[LT] Atskleisti dipeptidiniai junginiai, kuriuose dvi peptidinės grandinės yra prijungtos kartu prie neterminalinės aminorūgšties C alfa-atomo dvivalente jungiančia tilteliu grupe -A-. C alfa-atomai, prijungti prie grupės -A-, yra išdėstyti ekvivalentiškose vietose kiekvienoje peptidinėje grandinėje ir kiekvienas neturi savo nuosavos alfa-šoninės grandinės. Atskleisti tilteliniai dipeptidiniai junginiai turi stimuliuojantį poveikį ląstelės dalijimuisi, ypač mielopoezės ir kaulų čiulpų ląstelėms.
[EN]
[0001] Šis išradimas yra apie ląstelių proliferaciją skati-nančių peptidų panaudojimą ir naujus peptidus, pasi-žyminčius specifiniu ir/ar bendru ląsteles stimu-liuojančiu poveikiu.
[0002] Žinduolių kūnas sudarytas iš ląstelių, itin stipriai besiskiriančių struktūra ir funkcijomis, todėl, ląs-telių diferenciacijos ir vystymosi mechanizmai buvo daugelio tyrinėjimų objektu. Žinoma, kad nuolat atsi-naujinančių ląstelių sistemoje paprastai būna rezer-vuaras daugiavaisių (pliuripotentinių) kamieminių ląs-telių, kurios dalijasi ir pastoviai teikia sistemai naujas ląsteles. Nors pateiktos iš "rezervuaro" ka-mieninės ląstelės pradžioje yra vienodos, tačiau ne-trukus jos patiria vienoki, ar kitokį morfologini, paki-timą ir vėliau išsivysto i, ląsteles, atliekančias rei-kiamą funkciją.
[0003] Minėtų kamieninių ląstelių sistemų pavyzdžiais yra kraujodaros sistema kaulų čiulpuose bei epitelio ir epidermio sistemos.
[0004] Kamieninių ląstelių dalijimosi valdymas ar reguliavimas yra labai perspektyvi terapijos sritis, todėl daugelio tyrimų tikslas tebėra mechanizmų išaiškinimas ir spe-cifinių cheminių mediatorių suradimas. Iki šiol buvo nustatytos kelios tikrai dalyvaujančios ląstelių ga-myboje ir diferenciacijoje mokelulės, kurios skatina arba slopina tam tikrą proceso grandi,. Tuo požiūriu itin gerai ištirta mielopoezė, nustatytos joje daly-vaujančios molekulės: kolonijas stimuliuojantys faktoriai (KSF), kaip antai, granulocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius (G-KSF), makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius (M-KSF), granulocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius (GM-KSF) , i,vai-riakilmes kolonijas stimuliuojantis faktorius (multi-KSF; IL-3) [ žiūr. Metcalf, Science 229: 16 (1985)], interleukinas 11 (IL-11) [ žiūr. Paul et al, Proc, Natl. Acad. Sci., USA, 87: 7521 (1990)] , Laktoferinas [ žiūr, Broxmeyer et. al, Blood Cells, 11: 429 (1989)] prosta-glandinai [ žiūr, Pelus et al, J. Immunoi. 140: 479
[0005] (1988)], rūgštinis (H-subvienet.as) feritinas [žiūr, Broxmeyer et al, Blood 68: 1257 (1986)] , interferonai (a, p ir y) [ žiūr. Pelus et al aukščiau, ir Broxmeyer et al, J. Immunoi., 1_31: 1300 (1983)] , auglio nekrozės faktoriai (a ir P) [ žiūr. B.rcxmeyer et al, J. Immunoi. 136; 4487 (1936)] , transformuojantis augimą faktorius - p f žiūr. Octman et al, J. Immunoi., 140: 2661 (1988)], ir aktivinas bei inhibinas [ žiūr. Broxmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 779 (1989)].
[0006] Taip pat buvo rasta, kad hemoreguliacinis pentapeptidas (pEEDCK) selektyviai inhibuoja mielopoezės ląstelių proliferaciją (žiūr. Paukovits et al, Z. Naturforsch 37: 1297 (1982)] , ir buvo atskleisti kiti peptidai, atitinkantys siaurą bendrą formulę, duodantys panašų inhibicini, poveiki, hemopoezėje [žiūr. EP-A-112656 ir W090/027531. Peptido monomerų oksidacija davė dimerines molekules, sujungtas cisteino tilteliu, ir buvo rasta, kad tos bimerinės molekulės stimuliuoja mielopoezę
[0007] [ žiūr. Laerum et al, Exp Hematol., 16: 274 (1988)] .
[0008] (pEEDCK)2 dimeras ir kiti panašūs junginiai yra atskleisti W0-A~88/03535. Kiti dimeriniai peptidų junginiai yra atskleisti EP-A--408371, kuriame disulfidinė jungtis buvo pakeista anglimi arba anglies/sieros tilteliu, jungiančiu parinktas peptidines grandines. Tiltelis tuo būdu yra santykinai atsparus hidrolizei, bet pats yra inertinis ir negali dalyvauti recep-toriaus- dimero sąveikose.
[0009] Nors mes nenorime.būti surišti teorinių svarstymų, bet dabar tikimasi, kad tokie peptidiniai junginiai są-veikauja su stroir.os ląstelėmis in vivo ir kad stromos ląstelės atsakingos už ląstelinio dalijimosi stimu-liavimą arba inhibiciją per kitus išaiškinamus faktorius. Tuo būdu tikimasi, kad dimerai indukuoja arba pagreitina stimuliuojančių ląstelinių reguliuojančių faktorių stromatinę gamybą, tuo tarpu kai monomeriniai peptidai gali arba inhibuoti ši, procesą, arba sukelti faktorių, kurie užkerta kelią ar trukdo ląstelės dalijimuisi, gamybą. Tuo būdu, pagal tokią galvoseną stromos ląstelės gali sustiprinti dimerinių ir mono-merinių peptidų atitinkamai stimuliacin i, arba inhibicini, poveiki,.
[0010] Yra nuolatinis dimerinių peptidinių junginių, galinčių stimuliuoti ląstelės proliferaciją iki įprasto lygio in vivo, poreikis. Šiuo atžvilgiu reikėtų pastebėti, kad skirtingi stimuliavimo laipsniai gali būti labiau tinkami tam tikroms klinikinėms situacijoms negu ki-toms, ir ypač yra svarbus individualių ląstelių tipų selektyvus stimuliavimas.
[0011] Šis išradimas pateikia peptidinius junginius, sudarytus iš dviejų vienos grandinės hemoreguliacinių, pvz., he-mopoezę, inhibuoj ančių peptidų, sujungtų kartu til-teline grupe, kurios galai prijungti prie ne-galinių aminorūgščių Ca atomų esančių ekvivalentiškose vietose kiekviename minėtame peptide, kai peptide nėra nuosavos a-šoninės grandinės, minėtai tiltelinei grupei esant dvivalente grupe -A-, kai A yra
[0012]
[0013] kiekvienas y yra nepriklausomai 0, 1 arba 2;
[0014] kiekvienas z yra nepriklausomai 0 arba 1;
[0015] kiekvienas Y yra nepriklausomai 0, S, arba NR,
[0016] kur R reiškia vandenili, arba C- prijungtą organinę grupę
[0017] ( pvz., alkilą, aralkilą arba arilo grupę) ;
[0018] B reiškia karboksilinį arba heterociklini, žiedą ( pvz., 5- ių arba 6- ių narių aromatinį žiedą), pasirinktinai turinti, vieną arba du heterostcmus ( pvz., deguonies, azoto arba sieros), ir pasirinktinai reono-, di- arba tri- pakeis tus - 0RA, - NRAR*, - COOPA grupe arba halogeno atomu, tokiu kaip jodo, chloro, fluoro arba bromo atomas; ir kiekvienas RA nepriklausomai reiškia vandenilio atomą arba alkilo, alkanolio arba alkoksialkilo grupes, iš kurių kiekviena taip pat gali būti hidroksilinta).
[0019] Kur grupė B yra di- arba tri- pakeista bet kuria iš aukščiau paminėtų grupių, kiekvienas pakaitalas neturi būti identiškas kitiems arba to paties tipo.
[0020] Kur grupė R yra C- priiungta organinė grupė, geriau, kai turi nuo 1 iki 10 atomų, ypač nuo 1 iki 6 anglies atomų. Alkilo grupės gali būti tiesių grandinių arba šakotos ir gali būti pakeistos arilo grupėmis, tu-rinčiomis 6- 10 anglies atomų ( t. y. sudarančiomis aralkilo grupę), alkoksilo, nidroksilo, aciloksi, amino, acilamino arba karboksilo grupėmis. Arilo grupės apima 5- ių arba 6- ių narių heterociklines arilo grupes, turinčias vieną arba daugiau heteroatomų, parinktų iš O, N arba S, tokias kaip furilo, imidazolilo, pirolilo, piridinilo ir tienilo grupes. Pakaitalai, kurie gali būti prie arilo grupių, apima Ci_g alkilo grupes, hidroksilo ir karboksilo grupes. Favyzdžiai apima metilo, etilo, propilo, t- butilo, pentilo, karboksietilo ir benzilo grupes.
[0021] Geriau, kai R turi nuo 1 iki 6 anglies atomų, ypač nuo 1 iki 4 anglies atomų, kur tai reiškia alkilo, alkanolio arba alkoksialkilo grupę.
[0022] Viename tinkamesniame įgyvendinime dvivalentė jungianti tilteliu grupė -A- yra -CH2 CH2 Bz CH2 CH2-, kurioje Bz reiškia benzeno žiedą, kuris pasirinktinai yra mono-, di- arba tri-pakeistas grupe -0RA, NRARA, -COORA arba halogeno atomu, tokiu kaip jodo, chloro, fluoro ar bromo atomas, ir R yra toks, kaip apibrėžta aukščiau.
[0023] Bet kuris vienos grandinės peptidas, kuris rodo hemo-reguliacini poveiki, yra tinkamas kaip peptidas, kuris yra tiltelinis pagal ši, išradimą.
[0024] Apibūdinus alternatyviai, šis išradimas pateikia junginius pagal šį išradimą, kuriuose minėtos hemo-reguliacinės peptidinės grandinės apima šias formules:
[0025] Rb reiškia
[0026]
[0027] n ir m nepriklausomai reiškia 0 arba 1;
[0028] p, q ir r nepriklausomai reiškia 1 arba 2;
[0029] s reiškia 3 arba 4;
[0030] R 1 ir R 2 abu yra vandenilio atomai arba kartu reiškia okso grupę;
[0031] R3 ir R4 abu yra vandenilio atomai arba kartu reiškia jungti, anglis- anglis;
[0032] R5 yra vandenilis arba acilo grupė;
[0033] kiekvienas R6 ir R7 nepriklausomai reiškia hidroksilo grupę arba aminogrupę, bet tinkamesnės yra hidroksilo grupės;
[0034] R8 reiškia vandenili,, C2_ 6 alkilo grupę, C7_ 20 aralkilo grupę, kuri gali turėti vieną arba daugiau hidroksilo, amino arba metoksilo pakaitalų, arba metaboliškai labilią S- apsauginę grupę;
[0035] R10 reiškia hidroksilo arba aminogrupę, aminorūgšties gliutamino liekaną arba peptidą, turinti, N- galutini, glutamino vienetą).
[0036] Visos minėtos aminorūgšties liekanos gali būti arba D, arba L formos. Tačiau aminorūgščių L forma yra tin-kamesnė .
[0037] Kur yra N- galutinė apsauginė grupė R5, tai gali būti, kaip pažymėta aukščiau, acilo grupė, turinti 1- 20 anglies atomų, pvz., žemesnio alkanoilo grupė, turinti 1- 5 anglies atomų, tokia kaip acetilo grupė, arba aroilo ar aralkanoilo grupė, turinti nuo 7 iki 20 anglies atomų, tokia kaip benzoilo fenilacetilo grupė.
[0038] R5 gali taip pat būti acilo grupė, išvesta iš amino rūgsties arba peptido grandines. Konkrečiai, R gali būti acilo grupė, išvesta iš serino, arba iš bet kurio iš peptidų, išvestų iš tokios amino rūgšties sekos, pašalinant einančias iš eilės N-galutines amino rūgš-tis :
[0039] Yra geriau, kai bendro (I) formulės peptido galinė gru-pė yra apsaugota, pvz., acilinant su alkanoilo, aralkanoilo arba aroilo grupe.
[0040] Kur R yra C2_6 alkilo grupė, tai ji gali būti, pvz., etilo, butilo arba heksilo grupė. Kai Rs yra aralkilo grupė, tai ji gali patogiai, būti arilmetilo grupė, tokia kaip benzilas, difeniImetilas arba trifenil-metilas. Kur R yra metabeliskai labili grupė, tai ji gali, pvz., būti ariltio grupė, turinti nuo 5 iki 10 anglies atomų, pvz., piridiltio grupe arba acilo grupė kaip apibrėžta aukščiau.'
[0041] Tinkamesni šio išradimo junginiai yra pentapeptidai kiekvienoje grandinėje, t.y. n yra geriau O.
[0042] Geriau, kai ciklinės grupės Ra liekanoje yra penkių narių, t.y. m yra geriau O.
[0043] Nors bet kuris iš peptidų, apibrėžtų (I) formule aukš-čiau, yra žemo arba nežymaus hemoreguliacinio aktyvumo, nepaisant to, jie gali būti- efektyvūs būdami tiltelio formos pagal ši, išradimą, stimuliuojant ląstelių pro-liferacij ą.
[0044] Dimeriniuose peptiduose, sudarytuose iš peptidinių grandinių, kaip pavaizduota (I) formulėje, jungiantis grandinės taškas yra pageidaujamas prie Rd.
[0045] Ypač tinkami peptidiniai junginiai pagal ši, išradimą yra ir II formulės junginiai
[0046]
[0047] kur grupė -A- yra dvivalentė jungianti grupė, kaip svarstyta aukščiau.
[0048] Šis išradimas ypatingai tinkamas stimuliuoti mielopoezę pacientams, kurie kenčia nuo sumažinto mielopoetinio aktyvumo, įskaitant kaulų čiulpų pažeidimą, agra-nulocitozę ir aplastinę anemiją. Į tai ieina gydymas pacientų, turinčių sumažintą kaulų čiulpų funkciją, imunosupresiniam gydymui, slopinti audinių reakciją, t.y. kaulų čiulpų transplantavimo chirurgijoje.
[0049] Junginiai taip pat gali būti panaudoti pagreitinti kaulų čiulpų regeneraciją po citostatinės chemo-terapijos ir radiacinės terapijos neoplastinėms ir virusinėms ligoms.
[0050] Be to, nauji junginiai gali būti labai vertingi, kur pacientai turi rimtas infekcijas dėl imunoreakcijos trūkumo po kaulų čiulpų pažeidimo.
[0051] Kitas klinikinis taikymas bus kartu su atitinkamais monomerais arba susijusiais mielopoezės inhibitoriais, kaip atskleista EP-A-112656 arba W0-A~90/02753, indu-kuoti kintamas aukšto ir žemo aktyvumo pikus kaulų čiulpų ląstelėse, tuo būdu sustiprinant natūralų cir-kadini, hemcpoezės ritmą. Taip citostatinė terapija gali būti panaudota žemo kaulų čiulpų aktyvumo periodais, tuo būdu sumažinant kaulų čiulpų pažeidimo riziką, tuo tarpu kai regeneracija bus pagreitinta iš eilės einan-čiais aktyvumo pikais.
[0052] Apskritai, kad būtų pasiektas stimuliacinis poveikis, šio išradimo peptidai gali būti paskirti pacientui craliai arbr: injekcijomis 0.C01-100 mg, pvz., 1-5 mg 70 kg kūno svoriui, dienos doze. Jei paskyrimas intraveninis arba poodinis, dozė gali būti 1-10 mg ribose 70 kg kūno svoriui per dieną, pvz., apie 6 mg, iki 10 dienų. Na-zalinis, vietinis (transdermalinis) arba rektalinis paskyrimas taip pat yra, žinoma, lankstus. Iš esmės rei-kalaujama pagaminti peptido koncentracijas apie 10~13M - 10~'l5M neląsteliniame paciento skystyje.
[0053] Pagal tolimesnius šio išradimo požymius, pateikiamos farmacinės kompozicijos, turinčios savyje kaip aktyvią komponentę vieną arba daugiau pagal ši, išradimą, ypač (I) formulės junginių arba fiziologiškai suderinamų jų druskų, kartu su farmaciniu nešikliu arba užpildu. Kompozicijos pagal ši, išradimą gali būti, pvz., tokio pavidalo, kad tiktų oraliniam, nazaliniam, parentera-liniam arba rektaliniam paskyrimui.
[0054] Čia naudojamas terminas "farmacinis" apima ir veteri-narinius šio išradimo taikymus.
[0055] Junginiai pagal šį išradimą gali būti įprastų vaistų formų, tokių kaip tabletės, apvilktos tabletės, aerozoliai nosiai, tirpalai, emulsijos, milteliai, kapsulės arba ilgalaikio atpalaidavimo formos. Įprasti farma-ciniai užpildai, kaip ir iprasti gamybos būdai, gali būti panaudoti šių formų paruošimui. Tabletės gali būti pagamintos, pvz., sumaišant aktyvią komponentę arba žinomais užpildais, kaip pvz., skiedikliais, tokiais kaip kalcio karbonatas, kalcio fosfatas arba laktozė, skaldytojais, tokiais kaip grūdų krakmolas arba algi-ninė rūgštis, rišikliais, tokiais kaip krakmolas arba želatinas, tepalais, tokiais kaip magnio stearatas arba talko milteliai, ir/arba ilgalaikio atpalaidavimo agentais, tokiais kaip karboksipolimetilenas, karboksime-tilceliuliozė, celiulozės acetato ftalatas arba po-livinilacetatas. Tabletės, jeigu reikia, gali susidėti iš kelių sluoks-nių. Apvilktos tabletės gali būti pagamintos, apvelkant vidurį, gautą panašiai kaip tabletės, su agentais, paprastai naudojamais tablečių apvilkimui, pvz., poli-vinilo pirolidonu arba šelaku, gumiarabiku, talku, titano dioksidu arba cukrumi. Tam, kad būtų gautas ilgalaikis atpalaidavimas arba išvengta nesuderinamumų, vidurys gali susidėti iš kelių sluoksnių taip pat. Tablečių apvalkalas taip pat gali susidėti iš kelių sluoksnių, kad būtų gautas ilgalaikis atpalaidavimas, ir tuo atveju gali būti panaudoti anksčiau paminėti užpildai tabletėms.
[0056] Organinės specifinės nešiklių sistemos taip pat gali būti panaudotos.
[0057] Injekcijų tirpalai gali būti, pvz., pagaminti įprastu būdu, tokiu kaip konservavimo agentų, tokių kaip p-hidroksibenzoatai, arba stabilizatorių, tokių kaip EDTA, pridėjimas. Tirpalais paskui užpildomi injekcijų buteliukai arba ampulės.
[0058] Nazaliniai aerozoliai gali būti sudaryti panašiai vandens tirpale ir supakuoti į purškimo konteinerius arba su aerozoliniu išstūmėju, arba su priemonėmis rankiniam spaudimui. Kapsulės, turinčios vieną arba kelias aktyvias komponentes, gali būti pagamintos, pvz., sumai-šant aktyvias komponentes su inertiniais nešikliais, tokiais kaip laktozė arba sorbitalis, ir užpildant mi-šinį i, želatino kapsules .
[0059] Tinkamos žvakutės gali, pvz., būti pagamintos, su-maišant aktyvią komponentę arba aktyvių komponenčių kombinacijas su įprastais nešikliais, numatytais šiam tikslui, tokiais kaip natūralūs riebalai arba po-lietileno glikolis arba jo dariniai.
[0060] Tinkami dozavimo vienetai, turintys savyje šio išradimo junginių, turi 0,1-10 mg, pvz., 1-5 mg (I) formulės peptido arba jo druskos.'
[0061] Tačiau kitas svarbesnis naujų peptidų panaudojimas yra medžiagų, skirtų imunologinių tyrimų technikos gamy-boje. Tada peptidas gali būti kovalentiškai prijungtas prie tinkamo didelio molekulinio nešiklio, tokio kaip albuminas, polilizinas arba poliprolinas tam, kad būtų įvestas antikūnus gaminantiems gyvuliams (pvz., triu-šiams, jūros kiaulytėms arba ožkoms). Imunizacijos metodai taip pat gali būti panaudoti in vitro. Labai specifiški antiserumai yra gaunami, naudojant gerai žinomus absorbcijos metodus, panaudojant dideli, mole-kulinį nešiklį. Įvedant radioaktyvumą (3H, 125I, 14C, 35S) į peptido molekulę, radioimuninis tyrimas gali būti suprojektuotas ir panaudotas peptido nustatymui įvai-riuose biologiniuose skysčiuose, tokiuose kaip serumas (plazma), šlapimas ir cerebrospinalinis skystis.
[0062] Šio išradimo peptidai gali būti sintezuoti bet kuriuo patogiu būdu. Tinkami metodai aminorūgšties vienetų sudarymui yra aprašyti, pvz., "Synthesis of Optically Active a-Amino Acids" ("Optiškai aktyvių a-Amino rūgš-čių sintezė"), Robert M. Williams (Pergamon Press, 1989) . Apskritai, esančios reaktyvios šoninių grandinių grupės (amino, tiolo ir/arba karboksilo) bus apsaugotos per visos sintezės susijungimo reakcijas, bet galima palikti kai kurias šoninių grandinių grupes neapsau-gotas (hidroksilo grupes, imidazolo grupes, pirmines amido grupes, amido grupes ciklinėse aminorūgštyse kaip piroGlu) per visą sintezės procedūrą.
[0063] Tuo būdu galutinė stadija bus visiškai apsaugoto arba iš dalies apsaugoto I bendros formulės peptido darinio deblokavimas ir šie procesai sudaro tolimesni, šio išradimo aspektą.
[0064] Schollkopf ir kt. aprašė daugybės aminorūgščių gavimą bis-laktimo eterių metalinimu ir po to einančiu al-kilinimu (žiūr., pvz., Tetrahedron 3_9; 2085 (1983) ir Topics Curr, CHEM., 109: 65 (1983)). Šio metodo pritaikymas pasirodė ypač naudingas tiltelinių ami-norūgščių, kurios sudaro šio išradimo pagrindą, ga-vimui. Konkrečiai, bis-laktimo eteris, išvestas iš valino-glicino dipeptido, sudaro naudingą pradini, jungini, sujungimo tilteliu reakcijoje, kuri gali būti re-ziumuota taip:
[0065] ( kurioje X yra nueinanti grupė, tokia kaip halogeno atomas, pvz., bromas).
[0066] Tiltelinės ( S, S) - a, a' - diaminorūgštys gali būti susin-tetintos šiuo metodu, jei D- valinas yra iš pradžių naudojamas sudaryti bis- laktimo eteri,. Lygiai taip pat ( R, R)- a, a'- diaminorūgštys gali būti sudarytos, panaudojant L- valiną.
[0067] Mes taip pat suradome, kad arilo ( įskaitant hete-roarilą) diglicino dariniai gali būti gauti iš ati-tinkamų di-( halokarbonilmetil) arilo junginių. Pasta-rieji junginiai gali būti paveikti chiraliniu oksazo-lidonu ir sudaryti karboksimido enoliatą, kuris tada yra paveikiamas azidą sudarančiu reagentu, tokiu kaip 2, 4, 6- triizopropil benzenosulfonilazidu, kad būtų įves-tos azido grupės, po ko atliekama hidrogenolizė, pvz., su 10% paladžio/ medžio anglies, kad būtų pagamintas reikalingas diglicinas.
[0068] Mūsų metodas yra metodikos, aprašytos Evans et al, J. Am Chem. Soc., 109 , 6881 ( 1987) ir J. Am. Chem. Soc., 111 , 1063 ( 1987), pritaikymas.
[0069] Alternatyviai tinkamas elektrofilinis amino azotas gali būti rastas azodikarboksilato esteryje, ir šiuo atveju atitinkama dihidrazino rūgštis yra tarpinis junginys hidrogenolizei iki amino rūgšties.
[0070] Ši metodika yra iliustruojama reakcijos schema, duodama žemiau:
[0071]
[0072] Tuo būdu, šis išradimas taip pat pateikia peptidinio junginio gavimo būdą, susidedanti, iš dalinai arba vi-siškai apsaugoto jo darinio deblokavimo.
[0073] Taip pat šis išradimas pateikia peptidinio junginio
[0074] a) bis-laktimo eterio metalinimo ir po to einančio alkilinimo, kad būtų sudarytas bis-laktimo dipeptido eteris; b) stadijos a) bis-laktimo dipeptido eterio hidrolizės, kad būtų sudaryta tiltelinė oc, a1-diamino rūgštis; c) pasiliekančių amino rūgščių įvedimo i, peptido grandines; d) bet kurios apsauginės grupės deblokavimo.
[0075] Bis-laktimo dipeptido eteriai ir pagaminta šiuo būdu tiitelinė rūgštis-a, a' -diaminorūgštis sudaro tolimesnį šio išradime aspektą.
[0076] Kai tiitelinis dipeptidas sudarytas, tada pasiliekan-čios amino rūgštys peptido grandinėje gali būti įves-tos, panaudojant įprastus metodus.
[0077] Sudarant peptido grandines, iš esmės galima pradėti arba nuo C-galo, arba N-galo, nors įprasta naudoti tik C-galo pradinę procedūrą.
[0078] Tuo būdu galima pradėti nuo C-galo, paveikiant tinkamą apsaugotą darinį, pvz., liziną su tinkamu apsaugotu cisteino dariniu. Lizino darinys turės arba laisvą, arba aktyvuotą karboksilo grupę ir apsaugotą amino-grupę. Po sujungimo, tarpiniai produktai gali būti išvalyti, pvz., chromatografija, ir tada selektyviai N-apsauga nuskeiiama, leidžiant tolesnį N-apsaugotos ir laisvos arba aktyvuotos aminorūgšties liekanos pri-dėjimą. Ši procedūra tęsiama, kol sudaroma reikalinga aminorūgšties seka.
[0079] Karboksilo rūgštį aktyvuojantys pakaitalai, kurie gali, pvz., būti naudojami, apima simetrinius arba mišrius anhidridus arba aktyvuotus esterius, tokius kaip, pvz., p-nitrofenilo esteris, 2,4, 5-trichlorfenilesteris, N-hidroksibenzotriazolo esteris, (OBt), N-hidroksi-sukci-nimidilesteris (CSu) arba pentafluorofenilesteris (OPFP).
[0080] Laisvų amino ir karboksilo grupių sujungimas gali pvz., būti atliktas, panaudojant dicikloheksilkarbodiimidą (DCC) . Kitas sujungimo agentas, kuris gali, pvz., būti panaudotas, yra N-etoksikarbonil-2-etoksi-l,2-dihidro-chinolinas (EEDQ).
[0081] Apskritai patogu atlikti jungimo reakcijas žemose tem-peratūrose, pvz., nuo -20°C iki aplinkos temperatūros, patogiai tinkamoje tirpiklio sistemoje, pvz., tetra-hidrofurane, dioksane, dimetilformamide, metileno chloride arba šių tirpiklių mišinyje.
[0082] Gali būti patogiau atlikti sintezę ant kietos fazės dervos nešiklio. Chlorometilintas polistirenas susiūtas su 1% divinilo benzenu yra vienas naudingas nešiklio tipas; tuo atveju sintezė prasidės C-gale, pvz., su-jungiant N-apsaugotą liziną su nešikliu.
[0083] Visa eilė tinkamų kietos fazės metodų yra aprašyta Eric Atherton, Christopher J. Logan and Robert C. Sheppard,
[0084] J. Chem. Soc. Perkin I, 538-46 (1981); James P. Tam, Foe S. Tjoeng, and R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 102, 6117-27 (1980); James P. Tam, Richard D. Dimarchi and R. B. Merrfield, Int. J. Peptide Protein Res. 16, 412-25, (1980); Manfred Mutter and Dieter Belfof, Helvetica Chimica Actą, 67_, 2009-16 (1984).
[0085] Yra žinomas platus apsauginių grupių aminorūgštims pa-sirinkimas ir pateikta pavyzdžių Schroder, E. and Lubke, K., The Peptides, Vols. 1 and 2, Academic Press, New York and London, 1965 and 1966; Pettit, G. R., Synthetic Peptides, Vols. 1-4, Van Nostrand, Reinhold. New York 1970, 1971, 1975 and 1976; Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Synthese von Peptiden, Band 15, Georg Thieme Verlg Stuttgart, NY 1983; The Peptides, Analysis, synthesis, biology 1-7, Ed: Erhard Gross, Johannes Meienhofer, Academic Press, NY, San Francisco, London;. Solid phase peptide synthesis 2nd ed., John M. Stewart, Janis D. Young, Pierce Chemical Company.
[0086] Tuo būdu. pvz., amino apsauginės grupės kurios gali būti panaudotos, apima apsaugines grupes tokias kaip karbcbenzoksi (Z-), t-butoksikarbonilas (Boc-), 4-metoksi-2,3,6-trimetilbsnzeno suifonilas (Mtr-) ir 9-fluo-reniimetoksikarbonilas (Frnoc-) .
[0087] Bus suprantama, kad kai peptidas sudarytas nuo C-galo, amino apsauginė grupė bus ant kiekvienos naujos pri-dedamos liekanos L-arnino grupės ir ją reikės pašalinti selektyviai prieš kitą jungimo stadiją. Kietos fazės sistemoms viena ypač naudinga grupė tokiai laikinai amino apsaugai yra Fmoc grupė, kuri gali būti pašalinta selektyviai, paveikiant piperidinu organiniame tir-piklyje. Sintezei tirpale, Boc- yra tinkamesnė apsau-ginė grupė, kuri gali būti įvesta ir pašalinta įprastu būdu.
[0088] Aminorūgštys arba peptidai dažnai reikalauja silici-linimo prieš apsaugojimą, pvz., pridedant Fmoc, kad būtų pagerintas jų tirpumas organiniuose tirpikliuose. Sililinimas ir Fmoc apsaugos reakcijos yra susumuotos žemiau:
[0089] Karboksilo apsauginės grupės, kurios gali, pvz., būti panaudotos, apima suskaldytas esterio grupes, tokias kaip benzilas (-OBZI), p-nitrobenzilas (-ONB) arba t-butilas (t-tOBu), kaip ir jungimą ant kieto nešiklio, pvz., metilo grupes, prijungtas prie polistireno.
[0090] Tiolo apsauginės grupės apima p--metoksibenzilą (Mob) , tritilą (Trt) ir acetamido metilą (Acm).
[0091] Bus suprantama, kad egzistuoja daug kitų tokių grupių, kaip pvz., detaliai aprašyta aukščiau nurodytoje lite-ratūroje, ir visų tokių grupių panaudojimas čia aukš-čiau aprašytuose procesuose įeina i, šio išradimo sritį.
[0092] Egzistuoja daug procedūrų amino- ir karboksil-apsau-ginių grupių pašalinimui. Tačiau tai turi būti sude-rinama su naudojama sintezės strategija. Šoninės gran-dinės apsauginės grupės turi būti atsparios sąlygoms, naudojamoms pašalinti laikinas a-amino apsaugines grupes prieš kitą jungimo stadiją.
[0093] Amino apsauginės grupės, tokios kaip Boc, ir karboksilo .apsauginės grupės, tokios kaip tOBu, gali būti paša-lintos vienu metu paveikiant rūgštimi, pvz., trifluoro acto rūgštimi. Tiolo apsauginės grupės, tokios kaip Trt, gali būti pašalintos selektyviai, panaudojant ok-sidavimo agentą, toki, kaip jodas.
[0094] Cisteino turintys peptidai gali būti sintezuoti meto-dais, aprašytais tekste, su visų apsauginių grupių pa-šalinimu, įskaitant tiolo apsaugines grupes kaip pasku-tinę sintezės stadiją.
[0095] Toliau einantys pavyzdžiai pateikiami tik kaip ilius-tracijos .
[0096] (E)-DHs = (S,S)P 7-Diamino-i,3-dietilbenzeno- p, p'-dikar-boksilo rūgštis
[0097] a) a, a'- Bis( 2R, 5S)- 2, 5- dihidro- 3, 6- dimetoksi- 2- izopro-pil- 5- pirazinil)- m- ksilenas
[0098] n-Butillitis heksane (1,6 M, 9,4 ml, 15 mmol) pridėtas i, (2R) - (-) -2, 5-dihidro-3, 6-dimetoksi-2-izopropilpirazi-no (2,8 g, 15 mmol) tirpalą sausame THF (5 ml), at-šaldytą iki -78°C. Mišinys maišomas 15 minučių. Po to pridėtas a, a'-dibrom-m-ksileno (2,0 g, 7,5 mmol) tirpalas sausame THF (5 ml). Reakcijos mišiniui leista sušilti iki aplinkos temperatūros per naktį. Tirpiklis išgarintas ir likutis užpiltas dietilo eteriu. Eterio tirpalas buvo perplautas vandeniu, išdžiovintas (MgS04) ir išgarintas. Produktas išvalytas impulsine chromatografija (silikagelis, heksanas/EtOAc 3:1). Išeiga 2,8 g (80%) - gelsvai baltos pusiau kietos medžiagos.
[0099] 0,60 (6H, d), 0.94 (6H, d, CH3) , 2,1 (2H, m), 3,0 (4H, m), 3,3 (2H, m), 3,66 (6H, s), 3,71 (6H, s), 4,3 (2H, dd) , 6,8-7,1 (4H, m);
[0100] 18.0, 20,6, 32,6, 41, 5, 53, 2, 53,4, 57, 9, 61, 3, 127, 5, 128,1, 131,9, 137,1, 162,5, 163,7.
[0101] MS (IP 70 eV) : m/z 470 (0, 2), 288 (50), 183 (47), 182 (20) , 141 (100), 105 (40) .
[0102] C26H38N404 Paskaič., % :C 66, 34; H 8,14; N-11,91;
[0103] Rasta, %: C 66,48; H, 8,07; N 11,85.
[0104] b) Dimetil (S,S)-a,a'- diamino- 1, 3- benzendipropionatas
[0105] a,a'-Bis[ (2R,5S)-2,5-dihidro-3,6-dimetoksi-2-izopropil-5-pirazinil] -m-ksilenas (2,00 g, 4,25 mmol) ištirpintas metanolyje (10 ml) ir pridėta 0,25 M druskos rūgšties (68 ml, 17 mmol). Mišinys maišomas aplinkos temperatū-roje per naktį. Vandens/metanolio mišinys ekstrahuotas dietilo eteriu ir tada pH buvo sureguliuotas iki 10, pridedant amoniako. Produktai buvo ekstrahuoti eteriu. Eterio tirpalas išdžiovintas (MgS04) , filtruotas ir išga-rintas. D-Valino metilesteris nudistiliuotas Kugelrohr'o įrenginyje (50-60°C/0,1 mbar). Likutis buvo panaudotas sekančioje stadijoje be tolimesnio valymo.
[0106] 1,4 (4 H, pl, s), 2,83 (2H, dd, 2J 13,5Hz), 3,05 (2H, dd, 2J 13, 5Hz, 3J 5, 1Hz) , 3,7 (2H, dd) , 3,71 (6H, s), 7,0-7,3 (4H, m).
[0107] c) ( S, S) - a, a'- Diamino- 1, 3- benzendipropiono rūgšties. 2HC1
[0108] Dimetil (S,S)-a,a'-diamino-1,3-benzendipropionato (1,0 g,
[0109] 3,6 mmol) tirpalas 6 M druskos rūgštyje (10 ml) maišo-
[0110] mas, esant 50°C, per nakti,. Druskos rūgštis pašalinta rotaciniu garintuvu, ir gauta balta kieta medžiaga iš-džiovinta vakuuminėje krosnyje, esant 40°C.
[0111] 3,18 (2H, dd, 2J 14,5 Hz, 3J 7,4Hz), 3,29 (2H, dd, 2J 14,5 Hz, 3J 5,7Hz), 4,28 (2H, dd, 3J 5,7, 7,4 Hz), 7,1-7,4 (4H, m);
[0112] 39,2, 57,7, 131,8, 132,8, 133,0, 137,7, 173,7.
[0113] C12H18Cl2N204 Paskaič. %: C 44,32; H 5,58; N 8,61;
[0114] Rasta %: C 44,78; H 5,81; N 8,73;
[0115] d) ( S, S)a,a'- Bis( 9- fluorenilmetoksikarbonilamino)- l, 3- benzendipropiono rūgštis
[0116] (S, S) -a,a' -Bis (9-fluorenilmetoksik.srbonilamino) -1, 3-benzendipropiono rūgšties dihidrochlorido (1,05 g, 3,23 mmol) suspensija heksametildisilazano (15 ml) ir trimetil-chlorsilano (1,5 ml) mišinyje maišoma azoto atmosferoje 100°C temperatūroje per nakti,. Skaidrus reakcijos mi-šinys atšaldytas, ir sililinantys reagentai pašalinti vakuume. Likutis ištirpintas sausame dichlormetane (10 ml) ir atšaldytas ledo/vandens vonioje. Buvo pridėtas 9-fluorenilmetoksikarbonilo chlorido (1,75 g, 6,76 mmol) tirpalas sausame dichlormetane (5 ml) ir reakcijos mišinys maišomas azoto atmosferoje 3 valandas. Dichlormetanas pašalintas rotaciniu garintuvu, ir likutis ištirpintas THF (8 ml) bei vandens (1 ml) mišinyje. Šis mišinys maišomas 30 minučių ir po to išgarintas. Likutis buvo ištirpintas etilo acetate ir kelis kartus
[0117] perplautas vandeniu. Organinė fazė buvo išdžiovinta (MgS04) , filtruota ir koncentruota. Produktas išsikris-talizavo, pridėjus heksano. Kristalai perplauti heksanu, ir produktas išvalytas kolonėlės chromatografija (silicio dioksidas, heksanas/etilo acetatas, acto rūgš-tis 3:6:1), balta kieta medžiaga, lyd.t. 143-144°C.
[0118] Išeiga 1,85 g (82%). "
[0119] 2,8-3,1 (4H, m) 4,0-4,4 (8H, m), 7,0-8,0 (22H, m) ;
[0120] 37,5, 47,6, 55,3, 66,4, 120,2, 125,3, 127,1, 127,3, 127, 7, 128, 1, 129,9, 137, 8, 140, 6, 143, 6, 155,7, 172, 9.
[0121] FAB-MS signalas prie m/z 719,1(2), 539,1(6), 271,0(6) ir 179,1(100).
[0122] 2 PAVYZDYS
[0123] ( S, S)- a, a1- Bis( 9- fluorenilmetoksikarbonilamino)- 1, 4-benzendipropioninė rūgštis
[0124] a) a, a'- Bis[( 2R, 5S)- 2, 5- dihidro- 3, 6- dimetoksi- 2- izopro-pil- 5- pirazinil- p- ksilenas
[0125] Pavadinime nurodytas junginys susintetintas kaip anks-čiau iš (2R)-(-)-2,5-dihidro-3,6-dimetoksi-2-izopropil-pirazino (18 mmol) ir a,a'-dibrom-£-ksileno (9 miriol) . Gautas produktas išvalytas impulsine chromatografija ant silikagelio (CHC13) .
[0126] 0, 6- 0, 9 ( 2d, 12H), 2, 05- 2, 20 ( m, 2H) , 3, 05 ( d, 4H) , 3, 25 ( s, 2H) , 3, 60 ( s, 6H) , 3, 70 ( s, 6H) , 6, 9 ( s, 4H) .
[0127] b) Dimetil ( S, S)- a, a'- diamino- 1, 4- benzendipropionatas
[0128] Produktas iš priešeinančios stadijos ( 3, 4 mmol) buvo
[0129] suskaldytas į pavadinime nurodytą jungini,, panaudojant 0, 25 M HCi aplinkos temperatūroje, kaip aprašyta m- izomerui aukščiau.
[0130] c) ( S, S)- a, a'- Diamino- 1, 4- banzendipropiono rūgšties di-hidrochloridas
[0131] Metilo esterio grupė priešeinančiair. e produkte hidro-lizuota, pašildant su kone. HCI, kaip aprašyta m- izomerui aukščiau.
[0132] 0, 8- 0, 9 ( 2d, 6H) , 2, 10 ( m, 1H) , 3, 00 ( m, 2 H9) , 3, 45 ( d, 1H), 3, 81 ( t, 2H) , 7, 13 ( s, 4Ii) .
[0133] d) ( S, S)- a, a'- Bis( 9- fluorenilmetoksikarbonilamino)- 1, 4-benzendipropiono rūgštis
[0134] Pavadinime nurodytas junginys buvo susintetintas iš aukščiau minėtos rūgšties ir 9-fluorenilmetoksikarbonilo chlorido, kaip aprašyta m-izomerui aukščiau.
[0135] 2,79-3,11, (m, 6H) , 4,09-4,21 (pl, s, 6H), 7,13-7,92 (m, 20H).
[0136] a) a, a- Bis[( 2R, 5S)- 2, 5- dihidro- 3, 6- dimetoksi- 2- izopro-pil- 5- pirazinil- o- ksilenas
[0137] (R)-2, 5-Dihidro-3,6-dimetoksi-2-izopropilpirazinas (3,5 g, 19,00 mmol) ištirpintas sausame THF (8 ml) . Tirpalas atšaldytas (-78°C), ir lašinant pridėta BuLi (13 ml, 19,50 mmol, 1,5 M heksane), azoto atmosferoje. Elektrofilas, a, a'-dichlor -o-ksilenas (1,66 g, 9,50 mmol) THF (5 ml) pridėtas lašinant (-78°C). Reakcijos miši-niui leista atšalti iki aplinkos temperatūros per nakti,. Tirpiklis pašalintas ir gautas nevalytas produktas išvalytas impulsine chromatografija, panaudojant heksaną/etilo acetatą (4:1) kaip eliuentą. Blyškiai geltoni kristalai, 3,512 g (78%). Lyd.t. 109-112°C.
[0138] 0,59 (6H, d, J 6,7 Hz, 2 x CH3) , 0,94 (BH, d, J 6, 8 Hz, 2 x CH3), 2,13 (2H, m, 2 x CH) , 2, 95, 3, 45 (4H, m, 2 x CH2), 3,23 {2H, t, J 3,3 Hz, 2 x CH) , 3,62 (6H, s, OCH3), 4,26 (2H, m, 2 x CH) , 7,05 (4H, m, 4 x CH) .13C BMR (75 MHz, CDC13) 6: 16, 38, 18, 98, 30, 96, 36, 49, 52, 10, 52, 20, 57, 14, 59, 98, 125,86, 130,41, 136,75, 162,85, 163,61.
[0139] C26H38N404 Paskaič., % : C, 66, 35; H, 8,14.
[0140] Į a, a'-Bis[ (2R,5S)-2,5-dihidro-3,6-dimetoksi-2-izopro-pil-5-pirazinil] -o-ksileną (1,155 g, 2,45 mmol) pridėta 0,5 M HC1 (20 ml, 10,00 mmol) ir dioksano (20 ml). Šis mišinys maišomas 7 valandas aplinkos temperatūroje. Didžioji tirpiklių dalis pašalinta sumažintame slė-gyje, vandens (15 ml) ir chloroformo (15 ml) buvo pri-dėta. Chloroformo sluoksnis buvo nuleistas, o vandens sluoksnis pašarmintas kone. NH3 (pH 10). Vanduo išeks-trahuotas, chloroformu (3 x 20 ml), ir sujungti chloroformo sluoksniai išdžiovinti (MgS04) bei sukoncentruoti. Valino metilo esteris buvo pašalintas distiliacija iš kolbos X kolbą (0,3 mm Hg, 50°C) per 1,5 valandos. Likutis yra gelsvas aliejus, 0,55 g (80%).
[0141] 1,63 (4H, s, NH2), 3,02 (4H, m, 2 x CH2) , 3,71 (6H s, OCH3) , 3,74 (2H, m, 2 x CH) , 7,18 (4H, m, 4 x CH) .
[0142] 38,26, 52,47, 56,10, 127,48, 130,80, 136,73, 175,92.
[0143] C14H18N204 Paskaič., %: C, 59,98; H, 7,19.
[0144] C) ( S, S) - a, a'- Diamino- 1, 2- benzendipropiono rūgš-ties . 2HC1
[0145] Dimetil(S, S)-a,a'-diamino-1,2-benzendipropionatas (270 mg, 0, 963 mmol) veikiamas 6N HC1 (20 ml), esant 50°C, 20 va-landų. Vanduo pašalintas vakuume pridėta benzeno ir išgarinta (2 x 20 ml), liko bespalvė kieta medžiaga, 0,313 g.
[0146] 3,18 (4H, m, 2 x CH2) , 4,12 (2H, m, CH) , 4,64 (6H, s, NH3) , 7,23 (4H, m, 4 x CH) .13C BMR (75 MHz, D20) 5: 32,56, 53, 85, 128, 62, 130, 81, 133,27, 171, 36.
[0147] d) ( S, S) -a,a'- Bis( 9- fluorenilmetoksikarbonilamino)- 1, 2-benzendipropiono rūgštis
[0148] (S, S)-a,a'-Diamino-1,2-benzendipropiono rūgšties dihidro-chloridas (130 mg, 0,4 mmol) suspenduotas heksame-tildisilazane (7 ml) bei trimetilsililo chloride (0,5 ml) ir virinta su grįžtamu šaldytuvu azoto atmosferoje per nakti,. Tirpikliai buvo pašalinti vakuume, likutis iš-tirpintas sausame dichlormetane (10 ml) . Tirpalas at-šaldytas (0°C), ir lašinant pridėta 9-fluorenilmetoksikarbonilo chlorido (260 mg, 1,00 mmol) sausame dichlormetane. Šaldanti vonia pašalinta po 1 valandos, ir reakcijos mišinys maišomas per nakti,, azoto atmosferoje. Buvo pridėta 1N HC1 (5 ml). Tirpikliai pašalinti, ir likutis perplautas 1M HC1 (5 ml) dioksane (5 ml) bei išdžiovintas.
[0149] 2,49-3, 54 (14H, m, 4 x CH2, 4xCH, 2 x NH) , 7,29-7,84 (20H, m, 20 x CH).
[0150] 33,41, 46,94, 54,75, 66,14, 120,46, 125,64, 126,79, 127,48, 128,07, 130,21, 136,42, 141,02, 144,05, 156,37, 173,64 .
[0151] a) 2, 5- Bis[( 2R, 5S)-(-)- 2, 5- dihidro- 3, 6- dimetoksi- 2- izo-propil- pirazinilmetil)- tiofenas
[0152] (R)-2,5-Dihidro-3,6-dimetoksi-2-izopropilpirazinas (5,00 g, 27,14 mmol)ištirpintas sausame THF (15 ml) . Tirpalas atšaldytas (-78°C) ir lašinant pridėta BuLi (19 ml, 30,4 mmol, 1,5 M heksane) azoto atmosferoje. Po 10 minučių lašinant pridėtas elektrofilas, 2,5-bis (chlormetil)tiofenas (2,5 g, 13,8 mmol) THF (10 ml) . Reakcijos mišiniui leista pasiekti aplinkos temperatūrą per naktį, azoto atmosferoje. Tirpiklis pašalintas vakuume ir gautas produktas išvalytas impulsine chromatografija, heksanas/etilo acetatas (4:1).
[0153] Išeiga: 4,87 g (75%) baltų kristalų, 2,3% blogo diaste-reomero (kuris gali būti pašalintas impulsine chromatografija arba perkristalizavus iš acetonitrilo).
[0154] 0, 63 ( 6H, d, J 6, 9 Hz, CH3) , 0, 96 ( 6H, d, J 6, 9 Hz, CH3) , 2, 16 ( 2H, m, CH) , 3, 58 ( 2H, t, J 3, 5Hz, CH) , 3, 65 ( 6H, s, OCH3) , 3, 71 ( 6H, s, OCH3) , 4, 23 ( 2H, dd, CH) , 6, 48 ( 2H, s, H- 3, H- 4) .
[0155] 16, 56, 18, 85, 31, 46, 34, 59, 51, 94, 52, 41, 56, 04, 60, 48, 125, 80, 137, 65, 161, 57, 164, 43.
[0156] b) Dimetil-( S, S)- a, a1- diamino- 2, 5- tiofen- dipropionatas
[0157] 2, 5- Bist ( 2R, 5S)- (-)- 2, 5- dihidro- 3, 6- dimetoksi- 2- izopro-pil- 5- pirazinil] metil)- tiofenas ( 1, 007 g, 2, 113 mmol) suspenduotas dioksano ( 20 ml, HC1 ( 0, 7 ml, 8, 5 mmol, 12M) ir vandens ( 20 ml) mišinyje. Po 4 valandų aplinkos temperatūroje pridėtas dietilo eteris ( 30 ml) . Eterio fazė nuleista, vandens fazė pašarminta kone. NH3 ( pH 10). Po to ekstrahuota chloroformu ( 3x30 ml). Sujungti organiniai sluoksniai išdžiovinti ( MgS04) , ir tirpikliai pašalinti. Valino metilo esteris išskirtas distiliacija iš kolbos i, kolbą ( 0, 5 mmHg, 50°C, 1, 5 h).
[0158] C12H16N204S Paskaič. % : C, 50, 33; H, 6, 34.
[0159] 1, 60 ( 4H, pls, NH2), 3, 16 ( 4H, m, CH2) , 3, 70 ( 2H, m, CH) , 3, 73 ( 6H, s, OCH3) , 6, 68 ( 2H, s, H- 3, H- 4).13C BMR ( 75 MHz, CDC13) 8: 35,26, 52,02, 55,52, 126,32, 138,19, 174.85.
[0160] c) ( S, S)- a, a'- Diairu. no- 2, 5- tiofen- dipropiono rūgšties. 2HC1
[0161] Dimetil(3,S)-a,a'-diamino-2,5-tiofeno-dipropionatas
[0162] (531 mg, 1,854 rrimol) veikiamas 6N HC1 (30 ml) , esant 70°C, 20 valandų. Tirpalas išgarintas ir likęs vanduo zeotruopintas benzolu (2x30 ml).
[0163] 3,35 (4H, d, J 5,9, CH2) , 4,16 (2H, t, J 5,8 Hz, CH) , 4,65 (8K, S, NH3), 5,78'(2H, S, H-3, H- 4).
[0164] 29,96, 54,07, 128,61, 135,89, 171,35.
[0165] d) ( S, S)- a, a'- Bis{ 9- fluorenilmetoksikarbonilamino)- 2, 5-tiofen- dipropiono rūgštis
[0166] ( S, S)- a, a'-Diamino-2,5-tiofenodipropiono rūgšties di-hidrochloridas (590 mg, 1,78 mmol) suspenduotas hek-sametildisi.1 arane (15 ml) ir trimetilsililo chloride (1 ml) deflegmavosi per naktį. Tirpalas išgarintas, esant sumažintam slėgiui, likutis ištirpintas sausame dichlormetane (15 ml) . Tirpalas atšaldytas iki 0°C ir lašinant pridėtas 9-fluorenilmetiloksi-karbonilo chloridas (l,055g, 4,08 mmol) dichlormetane (5 ml) azoto atmosferoje. Šaldanti vonia pašalinta po 1 valandos, o mišinys maišomas per nakti, aplinkos temperatūroje azoto atmosferoje. Tirpiklis pašalintas, o junginys iš-tirpintas THF (5 ml) , ir pridėta 1N HC1 (5 ml) . Vandens fazė pašalinta po 2 valandų ir perplauta chloroformu (3x20 ml) . Sujungti organiniai sluoksniai išdžiovinti
[0167] (MgS04) ir tirpikliai pašalinti. Gautas produktas išvalytas impulsine chromatografija, panaudojant dichlor-metaną/metanoli,/acto rūgšti, (10:1:0,1) kaip eliuentą.
[0168] Geltoni kristalai: 0,557 g (44%). Lyd.t. 249°C (skyla).
[0169] 2, 90-4, 20 (14H, m, 4 x CH2, 4 x CH, 2 x NH) , 6,69 (2H, s, H-3, H-4), 7,20-8,00 (16H, m, 16 x CH).
[0170] 21,47, 31, 50, 109, 50, 120,20, 121, 56, 127, 50, 129, 15, 137,71, 139,83, 143,00, 172,00.
[0171] 5 PAVYZDYS
[0172] ( S, S) - a, a'- Diamino- cis- 1, 2- ciklopropan- dipropiono rūgštis
[0173] Į atšaldytą (0°C) trifenilfosfino (10,8 g, 41,16 mmol)
[0174] suspensiją acetonitrile (70 ml) lėtai pridėta bromo (6,6 g, 41,16 mmol). Šaldanti vonia pašalinta ir laši-nant pridėtas cis-1,2-bis(hidroksimetil)ciklopropano (2,0 g, 19,6 mmol) tirpalas acetonitrile (5 ml) . Šis mišinys maišomas aplinkos temperatūroje 1 valandą, nuo-sėdos nufiltruotos ir filtratas sukoncentruotas vakuume. Likutis ištirpintas eteryje (70 ml) , nufiltruotas, sukoncentruotas ir perdistiliuotas vakuume (12 mbar, vir.t. 135-155°C).
[0175] 0,44 (kv, J 5,8 Kz, 1H) , 1,18 (m, 1H) , 1,66 (m, 2H) , 3,50 (m, 4K) .
[0176] 16,66, 22,68, 33,46.
[0177] b) cis- 1, 2- Bis[(2R, 5S)- 2, 5- dihidro- 3, 6- dietoksi- 2- izo-propil- 5- pirazinil] metil- ciklopropanas
[0178] n-Butillitis heksane (1,6N, 5, 483 mi, 8,774 mmol) lėtai' pridėtas i, atšaldytą (-78°C) (2R)-2,5-dihidro-3, 6-dietoksi-2-izopropilpirazino (1,862 g, 8,774 mmol) tirpalą THF (30 ml) , ir maišymas tęsėsi 30 minučių. Po šio laikotarpio lėtai pridėtas cis-1,2-bis-(bromometil)ciklopropano tirpalas bevandeniame THF (10 ml) , ir mišiniui leista įgyti aplinkos temperatūrą per nakti,. Reakcija nuslopint p y. 2 . d G jus fosfato buferio pH 7 (30 ml), ir mišinys dukart ekstrahuotas eteriu (30 ml kiekvieną kartą) . Sujungti organiniai sluoksniai iš-džiovinti (MgS04) , išgarinti iki sausumo, ir produktas išskirtas impulsine chromatogra.fi j a (heksanas/etilo eteris 8:1).
[0179] -0,15 (kv, J 5,85 Hz, 1H) , 0,5 (m, 1H) , 0,65 (d, 6H) , 0,99 (d, 6H) , 1,22 (dvt, 12K) , 1,51 (m, 2H) , 1.92 (m, 2H) , 2,23 (m, 2H) , 3,83 (m, 2H) , 3,98-4,19 (m, 2H) .
[0180] 10,51, 10,90, 11,08, 14,37, 16,55, 17,03, 19,02, 19,12, 31,41, 31,59, 32,54, 33,31, 33,70, 46,78, 55,83, 56,15, 60,26, 60,38, 60,52, 60,55, 60,68, 61,03, 162,87, 163,03, 163,26, 163, 38.
[0181] c) Dietilo( S, S)- a, a'- diaminoamino- cis- 1, 2- ciklopropan-dipropionatas
[0182] Druskos rūgštis (1N, 3,51 ml) pridėta i, cis-1,2-bis[ (2R,5S)-2,5-dihidro-3,6-aietoksi-2-izopropil-5-pi-razinil)metil] -ciklopropano (430 mg, 0,876 mmol) tir-palą dioksane (3,5 ml) . Mišinys maišomas aplinkos tem-peratūroje 1 valandą, paskui dioksanas pašalintas vakuume. Likutis du kartus ekstrahuotas chloroformu (15 ml kiekvieną kartą), įdėjus 1,5 ml koncentruoto amoniako, sujungti ekstraktai išdžiovinti (MgS04) , išgarinti ir valino esteris buvo išskirtas vakuumine destiliacija (55°C, 0, 03 mbar) .
[0183] -0,15 (kv, 1H), 0,68 (m, 1H), 0,79 (m, 2H), 1,22 (t, J 7,2 Hz, 6H) , 1,36 (m, 2H) , 1.78 (m, 2H) , 3,41 (m, 2H) , 4,10 (kv, J 7,2 Hz, 4H).
[0184] 10,72, 11,37, 11,44, 13,88, 33,74, 54,56, 54,79, 60,36, 60,38, 175,39, 175,672.
[0185] d) Dietil( S, S)- a, a'- Bis( 9- fluorenilmetiloksikarbonil-amino)- cis- 1, 2- ciklopropan- dipropionatas
[0186] Fmoc-chloridas (678 g, 2, 622 mmol) ir 1N NaHC03 tirpalas (3 ml) iš eilės pridėti i, dietil ( S, S) - a, a' - diaminoamino-cis-1,2-ciklopropan-diprop.ionato (238 mg, 0,874 mmol) tirpalą dioksane (4 ml), esant aplinkos temperatūrai. Dioksano pašalinimas po 30 minučių mai-šymo, po to likučio, likusio po CHC13 išgarinimo, ekstrahavimas chloroformu (30 ml) ir impulsinė chromatografija (heksanas/etilo acetatas 4/1-2/1) davė pavadinime nurodytą jungini,.
[0187] -0,10 (pl s, 1H), 077(pl s, 3H), 1,28 (t, 6H), 1,56 (m, 2H), 2,03 (m, 2H), 4,23 (m, 6H), 4,41 (m, 6H), 5,46 (m, 2H), 7,25-7,77 (m, 16H).
[0188] 11.05, 11,24, 14,13, 31,77, 31,82, 47,16, 54,11, 54,28, 61, 49, 66, 93, 119, 93, 125, 01, 126, 99, 127,65, 141,26, 143,72, 143,86, 155,69, 172,11, 172,28.
[0189] e) ( S, S)- a, a'- Bis{ 9- fluorenilmetiloksikarbonilamino)-cis- 1, 2- ciklopropan- dipropiono rūgštis
[0190] Dietil(S,S)-a,a'-bis(9-fluorenilmetiloksikarbonilami-no) -cis-1,2-ciklopropan-dipropionato (497 mg, 0,693 mmol) tirpalas dioksane (5 ml) šildomas iki 90°C su 6N HC1 (3 ml) 26 valandas. Dioksanas pašalintas vakuume, o vandens likutis buvo du kartus ekstrahuotas chloroformu (20 ml kiekvieną kartą). Tirpiklis išgarintas po iš-džiovinimo (MgS04) , o likutis išvalytas impulsine chromatografija (heksanas/etilo acetatas/acto rūgštis 10/10/1). Frakcijos, turinčios produktą, buvo surink-tos, sukoncentruotos i, mažą tūri, vakuume ir liofili-zuotos, davė pavadinime nurodytą jungini, - baltus miltelius .
[0191] -0,04 (m, 1H) , 0,56 (m, 1H) , 0.82 (m, 2H) , 1,41 (m, 1H) , 1,60 (m, 1H), 1,74 (m, 1H) , 1,88 (m, 1H) , 3,97 (m, 2H), 4,25 (m, 6H), 7,27-7,88 (m, 16H).
[0192] 10,88, 12,35, 13,1 3, 30, 15, 30, 59, 47, 02, 54, 84, 66, 02, 120,43, 125,63, 127,44, 128,02, 136,68, 141,04, 144,10, 144,15, 156,43, 156,49, 174,00, 174,12.
[0193] 6 PAVYZDYS
[0194] (S,S)-a,a'- Diamino- cis- i, 2- ciklobutan- dipropiono rūgštis
[0195] Į atšaldytą (0cC) trifenilfosfino (2,664 g, 10,16 mmol)
[0196] suspensiją acetonitrile (15 ml) lėtai pridėtas bromas (1,623 g, 10,16 mmol). Šaldanti vonia pašalinta ir cis-1,2-bis (hidroksimetil)ciklobutanas (562 mg, 4, 838 mmol) acetonitrile (5 ml) pridėtas lašinant. Šis mišinys mai-šomas aplinkos temperatūroje 1 valandą, po to tirpiklis pašalintas vakuume ir sutrintas su eteriu (30 ml). Nuosėdos pašalintos filtravimu, filtratas sukoncentruotas ir nukreiptas vakuuminei destiliacijai (Kugel-rohr, 0,3 mbar, vir.t.110°C) .
[0197] 1,71 (s, 2H), 2,10 (s, 2H), 2,83 (s, 2H), 3,44 (m, 2H), 3, 58 (m, 2H) .
[0198] 23,72, 33,69, 39,45.
[0199] b) cis- 1, 2- Bis[( 2R, 5S)- 2, 5- dihidro- 3, 6- dietoksi- 2- izo-propil- 5- dihidropirazinil] metil- ciklobutanas
[0200] n-Butillitis heksane (1,6N, 4,92 ml, 7,87 mmol) lėtai pridėtas .i, atšaldytą (--78°C) (2R)-2,5-dihidro-3,6-dimetoksi-2-izopropilpirazino (1,449 g, 7,865 mmol) tir-palą THF (30 ml) ir maišymas tęsėsi 30 minučių. Po to, cis-1,2-bis-bromometil-cikiobutano (906 mg, 3,745 mmol) tirpalas vandeniniame THF (4 ml) lėtai pridėtas, ir tirpalui leista įgyti aplinkos temperatūrą. Reakcija nuslopinta, pridedant fosfato buferi, pH 7 (30 ml) , ir mišinys ekstrahuotas du kartus eteriu (30 ml kiekvieną kartą). Sujungti organiniai sluoksniai išdžiovinti (MgS04) , išgarinti iki sausumo, ir produktas atskirtas impulsine chromatografija (heksanas/etilo eteris 8/1).
[0201] 0,60 (d, 6H) , 0.98 (d, 6H) , 1,63 (m, 4H) , 1,85 (m, 4H), 2,17 (m, 2H) , 2,45 (m, 2H) , 3, 75-3, 67 (m, 12H) , 3,80-3,94 (m, 4H).
[0202] 16,35, 16,40, 19,02, 24,84, 25,54, 31,30, 31,36, 33,87, 34,22, 34,72, 34,81, 51,96, 52,04, 52,16, 54,22, 54,75, 60, 23, 60, 36, 162, 73, 163, 20, 164, 19.
[0203] c) Dietil( S, S)- a , a '- diaminoamino- cis- l, 2- ciklobutan- dipropionatas
[0204] Druskos rūgštis (1N, 4,61 ml), pridėta i, cis--l,2-bis[ (2R, 5S) -2 , 5-dihid.ro-3, 6-dietoksi-2--izopropil-5-d.i-hidropirazinilmetil-cik.lobutano (517 mg, 1,152 mmol) tirpalą dioksane (5 ml), mišinys maišomas aplinkos temperatūroje 1 valandą,, po to dioksanas pašalintas vakuume. Likutis dukart ekstrahuotas chloroformu (15 ml kiekvieną kartą), pridėjus 1,5 ml koncentruoto amoniako, sujungti ekstraktai išdžiovinti (MgS04) , išga-rinti ir valino esteris išskirtas vakuumine destiliacija (55°C, 0,03 mbar). Aliejingas likutis susideda iš gryno pavadinime nurodyto junginio.
[0205] 1,36 (pl s, 4H) , 1,50 (m, 4H) , 1,74 (m, 2H) , 1,91 (m, 2H), 2,43 (m, 2H), 3,24 (m, 2H), 3,59 (m, 6H).
[0206] 24,02, 24,80, 33,54, 33,86, 35,07, 35,67, 51,56, 51,68, 52,47, 53,03, 176,25, 176,59.
[0207] d) Dietil ( S, S) - <x, a' - bis ( 9- fluorenilmetiloksikarbonil-amino) - cis- 1, 2- ciklobutan- dipropionatas
[0208] Fmoc-chloridas (880 mg, 3,402 mmol) ir 1N NaHC03-tirpalas (3 ml) iš eilės pridėti d, dietil (S, S) -a,a' -diaminoamino -cis-1,2-ciklobutan-dipropionato (293 mg, 1,134 mmol) tirpalą dioksane (4 ml). Dioksano paša-linimas po 30 minučių maišymo ir ekstrahavimo chloroformu (30 ml) , po to CHCI3 išgarinimo, impulsinė chromatografija (heksanas/etilo acetatas 4/1-2/1) davė pavadinime nurodytą junginį.
[0209] 1.77 (m, 4H), 2,00 (m, 6H) , 2,25 (m, 2H), 3,74 (m, 6H) , 4,10-4,50 (m, 6H) , 5,10-5,20 (m, 2H) , 7, 27-7, 77 (m, 16H) .13C BMR (CDCI3) 8: 24,38, 24,95, 33,01, 33,18, 33,68, 33,78, 47,15, 52,19, 52, 30, 52, 40, 52, 65, 66, 93, 119,92, 125,.01, 126, 98, 127,65, 141,25, 143,67, 143,79, 155,63, 155,91, 172,84, 173,16.
[0210] e) ( S, S)- a, a'- Bis( 9- fluorenilme tiloksikarbonilami. no)-cis- 1, 2- ciklobutan- dipropiono rūgštis
[0211] Dietil(S,S)-a,a'-(9-fluorenilmetiloksikarbonilamino)-cis-1,2-ciklobutan-dipropior.ato (572 mg, 0,814 mmol) tirpalas dioksane (5 ml) pašildytas iki 65°C su 6N HC1 (3 ml) 20 valandų. Dioksanas pašalintas vakuume, o vandens likutis buvo du kartus ekstrahuotas chloroformu (20 ml kiekvieną kartą). Tirpiklis išgarintas po džio-vinimo (MgS04) ir likutis išvalytas impulsine chromatografija (heksanas/etilo acetatas/acto rūgštis 10/10/1). Frakcijos, turinčios produktą, buvo surink-tos, sukoncentruotos i, mažą tūri, vakuume ir liofili-zuotos, davė pavadinime nurodytą jungini, kaip baltus miltelius.
[0212] 1,42-2,0 (m, 6H), 2,40 (m, 2H), 3,6 (pls 2H), 3,82 (m, 2H) , 4,2.5 (m, 6H) , 7,26-7,90 (m, 16H) .
[0213] 23, 58, 24, 77, 31, 00, 32, 12, 33, 62, 46, 98, 51, 84, 53, 08, 65,83, 120,37, 125,55, 127,36, 127,94, 141,00, 144,01, 144,05, 144,11, 156,27, 156,43, 174,13, 174,55,
[0214] 7 PAVYZDYS
[0215] ( S, S)- a, a' - Diamino- trans- 1, 4- cikloheksan- diacto rūgštis
[0216] a) trans- 1, 4- Bis[( 2R, 5S)- 2, 5- dihidro- 3, 6- diraetoksi- 2-izopropil- 5- pirazinil- cikloheksa. nas
[0217] Į (2R)-2,5-dihidro-3,6-dimetoksi-2-izopropilpirazino (2,76 g, 15 mmol) ir 1,3-dimetil-2-imidazolidono (6,87 g, 60 mmol) tirpalą THF lašinant pridėta (48 ml) 1,6M nBuLi 9,6 ml, 15,3 mmol) . Po 1 valandos 1, 4-trans-dibromcikloheksano (1,82 g, 7,5 mmol) tirpalas THF pridėtas lašinant. Mišiniui leista įgyti aplinkos tem-peratūrą per naktį ir reakcija nuslopinta su 1M fosfato buferiu (pH=7). Mišinys atskiestas dietilo eteriu (100 ml) bei vandeniu (20 ml) ir sluoksniai atskirti. Vandeninis sluoksnis ekstrahuotas dar du kartus eteriu (2x150 ml) ir sujungti organiniai sluoksniai išdžiovinti (MgS04) , nufiltruoti, sukoncentruoti ir išvalyti impulsine chromatografija (silikagelis, heksanas: eteris = 2:1). Produktas iš sujungtų frakcijų perkristalizuotas iš MeOH (100 ml).
[0218] 3. 91 (t, 2H, J 3,6 Hz), 3,86 (kv, 2H, J 3,0 Hz), 3,69 (s, 6H) , 3,68 (s, 6H) , 2,67 (d, sept, 2H, J 3,0, 6,9 Hz), 1,78-1,54 (m, 8H), 1.05 (d, 6H, J 6,9 Hz), 1,78-1,54 (m, 8H) , 1,05 (d, 6H, J 6.9 Hz), 0,97 (m, 2H) , 0, 66 (d, 6H) ;
[0219] 163,23, 163,15, 60,30, 59,95, 52,24, 41,30, 31,40, 28,91, 26,17, 19,03, 16,38.
[0220] C24H40N4O4 (448, 60). Paskaič., %: C, 64,26; H, 8,98, N, 12,49;
[0221] Rasta %: C, 64,20; H, 9,04; N, 12,37.
[0222] b) Dimetil( S, S)- a, a1- diamino- trans- 1, 4- cikloheksan- diacto rūgštis
[0223] Junginys iš a) stadijos (1,00 g, 2,23 mmol) ištirpintas dioksane (17,8 ml) ir pridėta 0,5 M HC1 (17,8 ml, 8.92 mmol), mišinys maišomas aplinkos temperatūroje 12 valandų. Dioksanas pašalintas, aspiratoriaus vakuume, likutis atskiestas vandeniu ir ekstrahuotas eteriu (3x30 ml) . Sujungti CHC13 sluoksniai išdžiovinti (MgS04) , nufiltruota ir koncentruota. Likutis įdėtas į Kugelrohr'o įrenginį ir metilo valinatas išskirtas esant 0,1 tor. ir 25-50°C.
[0224] 3,68 (9s, 6H) , 3,26 (d, 2H, J 5,1Hz), 1,72-1, 54 (m, 6H), 1,26-1,19 (m, 2h), 1,13-1,06 (m, 2H);
[0225] 175,83, 59,22, 51,74, 41,64, 29,10, 27,17.
[0226] c) ( S, S) - a, a1- Diamino- trans- 1, 4- cikloheksan- diacto rūgštis
[0227] Aukščiau paminėto junginio (442 mg, 1,71 mmol) tirpalas
[0228] 6M HC1 (10 ml) šildomas iki 50°C 14 valandų. Po to, kai mišiniui buvo leista -i,gyti aplinkos temperatūrą, lengvai garuojantys junginiai buvo išgarinti rotaciniu garintuvu, o likutis ištirpintas (nevisiškai) vandenyje. Buvo pridėta etanolio ir mišinys paliktas per nakti, šaldytuve. Nuosėdos nufiltruotos, perplautos eteriu ir išdžiovintos.
[0229] 3,63 (m, 2H) , 1,68-1, 43 (m, 6H) , 1,00 (dd, 2H) , 0,89 (dd, 2H).
[0230] 170,77, 56,96, 37,30, 26,90, 26,71.
[0231] FAB-MS m/z 231 (M+ - 72);
[0232] Ci0H22N2O, (258, 31).
[0233] d) ( S, S)- a, a'- Bis ( 9- fluorenilmetiloksikarbonilamino)-trans- 1, 4- cikloheksan- diacto rūgštis
[0234] Į aminorūgšties iš c) stadijos (420 mg, 1,38 mmol) tirpalą vandenyje (4 ml) ir dioksane (4 ml) įdėtas FmocCl (1,43 g, 5,54 mmol) tirpalas dioksane (3 ml), po to 1 M NaOH (8,31 ml, 8,31 mmol). Mišinys maišomas per nakti,. Gauta skysta masė ekstrahuota dietilo eteriu (2x3 ml). Vandeninis sluoksnis parūgštinamas 6M HCi ir
[0235] ekstrahuotas CHC13 (3x30 ml) . CHC13 - fazė buvo sukon-centruota ir išvalyta impulsine chromatografija (silikagelis, heksanas: etilo acetatas: acto rūgštis = 10:10:1) .
[0236] 7,87 (d, 4H, J 7,5Hz), 7,73 (d, 4H, J 7,5 Hz), 7,41 (t, 4H, J 7,5Hz), 7,33 (t, 4H, J 7,5 Hz), 4,30-4,20 (m, 6H), 3,86 (t, 2H), 1,75-1,55 (m, 6H) , 1,25-0, 95 (m, 4H) .13C (DMSO) 8: 173,60, 156,64, 144,29, 144,17, 141,10, 128,02, 127,45, 125, 77, 120, 48, 66, 05, 59, 35, 47, 10, 29, 14, 27, 90, 21,51.
[0237] C40H40N2O8 (676, 76). Paskaič. %: C, 70, 99; H, 5,96, N, 4,14;
[0238] Rasta %: C, 68,90; H, 6,03; N, 3,99.
[0239] 8 PAVYZDYS
[0240] ( S, S)- a, a1- Bis( 9- fluorenilmetiloksikarbonilamino)- 1, 4-benzendiacto rūgštis
[0241] a) ( S, S) -( i , P 1 - Diokso- p, p'- bis ( 4- benzil- 2- okso- 3- oksazo-lidinil) 1, 4- dietilbenzenas
[0242] (4S)-4-benzil-2-oksazolidono (1,086 g, 6,13 mmol) ir trifenilmetano (indikatorius) (2,5 mg) tirpalas sausame THF (10 ml) maišomas, esant -78°C argono atmosferoje, ir lašinant paveikiama 1,6 M nBuLi (3,83 ml, 6,13 mmol)
[0243] kol išlieka apelsino spalva. Įdėjimo metu temperatūra palaikoma tarp -65°C ir -78°C. Vėl atšaldžius iki -78 C, tirpalas paveiktas 1,4-benzendiacetilo chloridu (0,75 g, 3,25 mmol) 2 minutes. Gautas mišinys pašildytas iki 25°C, paveiktas 10 ml prisotintu vandeniniu natrio bikarbonatu ir maišomas, esant 25°C, 30 minučių., Miši-nys ekstrahuotas trimis dichlormetano porcijomis. Di-chlorrnetano ekstraktai sujungti, perplauti 5% vandeniniu natrio karbonatu, perplauti sūrymu, išdžiovinti (MgS04) ir išgarinti. Gautas produktas išvalytas impulsine chromatografija, naudojant heksano: etilo acetato = 1:2 eliuentą.
[0244] 2,77, (dd, J 9,4 13,3 Hz, CHKPh) , 3,28 (dd, J 3,2 13,3Hz, CHHPh), 4,18-4,22 (m, CH20) , 4,31 (s, CH2CO) , 4,64-4,72 (m, CHN), 7,35-7,13 (m, 14H, aromat.).
[0245] 37,70, 41,20, 55,20, 66,00, 126,90, 128,50, 129,00, 132,10, 134,70, 152,90, 170,50.
[0246] b) ( S, S, S, S) - a, a' - Diazido- fi, ( 3' - diokso- p, ( 3' - bis ( 4- beri-zil- 2- okso- 3- oksazolidinil)- 1, 4- dietilbenzenas
[0247] Iš anksto atšaldytas (-78°C) (S,S)~P,P'-diokso-p,P'-bis(4-benzil-2-okso-3-oksazolidinil)-1,4-dietilbenzeno
[0248] (1,4 g, 2,73 mmol) tirpalas sausame THF (25 ml) įdėtas per piltuvėli, i, iš anksto atšaldytą (-78°C) 0,5 M kalio bis(trimetilsilil)amido (12 ml, 6,01 mmol) tirpalą to-luene, atskiestą sausu THF (30 ml). Po 30 minučių gautas kalio enoliato tirpalas paveiktas (per piltuvėli,
[0249] -78°C temperatūros 2,4,6-triizopropilbenzensulfonilo
[0250] azido (trisilazido) (2,02 g, 6,55 mmol) tirpalu sausame THF (15 ml). Pamaišius tirpalą 2 minutes, reakcija nuslopinta, pridedant ledinės acto rūgšties (0,983 g, 16,38 mmol). Skysta masė nedelsiant sušildyta iki 25°C vandens vonioje ir maišoma, esant šiai temperatūrai, 1,5 valandos. Po to reakcijos skysta masė padalinta tarp 200 ml sūrymo ir 250 ml etilo acetato. Vandens fazė plauta du kartus po 100 ml etilo acetato. Sujungti organiniai ekstraktai plauti atskiestu vandeniniu natrio bikarbonatu, išdžiovinti natrio sulfatu ir sukoncentruoti vakuume. Gautas produktas išvalytas impulsine chromatografija, naudojant iš pradžių kaip eliuentą heksaną:etilo acetatą = 2:1, po to etilo acetatą. Produktas paskui išvalytas impulsine chromatografija, eliuuojant pirma su heksanu: etilo acetatu - 2:1, po to heksanu: etilo acetatu = 1:2.
[0251] Išeiga (blyškiai geltona stiklinė puta): 698 mg (43%) .
[0252] 2,88 (dd, J 9,4 13,3 Hz, CHHPh) , 3,41 (dd, J 3,2 13,3 Hz, CHHPh), 4,17-4,20 (m, CH20) , 4, 64-4, 73 (m, CHN) , 6,13 (s, CHN3) , 7,21-7,42 (m, 10H, aromat.) , 7,50 (s, 4H, aromat.).
[0253] 37,90, 41,20, 55,80, 63,10, 66,60, 127,20, 128,70, 128,90, 129,00, 133,70, 134,10, 152,00, 168,20.
[0254] Li0H.H20 (0,222 g, 5,29 mmol) tirpalas H20 (8 ml)
[0255] sulašintas esant 0°C i, (S, S, S, S) -a, a' -diazido-p, pf-diokso-p,p-bis(4-benzil-2-okso-3-oksazolidinil)-1,4-di-etilbenzeno (0, 683 g, 1,15 mmol) tirpalą THF (16 ml) .
[0256] Tirpalas maišomas 1 valandą, esant 0°C. Po to pridėtas atskiestas natrio karbonato tirpalas, ir oksazolidonas ekstrahuotas etilo acetatu. Organinis ekstraktas plautas du kartus atskiestu vandeniniu natrio karbonato tirpalu. Sujungti vandeniniai ekstraktai rūgštinami vandeniniu kalio hidrosulfato tirpalu, ir produktas išekstrahuotas etilo acetatu (2x). Tirpalas išdžio-vintas natrio sulfatu ir išgarintas. Likutis panaudotas kitoje stadijoje be tolesnio valymo.
[0257] XH BMR (200 MHz, CDCl3/DMSO-d6) S: 4,93 (s, CH) , 7,40 (S, Ph) .
[0258] 13C BMR (50 MHz, CDCl3/DMSO-d6) 5: 67,50, 126,60, 134, 0, 170,1 .
[0259] 10% Pd/c (70 mg) pridėta į (S, S)-a,a' -diazido-1,4-benzendiacto rūgšties (180 mg, 0,65 mmol) tirpalą etanolyje: acto rūgštyje = 8:1 (12 ml) . Gauta skysta reakcijos masė nufiltruota per Celitą, ir Celito filtro nuosėdos plautos keliomis etanolio porcijomis. Tirpiklis pašalintas vakuume acto rūgštis pašalinta azeotropiniu destiliavimu su toluenu. Balta kieta me-džiaga užpilta etilo acetatu, nufiltruota ir išdžio-vinta vakuume.
[0260] XH BMR (200 MHz, D20) 5: 5,16 (s, CH) , 7,48 (s, aromat.).
[0261] e) ( S, S) - a, a'- bis-( 9- fluorenilmetiloksikarbonilamino)-1, 4- benzendiacto rūgštis
[0262] a,a'-Diamino-1,4-benzendiacto rūgšties (45 mg, 0,2 mmol) suspensija heksametildisilazano (5 ml) ir trimetil-chlorsilano (0,5 ml) mišinyje maišoma, argono atmosferoje 100°C temperatūroje per naktį. Reakcijos mišinys atšaldytas ir sililinimo reagentų perteklius pašalintas vakuume. Likutis ištirpintas sausame dichlormetane (5 ml) ir atšaldytas ledo/vandens vonioje. Buvo pridėtas 9-fluorenilmetoksikarbonilo chlorido (109 g, 0,42 mmol) tirpalas sausame dichlormetane (2 ml) ir reakcijos mišinys maišomas argono atmosferoje 3 valandas. Dichlormetanas išgarintas, o likutis ištir-pintas THF (4 ml) ir vandens (0,5 ml) mišinyje. Mišinys maišomas 30 minučių, tada išgarintas. Likutis ištir-pintas etilo acetate ir kelis kartus plautas vandeniu. Organinė fazė išdžiovinta (MgS04) , nufiltruota ir iš-garinta. Gautas produktas išvalytas impulsine chromatografija, panaudojant etilo acetatą: acto rūgšti, - 95:5 kaip eliuentą.
[0263] Išeiga (blyškiai geltona kieta medžiaga): 48 mg (40%).
[0264] 4,20-4,50 (m, CH ir CH2) , 4,88 (s, CHN) , 7,20-8,0 (m, 20H), aromat.).
[0265] 13C BMR (50 MHz, DMSO-d6) 8: 46, 8, 65, 5, 77, 7, 119, 9, 127,0, 127,8, 128,1, 128,5, 136,7, 140,5, 143,7, 155,9, 172,8.
[0266] Peptido sintezė: ( pG3u- Glu- Asp) 2 - [ ( rrs)- Xyl] ( Lys) 2
[0267] Peptidas yra sintezuojamas, naudojant Labort.ec peptidų sintezatorių. Fmcc~Lys(Boc)-Sasrin polimeras (1,0 g, 0,6 mmol; Bachem A. G. pakeitimas 0,6 mmol/g) pakrau-namas i, 100 ml reakcijos kolbą. Fmoc-[ (m) -Xyl] (160 ml, 0,23 mmol), DCC (290 mg, 1,4 mmol) ir HOBt (211 mg, 1,4 mmol) DMF'e (200 ml) pridedamas j, polimerą, ir reakcijai leidžiama vykti 9 valandas. Papildomai pri-dedama DDC (1,4 mmol) ir HOBt (1,4 mmol) ir reakcijai leidžiama vykti dar 2 valandas. Tada polimeras plaunamas CH2C12, 30% MeOH/CH2Cl2 ir DMF. Polimero laisvos amino grupės acetilinamos, naudojant Ac20/DMF (3x per 1 valandą; neigiamas Kaiserio testas).
[0268] Likusi sintezė atliekama pagal standartinę metodiką, panaudojant Fmoc-Asp(OtBu)-Opfp (1,33 g, 2,3 mmol), Fmcc-Glu(OtBu)-Opfp (1,35 g, 2,3 mmol) ir pGlu-pen-tachlorfenilo esteri, (0,86 g, 2,3 mmol) . HOBt (350 mg, 2,3 mmol) pridedamas kiekvienoje prijungimo stadijoje, kuri vyksta 1 valandą. Jungimosi pabaiga yra nustatoma neigiamu Kaiser'io testu. Po jungimosi su Fmoc-ami-norūgštimi, polimeras išplaunamas DMF, apsauginė grupė atskeliama 20% piperiainu/DMF, ir polimeras vėl plaunamas DMF. Po galutinio jungimosi, polimeras plaunamas MeOH/CH2Cl2 ir CH2C12. Išdžiovinto polimero-peptido svoris yra 1 g. Peptidas atskeliamas nuo polimero TFA: CH2C12 1:1, tirpalas išdžiovintas užsaldant, likutis ištirpintas vandenyje, nufiltruotas (0,45 ja) , ir filtratas išdžiovintas užsaldant. Tolimesniam gryni-nimui 100 mg šio produkto ištirpinama vandenyje (0,5 ml) ir nukreipiama preparatyvinei HPLC, panaudojant 2,1 x 15 cm Beckman'o Ultrasphere ODS kolonėlę ir tirpalus A
[0269] 0,1% TFA /H20, E 0,1% TFA/MeCN:H20 40:60. Gradientas yra 0-15% B, 120 minučių, srauto greitis 5 ml/minutę.
[0270] Gaunama 19 mg gryno peptido (>95%) po surinktų homo-geninių frakcijų išdžiovinimo užsaldant.
[0271] Peptidų kietos fazės sintezė
[0272] Kietos fazės peptido sintezė atliekama iš esmės pagal fluorenilmetoksikarbonilo (Fmoc-poliamido sintezės principus' (Atherton & Sheppard, Solid phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford: IL R Press at Oxford University Press, 1989). Panaudojamos prekyboje turimos dervos; periodine sinteze arba rankomis, arba naudojant pusiau automatinį instrumentą (Labortec pep-tidų sintezatorių 5P 60) šios buvo polistireno su rūgšties labiliais (Wang, J, Am. Chem. Sos., 95, 1328-1333, 1973) arba rūgšties hiperlabiliais ryšio agentais (Merger et al., Tetrahedron Letters 29, 4004-4008, 1988). Alternatyviai, peptidai sukonstruoti automatiniu būdu ant dervų, naudojamų procese (Atherton et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1151-2, 1981), panaudojant LKB Biolynx 4170 automatizuotą peptidų sin-tezatorių. Buvo įsigytos sintetinės dervos, kurios jau turėjo apsaugotą reikalingą C-galinę Fmoc-aminorūgšties liekaną. Grandinės pailginimas pasiektas įvairiai su šoninės grandinės apsaugotais Fmoc-aminorūgšties penta-fluorofenilo esteriais (Kisfaludy & Schoen, Synthesis, 325-327, 1983), panaudojant aktyvaciją su diciklohek-silkarbodiimidu (DDC)/1-hidroksibenzotriazolu (HOBt)
[0273] (Koenig & Geiger, Chem. Ber. 103, 2034-2040, 1970) arba naudojant sujungimo PyBOP (Coste et. al., Tetrahedron Lett., 31 205, 208, 1990) . Lizino šoninės grandinės amino grupė buvo apsaugota t-butiloksikarbonilu glutamino ir asparagino rūgšties šoninės grandinės karboksilo grupės buvo apsaugotos kaip t-butilo esteriai.
[0274] Sintezės dervos, nešančios reikalingą N-deblokuotą te-galinę liekaną, buvo acilintos puse ekvivalento, Fmoc-apsaugota diaminodikarboksilo rūgštimi, pridedant DCC ir HOBt. Reakcijai pasibaigus, reagentų perteklius buvo nuplautas. Peptidilo derva paveikta dar kartą DDC/HOBt, kad būtų pritvirtintos karboksilo grupės, kurios galėjo likti laisvos. Po šios stadijos derva nuplauta meta-noliu dezaktyvuoti bet kurias karboksilo grupes, kurios negali susijungti su dervą surišančiomis amino gru-pėmis. Pagaliau, perteklius amino grupių acetilinamas. Peptido sintezė toliau tęsiama kaip paprastai.
[0275] Po reikalingų sekų ant kietos fazės pilno sukonst-ravimo, peptidai išskaidyti iš sintezės dervų su kartu atliekamu šoninių grandinių deblokavimu, panaudojant trif luoroacto rūgšti,, \ kurią buvo pridėti tinkami priemaišas sugeriantys chemikalai. (King et al., Int. J. Peptide protein Res., 36, 255-268, 1990). Po išga-rinimo, peptidai išskirti nusodinant dietilo eteriu ir išdžiovinant. Gryninimas atliktas preparatyvine prie-šingos fazės skystine chromatografija.
1. Peptidiniai junginiai, susidedantys iš dviejų vienos grandinės homoreguliuoj ančių peptidų, su jungtų kartu dvivalente jungiančia tilteliu grupe -A-, kuri yra terminaliai prijungta prie aminorūgščių Ca atomų neter-minalinėse ekvivalentiškose vietose kiekviename iš mi-nėtų peptidų, kur nėra Ca atomų, prijungtų prie grupės-A- nuosavų a-šoninių grandinių, kur minėta dvivalentė jungianti tilteliu grupė -A- yra
2. Peptidiniai junginiai pagal 1 punktą, besiskiriantys tuo, kad minėta dvivalentė jungianti tilteliu grupė -A- yra
3. Peptidiniai junginiai pagal bet kuri, iš 1 ir 2 punk-tų, besiskiriantys tuo, kad minėti vienos grandinės homoreguliuoj antys peptidai yra (I) formulės
4. Peptidiniai junginiai pagal 3 punktą, besiskiriantys tuo, kad aprašomi (II) formule
5. Peptidiniai junginiai pagal bet kuri, iš 1-4 punktų, besiskiriantys tuo, kad aprašomi formule
6. Farmacinė kompozicija, kuri sudaryta iš peptidinio junginio ir farmaciškai tinkamo nešiklio arba užpildo, besiskirianti tuo, kad peptidinis junginys yra junginys* pagal bet kuri, iš 1-5 punktų.
7. Peptidiniai junginiai pagal bet kurį iš 1-5 punktų, skirti naudoti mielopoezės arba kaulų čiulpų rege-neravimo stimuliacijai.*
8. Peptidinių junginių pagal bet kuri, iš 1-5 punktų gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kada) bis-laktimo eteri, metalina ir po to alkilina, kad gautų bis- laktimo dipeptido eteri,;b) a) stadijos bis-laktimo dipeptidini, eteri, hidro-lizuoja, kad gautų tiltelinę a, a' -diaminorūgšti,;c) likusias aminorūgštis i,veda i, peptido grandinę; ird) vykdo bet kurios apsauginės grupės deblokavimą.
a) bis-laktimo eteri, metalina ir po to alkilina, kad gautų bis- laktimo dipeptido eteri,;b) a) stadijos bis-laktimo dipeptidini, eteri, hidro-lizuoja, kad gautų tiltelinę a, a' -diaminorūgšti,;c) likusias aminorūgštis i,veda i, peptido grandinę; ird) vykdo bet kurios apsauginės grupės deblokavimą. 9. Tiltelinės a,a'-diaminorūgštys formulės
10. Bis-laktimo dipeptidiniai eteriai formulės