[LT] Šiame išradime aprašomas celiuliozinės medžiagos frakcionavimo būdas, gautos frakcijos ir skaidulinių kultūrų apdorojimo būdas, panaudojant šias frakcijas tiek vienas, tiek kartu su naudingais mikroorganizmais.
[EN]
[0001] Šis išradimas yra susietas su skaidulinių kultūrų, kurias vartoja atrajojantys ir vienskrandžiai gyvuliai, maistingosios vertės pagerinimu, apdorojant naujais fermentiniais preparatais. Tiksliau sakant, išradimas susietas su celiulazės fermentų, gautų iš Trichoderma rūšies (kaip pavyzdys, bet nebūdingas), išskirstymu siekiant padidinti jų efektyvumą mikrobams paimant energiją iš celiuliozės ir hemiceliuliozės atrajotojų didžiajame skrandyje ir/arba pagerinant vienskrandžių ir atrajojančių vienskrandžių gyvulių, neturinčių fermentinės sistemos, galinčios susidoroti su skaidulomis, pašaro įsisavinimo procesą. Dar daugiau, šie nauji fermentiniai produktai gali būti panaudoti apdorojant skaidulines kultūras konservavimo metu ir pagerinant silosą, o taip pat apdorojant konservuotą derlių prieš pat šėrimą. Išradimas taip pat susietas su minėtų fermentinių gaminių paruošimo būdais.
[0002] Kai skaidulinės kultūros subręsta, energijos, gaunamos iš žemės ploto vieneto, kiekis padidėja, bet metabolinė energija, t. y. celiuliozės ir hemiceliuliozės kiekis sumažėja dėl augalų sumedėjimo, kurio metu celiuliozė, esanti augalų ląstelių sienelėse, sumedėja dėka sudėtingų skersinių ryšių. Dėl to gyvuliai žymiai prasčiau įsisavina sausus komponentus. Todėl, nežiūrint i, tai, kad ekonominiu požiūriu derlius turi būti nuimtas subrendęs, kai yra didžiausia sausų medžiagų išeiga, energijos įsisavinimo apribojimas priverčia nuimti derlių dar nepakankamai subrendusi, su mažesne sausų medžiagų išeiga. Dėl mažo sausų medžiagų kiekio iškyla problemos konservuojant. Suardant fermentais tuos skersinius ryšius tarp celiuliozės elementų, galima nuimti ir labiau subrendusi, derlių, padidinant išeigą ir nepamažinant, kaip paprastai būna, įsisavinimo galimybės. To paties proceso metu gali atsirasti cukrus, kurį gali naudoti siloso mikrobai, tuo pagerinant tokio derliaus konservavimą nepalankiomis oro sąlygomis, kai sausų medžiagų kiekis yra mažas.
[0003] Skaidulinių kultūrų (žolės, ankštinių augalų, visų javų - kukurūzų, sorgo ir t. t.) išsaugojimas vėlesniam panaudojimui šeriant iš esmės priklauso nuo vandens pašalinimo džiovinant (šienas ir panašūs dalykai) arba nuo sudarymo kliūčių orui patekti ir apsaugojimo masės rūgimo toje vietoje, kur epifitinių ardančių mikro-organizmų (mielių, pelėsių ir bakterijų) veikla yra kontroliuojama, augalų medžiagos fermentų veikla apribota. Praktiškai reikalingas pH mažesnis kaip 4,2 yra gaunamas pridedant rūgšties i, derlių arba dėka rūgšties, kurią pagamina epifitiniai mikroorganizmai fermentavimo metu.
[0004] Pastarosios nuostatos dėl aplinkos apsaugos riboja rūgščių panaudojimą. Šias aplinkosaugos nuostatas stiprina tokios plačiai naudojamos rūgštys kaip skruzdžių rūgštis. Šios rūgštys padidina rūgšties išsiskyrimą iš drėgno derliaus.
[0005] Alternatyva yra susieta su natūralia fermentacija. Tačiau natūrali fermentacija būna įvairi ir kartais nepatenkinama. Pavyzdžiui, derliuje, kuriame yra cukraus substratų, gali vyrauti nereikalingi epifitai ir gali trūkti reikalingų pieno rūgšties bakterijų. Būtinos pieno rūgšties bakterijos, t. y. homopieno bakterijos, iš esmės gamina pieno rūgšti,. Ši pieno rūgšties gamyba sumažina pH, nesumažinant bent kiek žymiau maistingosios vertės, ypač proteino kokybės. Priešingu atveju, kai vyrauja epifidai, pH sumažinamas labai nežymiai ir gali nepasiekti pakankamai žemos vertės. Tai daro įtaką maistingosioms savybėms ir tuo pačiu gyvulių sugebėjimui įsisavinti medžiagas.
[0006] Šią situaciją galima pagerinti pridedant tiek būtinų pieno rūgšties bakterijų i, derlių, kad jos vyrautų prieš epifitus. Bet šis metodas nepadeda, kai derliuje yra mažai cukraus. Galima pridėti vandenyje tirpstančių angliavandenių, kurių reikia pieno rūgšties bakteri-joms. Pavyzdžiui, galima pridėti melasos, krakmolo ar cukraus, tokio kaip gliukozė, laktozė ar sacharaozė. Tačiau dėl to iškyla kitos problemos. Bendru atveju reikia dėti daug cukraus, t. y. 10-20 kilogramų cukraus tonai derliaus arba tarp 35 ir 45 kilogramų melasos tonai derliaus. Labai sunku toki, dideli, kieki, klampios medžiagos įterpti į derlių. Taip pat sunku tolygiai įterpti sausas medžiagas. Kai kurie priedai, tokie kaip gliukozė, laktozė ir sacharozė yra per brangios vartoti tokiu būdu. Be to, pieno rūgšties bakterijos efektyviai nenaudoja krakmolo, nebent yra tam tikras kiekis amilazės, kuri verčia krakmolą į cukrų.
[0007] Sudėtingiems angliavandeniams derliuje skaidyti i, paprastą cukrų kaip alternatyvą galima naudoti fermentus. Pieno rūgšties bakterijos gali naudoti tokiu būdu gautą cukrų ir gali vyrauti fermentacija. JAV patente Nr. 4 751 089 (autoriai Heikonen ir kiti) yra siūlomas metodas, kaip silosuoti pašarus ir grūdus, pridedant gliukozės oksidazės. Gliukozės oksidazė gamina gliukoninę rūgšti, iš gliukozės tirpiuose angliavandeniuose. Gliukoninės rūgšties kaupimas mažina pH. Pagal minėtą JAV patentą kiti fermentai, tokie kaip celiulazė, hemiceliulazė ir B-gliukozidazė gali būti pridėti tikslu padidinti gliukozės gamybą.
[0008] Ląstelieną ardančių fermentų panaudojimas tikslu apsaugoti ir padidinti silosuoto pašaro maistingąsias vertybes ir pagerinti apdoroto pašaro skoni,, įsisa-vinimą bei virškinimo spartą taip pat buvo aprašytas JAV paraiškoje Nr. 510 506, pateiktoje 1990 m. balandžio 18 d. Fermentinė sudėtis, aprašyta šioje paraiškoje, apima bent vieną fermentą iš grupės, susidedančios iš pektinazės, celiulazės, ksilazės amilazės, arabinozidazės, kutinazės, lipazės ir esterazės ir gali būti naudojama kartu su homopieno bakterij omis.
[0009] Tačiau ląstelieną ardantys fermentai gali sukelti nepageidautinus šalutinius reiškinius, kai jie yra įdedami į skaidulines kultūras, kuriose yra mažai (t. y. mažiau kaip 25%) sausų medžiagų, būtent nesubren-dusiame derliuje. Pavyzdžiui, ląstelieną ardantys fermentai gali padidinti ištekančių medžiagų tėkmę. Ištekančiose medžiagose yra tirpios ląstelinės ,medžia-gos . Dėl šių medžiagų ištekančioms medžiagoms būdingas didelis BOD (biocheminis deguonies poreikis), o tai gali sukelti gamtosaugos problemas. Be to, ištekančių medžiagų praradimas sumažina derliaus maistingąsias vertybes. Šie fermentai taip pat gali padidinti pieno rūgšties vertę ir taip pakeisti skaidulinę struktūrą, kad net sumažina gyvulių galimybę įsisavinti. Be to, dėl padidėjusio cukraus kiekio, kuri, pagamina fermentai, gali geriau augti mielės ir pelėsiai. Padidėjęs mielių ir pelėsių augimas gali sumažinti aerobini, stabilumą ir pagaminti pavojingus mikotok-sinus .
[0010] Efektyvumas, su kuriuo gyvuliai įsisavina skaidulas, priklauso nuo mikrobų populiacijos mišinio didžiajame skrandyje. Mikrobų populiacijos sudėtis priklauso nuo pašaro. Galutinių mikrobų poveikio energijos šaltiniams rezultatu yra lakių riebiųjų rūgščių gamyba, kurios veikia kaip pirmtakas gyvulio audiniuose tiekiant energiją metaboliniams procesams ir sintezuojant gyvulinius produktus, t. y. pieną, mėsą ir vilną. Šių produktų gamybos efektyvumas priklauso nuo lakių riebiųjų rūgščių proporcijų, ypatingai acto, propano ir butano rūgščių.
[0011] Pašarai, kuriuose yra daug krakmolo ir/arba cukraus skatina butano ir propano rūgščių sintezę, o skaidulos
[0012] ■skatina acto rūgšties sintezę. Reikalingas didžiojo skrandžio fermentacijos tipas priklauso nuo gyvulio gaminamo produkto. Todėl galimybė keisti maitinančiąją terpę ekonomine prasme yra pirmo svarbumo dalykas, ypač galimybė keisti šiuo aspektu skaidulų reaktyvumą, kadangi tai yra pati pigiausia energijos forma.
[0013] Vienskrandžiams gyvuliams skaidulos nėra gatavas energijos šaltinis, bet jos yra daugelyje krakmolo šaltinių, t. y. grūdų. Skaidulos taip pat yra labai svarbios, palaikant normalią žarnyno veiklą. Tai susiję su skaidulų reaktyvumu, t. y. katijonų apykaitos geba. Galimybė išlaisvinti energiją iš maisto skaidulinių frakcijų ir pagerinti jo reaktyvumą yra labai svarbus dalykas, susijęs su vienskrandžių gyvulių šėrimu ir jų sveikata.
[0014] Fermentiniai produktai, skirti pašarui su mažu kiekiu sausų medžiagų išsaugoti ir pašaro įsisavinimui pagerinti iškelia dvi pagrindines problemas. Visų pirma, efektyviame silosavimo procese fermentai turi užtikrinti reikalingą pH, pieno rūgšties ir anglia-vandenių koncentracijas ir tuo pačiu mažinti ištekėj imą.
[0015] Pašaro apdorojimas pilnu ląstelieną ardančių fermentų mišiniu sumažina skaidulų kieki, silose tirpdant polimerinius angliavandenius. Dėl ypač efektyvaus įsisavinimo visos ląstelių sienelės suyra ir dėl to išteka visos medžiagos su dideliu cukraus kiekiu. Silosavimo metu stimuliuojamas fermentavimas, kaupiasi pieno rūgštis ir pH. Tokiomis sąlygomis bakterijos nuslopintos, bet fermentai toliau gamina monomerinius angliavandenius, kurių dalis gali būti prarasta su ištekančiomis medžiagomis. Silosas, kuriame yra didelė pieno rūgšties koncentracija ir lengvai fermentuojamas cukrus, gali būti pavojingas atrajojantiems gyvuliams, kadangi gali sukelti pieno rūgšties acidozę ir medžiagų įsisavinimo sutrikimus.
[0016] Antra, norint užtikrinti efektyvų atrajojančių gyvulių didžiojo skrandžio darbą ir pašaro vartojimą, cukraus kiekis, prieinamas didžiojo skrandžio mikrobams ir skaidulų reaktyvumas turi būti optimizuoti.
[0017] Šio išradimo tikslas - užtikrinti tokį fermentų paruošimą įvairioms kultūroms, subrendimo laipsniams ir sausų medžiagų kiekiams, kuris neturėtų trūkumų, būdingų žinomiems paruošimo būdams. Jeigu kalbėti tiksliau, tai šio išradimo tikslas - užtikrinti tokias fermentų kombinacijas, kurios naudingai pakeistų augalų ląstelių struktūrą, užtikrintų tiktai silosavimui reikalingą kiekį; nepadidintų ištekėjimo; neskatintų miltelių arba pelėsių augimo; bet galėtų taip pakeisti augalų polimerų struktūrą, kad jie pasidarytų labiau pasiduodantys tolimesnei hidrolizei didžiajame skrandyje ir juos būtų galima lengviau įsisavinti vienskrandžiame virškinimo trakte.
[0018] Kitas šio išradimo tikslas - sukurti minėtų fermentinių produktų paruošimo būdus.
[0019] Su nuostaba aptikta, kad komercinių produktų žalingą efektą lemia tam tikros fermentų kombinacijos, esančios komercinės rūšies celiulazėse, naudojamose minėtuose produktuose. Išskiriant minėtus komercinius fermentus, pagal šį Išradimą gaunami nauji fermentiniai produktai, kurių kiekviename yra keletas skirtingų fermentų ir turi skirtingas savybes, pagal kurias galima atskirti kiekvienam atskiram tikslui tinkančias frakcijas.
[0020] Atskyrimo metodai, taikomi pagal šį išradimą, apima tuos metodus, kurie atskiria komercinės celiulazės dalis pagal proteinų jonu mainų savybes. Pavyzdžiui, yra naudingi chromatografiniai metodai, tokie kaip jonų mainų chromatografija. Naudingose dervose yra Q-Sefarozės ir Mono-Q (abi iš Pharmacia).
[0021] Celiulazės frakcijos įvairiomis kombinacijomis yra naudingos apsaugant skaidulinius pašarus ir pagerinant jų įsisavinimą, kai jais šeriami atrajojantys ir vienskrandžiai gyvuliai. Kiekviena celiulazinė frakcija turi būdingą jai fermentų rinkinį ir todėl skirtingai veikia skaidulinį derlių silosavimo metu ir taip pat skirtingai veikia didžiajame skrandyje ir plonosiose žarnose, kai suėdamas pašaras. Frakcijos gali būti naudojamos po vieną arba kelios iš karto ir/arba su atitinkamais naudingais mikroorganizmais, tokiais kaip mielių bakterijos. Jų parinkimas priklauso nuo reikalingo rezultato kiekvienu konkrečiu atveju. Šie produktai taip pat gali būti naudojami konservuotam pašarui prieš pat šėrimą.
[0022] Fig.l. Eliuato, gauto iš komercinės celiulazės anijonitinėje kolonėlėje, sugertis ties 280 nm. Fig.2. Proteinų komercinėje celiulazėje ir visose keturiose pagrindinėse frakcijose, gautose anijonitiniu chromatografiniu būdu, izoelektriniai taškai. Fig.3. Eliuato, gauto iš komercinės celiulazės, ir pastarosios keturių pagrindinių anijonitiniu frakcijų, gautų Mono-Q analitinėje anijonitinėje kolonėlėje, sugertis ties 280 nm.
[0023] Fig.4. Eliuato, gauto iš komercinės celiulazės frakcijos A CM-Sefarozės (Pharmacia) katijonitinėje kolonėlėje, sugertis ties 280 nm.
[0024] Komercinės rūšies ląstelieną ardančių fermentų mišiniuose (tokiuose, kaip pardavinėjami su prekiniu pavadinimu Cytolase-123 iš Genencor) paprastai yra daug įvairių fermentų. Ląstelieną ardančių fermentų, turin-čių komercinę vertę, mišiniai gaminami iš Trichoderma rūšies, pavyzdžiui Trichoderma longibrachiatum. Kiti ląstelieną ardančių fermentų mišiniai, gaunami iš -bakterinių ar kitų grybinių šaltinių, turi panašias savybes.
[0025] Fermentų frakcijų poveikis (naudojant jas po vieną ar kelias iš karto) pašarui, silosui bei gyvuliams buvo nustatytas matuojant dideli, kieki, parametrų. Svarbiausi parametrai, susieti su gyvuliais, yra išlaisvinto cukraus kiekis ir jo rūšys bei skaidulų struktūros pakitimai. Tai reguliuoja didžiojo skrandžio fermentacijos procesą ir pašaro įsisavinimą vienskrandžiame trakte. Matuojant skaidulų sugebėjimą išlaisvinti cukrų prieš ir po silosavimo, galima nustatyti pašaro vertės praradimą saugojimo metu. Jeigu struktūrizuotų angliavandenių didžioji dalis paverčiama i, rūgšti, silosavimo metu, tai konservavimas geras. Iš kitos pusės, tai sumažina energiją, prieinamą didžiojo skrandžio mikrobams, ir todėl sumažina maistingąją vertę. Optimali kombinacija turėtų būti tokia, kuri išlaisvina pakankamai cukraus, kad būtų užtikrintas geras silosavimas, ir tik pagerina didžiojo skrandžio veiklą. Svarbia charakteristika taip pat yra medžiagų ištekėjimo skatinimas, kuris susijęs su cukraus išlaisvinimo aktyvumu.
[0026] Kiekvienoje gautoje fermentų frakcijoje yra būdingas atskirų fermentų rinkinys, ir tos frakcijos skirtingai veikia skaidulinę struktūrą, skirtingai išlaisvina cukrų, skirtingai konservuoja silosą ir sukelia skirtingą ištekėjimą.
[0027] Remiantis minėtomis savybėmis, galima pasirinkti tinkamiausią frakciją kiekvienam konkrečiam tikslui. Derliui konservuoti turėtų būti pasirinktos frakcijos, kurios per 48 valandas padaro pH apie 4,0 ir sudaro toki, likusio cukraus kiekį, kuris palaiko lactobacilae komponentą. Pasirinktos frakcijos taip pat gali būti panaudotos tikslu pagerinti šviežio ar konservuoto skaidulinio derliaus maistingąją vertę prieš šėrimą. Medžiagų ištekėjimo problemą galima išspręsti pašalinant tas frakcijas, kurios skatina per didelį cukraus išsiskyrimą.
[0028] Silosuojant skaidulines kultūras, kurios turi mažai sausų medžiagų, tikslinga naudoti fermentų frakcijas B arba C, po vieną arba kartu, kadangi jos užtikrina reikiamą cukraus kiekį, kad gerai vyktų siloso fermentacija, nepadidinant medžiagų ištekėjimo. Frakcija A, nors ir truputį padidina medžiagų ištekėjimą, tačiau padidina'ir cukraus grandinėlių laisvų galų skaičių ir padaro skaidulas palankias tolimesnei fermentinei hidrolizei, kurią atlieka didžiojo skrandžio mikroorganizmai, o taip pat lengvesniam įsisavinimui vienskrandžiame trakte. Frakcija A, viena arba su B, su C arba su B ir su C pagerina didžiojo skrandžio priėjimą prie cukraus. Frakcija A taip pat pagerina skaidulų reaktyvumą, kai naudojama viena arba su B, su C arba su B ir C. Tokiu būdu, nors frakcijoms B, C arba BC taikoma pirmenybė konservuojant derlių su mažu sausų medžiagų kiekiu, kadangi nesukelia medžiagų ištekėjimo, tačiau, pridėjus frakcijos A, pagerėja skaidulų reaktyvumas ir maistingosios vertybės.
[0029] Tais atvejais, kai medžiagų ištekėjimas nesudaro problemos, t. y. silosuojamos skaidulinės kultūros turi sausų medžiagų virš 25%, galima naudoti vien tik frakciją A arba kartu su B, su C arba su B ir C, kai norima pagerinti derliaus išsaugojimą ir gyvulių sugebėjimą įsisavinti pašarus. Šios frakcijos kombinacijos taip pat gali būti naudojamos šviežių ar konservuotų skaidulinių kultūrų, apdorotų prieš šėrimą, maištingajai vertei ir stabilumui pagerinti.
[0030] Jeigu derlius turi mažai sausų medžiagų, tai medžiagų ištekėjimo problemą galima išspręsti pašalinant frakcijas A ir D. Dėl frakcijos D iš esmės žalingai išteka medžiagos. Frakcija D taip pat neigiamai veikia cukraus išlaisvinimą. Jos dėka per daug angliavandenių paverčiama cukrumi. Be to, frakcija D žymiai sumažina skaidulų aktyvumą.
[0031] Kai reikalinga staigiai padidinti cukraus išlaisvinimą, pavyzdžiui prieš gyvulių šėrimą, pirmenybė teikiama frakcijai D ir kombinacijoms su ja. Tai reikalinga atrajojantiems ir ypatingai vienskrandžiams gyvuliams.
[0032] Fermentiniai produktai pagal šį išradimą turi keletą pranašumų. Naudojant tinkamas fermentų frakcijas, pavieniui arba tinkamomis kombinacijomis (kartu su egzogeniniais mikroorganizmais ar be jų), žymiai geriau išsaugomos skaidulinės kultūros ir gyvuliai geriau įsisavina pašarus. Ypatingai verta pabrėžti keturis dalykus: pagerinamas derliaus konservavimas, galima išspręsti medžiagų ištekėjimo problemą, gali būti pagerintas cukraus išlaisvinimas ir gali būti pagerinta skaidulų reaktyvumo vertė. Tai pasiekiama, naudojant fermentinius produktus pagal šį išradimą.
[0033] Frakcionavimas atliktas 2 litrų Pharmacia Q-Sefarozės anijonito kolonėlėje. Kiekvienam ciklui 1 litras citolazės-123 (Genencor), kurioje yra apie 200 g proteino (pagal sugerti, ties 280 nm) su pH 5,2, buvo pakeistas iki pH 8 ir iki laidumo 20 nM tris-buferio. Tai padaryta ultrafiltarcijos būdu, o po to atskiedžiant vandeniu. Toks fermentų tirpalas supiltas į kolonėlę. Nesugerta medžiaga (frakcija A) buvo išplauta su maždaug 10 litrų 20 mM tris-buferiu. Sugertieji fermentai buvo išskirti, naudojant NaCl su tiesiniu gradientu 0-0,5 M, kurio bendras tūris apie 10 litrų. Kolonėlės eliuentas buvo surinktas. Surištos frakcijos buvo išskirtos, naudojant 20 mM tris-buferį, esant natrio chlorido koncentracijoms 80 mM (frakcija B), 150 mM (frakcija C) ir 500 mM (frakcija D). (Čia ir žemiau frakcijos vadinamos A, B, C ir D jų išskyrimo tvarka.) Frakcionavimo rezultatai parodyti grafiškai fig.1.
[0034] Frakcijose A, B, C ir D yra tokie proteino kiekiai (nustatyta pagal sugerti, ties 280 nm) :
[0035] Manoma, kad frakcijos D uodegoje (t. y. išskyrimas 0,3 M NaCl ir aukštesniame lygyje) proteino yra tiktai pėdsakai, o uodegoje stebimą sugėrimą lėmė mažo molekulinio svorio W sugeriančioji medžiaga.
[0036] Frakcijos buvo ištirtos, naudojant izoelektrini, fokusavimą geliuose siekiant atskirti proteinus turinčius izoelektrini, tašką tarp 3 ir 9. Šie rezultatai buvo panaudoti kaip pirštų atspaudai, siekiant palyginti frakcijas, gaunamas iš skirtingų atskyrimo stadijų. Gauti rezultatai parodyti grafiškai fig.l. Svarbiausios frakcijos taip pat buvo tiriamos analitine skystine chromatografija, naudojant Mono-Q, ir tai leido puikią skiriamąją gebą. Rezultatas grafiškai pavaizduotas fig.3.
[0037] Medžiaga, kuri buvo neabsorbuota Q-sefarozėje (frakcija A), buvo frakcionuota, naudojant katijonitinę CM-Sefarozės kolonėlę. Rezultatai parodyti fig.4. Citolazė buvo padalinta i, 4 frakcijas, naudojant Q-Sefarozę. Kiekvienoje iš šių frakcijų yra keletas skirtingų proteinų ir fermentų. Citolazės ir keturių frakcijų įvairaus aktyvumo pasiskirstymas parodytas 1 lentelėje. Matyti, kad citolazė-123 yra labai sudėtingas fermentų mišinys ir kad net aptiktos frakcijos yra daugiafermentės. Vėliau, jeigu reikia, frakcijos gali būti išvalytos, pavyzdžiui chromatografiniu būdu ar nusodinant.
[0038] Kitu būdu fermentai gali būti išskirti, naudojant besiskiriančias pH kombinacijas, druskos koncentracijas ir buferių koncentracijas bei tipus. Pavyzdžiui naudojant 20 mM tris-buferi,, kai pH yra 7,6, daugiau yra išskiriama i, kolonėlę surištų frakcijų B, C ir D, negu naudojant 20 mm druskos tirpalą frakcijai B, 115 mM - frakcijai C ir 500 mM - frakcijai D. Tačiau šių parametrų pakitimas nepakeičia tvarkos, kuria frakcijos išsiskiria iš kolonėlės po to, kai frakcija A buvo išplauta. Alternatyvios procedūros metu fermentai gali būti išskirti, palaipsniui keičiant pH, buferio ir druskos koncentracijas.
[0039] Nefrakcionuota citolazė ir frakcijos A, B, C ir D buvo ištirtos anlitine skystine chromatografija, naudojant Mono-Q kolonėlę (Pharmacia). Iš rezultatų matyti, kad frakcijos B, C ir D sudarytos iš daugiau kaip vieno komponento. Žiūrėkite fig.3.
[0040] Celobiohidrolazė I, celobiohidrolazė II ir endogliu-konazė I buvo identifikuotos, naudojant anti-celobiohidrolazėsl, anti-celobiohidrolazės II ir anti-endogliukonazės I atiserumą (žr. 1 lentelę).
[0041] Medžiaga, kuri nebuvo sugerta Q-Sefarozėje (frakcija A), buvo frakcionuota katijonitinėj e CM-Sefarozės kolonėlėje. Q-Sefarozės frakcijos A frakcionavimas CM-Sefaroze parodė, remiantis fermentų aktyvumo analize, kad medžiaga, kuri išsisikiria ties taškais 4,1 ir 4,2, turi eksterazės aktyvumą; medžiaga, kuri išsiskiria ties taškais 4,3, 4,4 ir 4,5, turi CMC; medžiaga, kuri išsiskiria ties taškais 4,4 ir 4,5, taip pat turi ksilosidazės aktyvumą; medžiaga, kuri išsiskiria maždaug ties tašku 4,4 turi arabinozidazės aktyvumą; madžiaga, kuri išsiskiria ties tašku 4,6, turi gliukozidazės (celobiozė) aktyvumą; medžiaga, kuri išsiskiria ties tašku 4,7, turi ksilanazės aktyvumą.
[0042] 2 pavyzdys. Fermentinių frakcijų, pagamintų iš cito-lazės- 123, įtaka siloso skaidulinei struktūrai ir cheminei sudėčiai
[0043] Tetraploidinė svidrė (tręšimas 120 kilogramų azoto i, hektarą) buvo rankomis nupjauta, naudojant sterilius būdus, transportuojama atšaldyta ir eksperimentas pradėtas praėjus 5 valandoms po nupjovimo. Sausų medžiagų buvo 13% svorio. Žolė buvo sukarpyta žirklėmis i, 1 cm gabaliukus ir sudėta į plastmasinius maišelius po 80 g šviežios žolės i, kiekvieną. Vienodi bandiniai buvo apdoroti visomis Citolazės-123 frakcijų A, B, C ir D kombinacijomis. Po apdorojimo fermentais žolė po 25 g buvo sudėta i, 160 ml serumo butelius, į kuriuos 5 minutes leistos anaerobinės dujos. Po to buteliai buvo užkimšti butilo guminiais kamščiais. Buteliai buvo laikomi 30°C temperatūroje 6 savaites, ir po to išskirtos neutralaus detergento skaidulos (NDF): Į butelius su apdorota žole pripilta 75 ml vandens, buteliai 1 valandą kambario temperatūroje purtomi, o po to jų turinys nufiltruojamas per stiklo filtrą. Filtratas buvo naudojamas įvairiems tyrimams, o nuosėdos toliau išskiriamos. Nuosėdų ekstrahavimas neutraliu detergentu vykdomas tokiu būdu: i) nuosėdos buvo kiekybiškai suspenduotos 100 ml tirpale (pH 7), kurio 1 litre buvo 19,6 g Titriplekso III, 3,6 g Na2B407, 4, 6 g Na2HP04, 30 g natrio dodecilsulfato ir 10 ml etilenglikolmonoetileterio, ir 40 minučių plakamas, esant 60°C temperatūrai; ii) ekstrakto temperatūra buvo staigiai pakelta iki 75°C ir jis karštas filtruojamas per stiklo filtrą; iii) tada nuosėdos išplautos 10 ml vandens purtant 15 minučių 60°C temperatūroje, o po to temperatūra staigiai pakelta iki 75°C ir suspensija nufiltruota; ši vandens procedūra pakartota; iv) po to nuosėdos buvo išskiriamos, naudojant 100 ml druskos tirpalą, kurio litre buvo 3,64 g KN03, 1,76 g KC1, 0,17 g NaN03, 1, 92 g Ca (N03) 2. 4H20 ir 1,96 g Mg(N03)2, 6H20; v) kai temperatūra nukrito nuo 60 iki 40°C, suspensija buvo nufiltruota; vi) vandens procedūra (punktas iii) pakartota 2 kartus; vii) nuosėdos buvo ekstrahuojamos 75 mililitrais acetono 15 min ir nufiltruotos; tai pakartota 4 kartus; viii) gauta NDF buvo per naktį džiovinama ant stiklo filtro, sujungta su vakuumu.
[0044] D- ir L- pieno rūgštys buvo išanalizuotos, Boehringer ir Mannheim GmbH fermentinio tyrimo įrenginiu ir tai atlikta pagal gamintojo siūlomą metodiką. Amonis buvo tiriamas iš pašarmintų bandinių, naudojant specifini, elektrodą amoniui.
[0045] Tirpus proteinas buvo tirtas Lowry metodu. Tirpūs cukrus buvo tiriami kaip trimetilsililo dariniai GLC DSCh metodu, naudojant kapiliarinę kolonėlę ir temperatūros programą. Buvo panaudotas vidinio etalono būdas su dviem vidiniais etalonais (eritritolio ir fenil-B-D-glikopiranozido).
[0046] Rezultatai apibendrinti ir pateikti 2 lentelėje.
[0047] Likusio cukraus kiekis nustatytas neapdoroto kontrolinio pavyzdžio atžvilgiu; teigiamos reikšmės reiškia koncentracijos padidėjimą, neigiamos sumažėjimą. Buvo ištirti monosacharidai ir disacharidai ir jų kiekis pateiktas kaip likusio cukraus. Likusio cukraus kiekis gali atspindėti viso išlaisvinto cukraus silose dėl galimo skirtumo jį suvartojant ir/arba siloso mikroorganizmų augimo.
[0048] Silosas buvo gerai apsaugotas ir turėjo pH apie 4 ar dar mažiau ir didelę pieno rūgšties koncentraciją. Dėl pieno rūgšties formos galima pasakyti, kad fermentinis apdorojimas neturėjo kiek nors žymesnės įtakos dviejų formų santykiui. Visais atvejais apie 50% laktato buvo D formos.
[0049] Likusio cukraus kiekis, apdorojus frakcijų ABD, BCD, AD, BC, BD ir D kombinacijomis, yra didesnis, negu tada, kai yra visos frakcijos. Fermentų frakcijų pasirinkimas turėjo aiškią įtaką gliukozės, ksilozės, fruktozės ir arabinozės liekamaj ai koncentracijai. Kiekvienos iš jų koncentracija buvo susieta su kitų koncentracijomis; jeigu kurio nors apdorojimo metu gauta didžiausia gliukozės koncentracija, tai bus didžiausia ir kitų cukraus rūšių koncentracija. Pasirodė, kad frakcija D yra didžiausia cukraus gamintoja silose. Jeigu veikia frakcija B ir kombinacija AB, tai gaunama neigiama cukraus gamyba.
[0050] Tirpaus proteino koncentracija visuose bandymuose buvo tarp 50 ir 60 mg/g sausos žolės; siloso kokybė, apdorojus fermentais, nepablogėjo. Amonio kiekis nekoreliuoja su jokiomis fermentų frakcijomis. 2. Fermentų frakcijų įtaka skaidulinei struktūrai NDF struktūros analizė
[0051] Gauta NDF buvo pasverta ir išreikšta procentais nuo pradinės medžiagos sausų madžiagų kiekio.
[0052] Pasidavimas fermentinei hidrolizei buvo nustatytas, atliekant NDF hidrolizę pilnu ląsteles ardančių fermentų mišiniu Citolazė-123 (50 000 HEC/g). Prieš naudojimą fermentų preparatai buvo praleisti pro Sephadex G-25 GPC kolonėlę siekiant pašalinti visus mažo molekulinio svorio junginius, kurie gali turėti įtakos nustatant redukuojantį cukrų. 20 mg NDF buvo įdėta į mėgintuvėlį ir įpilta 9,6 ml Sorensen fosfato buferio, pH 7. Po 15 valandų inkubacinio laikotarpio kambario temperatūroje buvo pridėta 0,4 ml fermento ir nustatyta pradinis cukraus išlaisvinimo greitis. Po vieną mililitrą bandinio buvo paimama, praėjus 0,1, 2,5 ir 5 valandoms. Kievienas bandinys nedelsiant buvo sumaišytas su 4 ml dinitrosalicilo rūgšties (DNS) tirpalo, kuris naudojamas redukuojančiam cukrui tirti. Šis reagentas nedelsiant nutraukia fermentinę reakciją.
[0053] Tada bandiniai 5 minutes pakaitinami verdančio vandens vonelėje, staigiai atšaldomi ledo vonelėje ir išmatuojama sugertis ties 540 nm. Rezultatai išreikšti redukuojančio cukraus, išlaisvinto per valandą iš gramo NDF, moliais.
[0054] NDF redukukcinių galų kiekis buvo analizuojamas modi-fikuotu DNS metodu. 20 mg NDF buvo įdėta į mėgintuvėli, ir įpiltas 1 ml vandens, mišinys laikomas 1 valandą kambario temperatūroje, įpilta 4 ml DNS, mišinys 5 minutes pakaitinamas verdančio vandens vonelėje, staigiai atšaldomas ledo vonelėje, nufiltruojamas ir išmatuojama filtrato sugertis ties 540 nm. Rezultatai išreikšti moliais gramui NDF.
[0055] Reaktyvių hidroksilo grupių skaičius nustatytas, analizuojant acetilo grupių, įtrauktų į vėliau vykstantį acetilinimo procesą, skaičių. Trigubi 20 mg NDF bandiniai buvo sumaišyti su 2 ml piridino. Įpilta 200 Įil 14C - acto rūgšties anhidrido (specifinis aktyvumas 1,04-10 sk.per min moliui) ir mišinys laikomas 30 min užlydytuose mėgintuvėliuose, esant 70°C temperatūrai. Filtratas pašalinamas, o nuosėdos du kartus išplaunamos 2 ml šviežiai perdistiliuoto piridino, o po to 4 kartus vandeniu, naudojant ultragarsinę vonią siekiant suintensyvinti nekovalentiškai surišto acetato išplovimą iš skaidulų. Paskutinio plovimo tirpalas tirtas radioktyvumo požiūriu ir nustatyta, kad neviršija foninio lygio. Skaidulos, į kurių molekules buvo įterpta acetilinė grupė, buvo 5 valandas hidrolizuotos, naudojant 2 ml 4N HC1, esant 90°C, o po to išmatuotas neutralizuoto filtrato radioktyvumas. Acetilo įterpimas išreikštas mikromoliais gramui NDF.
[0056]
[0057] Kiekiai yra pateikiamo nulinio kontrolinio kiekio atžvigiu.
[0058] Jeigu gaminant silosą yra naudojami fermentai, tai NDF vertės sumažėja. Apdorojimas, naudojant fermentų mišinį ABCD, sumažina NDF iki 18%, palyginus su 35%, kai silosas neapdorotas fermentais. Gautas NDF sumažėjimas mažesnis, kai nebuvo frakcijos D. Fermentų frakcija D turi didžiausią įtaką NDF tirpumui. Tada, kai frakcija D kombinuojama su kitomis frakcijomis, labai efektyviai tirpdomos skaidulos. Tuo galima paaiškinti toki, dalyką, kad, esant frakcijai D, redukuojančių galų skaičius mažėja. Manoma, kad frakcija D sistemingai ardo skaidulas ir tokiu būdu masę daro tirpia. Laisvų galų skaičius pasidaro mažesnis, negu kontrolinio fermentais neapdoroto bandinio atveju. NDF tirpumui taip pat turėjo įtakos ir frakcija A kombinacijose su frakcijomis B ir C. Frakcija A taip pat pagerina reaktyvumą, galbūt dėl redukuojančių galų skaičiaus padidinimo.
[0059] Silosavimo metu reikia taip pakeisti skaidulas, kad didžiojo skrandžio mikrobams būtų lengviau jas ardyti ir kad jos būtų reaktyvesnės vienaskrandžiame trakte. Didžiajame skrandyje skaidulų pirmiausiai imasi ląsteles ardantys mikrobai ir jų fermentai. Fermentinio cukraus išlaisvinimo pradinis greitis buvo nustatytas kaip NDF pasidavimas minėtam ardymui. Vertės lyginamos su bandiniais, kurie neapdoroti fermentais; teigiamos vertės rodo, kad cukraus prieinamumas didžiojo skrandžio mikrobams pagerėja; neigiamos vertės rodo, kad silosavimo metu per daug cukraus paversta į rūgštis. Matyti, kad fermentų frakcija D, viena ar kombinacijose su kitomis frakcijomis, yra mažiau tinkama silosavimui dėl didelio cukraus išlaisvinimo efektyvumo. Frakcija A turi stiprią teigiamą įtaką pradinei cukraus gamybai. Gliukozė ir celobiozė sudaro 95% išlaisvinto cukraus. Kai naudojamos frakcijos A ir D, frakcija D buvo vyraujanti. Viena frakcija A arba kartu su B, C ar BC palengvina didžiojo skrandžio mikrobams priėjmą prie cukraus ir ta prasme naudinga.
[0060] NDF frakcijų acetilinimas iš fermentais apdoroto siloso parodė, kad angliavandenių pašalinimas iš ląstelės sienelių nesumažina reaktyvių hidroksilo grupių skaičiaus. Priešingai, efektyviai anglianvandenius skaidantys fermentai padidino 14C-acetilo įterpimą i, apdorotas skaidulas. Labiausiai tirpumą skatinančios fermentų kombinacijos ir pati citolazė padidina paveiktų hidroksilo grupių skaičių. Frakcija D turėjo didžiausios įtakos hidroksilo grupių skaičiui. Galimas dalykas, kad paveiktos hidroksilo grupės buvo fenoliniai lignino pakaitai. Pasirodė, kad frakcija C yra priešinga frakcijai D. Frakcija A veikė priešinga kryptimi, negu frakcija D.
[0061] Remiantis šiuo išradimu, galima keliais būdais pakeisti netirpias siloso dalis, parenkant atitinkamas fermentų kombinacijas. Didžiausias poveikis gautas panaudojant arba pašalinant, kur įmanoma, frakcijas A ir D, po vieną arba kombinacijose. Kai silosuojamas pašaras ir yra fermentų frakcija D kokioje nors kombinacijoje, susidaro netirpi frakcija, kuri vėliau negali būti fermentiškai hidrolizuojama naudotu fermentų mišiniu. Frakcijos A poveikis preišingas; silosas, pagamintas naudojant frakciją A, bet nenaudojant frakcijos D, labiau pasiduoda tolimesnei fermentinei hidrolizei, negu kontrolinis fermentais neapdorotas bandinys. Nors ne visos frakcijos ir frakcijų kombinacijos buvo smulkiai aptartos, akivaizdu, kad visos galimos frakcijų kombinacijos patenka į šio išradimo rėmus.
[0062] 3 pavyzdys. Fermentų frakcijų, pagamintų iš citolazės-123, įtaka nedžiagų ištekėjimui ir siloso, pagaminto iš tetraploidinės svidrės, cheminei sudėčiai
[0063] Tetraploidinė svidrė (tręšimas 120 kilogramų azoto i, hektatrą) buvo rankomis nupjauta, naudojant sterilius būdus, transportuojama atšaldyta ir eksperimentas pradėtas praėjus 5 valandoms po nupjovimo. Sausų medžiagų buvo 13% svorio, pH 6,35. Žolė buvo sukarpyta žirklėmis į 1 cm gabaliukus ir sudėta į plastmasinius maišelius po 80 g šviežios žolės į kiekvieną. Vienodi bandiniai buvo apdoroti kai kuriomis citolazės-123 frakcijų A, B, C ir D kombinacijomis. Po apdorojimo fermentais žolė po 5 g buvo sudėta į 20 ml anaerobinių kultūrų mėgintuvėlius, į kuriuos 5 minutes leistos anaerobinės dujos. Po to mėgintuvėliai buvo užkimšti butilo guminiais kamščiais. Kiekvienam tyrimui paruošta po devynis vienodus bandinius. Mėgintuvėliai buvo laikomi 30°C temperatūroje ir po vieną iš kiekvienų devynių bandinių atidaroma praėjus 1, 2 ir 4 savaitėms. Visas mėgintuvėlio turinys (5 g) buvo sunaudotas kaip bandinys tyrimui.
[0064] Medžiagų ištekėjimo nustatymas. Vieno mėgintuvėlio turinys (5 g) buvo patalpintas i, išbalansuotą perforuotą plastmasini, mėgintuvėli,, kuris įdėtas į 50 ml centrifugini, vamzdeli, su 2 cm tarpine dugne. Mėgintuvėliai 20 minučių buvo centrifuguojami Sorvall centrifūgoje SS- 34, esant 1000 apsisukimų per minutę. Perforuotas vidinis mėgintuvėlis buvo vėl subalansuotas ir apskaičiuotas ištekėjusios medžiagos kiekis (medžiagos ištekėjimas = 5 - nuosėdų svoris).
[0065] Rūgščių gamyba buvo ištirta keliais skirtingais būdais. Ištekėjusių medžiagų silose pH išmatuotas, praėjus 1, 2 ir 4 savaičių inkubaciniam laikotarpiui. Tuo pačiu metu nustatytos titruojamos rūgštys. Šiame tyrime nebuvo įtrauktos rūgštys druskų pavidalu, kai ištekėjusių medžiagų pH vertė 4. " Pieno rūgštis yra viena iš rūgščių, kurių pH vertė mažesnė negu pradinis titravimo pH. Pieno rūgštis ir acto rūgštis buvo atskirai tiriamos, naudojant HLPC su H* pavidalo kolonėle ir UV detektavimą ties 210 nm.
[0066] Rūgšties titravimas. Į mėgintuvėlį, kuriame yra 5 g siloso, įpilama 15 ml distiliuoto vandens. Mėgintuvėlis purtomas kambario temperatūroje vieną valandą; jo turinys nufiltruojamas per 0,2 jam filtrą ir padalijamas į tris lygias dalis. Du bandiniai naudojami organinių rūgščių analizei, o trečiasis - rūgšties titravimui. Bandinys atskiestas distiliuotu vandeniu ir titruotas, naudojant 0,05 M NaOH, iki neutralumo. Indikatoriumi naudotas fenolftaleinas.
[0067]
[0068] Iš aukščiau pateiktų rezultatų matyti, kad silosas buvo gerai išsaugotas, turi pH apie 4 ar net mažiau ir didelę pieno rūgšties koncentraciją.
[0069] Medžiagų ištekėjimas iš drėgno derliaus priklauso nuo fermentų frakcijų A ir D, o pastaroji frakcija ypatingai aktyvi. Fermentų frakcija D lemia žalingų medžiagų ištekėjimą. Naudojant frakciją A, medžiagų ištekėjimas sustoja po 14-tos dienos, o naudojant frakciją D, ištekėjimas nesustoja per visą silosavimo periodą.
[0070] Manoma, kad dariniai, tokie kaip kombinacijos ABC, ACD, AC ir ABD, o taip pat ir kitos kombinacijos, gali būti pagaminti genetiniu būdu iš celiulazės šaltinio. Pavyzdžiui, celobiohidrolazės I, celobiohidrolazės II, endogliukanazės I ir jų kombinacijų fermentų genų kodavimas gali būti ištrintas iš Trichoderma rūšies. Laukiama, kad celiulazė, išskirta iš rūšių su trūkstamais genais, turėtų panašią įtaką derliui, kaip atitinkamų celiuliozės frakcijų, gautų iš anijonitinės kolonėlės, kombinacij os .
[0071] Taip pat manoma, kad išvalyta ar praturtinta fermentais celiulazė turės panašią įtaką derliui, kaip ir celiu-lazės atitinkamos kombinacijos, frakcionuotos joniti-nėje kolonėlėje.
1. Fermentų kompozicija, apimanti daugiafermentinę celiuliazinę medžiagą, besiskirianti tuo, kad bent apie 99% minėtos celiulazinės medžiagos susijungia su Q-sefarozės anijonitu, esant pH apie 8 ir laidumui, maždaug ekvivalentiškam 20mM tris-buferio laidumui.
2. Fermentų kompozicija pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad bent apie 99% šios celiulazinės medžiagos susijungia su anijonitu, esant pH apie 8 ir laidumui, maždaug ekvivalentiškam 20 mM tris-buferio, kuriame yra 0,08 M NaCl, laidumui.
3. Fermentų kompozicija pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad bent apie 99% šios celiuliazinės medžiagos susijungia su anijonitu, esant pH apie 8 ir laidumui, maždaug ekvivalentiškam 20 mM tris-buferio, kuriame yra 0,15 M NaCl, laidumui.
4. Fermentų kompozicija pagal 1 punktą, besiski-r i a t i tuo, kad bent apie 99% šios celiuliazinės medžiagos (i) susijungia su anijonitu, esant pH apie 8 ir laidumui maždaug ekvivalentiškam 20 mM tris-buferio, kuriame yra 0,08 M NaCl, laidumui ir (ii) išsiplauna iš minėto anijonito, esant laidumui maždaug ekviva-lentiškam 20 mM tris-buferio, kuriame yra 0,15 M NaCl, laidumui.
5. Fermentų kompozicija pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad bent apie 99% šios celiuliazinės medžiagos (i) susijungia su anijonitu, esant pH apie 8 ir laidumui maždaug apie 20 mM tris-buferio laidumui ir (ii) išsiplauna iš šio anijonito, esant laidumui maždaug ekvivalentiškam 20 mM tris-buferio, kuriame yra 0,15 M NaCl, laidumui.
6. Fermentų kompozicija pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad bent apie 99% šios celiuliazinės medžiagos (i) susijungia su anijonitu, esant pH apie 8 ir laidumui maždaug apie 20 mM tris-buferio laidumui ir (ii) išsiplauna iš šio anijonito, esant laidumui maždaug ekvivalentiškam 20 mM tris-buferio, kuriame yra 0,0 8 M NaCl, laidumui.
7. Fermentų kompozicija pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad bent apie 99% šios celiuliazinės medžiagos (i) susijungia su anijonitu, esant pH apie 8 ir laidumui maždaug 20 mM tris-buferio laidumui ir (ii) išsiplauna iš minėto anijonito, esant laidumui maždaug ekvivalentiškam 20 mM tris-buferio, kuriame yra maždaug 0,01-0,08 M NaCl, laidumui ir laidumui maždaug ekvivalentiškam 20 mM tris-buferio, kuriame yra daugiau kaip maždaug 0,15 M NaCl, laidumui.
8. Fermentų kompozicija, apimanti daugiafermentinę celiuliazinę medžiagą, besiskirianti tuo, kad bent apie 95% šios celiulazinės medžiagos yra celiuliazinė medžiaga, kuri (i) nesusijungia su Q-sefarozės anijonitu, esant pH apie 8 ir laidumui maždaug ekvivalentiškam 20 mM tris-buferio laidumui, (ii) susijungia su minėtu anijonitu, esant pH apie 8 ir laidumui maždaug ekvivalentiškam 20 mM tris-buferio, kuriame yra 0,08 M NaCl, laidumui, arba (iii) yra (i) ir (ii) punktų kombinacija.
9. Fermentų kompozicija pagal 8 punktą, besiskirianti tuo, kad bent apie 95% šios celiuliazinės medžiagos yra celiuliazinė medžiaga, kuri (i) nesusijungia su anijonitu, esant pH apie 8 ir laidumui maždaug ekvivalentiškam 20 mM tris-buferio laidumui, (ii) susijungia su minėtu anijonitu, esant pH apie 8 ir laidumui maždaug ekvivalentiškam 20 mM tris-buferio, kuriame yra 0,15 M NaCl, laidumui arba (iii) yra (i) ir (ii) punktų kombinacija.
10. Fermentų kompozicija pagal 8 punktą, besiskirianti tuo, kad bent apie 95% minėtos celiuliazinės medžiagos nesusijungia su anijonitu, esant pH apie 8 ir laidumui maždaug ekvivalentiškam 2 0 mM tris-buferio laidumui.
11. Fermentų kompozicija pagal 8 punktą, besiskirianti tuo, kad bent apie 95% minėtos celiulazinės medžiagos yra celiuliazinė medžiaga kuri (i) nesusijungia su anijonitu, esant pH apie 8 ir laidumui maždaug ekvivalentiškam laidumui 20 mM tris-buferio, (ii) susijungia su minėtu anijonitu, esant pH apie 8 ir laidumui maždaug ekvivalentiškam 20 mM tris-buferio, kuriame yra tarp maždaug 0,08 ir 0,15 M NaCl, laidumui arba (iii) yra (i) ir (ii) punktų kombinacija.
12. Fermentų kompozicija, apimanti daugiafermentinę celiulazinę medžiagą, besiskirianti tuo, kad bent apie 95% minėtos celiulazinės medžiagos yra celiuliazinė medžiaga, kuri (i) nesusijungia su anijonitu, esant pH apie 8 ir laidumui maždaug ekvivalentiškam laidumui 20 mM tris-buferio, kuriame yra maždaug 0,08 M NaCl, (ii) susijungia su minėtu anijonitu, esant pH maždaug 8 ir laidumui maždaug ekvivalentiškam 20 mM tris-buferio, kuriame yra 0,15 M NaCl, laidumui, arba (iii) yra (i) ir (ii) punktų kombinacija.
13. Fermentų kompozicija pagal 12 punktą, besiskirianti tuo, kad joje bent apie 95% minėtos celiuliazinės medžiagos nesusijungia su anijonitu, esant pH apie 8 ir laidumui maždaug ekvivalentiškam 20 mM tris-buferio, kuriame yra maždaug 0,08 M NaCl, laidumui.
14. Fermentų kompozicija, apimanti daugiafermentinę celiulazinę medžiagą, besiskirianti tuo, kad joje bent apie 95% minėtos celiuliazinės medžiagos nesusijungia su anijonitu, esant pH apie 8 ir laidumui maždaug ekvivalentiškam 20 mM tris-buferio, kuriame yra maždaug 0,15 M NaCl, laidumui.
15. Pašarinių kultūrų apdorojimo būdas, besiskiriantis tuo, kad i, šias kultūras prideda celiuliazinės medžiagos tirpalą apibūdintos pagal bet kuri, iš 1-14 punktų.
16. Pašarinių kultūrų apdorojimo būdas pagal 15 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtą celiuliazės tirpalą prideda i, augančias kultūras, nuimtas kultūras arba nuimtas kultūras 48-ių valandų laikotarpyje prieš šeriant gyvulius šiomis kultūromis.