors tikslus pULAD3 kopijų skaičius nenustatytas, abiejų pIJ702 ir pULAD3 juostų intensyvumas rodė esant panašų kopijų skaičių.
[0057] Kad ištirtume geno dozės efektą, mes subklonavome pULAD3 1 kb Bgl II fragmentą i, mažo kopijų skaičiaus plazmidės pIJ61 Ba/nHI saitą (3-4 kopijos ląstelei)
[0058] (Hopwood et al., A LABORATORY MANUAL. The John Innes Foundation, Norwich, U.K.). Ši nauja plazmidė pavadinta pULAD30. Fig. 4 rodo, kad S. lividans transformuotų pULAD30, iš ląstelės išskiriamų fermentų gamyba aiškiai sumažėjo, palyginus su S. lividans, turinčiu pULAD3. Be to, S. lividans, turintis pULAD30, pasižymėjo panašia
[0059] pigmento gamyba ir sporuliacijos pobūdžiu kaip ir netransformuoti S. lividans.
[0060] Nors saf genas nekomplementavo E. coli Pho mutantų, mes pastebėjome, kad pULAD 1 kb Bal II intarpas, subklonuotas viena kryptimi i, pUC19 ( plazmidė pavadinta pULAD300) buvo ekspresuotas E. coli, sukeldamas bakterijų nenormalią morfologiją, auginant kietoje terpėje, ir nebuvo ekspresuotas, kai buvo įterptas priešinga kryptimi ( plazmidė pULAD301). Plazmidėje pULAD300 ORF ( žiūr. žemiau) yra išsidėstęs žemyn nuo lacZ promotoriaus. Šie rezultatai rodo, kad saf genas ekspresuoj amas E. coli iš lacZ promotoriaus, esančio pUC19.
[0061] Transkripcijos- transliacijos E. coli ( su plazmidė pULAD300) tyrimai atlikti taip pat in vitro, reakcijos produktus užnešant i, 12. 5% poliakrilamidini, geli,. 1500 mol masės juosta buvo takelyje atitinkančiame pULAD300, ir jos nebuvo kontroliniame pUC19 takelyje.
[0062] Kad tiksliai nustatytume saf geno vietą, nuspręsta toliau tęsti plazmidės pULAD300 1 kb fragmento skaidymą. Šiuose bandymuose pasinaudota restrikcija fermentų SstI ( nt 216), KpnI ( nt 648) ir SalGI ( nt 936) unikaliais pjūvio saitais, esančiais 1 kb fragmente. Įvairūs sub- fragmentai iš pULAD300 1 kb intarpo klonuoti i, pIJ2921, po to pUC18 darinys, turintis modifikuotą polilinkerį, buvo apribotas Bql II saitais ( Fig. 10), išskirtas Bql II lipnių galų pagalba ir klonuotas i, Bql II- suskaidytą pIJ702. Tirta Streptomyces lividans šarminės fosfatazės, amilazės ir proteazės gamyba panaudojant visas plazmidžių konstrukcijas. Šių tyrimų rezultatai parodyti schematiškai Fig. 5, ir iš jų galima padaryti tokias išvadas: 1. 1 kb fragmente yra visas saf genas, įskaitant jo gamtinių promotorių, kadangi jis buvo ekspresuotas panašiam lygyje abiejose plazmidės pIJ702 orientacijose (plazmidės pULAD3 ir pULAD4). 2. Matomai, šis saf genas yra išsidėstęs 648 nukleotidų BqlII- KpnI fragmente (plazmidės pULAD5 ir pULAD6). 3. Fragmentas Sstl- KpnI (432 nukleotidai), atrodo, turi genetinę determinantę iš ląstelės išskiriamo fermento supergamybai, bet, matyt yra praradęs savojo promotoriaus sritį, kadangi jis ekspresuojamas esant tik vienai orientacijai (plazmidės pULADlO ir pULAD14), bet ne priešingai (plazmidės pULAD9 ir pULAD13). 4. 215 nukleotidų fragmentas Sgl II-SstI turi saf geno promotoriaus sritį. 5. Visi poveikiai iš ląstelės išskiriamiems fermentams ir diferencijacijai pasireikšdavo kartu arba buvo prarandami kartu, tuo parodant, kad vienintelis geno produktas yra atsakingas už poveikį visiems fermentams. 6. Nelauktas pasirodė fragmento Sstl- KpnI (saf genas be promotoriaus) ekspresijos nebuvimas, pradedant mel-geno, esančio pIJ702, tirozinazės promotoriumi, kuris vis dėl to buvo ekspresuotas kryptimi (pagal laikrodžio rodyklę). Šis atradimas reiškia, kad fragmentas, pasižymintis promotoriaus aktyvumu, išdėstytas prieš mel geną, prie Bql II kolnuojamo saito (Bernar et al., GENE 37:101-110,1985). Nors šis atradimas nebuvo paskelbtas, bet apie jį buvo užsiminę keli autoriai (Gil and Hopwood, GENE 25:119-132, 1983). Veiklaus ORF galimybė priešinga kryptimi (nuo KpnI- SstI) atmesta dėl kelių priežasčių: A. Toks ORF nebuvo aptiktas, tiriant nukleotidinę seką.
[0063] B. Jei toks ORF egzistuotų, aišku, kad jis turėtų turėti savąjį promotorių, kadangi fragmentas BglII-SstI (ntl - nt648) ekspresuojamas abiem kryptim (plazmidės pULAD5 ir pULAD6). Be to, beprasmiška atrodo, kad fragmentas KpnI- SstI, kuris turėtų turėti promotorių zonoje KpnI, galėtų ekspresuotis tik viena kryptimi. C. Ekspresija E. coli visada vyksta tuomet, kuomet promotorius lacZ - yra vietoje ar prieš numatomą ORF ir niekada - priešinga kryptimi.
[0064] DNR viršutinio fragmento ORF1 promotoriaus aktyvumas
[0065] Tam, kad patvirtintume promotoriaus egzistavimą Bql-SstI fragmente, iš ankstesnių bandymų galime padaryti išvadą, kad šis fragmentas turi geną, koduojanti, aminoglikozidofosfotransferazę (neo), be jo promotoriaus. Šio geno ekspresija daro S. lividans atspariu kanamicinui ir neomicinui. Kada šis fragmenats buvo subklonuotas i, pIJ486 (SstI galu, šalia neo geno), buvo sukurta plazmidė pIJ 4 84:216. Pastebėta, kad S. lividans, trasnformuotas pIJ 486:216, auga MM terpėje pridėjus daugiau kaip 100 mkg/ml Km, tuo tarpu S. lividans, transformuotas pIJ486, neaugo MM terpėje, pridėjus 5 mg/ml Km. Šie rezultatai rodo, kad toks fragmentas pasižymi promotoriaus aktyvumu ir palaiko prielaidą apie numatytą ORF.
[0066] Kiti samprotavimai, kurie išvesti iš nukleotidinės sekos tyrimų ir galimo ORF yra tokie:
[0067] 1. Saf genas apsuptas dviem sritimis su apverstomis ir komplementarinėmis pasikartojančiomis sekomis, galin-čiomis sudaryti rRNR labai stabilius ryšius G=-38.4 kkal; esant genui saf padėtyje (nt 637-697) (Fig. 8). 2. Sekvenuotas fragmentas turi dideli, G+C procentą, kas būdinga Streptomyces genams. 3. Prieš saf geną, tarp ATG (nt 219) ir išsidėsčiusių "aukštyn" kryptimi pasikartojančių struktūrų yra labai įdomi nukleotidinė sritis: joje yra trys pasikartojančių nukleotidų poros (kiekviena su 7 nt) (Fig. 9). Labai panašu, kad ši sritis, ypač promotoriaus zona, vaidina svarbų vaidmenį saf geno ekspresijos reguliavime. 4. Verta paminėti, kad SAF-baltymas turi 18 suminių teigiamų krūvių. Iš teorinių samprotavimų galima daryti išvadą, kad tai sąlygoja žymiai didesni, afiniškumą DNR. Netgi išvestoje aminorūgščių sekoje galima stebėti sritį, labai panašią i, DNR-jungiančius baltymų domenus (Pabo and Sauer,1984) (Fig. 7).
[0068] Viso pULAD3 1 kb Bgl II intarpo nukleotidinė seka nustatyta, panaudojant plazmidę pULAD300 kaip pradinę medžiagą. Kadangi M13mpl0 ir M13mpll neturi KpnI saito, fragmentai su KpnI galais pirmiausiai subklonuoti i, pUC19, ir po to išskirti i?coRI ir HindlII fragmentų pavidalu ir įterpti i, mplO ir mpll, suskaidytus £ coRI ir HindlII. Aktyvaus rajono pilna nukleotidinė seka turi 0RF1, susidedanti, iš 339 nukleotidų, koduojančių numatomą SAF polipeptidą (Fig. 6). Yra tik vienas atviras skaitymo rėmelis, turintis BqlII- KpnI fragmentą, kuris prasideda ATG iniciacijos kodonu ties nt 183 ir baigiasi TGA stop kodonu ties nt 524 (0RF1 Fig. 5 ir 6). Kadangi Sstl - KpnI intarpas, esantis plazmidėje pULAD14, pasižymėjo mažesniu aktyvumo laipsniu, negu plazmidės, turinčios pasroviui SstI saito sriti, ( pULAD3, pULAD4 ir pULAD6) , tikėtina, kad ATG ( nt 219) rėmelyje su numatomu saf skaitymo rėmeliu gali veikti kaip iniciacijos kodonas plazmidėse pULADlO ir pULAD14. Jokie kiti alternatyvūs iniciacijos tripletai negalimi, kadangi egzistuoja TGA terminacijos kodonas prieš srovę pirmojo ATG. Ilga invertuota pasikartojanti sritis, galinti sudaryti labai stabilų stiebą ir kilpinę struktūrą ( G=- 53. 6 kkal), yra aukščiau saf geno, nuo nt 90 iki nt 135. Kita invertuota pasikartojanti seka stebėta pasroviui nuo ORF1 terminacijos tripleto ir tęsėsi nuo 637 iki 697 nukleotidų ( G=- 38. 4 kkal).
[0069] Saf genas turi dideli, G+ C kieki, ( 76. 3%) ir žymėtus genus ( Hopwood et al., Regulation of Gene Expresion 25 Years on, Cambridge University Press, p. 251- 276, 1986).
[0070] Esančio prieš srovę nuo ORF1 DNR fragmento promotorinia aktyvumas
[0071] Kadangi plazmidės, neturinčios BqlII - Sstl fragmento ( nuo nt 1 iki nt 216), ekspresavosi tik viena orientacija ( plazmidės pULADlO ir pULAD14), bet ne priešinga ( plazmidės pULAD9 ir pULAD13), atrodo tikėtina, kad ORF1 promotorius yra tame fragmente. Transkripcijos iniciacijos sekos buvimas šioje srityje įrodytas subklonuo j ant ši, fragmentą i, promotoriaus zondinę plazmidę pIJ486 ( Ward et al., MOL. GEN. GENET. 203:468- 478, 1986), turinčią aminogliukozido fosfotransferazės geną ( neo) be promotoriaus. Šio geno ekspresija sąlygoja S . lividans atsparumą kanamicinui ir neomicinui. Bql II fragmentas subklonuotas į pIJ48 6 ( SstI galas proksimaliai neo genui) ( plazmidė pavadinta pIJ 486:216). S. lividans, transformuotas pIJ486:216 galėjo augti MM, turinčioje daugiau negu 100 mkg/ml kanamicino, tuo tarpu S. lividans, turintis pIJ486, neauga MM, turinčioje 5 mkg/ml kanamicino. Tai rodo, kad fragmentas BglII-SstI pasižymi promotoriaus aktyvmu. Tačiau nukleotidinės homologijos su kitais Streptomyces promotoriais tyrimai neišryškino tipiško - 10 ar -35 sričių "konsensuso" (Hopwood et al., Regulation of gene Expresion 25 Years On, Cambridge University Press, p. 251-276, 1986).
[0072] Dabar nustatyta S.griseus IMRU 3570 amilazės geno ( amy) nukleotidinė seka. Visa nukleotidų seka ir išvesta S. qriseus amilazės geno produkto aminorūgščių seka parodyta Fig. 11. Baltymas su lyderiniu peptidu turi 566 aminorūgštis ( nuo nt 318 iki nt 2155, abu įskaitant), kas atitinka 59,713 D PM. Plazmidė pULADVl, turinti visą a-amilazės geną, sukonstruota, skaidant S.griseus IMRU 3570 DNR su Sau3A, ir išskiriant nuo 3 iki 9 kb frakcijas bei liguojant su BqlII-suskaidyta pIJ699. Po a-amilazės aktyvumo skryningo atrinkta plazmidė pULTVl, turinti visą a-amilazės geną. Šios plazmidės pULTVl konstrukcija pateikta Fig. 12. Kitas plazmidės su visu a-amilazės genu gavimo būdas yra jos konstravimas iš dviejų mažesnių fragmentų. Tarp plazmidžių, gautų klonuojant S.griseus DNR biblioteką yra tokių plazmidžių, kurios turi dalini, geną, prasidedanti 5'-gale, ir tokių, kuriose dalinis genas prasideda 3'-gale. Iš pirmojo galima gauti 1.3 kb fragmentą BanHI- SacI, i, kuri, i,eina geno 5' galas, o iš antro galima išskirti 1.2 kb SacI-SalI fragmentą, turinti, šio geno 3'-galą. Abu fragmentai gali būti sujungti su pIJ2921, paveikta SalI-Ba/nHI, kad gautume plazmidę su intaktiniu a-amilazės genu (pULTV200).
[0073] Tam, kad išbandytume amy geno ekspresiją, kontroliuojant įvairiems promotoriams, tyrėme kamienų S. lividans JI66 amilazės gamybą. Šis amy genas pateiktas įvairių promotorių kontrolei, ir amilazės gamyba lyginta su gamyba, gauta kontroliuojant savam gamtiniam promotoriui ( PamY) . Tirti saf geno ( Psaf), Kmr geno (Pneo), sintezės PABA genų ( Ppab) ir E. coli p-galaktozidazės geno ( Plac) promotoriai. Plazmidė pULTV220, turinti amilazės geną be promotoriaus, gauta, liguojant fragmentą EcoRI-BglII, išskirtą iš pULTV200, su 5 EcoRI-BamlII suskaidyta pUC18. Fragmentas EcoRI-HindlII iš pULTV220 liguotas tiesiog su saf, pab arba Kmr genų promotoriais, kad gautume atitinkamai plazmides pULVDlO, pULVAl ir pULTV80. pULTV150, turinti lac promotorių, gauta pULTV220 skaidant HindlII ir liguojant su 5 kb pIJ699 tfindlll fragmentu.
[0074] Gautų plazmidžių gamybos tyrimai atlikti lėkštelėse su terpe MM+krakmolas(1%)+tiostreptonas, MM be fosfato+ krakmolas+tiostreptonas ir MM+krakmolas(1%)+tiostrep-tonas+IPTG. Kontrolei naudotos plazmidės pIJ699, pULTVIOO (žiūr. Fig. 6a) ir pULTVl. Santykiniai amilazės gamybos matavimai atlikti, įvertinant žiedo apie kiekvieną koloniją, atsiradusio augimo terpę nudažius su I2, plotą.
[0075] Įvairių konstrukcijų plazmidžių gamybos grafikai pateikti Fig. 13. Išskyrus kontrolę, didžiausia gamyba stebėta terpėje M(1 mM P)+krakmolas+tiostreptonas. Aiškiai matyti, kad gamybos maksimumas gautas panaudojus pULVDlO, kuri turi saf geno promotorių
[0076] (1482 mm 2 , palyginus su 1335 mm 2 kito geriausio producento pULTV150, turinčio Plac promotorių, inkubuojant 114 valandų).
[0077] Fig. 13 (žemutinis panelis, dešinėje) pateiktas pULVDlO gamybos lygis, palyginus su kontrolėmis, esant geriausioms kiekvienai konstrukcijai žinomoms sąlygoms. pULVDlO gamybos padidėjimas, lyginant su gamtinio pULTVl gamyba, yra gana žymus: 1482 mm2, palyginus su 1105 mm2.
[0078] Tokiu būdu, saf geno promotorius gali būti panaudotas pakeisti kitus, nuosavus, gamtinius promotorius, kad būtų padidinta įvairių endogeninių Streptomyces polipeptidų ir baltymų ekspresija. Panašiai, galima tikėtis, kad įterpus svetimą DNR, saf geno promotorius duos panašius pagerintus rezultatus, kaip tai parodyta su amilaze.
[0079] Tam, kad būtų ekspresuojamas svetimas polipeptidas arba baltymas, geriausia įterpti svetimą DNR i, tinkamą endogeninio geno, koduojančio iš ląstelės išskiriamą fermentą, atpažinimo saitą taip, kad būtų gauta svetimo polipeptido arba baltymo sekrecija. Kai šiuo genu yra amilazės genas, tinkamu atpažinimo saitu yra Bst E II saitas (Fig. 11). Svetima DNR įterpiama tokiu būdu, kad būtų išsaugoti sekrecijos signalai tiek, kiek įmanoma, iš ląstelės išskiriamo fermento geno. Kadangi šie signalai išdėstyti daugiausia lyderinėje sekoje, akivaizdu, kad amilazės geno atveju terminalinis karboksilinis galas taip pat svarbus sekrecijai. Tokiu būdu, gali būti geriau sukurti sulietą baltymą, įterpiant svetimą DNR į endogeninę DNR, negu pašalinti endogeninės DNR transkripcinę dalį ir pakeisti ją svetima DNR.
[0080] Žinoma, kad saf genas kontroliuoja iš ląstelės išskiriamų fermentų gamybą chromosominėje DNR. Matyt, chromosominėje DNR yra atpažinimo sekos, kurios
[0081] atpažįsta SAF polipeptidą ir sukelia iš ląstelės išskiriamo fermento gamybos padidėjimą. Saf geno kombinacija su amilazės genu plazmidėje neiššaukia amilazės padidintos gamybos. Tokiu būdu, geriau patalpinti svetimą baltymą, sujungtą su sekrecijos seka endogeninio iš ląstelės išskiriamo fermento, kontroliuojamo SAF, ir geriausia toliau sujungti su saf promotoriumi (nesant nuosavo promotoriaus) , d, chromosominę DNR, vietoje plazmidės. Tuo būdu, svetimo polipeptido arba baltymo gamyba bus toliau sustiprinta gamtiniu SAF. Tolimesniame darbo etape saf genas bus plazmidės pagalba įterptas i, tuos pačius organizmus, kuriuose svetima DNR seka buvo įterpta į chromosominę DNR. Tai užtikrins svetimo polipeptido arba baltymo padidintą sekreciją.
[0082] DNR fragmentai gali būti klonuoti i, Streptomyces chromosominę DNR bet kurio iš žinomų Streptomyces bakteriofaginių vektorių pagalba, tokių kaip 0C31 arba R4 (Chater et al., "Gene cloning in Streptomyces" in Gene Clonin in Organisms Other than E. coli, ed. by P.H.Hofschneider et al., Springer-Verlag, Berlin, 1982, p.87-95). Fig. 14 diagrama rodo geriausią svetimo baltymo sekrecijos gavimo būdą, šiuo atveju CRF, iš Streptomyces. KC 400 yra 031 darinys, kuris neturi surišimo saito (att ) ir turi C -f geną. Zxiur. Charter, K.F. et al., "Mutational cloning in Streptomyces and the isolation of antibiotic production genes", Gene, 26:67-78 (1983). C+ genas koduoja represorių, reikalingą lizogeninei būsenai palaikyti. Saitas att laukinio tipo fage sąlygoja fago prisijungimą prie ląstelės-šeimininkės DNR bei išsilaisvinimą iš ten. Be att saito šis fagas negali integruoti i, šeimininko chromosomą, kol joje neklonuotas homologinis DNR fragmentas. Tam kamiene-šeimininke gali būti panaudotas bet kuris endogeninis genas ir, tuo būdu, jis paprastai žymimas "genas X" Fig. 14. Fagas 031 KC 400 paruošiamas žinomais būdais (žiūr. Hopwood, D.A. et al., "Genetic manipulation of Streptomyces A Laboratory Manual", The John Foundation, Norwich, U.K. (1985)), tam, kad būtų įterptas geno (geno X) homologinis fragmentas, kaip ir geno turinčio saf promotorių ir endogenini, a-amilazės geną su genu CRF, sujungtu skaitymo rėmelyje su a-amilazės genu. Užkrėtus Streptomyces kamieną-šeimininką, geriausia S. caelicolor A3(2) (turimą kolekcijoje John Innes Institute, Norwich, U.K.), šiuo fagu visa fago DNR bus įterpta i, ląstelės-šeimininkės chromosominę DNR, pradedant homologinio geno X, šiam tikslui geriau panaudojant Campbell tipo rekombinaciją. Kaip nurodyta, visi naudojami būdai šių procedūrų įgyvendinimui yra šios srities specialisto žinių ribose, taip kad toks įterpimas gali būti atliktas tiesiogiai be nereikalingo eksperimentavimo.
[0083] Ląstelės su įterptu chromosominiu genu po to paveikiamas taip, kad galima būtų įterpti plazmidę pULAD3. Tokios ląstelės ekspresuos SAF polipeptidą, kuris savo ruožtu padidins chromosominio geno a-amilazės sekreciją. Saf promotoriaus, esantis šiame gene toliau didins a-amilazės sekreciją. Išskirta a-amilazė turės prijungtą prie CRF molekulę, kuri gali būti lengvai atskirta paveikus atitinkamu fermentu.
[0084] Nors Streptomyces a-amilazės genas pateiktas pavyzdžiu, tačiau reikia suprasti, kad norint padidinti ekspresiją saf promotoriaus pagalba, galima panaudoti Streptomyces, bet kokio polipeptido ar baltymo geną ir jį modifikuoti pašalinant jo gamtinų promotorių ir pakeičiant saf promotoriumi. Panašiai svetimas polipeptidas ar baltymas gali būti įterpti į bet kurį iš endogeninių genų. Geriau, kai parenkamas toks endogeninis genas, kuris ekspresuoja sekretuojamą baltymą, šiuo atveju svarbu išsaugoti sekrecijos signalinę seką. Geriausi rezultatai bus gauti, kuomet pasirinktas genas svetimo geno įterpimui yra SAF promotoriaus valdomas ir kuomet įterpiama i, chromosominę DNR, be to, panaudojant konkurentinį plazmidės, turinčios saf geną, įterpimą.
[0085] Nors CRF buvo paminėtas specialiai, reikėtų suprasti, kad svetima DNR seka gali būti bet kuri ne iš Streptomyces išskirta DNR seka, koduojanti baltymą arba polipeptidą, ypač eukariotinės arba virusinės prigimties. Tokių eukariotinių ir virusinių DNR sekų pavyzdžiai yra sekos, koduojančios žmogaus ir gyvulio leukocitų interferonus (IFN-a), fibroblastų interferonus (INF-(3) ir imuninius interferonus (INF-y) , žmogaus insuliną, žmogaus ir gyvulio augimo ir kitus hormonus, pavyzdžiui, kartikotropiną išlaisvinanti, faktorių (CRF), žmogaus serumo albuminą ir įvairius žmogaus kraujo faktorius ir plazminogeno aktyvatorius, bei audinių, urokinazės, hepatito B viruso šerdies ir paviršiaus antigenus, FMD viruso antigenus ir kitus žmogaus, gyvūnų ir virusinius polipeptidus ir baltymus.
[0086] Nors saf promotoriui teikiama pirmenybė, svetimo polipeptido arba baltymo gamyba toliau bus didinama, transformuojant ląsteles-šeimininkus ekspresijos vektoriumi, turinčiu saf geną. Ekspresijos vektorius gali būti šios ląstelės plazmidės DNR. Tuo būdu, gali būti panaudotas endogeninis arba bet kuris kitas promotorius, ir bus gauta svetimo polipeptido arba baltymo sekrecija.
[0087] Šis konkrečių įgyvendinimų aprašymas taip atskleidžia bendrą išradimo esmę, kad kiti, panaudodami savo žinias šioje srityje, galės lengvai modifikuoti ir/arba pritaikyti išradimą įvairiems kitiems panaudojimams konkrečių kitų įvairių įgyvendinimų forma, neatsitraukdami nuo bendros koncepcijos, todėl tokios adaptacijos ir modifikacijos įjungiamos į atskleistų
[0088] įgyvendinimų reikšmę ir apimti,. Taip pat reikėtų suprasti, kad šio išradimo frazeologija ir terminologija panaudota ne apribojimams, o aprašymo aiškumui.
[0089]
[0090] 1. Hoffman, C.S., Wright.l985. Fusion of secreted proteins to alkaline phosphatase: an approach for studying protein secretion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5107-5111. 2. Messing, J., R. Crea, and P.H. Seeburg. 1981. A system for shotgun DNR seąuencing. Nucl. Acids. Res. 9:309-321. 3. Katz, E., C.J. Thompson, and D.A. Hopwood.1983. Cloning and ecpression of the tyrosinase gene from Streptomyces antibioticus in Streptomyces lividans. J. Gen. Microbiol.129:2703-2714. 4. Kieser, T., and R.E. Melton.1988. Plasmid pIJ699, a multicopy positive-selection vector for Streptomyces. Gene 65:83-91. 5. Hopwood, D.A., M.J..Bibb, K.F. Chater, T. Kieser, C. J. Bruton, H.M. Kieser, D. J. Lydiate, C.P., Smith, J.M. Ward, and H. Schrempf 1985. Genetic manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, U.K. 6. Ward, J.M., G.R. Janssen, T. Kieser, M.J. Bibb, M.J. Butner, and M. J. Bibb.1986. Construction and characterization of series of multi-copy promoter-prober plasmid vectors for Streptomyces using the aminoglycoside phosphotransferase genes from Tn5 as indicator. Mol Gen. Genet. 203:468-478. 7. Yanisch-Perron, C., J. Vieira, and J. Massing.1985. Improoved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide seąuences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. GENE 33:103-119. 8. Messing, J.1983. New M13 Vectors for Cloning. Methods Enzymol.101:20-78.
[0091] Streptomycos livid& na KULTŪRŲ TRANSFORMUOTŲ ĮVAIRIOMIS
[0092] PLAZMIDĖMIS BALTYMO- NEŠĖJO ( AMILAZĖS) KIEKYBINIS ĮVERTINIMAS KULTŪROS TERPĖSE ( SUPERNATANTUOSE)
[0093] Mes naudojome tris skirtingus būdus išskirto baltymo kiekiui nustatyti: 1. Nudažytų sudabru baltymo juostų SDC-PAGE geliuose arba tų pačių gelių fotonegatyvų (juostų) spektrodensitometrija, panaudojant Shimadzu spektrodensitometrą. 2. Įvairių baltymų kiekių analizė, panaudojant aukšto slėgio skystinę chromatografiją, įrengtą su kolonėle C8 Aąuapore RP-300 (200x4.6 nm: Brownlee Labs, USA) . 3. HPLC analizė, panaudojant molekulinę Sievino (gelio filtracija) kolonėlę Protein Pak 300 SW.
[0094] S. lividans (pULTVUOO) , S. lividans (pULVDlO) ir S. lividans (pULTV80) sporos inokuliuotos i, Lechevalier + 1% krakmolo terpę. Maksimalus amilazės aktyvumas gautas atitinkamai per 36, 60 ir 60 fragmentacijos valandas. Bendras baltymo kiekis beląsteliniame skystyje (supernatante) nustatytas Bradford metodu. 5 |ig proteino iš kiekvienos terpės ištirta SDS-PAGE ir nudažyta sidabru.
[0095] 1. Spektrodensitometrija atlikta S. lividans (pULTVIOO)
[0096] S. lividans ( pULTV80 ( 5 jig proteino) supernatantų SDS-PAGE ( 10% akriliamido) juostų spektrodensitometrij a. 2. Aukšto slėgio skystinės chromotografijos (HPLC) kolonėlėje Avruapore RP- 300- baltymai eliuoti panaudojant 50 mM acto rūgšties- amonio acetato buferi, ir metanolio gradientą; 0- 20 min. 0% metanoli, ; 30- 35 min. 100% metanoli, ; 45 min. 0% metanoli,. Amilazė eliuota 100% metanoliu per 33- 34 min. Rezultatai parodyti 3- ioje lentelėje. 3. HPLC proteine- Pak 300 SW - tų pačių darinių, kaip aukščiau kultūros terpių supernatantai, dializuoti ir koncentruoti liofilizacija. Baltymai išplauti acto rūgšties- amonio acetato buferiu su srauto greičiu 0. 5 ml/ min. Amilazės eliucijos piko centras 21- 22 min.
1. Grynas polipeptidas, turintis tokią aminorugščių seką:
2. DNR seka, besiskirianti tuo, kad ji koduoja polipeptidą pagal 1 punktą.
3. DNR seka, turinti tokią nukleotidinę seką:
4. DNR seka, besiskirianti tuo, kad ji hidridizuoja su nukleotidine seka pagal 3 punktą ir koduoja SAF tipo polipeptidą.
5. Vektorius, besiskiriantis tuo, kad jis turi DNR seką pagal 2 punktą.
6. Vektorius pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad DNR seka apribota reguliacijos vienetais.
7. Vektorius pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad reguliacijos vienetas prieš srovę ATG turi tokią polipeptidinę seką:
8. Streptomyces ląstelė-šeimininkė besiskirianti tuo, kad ji transformuota vektoriumi pagal 5 punktą.
9. Polipeptido gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad polipeptidą gauna kultivuojant ląstelę-šeimininkę pagal 8 punktą.
10. Vektorius, besiskiriantis tuo, kad jis turi DNR seką pagal 3 punktą.
11. Vektorius pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad DNR seka apribota reguliacijos vienetais.
12. Vektorius pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad reguliacijos vienetas turi tokią nukleotidinę seką:
13. Streptomyces ląstelė-šeimininkė, besiskirianti tuo, kad ji transformuota vektoriumi pagal 10 punktą.
14. Polipeptido gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad polipeptidą gauna, kultivuojant ląstelę-šeimininkę pagal 13 punktą.
15. Vektorius, besiskiriantis tuo, kad jis turi DNR seką pagal 4 punktą.
16. Vektorius pagal 15 punktą, besiskiriantis tuo, kad DNR seka apribota reguliacijos vienetais.
17. Vektorius pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo, kad reguliacijos vienetas prieš srovę ATG turi tokią nukleotidinę seką:
18. Streptomyces ląstelė-šeimininkė, besiskirianti tuo, kad ji transformuota vektoriumi pagal 15 punktą.
19. Polipeptido gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad polipeptidą gauna kultivuojant ląstelę-šeimininkę pagal 18 punktą.
20. Plazmidė pULAD3, deponuota CNCM (Prancūzija) 1989 05 19, Nr.1-859.
21. Promotorius, besiskiriantis tuo, kad jis turi tokią DNR seką:
22. Klonuojamas vektorius, besiskiriantis tuo, kad turi DNR seką, koduojančią polipeptidą arba baltymą, besijungianti, su promotoriumi pagal 21 punktą.
23. Klonuojamas vektorius pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR seka yra viena iš Streptomyces kamienų endogeninių sekų.
24. Klonuojamas vektorius pagal 22 punktą, b e s i s k iriantis tuo, kad minėta DNR seka turi visą arba dali, sekos, koduojančios polipeptidą arba baltymą, endogeniniu Streptomyces, prie kurios buvo prijungta tame pačiame skaitymo rėmelyje DNR seka, koduojanti ne Streptomyces polipeptidą arba baltymą.
25. Streptomyces ląstelė-šeimininkė, besiskirianti tuo, kad ji transformuota klonuojamu vektoriumi pagal 22 punktą.
26. Streptomyces ląstelė-šeimininkė, besiskirianti tuo, kad ji transformuota klonuojamu vektoriumi pagal 23 punktą.
27. Streptomyces ląstelė-šeiminikė, besiskirianti tuo, kad ji transformuota klonuojamu vektoriumi pagal 24 punktą.
28. Svetimos DNR sekos ekspresijos Streptomyces kamiene būdas, besiskiriantis tuo, kad jis numato operatyvų nurodytos svetimos DNR sujungimą su Streptomyces seka, kontroliuojančia ekspresiją, įjungiančiai promotorių pagal 21 punktą.
29. Ekspresijos būdas pagal 28 punktą, besiskiriantis tuo, kad svetima DNR seka ir Streptomyces ekspresijos kontrolės seka yra įterpiamos chromosominę Streptomyces DNR.
30. Ekspresijos būdas pagal 29 punktą, besiskiriantis tuo, kad Streptomyces toliau įjungia plazmidę, galinčią išskirti SAF tipo polipeptidą.
31. Ekspresijos būdas pagal 28 punktą, besiskir i a n t i s tuo, kad minėta svetima DNR seka yra operatyviai sujungta su minėta Streptomyces ekspresijos kontrolės seka per DNR seką, koduojančią bent dalį baltymo arba polipeptido, sekretuojamo Streptomyces, ir minėta DNR seka, koduojanti šią signalinę seką, išskiriama kartu su nurodyta svetima DNR seka, reguliuojant minėtai Streptomyces ekspresijos kontrolės sekai, kad įvyktų šio baltymo arba polipeptido, koduojamo šia DNR seka, sekrecija.