[LT] Aprašyti nauji mikroorganizmai, atrinkti selekcijos būdu taip, kad jie, panaudojami laktoną arba jo tirpias druskas kaip vieningą anglies, azoto ir energijos šaltinį, gali jį pervesti į laktoną arba jo tirpias druskas.
[EN]
[0001] Išradime aprašomi' nauji malonil- 7- aminocefolosporano
[0002] rūgšties dariniai arba jų tirpios druskos, turintys
[0003] ■■■ formulę
[0004] aminocefalosporano rūgšties darinių gamybos būda£>, . pradedant nuo malonil- 7- aminocefalosporano rūgšties darinių, taip pat naujas Pseudomonas ( DCM 7509) genties mikoorganizmų panaudojimas.
[0005] Tolesniame aprašyme . pavadinimai malonil- 7- aminocefalosporano rūgšties dariniai ( formulė cefalosporino C dariniai ( formulė IV), malonil- laktonas ( formulė ir laktonas ( formulė I) apima ir šių junginių tirpias druskas, tokias kaip amonio arba šarminių metalų
[0006] Malonil- 7- aminocefalosporano rūgšties dariniai gali būti, pavyzdžiui, pradine medžiaga sintetinant 7-aminocefalosporc. no rūgšties darinius, kurie vėlgi yra
[0007] svarbios pradinės medžiagos cefalospor>ininių antibiotikų gamyboje (3V Bacteribl., 19' 87, vol. 169, Nr. 12, 5815- 5820)..
[0008] t.
[0009] Iki šiol nebuvo žinomi nei cheminiai, nei mikro-biologiniai malonil- 7- aminocefalosporano rūgšties- da-. rinių gamybos būdai.
[0010] 7- Aminocefalosporano rūgšties darinių sintezei yra daug mikrobiologinių metodų, kuriuose pradine medžiaga yra cefalosporinas C, aprašytų, pavyzdžiui, JP- A 62 48380. Visų šių metodų trūkumas yra tai, kad j ie negali būti pritaikyti pramonėje.
[0011] Išradimo tikslas buvo sukurti, panaudojant naujus mikroorganizmus, naują paprastą ir ekonomišką mikrobio-loginį naujų malonil- 7- aminocefalosporano rūgšties
[0012] darinių gamybos būdą. Kitas uždavinys buvo, panaudojant šiuos darinius, sukurti' naują mikrobiologini, 7-aminocef alosporar. o rūgšties darinių gamybos ■ būdą .
[0013] Išradimo tikslas buvo pasiektas pateikus naujus 1 mikroorganizmus pagal išradimo apibrėžties 1 punktą, naują būdą pagal išradimo apibrėžties 3 punktą, naujus malonil- 7- aminocefalosporano rūgšties darinius pagal 8 punktą ir naują būdą' pagal 10 punktą.
[0014] Išradime aprašomi mikroorganizmai -. yra atrinkti selekcijos būdu taip, kad jie gali laktoną, turintį formulę
[0015]
[0016] i ir pastarąjį nekatabolizuoti.
[0017] Šie mikroorganizmai selekcionuojami naudojant laktoną,. turinti, formulę I, Į>ėi" pasitelkiant tradicinius mikrobiologinius metodus, pavyzdžiui, analizuojant įvairius dirvožemio pavyzdžius. Kai mikroorganizmai iš dirvožemio pavyzdžių auginami kaip inokuliatas ant laktono, turinčio formulę I, gaunami mikroorganizmai, galintys augti panaudodami ši, laktoną kaip vieninteli, anglies, . azoto ir energijos šaltini,. Iš Šių mikro-organizmų specialistams žinomais metodais atrenkami mikroorganizmai, kurie paverčia laktoną, turinti, formulę I, malonilo laktonu, tu'rinčiu formulę I ir nekatabolizuoja pastarojo.
[0018] Selekcijai reikalingą laktoną, turinti, formulę I, galima susintetinti iš komercinio de-zacetilcefalosporino C. Iš pradžių dezacetilcefalosporinas C
[0019] žinomais metodais (Jefferay et al., Biochem J. 1961, 81, 591) laktonizuojamas iki' atitinkamo laktono. Norint gauti pageidaujamą laktoną, turinti, perkirstą laktamini,
[0020] žiedą (formulė I), laktaminis žiedas specialiai skaldomas, pavyzdžiui, penicilinaze.
[0021] Iš esmės tinka visi mikroorganizmai, gaunami selekciniu dauginimu. Šie mikroorganizmai literatūroje neaprašyti ir yra šio išradimo dalis.
[0022] Selekcionuojant gauti, mikroorganizmai, kurie žymimi FE1 (DSM 7007), jų mut'antaį ir palikuonys. ' Jie . yra 1992.03,25 deponuoti firmoje' Deutsche Sįammlung fūr Mikroorgąriįsmen ųnd Zeilkulturen GmbH, Mascheroderweg lo, D-3300 Braunschweig.
[0023] Šie mikroorganizmai, padavus paraišką dėl prioriteto, buvo analizuojami 16 S .RNA metodu ir nustatyta, kad jie priklauso Sphingomonas sp. genčiai.
[0024] Mokslinis Sphingomonas sp. FBI (DSM 7007) aprašymas:
[0025]
[0026] Paprastai selekcija ir auginimas vyksta mineralinių druskų terpėje, labiau tinka mineralinių druskų terpė, kurios sudėtis pateikta Lentelėje 1 (a ir b). Mikroorganizmų auginimui gali būti panaudotos ir kitos terpės, pavyzdžiui, komercinės pilnos terpės.
[0027] Auginant ir selekcionuojant tikslinga i, mineralinių druskų terpę i,dėti nuo 0.2 iki 1 svorio %, labiau tinkamas kiekis nuo 0.. 3 iki 0.6 svorio%, laktono, turinčio formulę I.
[0028] Temperatūra auginimo ir selekcijos metu palaikoma tarp 0 ir 60°Cr labiau- tinka temperatūra nuo 20 iki 40°C.
[0029] Selekcija ir auginimas vyksta esant pH nuo 5 ik' 9, labiau tinka pH nuo 6 iki 8.
[0030] Kai optinis tankis prie 650 nm reikšmės {OD650) pasiekia reikšmes nuo 0.1 iki ly mikroorganizmai surenkami
[0031] specialistams žinomais metodais ir panaudojami šiame išradime aprašytame metode.
[0032] Pagal šį išradimą tokiu būdu selekcionuoti mikroorganizmai panaudojami šiame išradime aprašytame metode
[0033] cefalosporino C darinių kaip substratų, turinčių bendrą formulę
[0034]
[0035] kai R reikšmės apibrėžtos aukščiau.
[0036] v
[0037] Tikslinga šiame metode naudoti selekcionuotus mikroorganizmus Sphingomonas sp . ( DSM 7007). arba jų palikuonis
[0038] ir mutantus, kurie, kaip jau minėta, yra deponuoti.
[0039] Paprastai šiame procese specialistams žinomais būdais naudojamos neaugančios ląstelės.
[0040] Substratais naudojami cefalosporino C dariniai, turin-' tys bendrą formulę IV, kai R reikšmės apibrėžtos aukščiau. Tinkamas substratas yra cefalosporinas C ( kai R bendroje formulėje III' = acetoksi).
[0041] Substratas proceso metu įdedamas vienu kartu arba nuolatos. Labiau tinka substratą pridėti taip, kad substrato koncentracija kultūrinėje terpėje neviršytų 20 svorio %, dar geriau jei Koncentracija neviršys 4 svorio %.
[0042] Procesui gali bu t i panaudotos specialistams įprastos terpės. Labiau r. inka procesui žemo molingumo HEPES
[0043] buferis [ 4-( ?- hidroksietil) piperazin- l- etansulfoninė rūgštis] .
[0044] Paprastai šiuo metodu dirbama su suspensijomis, kurių
[0045] optinis tankis OD6f) 0 siekia nuo 1 iki 100, labiau tinka OD650 reikšme nuo 2 iki 50.
[0046] Procesui tinkama temperatūra yra nuo 0 iki 60°C, labiau tinkama temperatūra yra nuo 20 iki 40°C, pH reikšmės nuo 5 iki 9, labiau tinka pH reikšmės nuo 6 iki 8...
[0047] Pasibaigus reakcijai, kurios trukmė yra nuo 1 ' iki 24 valandų, galima specialistams žinomais metodais išs-kirti iki šiol neaprašytus malonil- 7- aminocefalosporano rūgstles darinius, turinčius formulę III. Ypač tinkamas malonil- 7- aminocefalosporano rūgšties darinių atstovas yra malonil-7-aminocefalosporano rūgštis (kai R bendroje formulėje III = acetoksi).
[0048] šio išradimo būdas, skirtas gaminti 7-aminocefalosporano rūgšties darinius, turinčius bendrą formulę
[0049]
[0050] kurios R reikšmės apibrėžtos aukščiau, vykdomas taip, kad malonil-7-aminocefalosporano rūgšties dariniai arba jų tirpios druskos, turintys bendrą formulę III, Pseudomonas sp. (DSM 7509) genties mikoorganizmų arba jų palikuonių arba mutantų', arba veikiant fermentais be ląstelių, išskirtais iš šių mikroorganizmų, paverčiatfii .produktais, turinčiais formulę V.
[0051] Mikroorganizmai Pseudomonas sp. (DSM 7509) yra 1992.03.5 .deponuoti firmoje Deutsche Sammlung fūr Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Masčheroderweg lb, D-3300 Braunschweig.
[0052] Šie mikroorganizmai yra žinomi ir aprašyti- JP-A 62 483 80 kaip Pseudomonas sp. SE-495 (FERMBP-818). Pagal JP-A 62 483 80 šie mikroorganizmai atrinkti taip, kad jie hidrolizuotų- glutaril-7-aminocefalosporano rūgšti, i 7-aminocefalosporano rūgšti. Šių mikroorganizmų panaudojimas malonil-7-aminocefalosporano rūgšties hidrolizei nėra aprašytas.
[0053] Todėl šis išradimas • įprašo ir šių mikroorganizmų panaudojimą malonil-7-aminocefalosporano rūgšties dari-nių (formulė V), ypač malonil-7-aminocefalosporano rūgšties (R = acetoksi-), hidrolizei.
[0054] Procesas vykdomas, su padidinto pralaidumo mikroor-ganizmų ląstelėmis arba ląstelių homogenizatu, .ypač tinka ląstelių homogenizatas.
[0055] Ląstelių homogenizato gaminimui tinka specialistams žinomi metodai, pavyzdžiui, ardymas ultragarsu arba "French-press" tipo'aparatai.
[0056] Substratu gali būti rūgš-ties dariniai, turintys formulę V, kai R reikšmės
[0057] apibrėžtos aukščiau. Tikslinga , substratu vartoti malonil-7- aminocefalosporano rūgšti, (R = acetoksi-).
[0058] Substratas proceso gali vienu kartu arba nuolatos taip, substrato koncentracija kultūrinėje terpėje neviršytų 1CL svorio %, dar geriau jei koncentracija neviršys 2: svorio %.
[0059] Procesui gali būti panaudotos specialistams įprastos
[0060] ■-'■r maitinančios terpės.
[0061] Jei procesas vykdomas su ląistelių homogenizatu, baltymo koncentracija šiame ekstrakte yra nuo 0.1 iki 20 g/l, labiau tinka koncentracija nuo 1 iki 5 g/.l.
[0062] Procesą tikslinga vykdyti esant temperatūrai nuo 4viki 50°C, labiau tinka temperatūra nuo 20 iki 35°C, ir pH nuo 4 iki 9, labiau tinka pH reikšmės nuo 7 iki 8.
[0063] Pasibaigus reakcijai, kurios trukmė nuo 3 iki 2'4 valandų, galima išskirti 7-aminocefalosporano rūgšties darinius, turinčius formulę V.
[0064] Į 100 ml mineralinių druskų terpės ( Lentelė 1), pH 7, kurioje yra. 5 mmol ( 0. 5 mmol/ 100 ml) laktono, turinŽio suskaldytą laktamini, žiedą ( formulė - I), pridedami kaip inokuliatai įvairūs dirvožemio pavyzdžiai, surinkti Visp miesto ( Šveicarija) apylinkėse ir inkubuojami purtyklėje su 140 rpm ( apsisukimų per. minutę), esant 25°C. Kul«tūros persėjamos 4 kartus i, šviežią mineralinių druskų terpę ir laktono pakitimai tikrinami analitinės aukšto slėgio skysčio chromatografijos ( ASSC) metodais.
[0065] Po to šios kultūros inhibuojamos mineralinių druskų terpės ir agaro lėkštelėse, kur yra 5 mmol laktono
[0066] ( formulė I) esant 25°C. Pagaliau buvo išskirtas bakterijų kamienas Sphingomonas sp . FBI 7007), kuris augimo metu laktoną paverčia malonilo laktonu, turinčiu formų1ę II, ir pastarojo toliau nesuskaldo.
[0067] Mi kroorgan i zma i Sphingomonas sp . FBI ( DSM 7007) auginami 4 dienas mineralinių druskų terpėje, pH 7. 0 ( Lentelė Ib), kur yra 5 mmol laktono ( formulė I) iki OD650 =0. 44 . ( Po pirmų dviejų dienų pridedama papildomas kiekis laktono, tiek, kad jo visa koncentracija siektų 1 mmol laktono 100 ml terpės). Pc to ląstelės nucentrifuguojamos ir ląstelių pasta resuspenduojama 20 ml lOmmol HEPES buferio, pH 7. 0 palaikant optini, tanki, OD65Q = 2. 2. X tokią ląstelių suspensiją pridedama 0. 4 mmol cefalosporino C ( formulė' IV).
[0068] Po 30 min. 60 min. 2.25 vai, 5.0 vai ir 24 vai terpės pavyzdys analizuojamas ASSC.
[0069] Malonil-7-aminocefaIosporano rūgšties sintezės greitis praėjus 2.25 vai sudarė 410 mg/l/val/OD650.
[0070] Po 5 valandų analizė parodė, kad susidaro 142 mg JnaI<wiil-7-aminocefalosporano rūgšties - tai reiškia, kad sureagavo 99 % cefalosporino C.
[0071] Malonil-^-aminocefalosporano rūgšti galima išskirti prepaiatyvinės ASSC metodais,"išeiga 40 %.
[0072] c
[0073] Malonil- 7- aminocefalosporano rūgšties ( formulė t II) identifikavimas
[0074] Norint identifikuoti produktą (formulė III) 500 ml mineralinių druskų terpės {Lentelė I), pH 7.0, sumaišoma su laktonu, turinčiu formulę I taip, kad jo galutinė koncentracij.a sudarytų 5 mmol- Po to tirpalas inokuliuojamas ankstesne kultūra, kurios OD650 = 0.5, palaikant 25°C ir 140 rpm. Praėjus dienai pridedama dar 5 mmol laktono (formulė 1} skaičiuojant 500 ml terpės. Kai OD650 pasiekia 0.5 ląstelės surenkamos. Po to ląstelių pasta resuspenduojama 30 ml lOmmol HEPES buferio, pH 7.0, kuriame yra 0.6 mmol cefalosporino C (formulė IV). Po 5 vai inkubacijos esant 25°C ir 140 rpm, ląstelės centrifuguojamos ir iš supernatanto-preparatyvinės ASSC metodais išskiriama malonil-7-aminocefalosporano rūgštis. Išgryninti pavyzdžiai liofilizuojami per nakti, ir liofilizatas analizuojamas BMR (lH ir 13C> metodais.
[0075] Lyginant su cheminiais' būdais susintetintu palyginamuoju preparatu (pagamintu iž 7-aminocefalosporano rūgšties pagal Bull. Soc. Chem. Belg., 1977, 86, 991- 1002), įrodomas malonil- 7-aminocefalosporano rūgšties susidarymas.
[0076] Malonil- 7- aminocefalosporano . rūgšties natrio druska ( cheminis standartas).
[0077] 13C- BMR ( DMSO, 100, 5 MHz, cheminiai poslinkiai, m. d. :
[0078] 20, s; 25, s;40, m;58, d;64, s;112, s;134, s;164, d;170, t.
[0079] Malonil- 7- aminocefalosporano rūgštis ( pagal ši, išradimą)
[0080] 13C- BMR ( DMSO, 100, S MHz, cheminiai poslinkiai, m. d. :
[0081] 20, 2;25, s;4Q, m;58, d;64, s;112, s;134, s;164, - d;170,' • t.
[0082] XH- BMR ( cheminis standartas, DMSO, 400/ MHz, cheminiai poslinkiai, m. d.) : 20, s;2. 5, s;3. 0, t;3. 5 m;4. 8, d;5. 0, d;5. 6 d.
[0083] 20, s;2. 5, s;3. 0, t;3. 5 m;4. 8, d;5. 0, d;5. 6 d.
[0084] Dezacetilcefalosporino laktonizavimas
[0085] Dezacetilfalosporino C laktonas buvo susintetintas iš dezacetilfalosporino C ( Ciba- Geigy, Basei) taip: 100 g dezacetilcefalosporino C ištirpinama 1 litre 20 mmol natrio fosfatinio buferio, pH 7. 0. Į ši, tirpalą pridedama jonų mainų dervos ( D0WEX 50X8 ( Fluka) ( H+ forma), kol pasiekiama pH 2. 5. Maišoma 10 min, ( 250
[0086] j
[0087] rpm, kambario temperatūra), po to derva nufiltruojama ir tirpalo pH koreguojamas koncentruota druskos rūgštimi iki 0. 8. Maišoma 1 valandą, po to i, reakcijos tirpalą pridedama DOWEX 1X8 ( Fluka) ( acetatinė forma), kol pasiekiama pH 3. 0 - 3. 2.
[0088] T
[0089] Po to maišoma kambario temperatūroje dar 1- 5 valandos esant 250 rpm ir derva nufiltruojama. fVėl pridedama D0WEX 1X8 ( acetatinė forma), kol pasiekiama pH 3. 3 - 3. 5, Maišoma 1 valandą, ( 250 rpm, kambario tempera-tūra), po to derva nufiltruojama. Reakcijos mišinys rotaciniame garin" tuve nugarinamas iki sausumo ( 30 mbar, 30°C) . Siekiant pašalinti dar - likusią acto rūgšti, produktas po išgarinimo tirpinamas vandenyje taip, ■ kad būtų gautas 35 % tirpalas, kurio pH koreguojamas koncentruota druskos rūgštimi iki 1. 5.
[0090] Taip paruoštas tirpalas ekstrahuojamas du kartus etilo acetatu, kurio tūris lygus tirpalo tūriui. Vandeninės fazės apjungiamos, pH koreguojamas 3 M kalio šarmu iki 3. 5, ir nugarinama rotaciniu garintuvu ( 30 mbar, 30°C) . Po to produktas visiškai išdžiovinamas vakuuminėje džiovinimo spintoje ( 30 mbar, 20°C) .
[0091] Bendra išeiga sudaro 60 g, skaičiuojant nuo 100 g dezacetilcefalosporino C.
[0092] Pavyzdys 5;
[0093] Laktono su perkirstu laktaminiu žiedu ( formulė I ) sintezė
[0094] Norint susintetinti laktoną (formulė I), dezacetil-cefaiosporino C laktonas veikiamas beta-laktamaze, penicilinaze E.C.3.5.2.6. (Sigma) tirpale 6 (lentelė Ia) . Reakcija prasideda iškart pridėjus penicilinazę. Reakcijos metu pH palaikomas. 7.0 pridedant 1 N NaOH tirpalą. Reakcija pasibaigia, kai pH .7.0 nepridedant NaOH nebekin.ta. Pasibaigus reakcijai (maždaug 2 vai) tirpalas steriliai filtruojamas (0.2 Įim filtras) ir laikomas -80°C.
[0095] 7- Aminocefalosporano rūgšties ( formulė V) sintezė
[0096] Mikroorganizmai Pseudomonas sp. SE-495 (DSM 7509; FERMBP-818) auginami per nakti, terpėje (pH 7.0), kuri sudaryta iš 0.2% (svoris.tūris) mielių ekstrakto, 0,5%
[0097] (svoris/t* ūr/is) peptono, 0.5% (svoris/tūris) natrio 'glutamato ir 0.005 % (svoris/tūris), magnio sulfato, esant 30- 0 C. S xios kultūros persėjamos i, šviežią maitinančią tokios pat sudėties terpę (pasėjamosios kultūros kiekis sieicia 10 %) ir inkubuojama nuo 2 iki 4 dienų..
[0098] Po to ląstelės surenkamos centrifuguojani (20 min 600 rpm), resuspenduojamos 0.1 M kalio fosfato buferyje ir recentrifuguojamos (viso 3 kartus su 10% kultūros tūrio). Po to ląstelių pasta resuspenduojama minima-liame kiekyje kalLo fosfato buferio ir apgarsinama šaldant ledu (10 kartų po 30 sek,; pertrauka 20 sek). Iš tokio homogenizato centrifugavimu (20 min, min. 20 000 apsis./min. atskiriamos ląstelių nuolaužos.
[0099] Siekiant susintetinti 7-aminocefalosporano rūgšti, šis ekstraktas (baltymo koncentracija 2 mg/ml) šildomas iki kambario temperatūros ir po to pridedama malonil-7-aminocefalosporano rūgšties, ištirpintos kalio fosfato buferyje, koncentracija 5 mmol. Visas tirpalas inkubuo-jamas 25°C nemaišant j r 24 vai bėgyje analizuojamas 7-aminocefalosporano rūgšties susidarymas.
[0100] / nalizė atliekama plonasluoksnės chromatografijos metodais ( plokštelė: silikagelis 60F245, nešėjas: butanolis-metanolis- acto rūgštis- vanduo santykiu 50:30:3:17). 7-Aminocefalosporano rūgšties ( Rf 0. 51) susidarymas iš malonil- 7- aminocefalosporano rūgšties ( R^ 0. 43) gali t būti įrodomas pagal UV- absorbciją esant nm bangos ilgiui -^ rba nupurškus plokštelę Fluram- reagentu ( 3 mg Fluram; Fluka CH- 9470 Buchs," ištirpinti 10 ml acetono) pagal UV- absorbciją, esant 366 nm bangos ilgiui.
[0101] Po maždaug 14 vai šiame ekstrakte, kurio sudėtyje ; yra malonil- 7- aminocefalosporano rūgšties acilazė, galima aptikti nuo 50 iki 100 molio 7- aminocefalospotano rūgšties.
[0102] i Lentelė 1
[0103]
[0104] Tirpalas 2:
[0105] Tirpalas 3:
[0106] Tirpalas 4:
[0107] Tirpalas 5:
[0108] Tirpalas 6:
[0109] Po sterilįnimo pridėti: C
1. Mikroorganizmai, atrinkti selekcijos būdu taip, kad f jie, panaudodami laktoną arba jo tirpias druskas, kurių formulė
2. Mikroorganizmai pagal \ punktą, žymimi Sphingomonas sp. FBI (DSM 7007) bei jų palikuonys ir mutantai.
3. Mikrobiologinis malonil-7-aminocefalosporano rūgšties darinių arba jų tirpių druskų, turinčių formulę
4. Būdas pagal 3 punktą, t/esisk'iriant/is tuo, kad procesą vykdo naudojant mikroorganizmus Sphingomonas sp. FBI (DSM 70C7) bei jų palikuonis ir mutantus.
5. Būdas pagal bent vieną iš 3 arba 4 punkto, besiskiriantis tuo, kad kaip substratą naudoja cefalosporiną C.
6. Būdas pagal bent vieną iš 3-5 punktą, besiskiriantis tuo, kad proceso eigoje substratą prideda vienu kartu arba nuolatos taip, kad substrato koncentracija kultūrinėje terpėje neviršytų 20 svorio %.
7. Būdas pagal bent vieną iš 3-6 punktų, besiskiriantis tuo, kad procesą vykdo esant tempe-ratūrai nuo 0 iki 60°C ir pH reikšmėms nuo 5 iki 9..
8. Malonil-7-aminocefalosporano rūgšties dariniai arba jų tirpios druskos, turinčios formulę
9. Malonil- 7-- aminocefalosporano rūgštis.
10. Mikrobiologinis 7- aminocefalosporano rūgšties darinių arba jų tirpių druskų, bendros formulės
11. Būdas pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo,' kad kaip substratą naudoja naloni1- 7- aminocefalosporano rūgšti,.
12. Būdas pagal bent vieną iš 10 arba 11 punkto, besiskiriantis tuo, kad proceso eigoje substratą prideda vienu kartu arba nuolatos taip, kad substrato koncentracija kultūrinėje terpėje neviršytų 10 svorio %.
13. Būdas pagal bent vieną iš 10- 12 punktų, besiskiriantis tuo, kad procesą vykdo esant tem-peratūrai nuo 4 iki 50°C ir pH reikšmėms nuo 4 iki 9.