[LT] Čia atskleisti viengrandžiai peptidiniai junginiai, pakeisti ties negalinės aminorūgšties C alfa-atomu grupe -A-. Natyvios C alfa-šoninės grandinės, sujungtos su grupe -A-, nėra.@Peptidiniai junginiai pagal šį išradimą yra naudingi ląstelių proliferacijos, ypač mielopoezės ir kaulų čiulpų ląstelių, inhibicijai.
[EN]
[0001] Šis išradimas yra apie ląstelių proliferaciją ska-tinančių peptidų panaudojimą ir naujus peptidus, pasi-žyminčius specifiniu ir/ar bendrus ląsteles stimu-liuojančiu poveikiu.
[0002] Žinduolių kūnas sudarytas iš ląstelių, itin stipriai besiskiriančių struktūra ir funkcijomis, todėl ląstelių diferenciacijos ir vystymosi mechanizmai buvo daugelio tyrinėjimų objektu. Žinoma, kad nuolat atsinaujinančių ląstelių sistemoje paprastai būna rezervuaras daugia-vaisių (pliuripotentinįų) kamieninių ląstelių, kurios dalijasi ir pastoviai tiekia sistemai naujas ląsteles. Nors patiektos iš "rezervuaro" kamieninės ląstelės pradžioje yra vienodos, tačiau netrukus jos patiria vienoki, ar kitoki, morfologinį pakitimą ir vėliau išsivysto i, ląsteles, atliekančias reikiamą funkciją.
[0003] Minėtų karnieninių ląstelių sistemų pavyzdžiais yra kraujodaros sistema kaulų čiulpuose bei epitelio ir epidermio sistemos.
[0004] Kamieninių ląstelių dalijimosi valdymas ar reguliavimas yra labai perspektyvi terapijos sritis, todėl daugelio tyrimų tikslas tebėra mechanizmų išaiškinimas ir specifinių cheminių mediatorių suradimas. Iki šiol buvo nustatytos kelios tikrai dalyvaujančios ląstelių gamyboje ir diferenciacijoje molekulės, kurios skatina arba slopina tam tikrą proceso grandi,. Tuo požiūriu itin gerai ištirta mielopoezė, nustatytos joje dalyvau-jančios molekulės: kolonijas stimuliuojantys faktoriai (KSF), kaip antai, granulocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius (G-KSF), makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius (M-KSF), granulocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius (GM-KSF), įvairia-kilmes kolonijas stimuliuojantis faktorius (multi-KSF;
[0005] IL-3) [ žr....] , interleukinas 11 (IL-11) [ žiūr. Metcalf, Science 229: 16 (1985)] , interleukinas 11 (IL-
[0006] 11) [ žiūr. Paul. et al, proc. Kati. Acad. Sci., USA, 87: 7521 (199C)1 t Laktoferinas [ žiūr. Broxmeyer et, Blood Cells, 1_1: 429 (1989)] , prostaglandinai [ žiūr. Pelus et al, J. Imrnunol. 14 0: 479 (1988)] , rūgštinis (H-subvienetas) feritinas f žiūr. Broxmeyer et al, Blood, 68: 1257 (1986)] , interferonai (a, P ir y) [ žiūr . Pelus et al aukščiau, ir Broxmeyer et al, J, Immunol. , 131: 1300 (1983)] t auglio nekrozės faktoriai (a ir P) [ žiūr. Broxmeyer et al, J. Immunol. 136: 4487 (1986)] , transformuojantis augimą faktorius -p [žiūr. Ottman et al, J. Immunol., 1 40: 2661 (1.988)] , ir aktivinas bei inhibinas [ žiūr. Broxmeyer et al., Proc, Natl. Acad. Sci., USA, 86: 779 (1989)] .
[0007] Taip pat buvo rasta, kad hemoreguliacinis pentapeptidas (pEEDCKi selektyviai inhibuoja mielopoezės ląstelių proliferaciją [ žiūr. Pa u ko vi t s ei al,- Z. Naturforsch 37: 1297 (1982)[ , ir buvo atskleisti kiti peptidai, atitinkantys siaurą bendrą formulę, duodantys panašų inhibicini, poveiki, heir.opoezė j e į žiūr. EP-A-112656 ir W090/G2753] . Peptido monomerų oksidacija davė dimerines molekules, sujungtas cisteino tilteliu, ir buvo rasta, kad tos dimerinės molekulės stimuliuoja mielopoezę
[0008] [ žiūr. Laerum et al, Exp. Hematol., 1_6: (1988)] .
[0009] (pEEDCK)2 dimeras ir kiti panašūs junginiai yra atskleisti W0-A-88/O3535. Kiti dimeriniai peptidų junginiai yra atskleisti EP-A-408371, kuriame disul-fidinė jungtis buvo pakeista anglimi arba anglies/sie-ros tilteliu, jungiančiu parinktas peptidines grandines. Tiltelis tuo būdu yra santykinai atsparus hidrolizei, bet pats yra inertinis ir negali dalyvauti receptoriaus- dimero sąveikose.
[0010] Nors mes nenorime.būti surišti teorinių svarstymų, bet dabar manoma, kad tokie pepcidiniai junginiai sąvei-kauja su stromos ląstelėmis in vivo ir kad stromos ląstelės atsakingos už ląstelinio dalijomosi stimulia-ciją arba inhibiciją per kitus išaiškinamus faktorius. Tuo būdu manoma, kad dimerai indukuoja arba pagreitina stimuliuojančių ląstelinių reguliuojančių faktorių stromos gamybą, tuo tarpu kai monomeriniai peptidai gali arba inhibuoti ši, procesą, arba sukelti faktorių, kurie užkerta kelią ar trukdo ląstelės dalijimuisi, gamybą. Tuo būdu pagal tokią galvoseną stromos ląstelės gali sustiprinti dimerų ir monomerinių peptidų atitinkamai stimuliuojanti, arba inhibicini, poveiki,.
[0011] Yra nuolatinis dimerinių peptidinių junginių, galinčių stimuliuoti ląstelės proliferaciją iki įprasto lygio in vivo, poreikis. Šiuo atžvilgiu reikėtų pastebėti, kad skirtingi stimuliavimo laipsniai gali būti labiau tinkami tam tikroms klinikinėms situacijoms negu kitoms, ir ypač yra svarbus individualių ląstelių tipų selek-tyvus stimuliavimas.
[0012] Šis išradimas pateikia peptidini, darini, sudarytą iš viengrandžio hemoreguliacinio, pavyzdžiui, inhibuojan-čio hemopoezę, peptido, kur negalinės aminorūgšties Ca atomas pakeistas -A grupe, prie minėto Ca atomo nesant natyvios a- šoninės grandinės, kur A yra -CRARA -Z,
[0013] kur kiekvienas R £ yra nepriklausomai vandenilio atomas arba -ra", -0RA", -SRA", -NRa"ra", CONRA"RA" arba -COORA" grupė;
[0014] RA yra vandenilio atomas arba RA grupė;
[0015] RA yra alkilas, cikloalkilas, alkanoilas, hidroksial-kilas, anido grupė arba karbociklinė ar heterociklinė grupė;
[0016] Z yra grupė -ORB, y -NRCRC, -CRDRERF arba pakeistas ar nepakeistas, aromatinis ar nearomatinis, karbociklinis ar heterociklinis žiedas, kitoks nei nepakeistas fenilas;
[0017] kur kiekviena RB yra linijinės arba šakotos grandinės, prisotinta arba neprisotinta angliavandenilio grupė, tokia kaip alkilo, aralkilo arba arilo grupė, pasirinktinai pakeista viena ar daugiau R A grupėmis, kur RA yra kaip nurodyta aukščiau, ir i, karią paprastai įterp-tas vienas ar daugiau -N-, -0- ar -S- heteroatomų;
[0018] RC yra vandenilio atomas arba RB grupė;
[0019] R" n yra vandenilio atomas arba R p grupe;
[0020] Re yra vandenilio atomas arba Rc grupė, arba kartu su R°
[0021] grupe sudaro
[0022]
[0023] grupę; ir
[0024] RF yra grupė -RB, -0R3, -NRCRC arba -SRB, arba hidroksilo, karboksilo, aminokarboksilo ar alkoksi grupė, arba metileno grupė, prijungta prie azoto atomo, su-jungto su Ca atomu, arba kartu su R° sudaro alkilideno grupę, arba yra vandenilio atomas, kur vienas iš RA, RA , RD ir RE yra ne vandenilis.
[0025] Kai bet kuri įs grupių R A ir R B yra C-prijungta organinė grupė, geriau, kai turi nuo 1 iki 10 anglies atomų, ypač nuo 1 iki 6 anglies atomų. Alkilo grupės gali būti linijinių ar šakotų grandinių ir gali būti pakeistos arilo grupėmis, turinčiomis 6 - 10 anglies atomų (t.y. sudarančiomis aralkilo grupę), alkoksi, hidrcksilo, aciloksi, amino, azido, acilamino, aminokarbonilo arba karboksilo grupėmis. Arilo grupės apima 5- ar 6-nares heterociklines arilo grupes, turinčias vieną ar daugiau heteroatomų, parinktų iš O, N, ar S, tokias kaip furilo, imidazolilo, pirolilo, piridinilo ir tienilo grupės. Arilo grupės pakaitalai gali būti C1_6 alkilo grupės, hidroksilo ir karboksilo grupės. Pavyzdžiui apima metilo, etilo, propilo, t-butilo, pentilo, kar-boksietilo ir benzilo grupes.
[0026] Viename įgyvendinime Z reiškia pakeistą arba nepa-keistą, aromatini, arba nearomatini,, karbociklini, arba heterociklini, žiedą, kitoki, nei nepakeistas fenilas.
[0027] Ypač tinkančios Z grupės yra benzilo, indolilo, hidroksifenilo, imidazolilo, naftilo, tienilo, piridinilo, furanilo, izoksazolilo, 3,5-dimetilizoksazolilo ar cikloheksilo grupės.
[0028] Kitame Įgyvendinime Z grupė -0R B (kur R B -kaip nurodyta aukščiau) arba -CHRDRF (kur RD reiškia vandenilio atomą arba -CH3 - grupę; R f reiškia alkilo grupę, paprastai pakeistą hidroksilo, amino ar azido grupėmis, arba R° ir Rf kartu sudaro alkilidino grupę).
[0029] Geriau, kai ir Ra, ir RA reiškia vandenili,, taip, kad -A yra grupė -CH2-Z.
[0030] Bet koks viengrandis peptidas, kuris rodo hemoregu-liacini, poveiki,, yra tinkamas kaip peptidas, pakeistas pagal ši, išradimą.
[0031] Alternatyviai išreikštas, išradimas pateikia junginius pagal ši, išradimą, kuriame minėto hemoreguliacinio peptido grandinė apima grandines pagal formulę:
[0032]
[0033] Rf reiškia
[0034] n ir m nepriklausomai reiškia 0 arba 1;
[0035] p, q ir r nepriklausomai reiškia 1 arba 2;
[0036] s reiškia 3 arba 4;
[0037] R1 ir R2 abu yra vandenilio atomai arba kartu reiškia okso grupę;
[0038] R3 ir R4 abu yra vandenilio atomai arba kartu reiškia jungtį anglis- anglis;
[0039] R5 yra vandenilis arba acilo grupė;
[0040] kiekvienas R 6 ir R 7 nepriklausomai reiškia hidroksilo grupę arba amino grupę, bet tinkamesnės yra hidroksilo grupės;
[0041] R g reiškia vandenili,, C2- 6 alkilo grupę, C7_ 20 aralkilo grupę, kuri gali turėti vieną arba daugiau hidroksilo, amino arba metoksi pakaitalų, arba metaboliškai labilią S- apsauginę grupę;
[0042] R10 reiškia hidroksilo arba pakeistą ar nepakeistą amino grupę, aminorūgšties glutamino liekaną arba- peptidą, turinti, N- galini, glutamino fragmento ir jų druskas.
[0043] Visos minėtos aminorūgšties liekanos gali būti arba D, arba L formos. Tačiau aminorūgščių L forma yra tin-kamesnė .
[0044] Kur yra N- galinė apsauganti grupė R5, tai gali būti, kaip pažymėta aukščiau, acilo grupė, turinti 1- 20 anglies atomų,, pvz., žemesniojo aikanolio grupė, turinti 1-5 anglies atomus, tokia kaip acetilo grupė, arba aroilo ar aralkanoilo grupė, turinti nuo 7 iki 20 anglies atomų, tokia kaip benzoilo arba fenilacetato gru-pė.
[0045] R gali taip pat buti acilo grupė, išvesta iš amino rūgšties arba peptidinės grandinės. Konkrečiai, R5 gali būti acilo grupė, išvesta iš serino, arba iš bet kurio iš peptidų, išvestų iš tokios aminorūgšties sekos, pa-šalinant einančias iš eilės N-galines aminorūgštis:
[0046] • »
[0047] Yra geriau, kai bendro (1) formulės peptido galinė amino grupė yra apsaugota, pvz., acilinimu su alka-noilo, aralkanoilo arba aroilo grupe.
[0048] Kur R8 yra C2_6 alkilo grupė, tai gali būti, pvz., etilo, butilo arba vheksilo grupė. Kai R g yra aralkilo grupė, tai gali patogiai būti ari lmetiJ.o ' grupė, tokia kaip benzilas, difenilmetilas arba trifenilmetilas. Kur R 8 yra metaboliškai labili grupė, tai gali, pvz., bū-ti ariltio grupė, turinti nuo 5 iki 10 anglies atomų, pvz., piridiltio grupė arba acilo grupė, kaip apibrėžta aukščiau.
[0049] Tinkamesni šio išradimo junginiai yra pentapeptidai, t.y. n yra geriau O.
[0050] Geriau, kai ciklinės grupės Ra liekanoje yra penkia-narės, t.y m yra geriau O.
[0051] Nors bet kuris iš peptidų, apibrėžtų (I) formule aukš-čiau, yra žemo arba nereikšmingo hemoreguliacinio aktyvumo, nepaisant to, jie gali būti efektyvūs peptidinio junginio darinyje pagal ši, išradimą, inhibuojant ląs-telių proliferaciją.
[0052] Peptidinio junginio dariniuose, suformuotuose iš pepti-dinės grandinės pagal I formulę, grandinės pakaitalas turi būti ties Rd.
[0053] Ypač tinkami peptidinio junginio dariniai pagal ši, iš-radimą yra II formulės dariniai:
[0054]
[0055] Šio išradimo peptidinių darinių sugebėjimas inhibuoti visos eilės ląstelių proliferaciją ar net pašalinti hemopoetinę sistemą yra labai vertingas medicinai arba kai reikia gydyti pernelyg stiprią ląstelių proli-feraciją, kaip psoriazės atveju, arba kai atrodo, kad vėžio terapija pažeis tam tikrą ląstelių populiaciją. Daugelis ląstelių tipų yra ypač jautrūs citotoksiniams
[0056] vaistams arba radiacijai, panaudotai priešvėžinėje terapijoje, ir vienas iš žinomų metodų yra panaudoti vaistą inhibuoti ląstelių --tokių kaip hemopoetinės sistemos-proliferaciją priešvėžinės terapijos metu, o pasibaigus inhibuojancio vaisto veikimui, normali proliferacija atsinaujina. Šio išradimo peptidai turi tinkamą tokiai terapijai trumpą biologini, gyvenimo pusperiodį. Panašiai tam tikrų ląstelių populiacjų, jautrių vėžio terapijai, proliferacija gali būti įnhi-buota kartu su vėžinėmis ląstelėmis, ir antivėžinė terapija yra pradedama tik tada, kai vėžinės ląstelės jau pasiekusios jautrią proliferacijos fazę, tuo tarpu kai normalios ląstelės yra mažiau jautrioje fazėje.
[0057] Vienas ląstelių proliferacijos tipas pasitaiko tada, kai tokios ląstelės, kaip kaulų čiulpų ląstelės, fago-citai ar granuliocitai, terapijos metu yra stimu-liuojamos KSF vaistais. Tokių ląstelių augimo inhibi-cija gali atstatyti normalius jų augimo greičius.
[0058] Daugelio autoimuninių ligų metu subjektas gamina akty-vius leukocitus prieš savo audinius. Inhibuojant leuko-citų funkciją, bent jau kuriam laikui tokios autoimu-ninės reakcijos gali būti atitinkamai susilpnintos.
[0059] Kitas klinikinis pritaikymas bus kombinacijoje su ati-tinkamais dimerais arba susietas mielopoezės stimulia-toriais, kaip atskleista MO-A-88/03535 indukuoti alter-natyviu aukšto ir žemo aktyvumo pikus kaulų čiulpų ląstelėse, taip sustiprinant natūralų hemopoezės cir-kadinį ritmą. Tuo būdu citostatinė terapija gali būti suteikta žemo kaulų čiulpų aktyvumo periodais, t.aip sumažinant kaulų čiulpų pažeidimo riziką, tuo tarpu regeneracija bus pagreitinta po to einančiu aktyvumo piko pakilimu.
[0060] Apskritai tam, kad būtų sukeltas inhibicinis efektas, šio išradimo peptidai gali būti paskirti pacientams vartoti per burną ar injekcijomis dozėmis, svyruo-jančiomis tarp 0.001-100 mg, pvz., 1-5 mg 70 kg kūno svorio per dieną. Paskyrus intravenines arba paodines injekcijas, dozė gali svyruoti 1-10 mg 70-kg kūno svorio per dieną, pvz., apie 6 mg, iki 10 dienų. Paskyrimai per nosį, per odą ar per tiesiąją žarną taip pat galimi. Iš esmės pageidautina sudaryti maždaug nuo 10~13 M iki 10 5 M peptido koncentraciją neląsteliniame paciento skystyje.
[0061] Pagal tolesni, šio išradimo požymi, yra pateikiamos far-macinės kompozicijos, turinčios kaip aktyvią komponentę vieną ar daugiau peptidinio junginio darinių, kaip čia apibūdinta anksčiau, arba fiziologiškai suderinamų jų druskų kartu su farmaciniu nešikliu arba užpildu. Mišiniai pagal ši, išradimą gali būti pateikti, pvz., pavidalu, tinkamu oraliniam, nazaliniam, parentera-liniam arba rektaliniam paskyrimui.
[0062] Čia naudojamas terminas "farmacinis" apima ir veteri-narinius šio išradimo taikymus.
[0063] Junginiai pagal ši, išradimą gali būti įprastų vaistų formų, tokių kaip tabletės, apvilktos tabletės, aerozoliai nosiai, tirpalai, emulsijos, milteliai, kapsulės arba ilgalaikio atpalaidavimo formos. Įprasti farma-ciniai užpildai, kaip ir įprasti gamybos būdai, gali būti panaudoti šių formų paruošimui. Tabletės gali būti pagamintos, pvz., sumaišant aktyvią komponentę arba komponentes su žinomais užpildais, kaip, pvz., skiedik-liais, tokiais kaip kalcio karbonatas, kalcio fosfatas arba laktozė, skaldytojais, tokiais kaip grūdų krakmolas arba algininė rūgštis, rišikliais, tokiais kaip krakmolas arba želatinas, tepalais, tokiais kaip magnio stearatas arba talko milteliai, ir/arba agentais ilgalaikio atpalaidavimo gavimui, tokiais kaip karboksipo-limetilenas, karboksimetilceliuliozė, celiuliozės ace-tato ftalatas arba polivinilacetatas.
[0064] Tabletės, jeigu reikia, gali susidėti iš kelių sluoks-nių. Apvilktos tabletės gali būti pagamintos, apvelkant vidurį, gautą panašiai kaip tabletės, su agentais, paprastai naudojamais tablečių apvilkimui, pvz., poli-vinilC pirolidonu arba šelaku, gumiarabiku, talko mil-teliais, titano dioksidu arba cukrumi. Tam, kad būtų gaištas ilgalaikis atpalaidavimas arba išvengta nesu-derinamumų, 'vidurys gali susidėti iš kelių sluoksnių taip pat. Tablečių apvalkalas taip pat gali susidėti iš kelių sluoksnių, kad būtų gautas ilgalaikis atpalaidavimas, ir tuo atveju gali būti panaudoti anksčiau paminėti užpildvtojai tabletėms.
[0065] Organinės specifinės nešiklių sistemos gali būti panaudotos taip pat.
[0066] Injekcijų tirpalai gali būti, pvz., pagaminti įprastu būdu, tokiu kaip konservavimo agentų, tokių kaip p-hidroksibenzoatai, arba stabilizatorių, tokių kaip EDTA, pridėjimas. Tirpalais paskui užpildomi injekcijų buteliukai arba ampulės.
[0067] Nazaliniai aerozoliai gali būti sudaryti vandens tirpale ir supakuoti i, purškimo konteinerius arba su aerozoliniu išstūroėju, arba su priemonėmis rankiniam spaudimui. Kapsulės, turinčios vieną arba kelias aktyvias komponentes, gali būti pagamintos, pvz., su-maišant aktyvias komponentes su inertiniais nešikliais, tokiais kaip laktozė arba sorbitolis, ir užpildant mišinį į želatino kapsules.
[0068] Tinkamos žvakutės gali, pvz., būti pagamintos, sumai-šant aktyvią komponentę arba aktyvių komponenčių kom-binacijas su įprastais nešikliais, numatytais šiam tikslui, tokiais kaip natūralūs riebalai arba polieti-lenglikolis ar jo dariniai.
[0069] Tinkami dozavimo vienetai, turintys savyje šio išradimo junginius, turi 0.1-10 mg, pvz., 1-5 mg (I) formulės peptido arba jo druskos.
[0070] Šis išradimas apima peptidinius junginius ir- mišinius, išaiškintus aukščiau, naudojimui ląstelių dalijimosi, ypač rnielopoezės ir kaulų čiulpų ląstelių rege-neracijos, inhibicijai. Peptidinių junginių pagal ši, išradimą panaudojimas vaistų gamyboje ląstelių dalijimosi, tokio kaip mielopoezė ar kaulų čiulpų regeneracija, inhibicijai taip pat sudaro tolimesni, šio išradimo aspektą.
[0071] Tolimesnis svarbus naujų peptidinių junginių darinių pritaikymas yra medžiagų, tinkančių imunologinių tyrimų metodams gamybai. Peptidas tuomet gali būti kovalen-tiškai prijungtas prie tinkamo stambiamolekulinio ne-šiklio kaip albuminas, polilizinas arba poliprolinas, tam, kad būtų suleistas antikūnus produkuojantiems gy-vūnams (pvz., triušiams, jūrų kiaulytėms ar ožkoms). In vitro imunizacijos metodai taip pat gali būti panaudoti. Aukšto specifiškumo antiserumai yra gauti, panaudojant gerai žinomus absorbcijos metodus, naudojant stambiamolekulinius nešiklius. Įvedant radio-aktyvumą (3H, 125I, 14C, 35S) i, peptido molekulę, gali būti suprojektuotas radioimuninis tyrimas ir panaudotas peptido nustatymui įvairiuose biologiniuose skysčiuose, tokiuose kaip serumas (plazma), šlapimas ir cerebro-spinalinis skystis.
[0072] Išradimo peptidai gali būti sintezuoti bet kokiu patogiu būdu. Tinkami metodai aminorūgščių liekanų formavimui yra aprašyti, pav., Robert. M. Williams "Synthesis of Optically Active a-Amino Acids" (Pergamon Press, 1989). Apskritai esančios reaguojančios šoninės grandinės grupės (amino, tiolo ir/arba karboksilo) bus apsaugotos bendros sintezės prijungimo reakcijų metu, bet įmanoma palikti keletą šoninių grandinių neapsau-gotų (hidroksiio grupes, imidazolo grupes, pirmines amido grupes, amido grupes ciklinėse aminorūgštyse, kaip piroGlu).
[0073] Tuo būdu galutinė stadija bus visiškai apsaugoto arba iš dalies apsaugoto (I) bendros formulės peptido darinio blokavimas, ir šie procesai sudaro tolimesni, šio išradimo aspektą.
[0074] Schollkopf ir kt. aprašė įvairių aminorūgščių sintezę bis-laktimo eterių metalinimu ir po to alkilinimu (žiūr., pvz., Tetrahedron 39: (1983) ir Topics Curr. CHEM., 109: 65 (1983) . Šio metodo pritaikymas pasirodė ypač naudingas pakeistų aminorūgščių, kurios sudaro išradimo pagrindą, sintezę. Konkrečiai, bis-laktimo eteris, išvestas iš valino-glicino dipeptido, sudaro naudingą pradinį jungini, pakeitimo reakcijai, kuri gali būti susumuota taip:
[0075] (kurioje X yra paliekanti grupė, pvz., bromo atomas).
[0076] (S) a-Aminorūgšties dariniai gali būti gauti šiuo būdu, jei D-valinas yra pradžioje panaudotas bis-laktimo eterio sudarymui. Taip pat (R)- a-arainorūgšties dariniai gali būti sudaryti, panaudojant L-valiną.
[0077] Tokiu būdu, šis išradimas taip pat pateikia būdą peptidinio junginio pagal ši, išradimą gamybai, apimanti, jo pilnai ar dalinai apsaugoto darinio blokavimą.
[0078] Šis išradimas toliau pateikia būdą peptidinio junginio pagal ši, išradimą gamybai, apimanti, a) bis-laktimo eterio metalinimą ir po to einanti, alkilinimą bis-laktimo dipeptido eterio suforma-vimui; b) (a) stadijos bis-laktimo dipeptido eterio hidrolizę gauti NH2-CH (A) -COOH formulės aminorūgšti,, kur A yra
[0079] c) likusių aminorūgščių įvedimą i, peptidinę grandinę;ir
[0080] Pakeisti bis-laktimo dipeptido eteriai ir pakeista
[0081] a-amino rūgštis, pagaminti šiuo metodu, sudaro tolimesni, šio išradimo aspektą.
[0082] Be to, šis išradimas taip pat apima amino-apsaugotus, hidroksilo apsaugotus ir/arba karboksilo apsaugotus šio išradimo peptidinius darinius.
[0083] Sudarius kartą pakeistą a-amino rūgšti,, likusios amino rūgštys i, peptidinę grandinę gali būti įvestos, naudojant iprastus metodus.
[0084] Formuojant peptidines grandines, galima iš principo pradėti arba nuo C-galo, arba nuo N-galo, nors tik C-galinio pradėjimo būdas yra visuotinai priimtas.
[0085] Tokiu būdu galima pradėti C-gale tinkamai apsaugoto pirmos aminorūgšties darinio reakciją su apsaugotu antrosios aminorūgšties dariniu. Pirmosios aminorūgš-ties darinys turės laisvą a-amino grupę, tuo tarpu kitas reagentas turės arba laisvą, arba aktyvuotą karboksilo grupę ir apsaugotą aminogrupę. Po sujungimo, tarpinis produktas gali būti išgrynintas, pvz., chromatografija, ir tada N-deblokuoj amas tam, kad leistų tolesnės N-apsaugotos ir laisvos arba aktyvuotos ami-nogrupės liekanos prijungimą. Šis procedūra yra tęsia-ma, kol reikiama aminorūgščių seka yra užbaigiama.
[0086] Karboksiliniai rūgšti, aktyvuoj antys pakaitalai, kurie gali, pav., būti panaudoti, apima simetrinius arba miš-rius anbidridus, arba aktyvuotus esterius, tokius kaip, pvz., p-nitrofenilo esteris, 2,4,5, - trichlorofenil-esteris, N-hidroksibenzotriazolo esteris (OBt), N-hid-roksisukcinimidilesteris (OSu) arba pentafluorofeniles-teris (OPFP) .
[0087] Laivų amino ir karboksilo grupių sujungimas gali būti, pvz., atliktas, panaudojant dicikloheksilkarbodiimidą
[0088] (DCK) . Kitas sujungiantis faktorius, kuris pvz., gali būti panaudotas, yra N-etoksikarbonil-2-etoksi-l,2-di-hidrochinolinas (EEDQ).
[0089] Apskritai, yra patogu atlikti prijungimo reakcijas že-mose temperatūrose, pvz., nuo -20°C iki kambario tem-peratūros, patogiai tinkamoje tirpiklio sistemoje, pvz., tetrahidrofurane, dioksane, dimetilformamide, metileno chloride arba šių tirpiklių mišinyje.
[0090] Gali būti patogiau vykdyti sintezę ant kietos fazės dervos nešiklio. Chlormetilintas polistirenas (susiūto su 1% divinilo benzenu yra vienas naudingas nešiklio tipas; tuo atveju sintezė prasidės nuo C-galo, pvz., prijungiant N-apsaugotą liziną prie nešiklio.
[0091] Eilė tinkamų kietos fazės metodų yra aprašyta Eric Atherton, Christopher J. Logan, and Robert C. Sheppard, J. Chem. Soc. Perkin I, 538-46 (1981); James P. Tam, Foe S. Tjoeng, and R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 102, 6117-27 (1980); James P. Tam, Richard D. Dimarchi and R.B. Merrifield, Int. J. Peptide Protein Res 16, 412-25 (1980); Manfred Mutter and Dieter Bellof, Helvetica Chimica Actą, Gl_r 2009-16 (1984) .
[0092] Prijungimo reakcijos taip pat gali būti atliktos tirpale.
[0093] Yra žinomas platus apsauginių grupių aminorūgštims pasirinkimas ir pateikta pavyzdžių Schroder. E. and Lubke, K., The Peptides, Vols. 1 and 2, Academic Press, New York and London, 1965 and 1966; Pettit, G. R., Synthetic Peptides, Vols. 1-4, Van Nostrand, Reinhold, New York 1970, 1971, 1975 and 1976; Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Synthese von Peptiden, Band 15, Georg Thieme Verlag Stuttgart, NY, 1983; The Peptides, Analysis, synthesis, biology 1-7, Ed: Erhard Gross, Johannes Meienhofer, Academic Press, NY, San Fransisco, London; Solid phase peptide synthesis 2nd ed., John M. Stewart, Janis D. Young. Pierce Chemical Company.
[0094] Tuo būdu, pvz., amino apsauginės grupės, kurios gali būti panaudotos, apima apsaugines grupes, tokias kaip karbobenzoksi (Z-), t-butoksikarbonilas (Boc-), 4-metoksi-2,3,6-trimetilbenzeno sulfonilas (Mtr-) ir 9-fluo-renilmetoksikarbonilas (Fmoc-). Bus suprantama, kad kai peptidas sudarytas nuo C-galo, arai no apsauginė grupė bus kiekvienos naujos pridedamos liekanos a-amino grupėje ir ją reikės pašalinti selektyviai prieš kitą jungimo stadiją. Kietos fazės sistemoms viena ypač naudinga grupė tokiai laikinai amino apsaugai yra Frnoc-grupė, kuri gali būti pašalinta selektyviai, paveikiant piperidinu organiniame tirpiklyje. Sintezei tirpale Boc- yra tinkamesnė apsauginė grupė, kuri gali būti įvesta ir pašalinta įprastu būdu.
[0095] Aminorūgštys arba peptidai dažnai reikalauja sili.linimo prieš apsaugojimą, pvz., pridedant Fmoc, kad būtų pa-gerintas jų tirpumas organiniuose tirpikliuose. Sili-linimas ir Fmoc apsauginės reakcijos yra susumuotos žemiau:
[0096] Karboksilo apsauginės grupės, kurios gali, pvz., būti panaudotos, apima suskaldytas esterio grupes, tokias kaip benzilas (-OBZI) p-nitrobenzilas (-ONB) arba t-butilas (-tOBu), kaip ir jungimus ant kieto nešiklio, pvz., metilo grupes, prijungtas prie polistireno.
[0097] Tiolo apsauginės grupės apima p-metoksibenzilą (Mob), tritilą (Trt) ir acetamidometilą (Acm).
[0098] Bus suprantama, kad egzistuoja daug kitų tokių grupių, kaip, pvz., smulkiai aprašyta aukščiau nurodytoje li-teratūroje, ir visų tokių grupių panaudojimas čia aukščiau aprašytuose procesuose įeina i, šio išradimo sritį.
[0099] Egzistuoja daug procedūrų amino- ir karboksil-apsau-ginių grupių pašalinimui. Tačiau jos turi būti sude-rintos su naudojama sintezės strategija. Šoninės gran-dinės apsauginės grupės turi būti atsparios sąlygoms, naudojamoms pašalinti laikinas a-amino apsaugines grupes prieš kitą jungimo stadiją.
[0100] Amino apsauginės grupės, tokios kaip Boc, ir karboksilo apsauginės grupės, tokios kaip tOBu, gali būti paša-lintos vienu metu, paveikiant rūgštimi, pvz., trifluoracto rūgštimi. Tiolo apsauginės grupės, tokios kaip Trt, gali būti pašalintos selektyviai, panaudojant ok-sidavimo agentą, toki, kaip jodas.
[0101] Cisteino turintys peptidai gali būti sintezuoti me-todais, aprašytais tekste, su visų apsauginių grupių pašalinimu, įskaitant tiolo apsaugines grupes kaip pas-kutinę sintezės stadiją.
[0102] Toliau einantys pavyzdžiai pateikiami tik kaip iliust-racij os.
[0103] 1 PAVYZDYS
[0104] ( S)- 2-( 9- Fluoreniimatoksikarbonilamino)- 5- fenil- 4-( E)-penten- l- o rūgštis
[0105] (S)-2-Amino-5-fenil-4- (E)-penten-l-oinė rūgštis susin-tetinta iš (R)-(-)-2,5-diliidro-3,6-dimetoksi-2-izopro-pilpirazino ir cinamilo bromido analogiškai metodikai, aprašytai U. Schollkopf, U. Groth and C. Deng, Angew. Chem. 93 (1981) 7 93. Amino rūgštis (4.0 mmol), gauta tokiu būdu, yra pridedama i, heksametildisiliza.no (15 ml) ir trimetilchlorsilano { 2. 0 ml) mišinį, mišinys per naktį šildomas 100°C temperatūroje, maišant N2 atmosferoje. Tada sililinančio reagento perteklius nudis-tiliuotas, likutis ištirpintas CH2C12 (10 ml) , pridėta 9-fluorenilmetoksikarbonilo chlorido (4,1 mmol) tirpalo sausame CH2C12 (5 ml) , mišinys maišytas kambario temperatūroje azoto atmosferoje 3 valandas, CH2C12 išgarintas, likutis ištirpintas THF (9 ml) ir vandenyje (1 ml), tirpalas 30 minučių maišytas, nugarintas, likutis ištirpintas EtOAc, išdžiovintas (MgS04) ir nugarintas,- kad būtų gautas pavadinimo junginys tolimesnei peptido sintezei.
[0106] 2 PAVYZDYS
[0107] ( 2S, 4R; §R) - N- 9- Fluorenilmeti. loksikarbonil- N' - benziloksikarbonil- 4 , 5- dihidroksi-- 4 , 5- 0, O- izopropilidenlizinas
[0108] a) ( 2R, 3R)- l- Brom- 4-[( 2R, 5S)- 3, 6- dimetoksi- 2- izopropil-2, 5- dihidro- 5- pirazinil- 2, 3- dihidroksi- 2, 3- 0, O- izopropilidenbutanas
[0109] (3,24 g, 17,36 mmol) ištirpintas 60 ml bevandenio THF ir tirpalas atšaldytas iki -78°C. Buvo pridėta BuLi tirpalo heksane (10,85 ml, 17,36 mmol), ir tirpalas 30 minučių maišomas. Pridėjus 7.8 ml 1,3-dimetil-2-imidazolidinono, maišymas tęsiamas dar 15 minučių. Buvo sulašintas (2R,3R)-1,4-dibrom-2,3-dihidroksi-2,3-0,0-izopropilidenbutano (5.0 g, 17,36 mmol) tirpalas 10 ml THF, ir tirpalas per nakti igijo kambario temperatūrą. Po hidrolizės fosfato buferiu (pH 7), reakcijos mišinys keletą kartų ekstrahuotas dietilo eteriu, organiniai tirpalai išdžiovinti (MgS04) , sukoncentruoti, o likutis išgrynintas impulsine chromatografija (heksanas/etilo acetatas 9/1).
[0110] 0.7 (d, 3H) , 1.04 (d, 3H) , 1.40 (s, 3H) , 1.41 (s, 3H) , 1.95-2.30 (m, 3H) , 3.40-3.58 (m, 2H) , 3.68 (s, 3H) , 3.70 (s, 3H), 3.97 (dd, 1H), 4.03-4.20 (m, 3H);
[0111] 16.74, 19.03, 27.29, 27.46, 31.88, 32.66, 37.83, 52.40, 52.42, 52.55, 60.76, 79.80, 109.22, 163.21, 164.00
[0112] b) ( 2R, 3R)- l- Azido- 4-[( 2R, 5S)- 3, 6- dimetoksi- 2- izopropil- 2, 5- dihidro- 5- pirazinil]- 2, 3- dihidroksi- 2, 3- 0, 0- izopropilidenbutanas
[0113] (2R, 3R) -l-Brom-4~[ (2R, 5S) -3, 6-dimetoksi-2-izoprop.il-2, 5-dihidro-5-pirazinil-2,3-dihidroksi-2,3-0,0-izopropilidenbutanas (5.51 g, 14.11 mmol) ištirpintas 50 ml DMF ir 2.93 g NaN3 (45 mmol), ir pridėta 0.1 g NBu4I. Tirpalas per nakti, laikytas tarp 70 ir 80cC ir praskiestas 50 ml vandens. Po ekstrakcijos chloroformu, organiniai sluoksniai surinkti ir išdžiovinti (MgS04).
[0114] Likutis išgrynintas impulsine chromatografija (heksanas/etilo acetatas 7/3) .
[0115] 0.68 (d, 3H), 1.03 (d, 3H), 1.40 (s, 3H), 1.42 (s, 3H) , 1.95-2.30 (m, 3H) , 3.20-3.80 (m, 2H) , 3,65 (s, 3H) , 3.68 (s, 3H), 3.95 (dd, 1H) , 4.00-4.15 (m, 3H);
[0116] 16.72, 19.02, 26.92, 27.27, 31.35, 52.10, 52.36, 52.41, 52.47, 60.70, 75.09, '109.13, 163.17, 164.00
[0117] c) ( 2R, 3R) - l- BenziloksiksrbORilairino- 4- [ ( 2R, 5S) - 3 , 6- dimetoksi- 2- izopropil- 2, 5- dihidro- 5- pirazinil- 2, 3- dihidroksi- 2, 3- 0, O- izopropilidenbutanas
[0118] (2R, 3R) -l-Azido-4- ( (2R, 5S) -3, 6-dimetoksi-2~izoprop.il-2, 5-dihidro-5-pirazinil) -2, 3-dihidroks.i-2, 3-0,0-izopropilidenbutanas (3.57 g, 10.12 mmoi) ištirpintas 60 ml EtOH ir pridėta 1.3 g Pd/C. Į tirpalo pučiamas argonas. Per tirpalą buvo perleistas vandenilis, ir jis per naktį išlaikytas vandenilio atmosferoje ir perfilt-ruotas pei celitą. Likutis išdžiovintas vakuume ir iš-tirpintas 30 ml dioksano. Buvo pridėta 15 ml 1 M NaHC03 tirpalo (15 mmol) ir 0°C temperatūroje pridėta 1.84 ml CbzCl (13 mmol) . Tirpalas 1 valandą maišytas šioje temperatūroje, praskiestas vandeniu ir ekstrahuotas chloroformu. Likutis išgrynintas impulsine chromatografija (heksanas/etilc acetatas 8/2).
[0119] 0.67 (d, 3 H), 1.03 (d, 3H), 1.35 (s, 3H), 1.38 (s, 3H), 1.90-2.05 (m, 1H), 2.10-2.30 (m, 2H) , 3.30-3.55 (m, 2H) , 3.64 (s, 3H), 3.68 (s, 3H) , 3.92-4.15 (m, 4H) , 5.09 (s, 2H), 5.45 (m, 1H), 7.26-7.38 (m, 5H) ;
[0120] 16.70, 19.05, 27.17, 31.83, 37.69, 42.94, 52.26, 52.41, 52.52, 60.65, 66.72, 75.69, 79.41, 108.61, 128.02, 128.07, 128.47, 136.54, 156.40, 163.24, 164.11.
[0121] FAB- MS signalai prie m/ z 462.3(56), 141.1(47), 91.0 (100) .
[0122] C24H35N306 (461.6): Pask. %: C, 62.45; H, 7.64; N, 9.10.
[0123] Rasta %: C, 62.99; H, 7,67; N, 8.77.
[0124] d) ( 2S, 4R, 5R)- N'- Benziloksikarbonil- 4, 5- dihidroksi- 4, 5-0, 0- izopropilidenlizino metilo esteris
[0125] (2R,3R)-l-Benziloksikarbonilamino-4-[ (2R,5S)-3,6-dimetoksi-2-izopropil-2,5-dihiaro-5-pirazinil] -2,3-dihia-roksi-2,3-0,0-izopropilidenbutanas (0.5 g, 1.08 mmol) ištirpintas 5 ml dioksano, įlašinta 4.20 nl 0.5 M HC1 (2.10 mmol), ir mišinys maišomas argono aplinkoje kambario temperatūroje 5 valandas. Buvo pridedama amoniako tirpalo, kol buvo pasiektas pH 9, ir tirpalas po to ekstrahuotas chloroformu, išdžiovintas (MgS04) , ir vaimo metilo ea teris pašalintas distiliacija iš kolbos (0.05 torų, 2 5°C).
[0126] 1.35 (s, 6H), 1.70-2.20 (m, 4H), 3.20-3.60 {m, 3H), 3.70 (s, 3H), 3.73-3.90 (m, 2H), 5.09 (s, 2K), 5.32 (m, 1H), 7.26-7.40 (m, 5H).
[0127] 27.01, 27.05, 37.56, 42.11, 51.99, 52.38, 66.79, 75.79, 79.82, 108.99, 128.00, 128.44, 136.39, 156.46, 175.30.
[0128] ( 2S, 4R, 5R)- N1- Benziloksikarbonil- 4, 5- dihidroksi™ 4, 5-0, O- izopropilidanlizinas
[0129] (2S, 4R, 5R) -N' -Benziloksikarbonil- 4, 5-dihidroksi- 4, 5-0,0-izopropilidenlizino metilo esteris (0.40 g, 1.08 mmol) ištirpintas 3.5 ml vandens ir 4 ml dioksano ir atšal-dytas iki 0°C. Buvo pridėta 0.54 ml 2 N LiOH tirpalo (1.08 mmol), ir tirpalas buvo per naktį maišomas argono aplinkoje. PSC kontrolė parodė kiekybini,. (2S, 4R, 5R) -N1 - benziloksikarbonil-4, 5-dihidroksi-4, 5-0,0-izopropiliden-lizino susidarymą, šis nevalytas tirpalas buvo tiesia: panaudotas kitoje stadijoje.
[0130] ( 2S, 4P., 55.) - H' -■ Pluoronilnatiloksikarbonil- N' - benziloksikarbonil- 4 , 5- dihidroksi- 4, 5- 0, 0- izopropilidenlizinas
[0131] 1.5 rr.l 1 M NaOH tirpalo (2.5 mmol) ir 0.518 g 9-fluoreniloksikarbonilchlorido (2.00 mmol) tirpalas 3 ml dioksano pridėtas i, nevalytą (2S, 4R, 5R)-N1-banzilok-sikarbonil-4,5-dihidroksi-4, 5-izopropilidenlizinc tir-palą, ir šis mišinys maišytas per naktį. Tirpalai pa-rūgštintas iki pH 2, pridedant KHSO4 tirpalo,- ekr ;:ra-"nucuas etilo acetatu, .išdžiovintas (MgSO.;) , ir 1:' :~is išgrynintas impLi. r.r.r^rr.ar.ovrafij;. ; .'.•■hlsr cr-mas/'MeOH 8/2) .
[0132] 1. 19 (s, 3H) , 1.22 (s, 3H) , 1.60-2.10 (m, 2H) f 2.90-3. 30 ( m, 2H), 3.50-4.00 (m, 3H) , 4.00-4.40 (m, 3H) , 4. 95 (s, 2H), 7.20-8.00 (m, 13H) .
[0133] 27. 59, 27.81, 37.14, 43.15, 53.94, 65.92, 66.01, 76.98, 80. 16, 108. 40, 120.61, 125.67, 125.79, 127.66, 128.16, 128. 22, 128. 32, 128.89, 137.55, 141.18, 144.36, 156.14, 156. 87, 176. 09.
[0134] FAB- MS signalai prie m/ z 497.1(3), 429.1(3), 179.1(31), 91.0 (64)
[0135] C32H34N2O8 (574.6): Pask. %: C, 66.89; H, 5.96; N, 4.88.
[0136] Rasta %: C, 62.53; H, 5,60; N, 5.03.
[0137] 3 PAVYZDYS
[0138] ( S)- 2-( 9- Fluorenilmetiloksikarbonilamino)- 6- azidoheksano rūgštis
[0139] a) l- Brom- 4-[ ( 2R, 5S)- 3, 6- dimetoksi- 2- izopropil- 2, 5- dihidro- 5- pirazinil- butanas
[0140] ( 2R) - 2, 5- Dihidro-3,6-dimetoksi-2-izopropilpirazinas
[0141] ( 3. 76 g, 20.43 mmol) ištirpintas 60 ml bevandenio THF, ir tirpalas atšaldytas iki -78°C. Buvo pridėta nBuLi tirpalo heksane (20.43 mmol, 12.77 ml), ir tirpalas maišomas 30 minučių. Buvo Sulašintas 1,4-dibrombutano ( 4. 41 g, 20. 45 mmol) tirpalas 10 ml THF, ir per nakti, tirpalas igijo kambario temperatūrą. Po hidrolizės fosfato buferiu (pH 7) , reakcijos mišinys keletą kartų ekstrahuotas dietilo eteriu, organinis tirpalas iš-džiovintas (MgS04), o likutis išgrynintas impulsine chromatografija (heksanas/etilo acetatas 9/1).
[0142] 0.68 (d, 3H), 1.04 (d, 3H) , 1.23-1.47 {m, 2H), 1.63-1.91 (m, 4H), 2.25 (m, 1H), 3.38 (t, 2H), 3.67 (s, 3H), 3.68 (s, 3H), 3.90-4.05 (m, 2H) .
[0143] 16.58, 19.03, 23.29, 31.75, 32.63, 33.13, 33.58, 52.33, 55.13, 60.78, 163.60.
[0144] b) l- Azido- 4-[( 2R, 5S)- 3, 6- dimetoksi- 2- izopropil- 2, 5- dihidro- 5- pirazinil]- butanas l-Broino-4-[ (2R,5S)-3,6-dimetoksi-2-izopropil-2, 5-dihidro -5-pirazinilj-butanas (3.81 g, 11.95 rnmoi} ištir-pintas 40 ml DMF ir 3.25 g NaN3 (50 mmol) , ir pridėta 0.1 g NBu4I. Tirp'alas per naktį 'laikytas tarp 70 ir 80°C ir praskiestas 50 ml vandens. Po ekstrakcijos chloroformu, organiniai sluoksniai surinkti ir išdžiovinti (MgSO.) . Likutis išgrynintas impulsine chromatografija (heksanas/etilo acetatas 9/1).
[0145] 0.68 (d, 3H) , 1.04 (d, 3H) , 1.20-1.50 (m, 2H) , 1.53-1.91 (m, 4H), 2.26 (m, 1H), 3.25 (t, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 3.90-4.07 (m, 2H).
[0146] 16.58, 19.05, 21.83, 28.72, 31.76, 33.56, 51.32, 52.35, 55.16, 60.79, 163.63.
[0147] l-Azido-4-[ (2R,5S)-3,6-dimetoksi-2-izopropil-2, 5-dihidro-5—pirazinil] -butanas (2.17 g, 7.72 mmol) ištirpintas 30 ml dioksano ir buvo sulašintas 1.28 ml kone. HC1 tirpalas 30 ml vandens (15.45 mmol), mišinys argono aplinkoje per naktį buvo maišomas kambario tempe-ratūroje. Buvo dedama amoniako tirpalo, kol pasiekta pH 9-, po to tirpalas ekstrahuotas chloroformu, išdžio-vintas (MgS04), ir valino metilo esteris pašalintas distiliacija iš kolbos X kolbą (0.05 torų, 25°C) .
[0148] 1.40-1.87 (m, 8H), 3.28 (t, 2H) , 3.43 (dd, 1H) , 3.73 (s, 3H) .
[0149] 13C,BMR (CDCI3): 5
[0150] 22.93, 28.63, 34.36, 51.22, 51.98, 54.26, 176.37.
[0151] d) ( S)- 2- Amino- 6- azidoheksano rūgštis
[0152] Metil- (S) -2-amino-6-azidoheksanoatas (1.44 g, 7.73 mmol)
[0153] ištirpintas 4 ml dioksano ir atšaldytas iki 0°C. Buvo pridėta 3.87 ml 2N LiOH tirpalo (7.74 mmol), ir tirpalas buvo maišomas per naktį azoto aplinkoje. PSC (plonasluoksnės chromatografijos) kontrolė parodė kie-kybinį (S) -2-amino-6 -azidoheksano rūgšties susidarymą. Šis nevalytas tirpalas buvo panaudotas kitoje stadijoje.
[0154] e) ( S)- 2-( 9- FluoreniliftetiloksikarbonilamiRo}- 6- azidoheksano rūgštis
[0155] 11.6 ml 1N NaHCC'3 tirpalo (11.6 mmo 1) ir 3.00 g S-fluo-reniloksikarbon.ilchlorido (11.6 rnmol) tirpalo 12 rai d.i-oksano buvo pridėta prie nevalyto (5)-2-amino-6-azidoheksano rūgšties (7.73 ivmcl) tirpalo ir toliau per nakti, maišoma argone aplinkoje. Tirpalas parūgštinamas iki pH 2, pridedant KHSO^ tirpalo, ekstrahuotas etilo acetatu, išdžiovintas (MgS04) , ir l ikutis išgrynintas impulsine chromatogra.fija (heksanas/etilo acetatas/acto rūgštis 7/3/9.5).
[0156] 1.20-1.80 (m, 2}l) , 3.31 (t, 2H) , 3.94 (m, IK) , 4.27 (ra, 3H), 7.20-8.00 (m, SH).
[0157] 23.32, 28.26, 30.73, 47.10, 50.94, 54.05, 66.01, 120.48, 125.65, 127.44, 128.02, 141.11, 144.19, 144.25, 156.54, 174.22.
[0158] 4 PAVYZDYS
[0159] a) ( 2R, 5S)- 3, 6- dimetoksi- 5-( aretoksimetil)- 2- izopropil-2, 5- dihidropirazinas
[0160] Į (R) -2, 5-dihidro-3, 6-di.metoksi--2-izopropil~piras.ino (5.53 g, 30 rnmol) tirpalą bevandeniame THF (CC ml)
[0161] -78°C temperatūroje pridėta 1.6 M nBuLi tirpalo heksane (10.85 ml, 17.36 rnmol). Po 30 minučių sulašintas bro~
[0162] mometilo eterio tirpalas (4.5 g, 36 mmol) THF-e. (20 ml). Reakcijos mišiniui per nakti, leista igyti 20°C tempe-ratūrą, ir jis buvo užgesintas, pridėjus 1 M fosfato buferio (pH 1, 80 ml) . Drumstas mišinys maišomas 10 mi-nučių, praskiestas vandeniu (250 ml) ir dietilo eteriu (180 ml) . Sluoksniai atskirti, o vandeninė fazė ekstrahuota dietilo eteriu (2 x 150 ml). Sujungtas organinis sluoksnis išdžiovintas (Na2S04) , sukoncentruotas ir išgrynintas impulsine chromatografija (silikagelis; heksanas : dietilo eteris 5:1), davė 5.61 g produkto. Kito diastereomero galutinių priemaišų pašalinimui, medžiaga kristalizuota iš acetonitrilo -30°C temperatūroje ir šaltos nuosėdos vėl ištirpintos CH2C12, išdžiovintos (Na2S04) ir sukoncentruotos.
[0163] 4.05 (kv, 1H, J 3.5 Hz), 3.99 (t, 1H, J 3.5 Hz), 3.80-3.64 (m, 8H) r 3.34 (s, 3H) , 2.29 (d sept, 1H, J 3.5, 7.0 Hz), 1.05 ( d, 3H), 0.68 (d, 3H).
[0164] 164.79, 161.55, 74.13, 60.76, 59.51, 56.82, 52.42.
[0165] CnH2oN203 ( 2 2 8 . 29) .
[0166] b) Metil ( S) — 2- ( 9- fluorenilmetiloksikarbonilamino) - 3-metoksipropionafcas
[0167] Į (2R, 5S) -3, 6-dimetoksi-5- (metoksimetil)-2-izopropil-2,5-dihidropirazino (2.1 g, 9.2 mmol) tirpalą dioksane (18 ml) pridėta 1 M HC1 (18.4 ml, 18.4 mmol), ir
[0168] mišinys per nakti, maišomas kambario temperatūroje. La-kūs komponentai išgarinti, likutis vėl ištirpintas dioksane ir vėl išgarintas. Nevalytas likutis ištirpintas dioksane ir pridėta FmocCi (5.71 g, 2.21 mmol). Po 2 minučių pridėta 1 M NaHC03 (44.2 ml, 44.2 mraol) . Po 15 minučių mišinys . praskiestas vandeniu (50 ml) ir CHC13 (100 ml) . Sluoksniai atskirti ir vandeninė fazė ekstrahuota CHC13 (2 x 75 ml). Sujungtas organinis sluoksnis išdžiovintas (Na2S04) .sukoncentruotas ir iš-grynintas impulsine chromatografija (silikagelis; heksanas : etilo acetatas 2:1) .
[0169] 7.78 (d, 2H, J 7 Hz), 7.63 (t, 2H, J 7 Hz), 7.41 (t, 2H, 7Hz), 4.56-4.35 (m, 3H) , 4.25 (t, III, J 3.0, 9,3 Hz), 3.84 (dd, 1H, J 3.0, 9. 3 Hz), 3.70 (s, 3H) , 3.55 (dd, 1H, J 3.6, 9.3 Hz), 3.36 (s, 3H).
[0170] 170.77, 156.01, 143.88, 143.75, 141.25, 127.66, 12.7.02, 125. 12, 125.07, 119.92, 72.27, 67.11, 59.23, 54.37, 53.44, 52.54, 47.12.
[0171] c) ( S) - ( 9— f luorenilmetiloksikarbonilami. no) - 3- metoksi-propiono rūgštis 1 metilo (S)-(9-fiuorenilmetiloksikarbonilamino)-3-me-toksipropionato (2.18 g, 6.13 mmol) tirpalą dioksane (31 ml) pridėta 6 M HC1 (31 ml, 184 mmol) . Mišiniui leista atšalti ir" jis buvo koncentruotas. Likutis iš-grynintas impulsine chromatografija (silikagelis; heksanas : etilo acetatas; actc rūgštis 10:10:1).
[0172] 7.87 (d, 2H, J 7.5 Hz), 7.74 (d, 2H, J 7.5 Hz), 7.41 (dt, 2H, J 0.6 Hz, 7.5 Hz), 7.31 (dt, 2H, J 0.6 Hz, 7.5 Hz), 4.29-4.19 (m, 4H) , 3.65-3.54 (m, 2H) , 3.24 (s, 3H) .
[0173] 172.07, 156.46, 144.23, 144.21, 141.11, 128.03, 127.46, 125.73, 120.48, 71.80, 66.19, 58.60, 54.47, 47.05.
[0174] 5 PAVYZDYS
[0175] ( S) - 6- ( Benziloksikarbonilami. no) - 2- ( 9- f luorenilmetilok-sikarbonilamino)- heks- 4- ino rūgštis
[0176] a) l- Chloro- 4-[( 2R, 5S)- 3, 6- dietoksi- 2- izopropil- 2, 5- dihidro- 5 pirazinil] but- 2- inas: Į (R)-2,5-dihidro-3,6-dietoksi-2-izopropilpirazino (21.23 g, 100 ml) tirpalą/THF (200 ml) -78°C temperatūroje su-lašinta 1.6 M nBuLi (62.5 ml, 100 mmol) . Po 30 minučių šis tirpalas -78°C temperatūroje perpiltas i, 1,4-dichlorobut-2-ino (49.2 g, 400 mmol) tirpalą THF (400 ml) . Mišiniui per naktį buvo leista įgyti 20°C temperatūrą. Reakcija užgesinta, pridedant 1 M fosfato buferio tirpalo (250 ml). Mišinys praskiestas dietilo eteriu (300 ml) ir vandeniu (300 ml). Vandeninis sluoksnis atskirtas ir ekstrahuotas dietilo eteriu (2 x 300 ml) . Sujungtas organinis sluoksnis išdžiovintas (Na2S04) , perfilt-ruotas, sukoncentruotas ir išgrynintas impulsine chromatografija (silikagelis; heksanas:dietilo eteris 10:1).
[0177] 4.39-4.00 (m, 8H) , 2.78 (m, AA'X, 2H) , 2.30 (d sept, 1H, J 3.5, 9.5 Hz), 1.38-1.20 (m, 6H) , 1.05 (d, 3H, 7Hz), 0.70 (d, 3H, 7Hz).
[0178] 161.03, 159.25, 83.78, 60.90, 54.21, 31.68, 30.95, 25.48, 20.62, 19.03, 15.85, 14.21.
[0179] b) l- Azido- 4-[( 2R, 5S)- 3, 6- dietoksi- 2- izopropil- 2, 5- di-hidrc- 5- pirazinilJbut- 2- inas
[0180] 1- (chloro)-4-[ (2R,5S)-3,6--dietoksi-2-izopropil-2,5-dihidro-5-pirazini1] but-2-ino (19.4 g, 65 mmol) ir tet-rabutiiamino jodido (2 g) tirpalas bevandeniame DMF (200 n\i) per nakti, maišomas 20°C temperatūroje. Di-džioji dalis DMF pašalinta sumažintame slėgyje (0.01 to-rų) . Likutis paskirstytas tarp dietilo eterio (250 ml) ir vandens (250 rul) . Vandeninis sluoksnis ekstrahuotas eteriu (2 x 250 ,nl) . Sujungtas organinis sluoksnis iš-džiovintas (Na2S0į) , sukoncentruotas ir išgrynintas impulsine chromatografija (silikagelis; heksanas -.dietilo eteris 8:1).
[0181] 4.25-3.99 (m, 4H) , 3.84 (m, 6H) , 3.84 (m, 2H) , 2.83-2.77 (m, AA1X, 2H) , 2.33-2.26 (m, 1H) , 1.35-1.27 (m, 6H), 1.05 (d, 3H, 7.2 Hz), 0.71 (d, 3H, J 7.2 Hz).
[0182] 164.24, 161.16, 84.54, 73.50, 61.00, 60.74, 54.31, 40.20, 31.84, 25.31, 19.03, 16.62, 14.27, 14.21.
[0183] c) l- Benziloksikarbonilamino- 4-[( 2R, 5S)- 3, 6- dietoksi-2, 5- dihidro- 2- izopropil- 5- pirazinil] but- 2- inas
[0184] Į l-azido-4-J (2R,5S)-3,6-dietoksi-2-izopropil-2, 5-dihidro-5-pirazinil] but-2-ino (3.6 g, 11.8 mmol) tirpalą THF (236 ml) 20°C pridėti trifenilfosfinas (3.7 g, 14.16 mmol) ir H20 (680 ml, 37.8 mmol). Iškart paste-bėtas N2 išsiskyrimas. Reakcijos mišinys 2 valandas maišomas ir tada koncentruojamas. Prie likučio tirpalo dioksane (29 ml) 0°C temperatūroje buvo pridėti 1 M NaHC03 (14.2 ml, 14.2 mmol) ir Cbz-chloridas (2.42 g, 14.2 mmol). Mišinys laikytas šioje temperatūroje 1 va-landą, tada ekstrahuotas dietilo eteriu (3 x 50 ml) . Sujungtas organinis sluoksnis išdžiovintas (Na2S04), per-filtruotas, sukoncentruotas ir išgrynintas impulsine chromatografija (silikagelis; heksanas:etilo acetatas 4:1).
[0185] 7.37-7.33 (m, 5H) , 5.10 (s, 2H) , 4.24-4.03 (m, 6H) , 3.97-3.90 (m, 4H), 2.70-2.67 (m, AA'X, 2H) , 2.32-2.25 (m, 1H), 1.27 (t, 4H, J 7 Hz), 1.04 (d, 3H, J 7 Hz), 0.69 (d, 3H, J 7 Hz).
[0186] 164.11, 161.35, 136.31, 128.46, 128.42, 128.05, 127.53, 126.89, 80.41, 66.85, 65.25, 60.85, 60.69, 60.65, 54.43, 31.66, 25.32, 19.054, 16.53, 14.29, 14.21.
[0187] d) Etil ( S)~ 2- Amino- 6-( benziloksikarbonilamino)- 2- hek-sinoatas
[0188] Į l-benziloksikarbonilamino-4-[ (2R,5S)-3, 6-dietoksi-2, 5~ dihidro-2-izopropil--5-pirazinil] but-2-ino (4 g, 9.67 mmol) tirpalą dioksane (38 ml) pridėta 1 M HC1 (38.7 ml, 38.70 mmol). Šis mišinys per naktį maišytas kambario temperatūroje. Didžioji dalis dioksano pašalinta su-mažintame slėgyje, o vandeninis likutis praskiestas vandeniu iki 100 ml. Šis mišinys ekstrahuotas eteriu (100 ml) . Tada tirpalo pH buvo sureguliuota iki 9, pridedant koncentruoto NH3 iki kol susiformavo baltas aliejus- Šis mišinys ekstrahuotas CHC13 (3 x 50 ml) , sujungtas CHCl3-sluoksnis išdžiovintas (MgS04) , per-filtruotas ir sukoncentruotas. Likutis pajungtas Kugelrohr'o distiliacijai tam, kad būtų pašalintas etilo valinatas 50°C temperatūroje (0.1 torų). Likusi medžiaga buvo grynas produktas.
[0189] 7.34 (s, 5H) , 5.11 (s, 2H) , 4.18 (q, 2H, J 7Hz) , 3.96 (m, 2H) , 3.57 (t, 1H, J 6 Hz), 2.60 (AA'X, 2H) , 1.27 (t, 3H, J 7 Hz).
[0190] 173.73, 160.35, 136.24, 128.44, 128.10, 128.05, 79.02, 78.66, 66.93, 61.19, 53.22, .31.15, 25,10, 14.15.
[0191] e) ( S)- 6-( Benziloksikarbonilamino)- 2-( 9- fluorenilmetiloksikarbonilamino)- 4- heksino rūgštis
[0192] Į etilo (S)-2-amino-6-- (benziloksikarbonilamino) -4-hek-sinoato. HC1 (520 mg, 1.71 mmol) tirpalą dioksane (5 ml)
[0193] pridėta 1 M NaHCG3 (2.05 ml, 2.05 mmo1) ir vandens (3 ml). Po 5 valandų pridėta FmocCl (530 mg, 2.05 mmol) dioksane (5 ml) . Beveik iš karto susidarė nuosėdos. Šis mišinys parūgštinamas, pridedant 1 M HC1 ir ekstrahuotas CHC13 (3 x 30 ml) . Organinis sluoksnis sukoncentruotas ir išgrynintas impulsine chromatografija (silikagelis; heksanas:etilo acetatas:acto rūgštis 10:10:1).
[0194] 7.87 (d, 2H, J 7.5Hz), 7.71 (d, 2H, J 7.5 Hz), 7.42-7.28 (m, 9H), 5.00 (s, 2H), 4.30-4.20 (m, 3H), 4.10 (m, 1H), 3.77 (m, 2H), 2.58 (m, 2H) .
[0195] 172.41, 156.28, 144.20, 141.10, 137.35, 128.73, 128.21, 128.03, 127.48, 125.68, 120.49, 100.09, 79.37, 79.03, 66.21, 65.93, 53.49, 47.04, 30.63, 21.78.
[0196] a) ( 2R, 5S) - 2, 5- Dihidro- 3, 6- dimetoksi- 2- izopropil- 5- fur-furilpirazinas
[0197] 1.55 M butilličio (6.45 ml, 10 mmol) tirpalas heksane švirkštu suleistas i maišomą (2R)-2,5-dihidro-3, 6-dimetoksi -2-izopropil-pirazino (1.84 g, 10 mmol) tir-palą THF (50 ml) -78°C temperatūroje, ir tirpalas 1 va-landą buvo maišomas -78°C temperatūroje. Laipsniškai pridėtas 2-chlorometilfurano (1.3 g, 11 mmol) tirpalas THF (10 ml), ir maišymas buvo tęsiamas per naktį. Tirpiklis sumažintame slėgyje pašalintas, likutis iš-
[0198] tirpintas etilo acetate (5C ml) ir ekstrahuotas fosfato buferiu (pH 7). Vandeninė fazė du kartus ekstrahuota etilo acetatu (2 x 20 mi) . Organinis sluoksnis išdžio-vintas (MgS04) , tirpiklis sumažintame slėgyje išgarin-tas ir likutis išgrynintas impulsine chromatografija (dietilo eteris/heksanas 15/1, siiikagelis) .
[0199] 0.65 (d; 3H, J 6.7Hz), 1.00 (d, 3H, J 6.7 Hz), 2.20 (m, 1H), 3.11 (d, 2Hf J 5 Hz), 3.62 (t, 1H, J 3.5 Hz), 3,65 (d, 3H, J 0,9 Hz), 3.70 (d, 3H, J 0.9 Hz), 4.26 (dd, 1H, J 5, J 8.5 Hz), 5.96 (d, 1H, J 3.1 Hz), 6.23 (dd, 1H, J 1.8, J 3.1 Hz), 7.26 (dd, 1H, J 1.0, J 0.8 Hz).
[0200] 16.54, 19.07, 31.43, 33.03, 52.33, 52.41, 54.95, 60.48, 107.10, 110.24, 141.28, 152.27, 162.53, 164.10.
[0201] b) Metil ( S)- 2- amirxo- 3-( 2- furil) propionatas
[0202] (2R, 5S) -2, 5-Di'nidro-3, 6-aimetoksi-2-izopropil-5-furfu-rilpirazino (2 g, 7.6 mmol), 1 M HC1 (7.6 ml, 7.6 mmol) ir dioksano (7.6 ml) mišinys per nakti, maišomas N2 atmosferoje kambario temperatūroje. Dioksanas pašalin-tas sumažintame slėgyje, o vandeninė fazė ekstrahuota dietilo eteriu (20 ml). Į vandeninę fazę iki pH 9 dedamas skystas amoniakas,, po to ekstrahuota CHC13 (3 x 30 ml) , išdžiovinta (MgS04) ir tirpiklis paša-lintas sumažintame slėgyje. Valino metilo esteris pa-šalintas 40-50°C temperatūroje (0.05 mbar) distiliacija iš kolbos i, kolbą. Visas neišdistiliuotas junginys panaudotas be tolimesnio valymo.
[0203] 1. 5 ( s, 2H), 2. 92 ( dd, 1H, J 15, J 7, 2 Hz), 3. 04 ( dd, 1H, J 15, J 5 Hz), 3. 68 ( d, 3H, J 0. 5 Hz), 3. 73 ( dd, 1H, J 7. 2, J 5. 1 Hz), 6. 06 ( dd, 1H, J 0. 7 , J 3. 2 Hz), 6. 24 ( dd, 1H, J 2. 9, J 2 Hz), 7. 28 ( dd, 1H, J 0. 7, J
[0204] 33. 45, 52. 00, 53. 67, 107. 44, 110. 20, 141. 83, 151. 32, 174. 97.
[0205] c) ( S)- 2-( 9- Fluorenilmetiloksikarbonilamino)- 3-( 2- furil)- propiono rūgštis
[0206] Metil ( S)- 2- amino- 3- ( 2- furil) propionatas ( 1 g, 6. 5 mmol) sumaišytas su 2M LiOH ( 3. 27 ml, 6. 5 mmol) ir dioksanu ( 3. 37 ml) 0°C temperatūroje ir per nakti, maišomas N2 atmosferoje. Kitą dieną reakcijos mišinio PSC kontrolė
[0207] ( CHCl3/ MeOH/ NH3 sk 1/ 1/ 0. 1) esterio buvimo nerodė 1 M NaHC03 ( 9. 75 ml, 9. 75 mmol) ir 9- fluorenilmetiloksi-karbonilo chloridas ( 2. 5 g, 9. 75 mmol), ištirpinti dioksane ( 10 ml), pridėti i, aukščiau minėtą tirpalą, ir maišymas tęsiamas dar 1 valandą. Dioksanas sumažintame slėgyje pašalintas, o vandeninis tirpalas rūgštinamas 10% KHS04 tirpalu iki pH 2. Tirpalas ekstrahuotas CHC13 ( 3 x 20) , išdžiovintas, išgarintas ir išgrynintas impulsine chromatografija ( heksanas/ etilo acetatas/ acto rūgštis 10/ 10/ 1) .
[0208] 2.95 (dd, 1H, J S.9, J 15.2 Hz), 3.03 (dd, 1H, J 4,4, J 15.2 Hz), 3.6 (pls, 1H), 4.16-4.26 (m, 4H) , 6.12 (d, 1H, J 2.9 Hz), 6.33 (t, 1H, J 2.3 Hz), 7.29 (t, 2.R, J 7.32 Hz), 7.39 (t, 2H, J 7.48 Hz), 7.49 (pls, 1H), 7.64 (dd, 2H, J 7 17, J 2.14 Hz), 7.85 (d, 2H, J 7.48 Hz).
[0209] 2 9.8, 46.98, 66.04, 107.45, 110.85, 120.48, 125.57, 125.63, 127.50, 128.07, 141.06, 142.21, 144.09, 151.84, 156.26, 160.35. 7 PAVYZDYS
[0210] ( S)- 2- Amino- 3-( 3, 5- dirnetil- 4- izoksazolil) propiono rūgštis
[0211] a) (2R, 53)- 2,5-Dihidro-3, S~diinetoksi-2- izopropil- 5- ( 3, 5-dimetil-' l- izoksazolilmetil) pirazinas
[0212] 1.55 M butilličio tirpalas (10 mi, 15.5 mmol) heksane švirkštu suleistas i, maišomą (2R) -2, 5-dihidro-3, 6-dimetoksi-2-izopropilpirazino (2.85 g, 15.5 mmol) tirpalą THF (50 ml) -78°C temperatūroje. Tirpiklis sumažintame slėgyje pašalintas, likutis ištirpintas etilo acetate (50 ml) ir išekstrahuotas fosfato buferiu (pH 7) . Van-deninė fazė du kartus ekstrahuota etilo acetatu (2 x 20 ml). Organinis sluoksnis išdžiovintas (MgS04), tirpiklis išgarintas sumažintame slėgyje ir likutis išgrynintas impulsine chromatografija (dietilo eteris/heksanas 4/1, silikagelis).
[0213] 0.60 (d, 3H, J 6.7 Hz), 0.97 (d, 3H, J 6.7 Hz), 2.17 (s, 3H), 2.26 (s, 3H), 2.73 (dd, 1H, J 5.9, J 14.6 Hz), 2.86 (dd, 1H, J 4.4, J 14.7 Hz), 3.59 (t, 1H, J 3.4 Hz), 3.63 (d, 3H, J 0.3 Hz), 3.68 (d, 3H, J 0.3 Hz), 4.11 (m, 1H) .
[0214] 13C BMR (CDC13): 8
[0215] 10.21, 11.16, 16.41, 18.99, 26.99, 31.29, 52.26, 52.33, 55.93, 60.46, 109.82, 160.18, 162.33, 164.24, 166.34.
[0216] b) Metil ( S)- 2- amino- 3-( 3, 5- dimetil- 4- izoksazolil)- propionatas
[0217] (2R,5S)-2,5-dihidro-3,6-dimetoksi-2-izopropil-5-(3,5-dimetil-4-izoksazolilmetil)pirazino (2 g, 6.8 mmol), 1.0 M HCl (13.6 ml, 13.6 mmol) ir dioksano (13.6 ml) mišinys per naktį maišomas kambario temperatūroje N2 atmosferoje. Dioksanas sumažintame slėgyje pašalintas, o vandeninė fazė ekstrahuota dietilo eteriu (20 ml) . Į vandeninę fazę iki pH 9 dedamas skystas amoniakas, ekstrahuojama CHC13 (3 x 30 ml) , išdžiovinama (MgS04) , ir tirpiklis sumažintame slėgyje pašalintas. Valino metilo esteris 40-50°C (0.05 mbar) pašalintas distiliacija iš kolbos i, kolbą. Visas nenudistiliuotas junginys panaudotas be tolesnio valymo.
[0218] 1.52 (pls, 2H) , 2.21 (s, 3H), 2.31 (s, 3H) , 2.56 (dd, 1H, J 7.5, J 14.6 Hz), 2.74 (dd, 1H, J 6.2, J 14.6 Hz), 3.55 (t, 1H, J '6.7 Hz), 3.69 (s, 3H) .
[0219] 0.18, 11.06, 27.94, 52.06, 54.45, 109.45, 159.63, 166.31, 175.18.
[0220] c) ( S) - 2- ( 9- Fluorenilmetiloksikarbonilaraino- 3~ ( 3, 5- dimetil- 4- i7:oksazolii) propicno rūgštis
[0221] Metil (S) -2-amino-3- (3, 5-dimetil-4-i2cksazol. il) - propionatas (1,3 g, 6.6 inmol) sumaišytas su 2 M LiOH (3.3 ml, 6.6 jrmiol) ir dioksanu (3.3 ml), 0°C temperatūroje mai-šomas per naktį N2 atmosferoje. Kitą dieną reakcijos mišinio PSC kontrolė (CKCl2/MeOH/Nfi3 sk 1/1/0,1) nerodė esterio buvimo, 1 M NaHC03 (10 ml, 10 mmol) ir 9-fluo-renilmetiloksikarfconilo chloridas (2.6 g, 10 nunol), iš-tirpinti. dioksane (10 ml), prideri prie ankščiau apra-šyto tirpalo, ir maišymas tęsiamas dar valandą. Dioksanas pašalintas sumažintam,e slėgyje, c vandeninis tirpalas rūgštinamas 10% KHSO, tirpalu iki pH 2. Tirpalas ekstrahuotas CHCi3 (3 x 20 ml), išdžiovintas (MgSG4) , išgarintas ir išgrynintas impulsine chromatografija ( heksanas/' etiio acetatas/acto rūgštis 10/10/1) .
[0222] 2.10 (s, 3H) , 2.. 19 (s, 3H) , 2.65 (dd, 1H, J 9.46, J 14.65 Hz), 2.76 (dd, 1H, J 5.4, J 14.65 Hz), 3.5-4.2 (m, 4H) , 7.24-7.40 (m, 4K) , 7.63 (d, 2H, J 7.32 Hz), 7.82 (t, 2H, 7.63 Hz).
[0223] 10.02, 10.90, 24 .27, 4 6.94, 53.81, 66.73, 110.16, 120.44, 125.51, 127.46, 123.06, 141.06, 144.12, 156.27, 159.83, 166.51, 173.02.
[0224] Peptidų kietos fazės sintezė
[0225] Kietos fazės peptido sintezė buvo atliekama iš esmės pagal fluorenil, metoksikarbonilo (Fmoc)-poliamido sin-tezės principus (Atherton and Sheppard, Solid phase peptide synthesis: a practical approach, Oxford IRL Press at Oxford University Press, 1989). Buvo panaudotos prekyboje turimos sintetinės dervos; periodine sinteze arba rankomis, arba naudojant pusiau automatinį prietaisą (Labortec Peptide Synthesizer 5P 650) jos buvo polistireno su rūgšties labilaus (Wang, J. Amer. Chem. Soc., 95, 1328- 1333, 1973) arba rūgšties hiper-labilaus ryšio agentais (Merger et al., Tetrahedron Letters 29, 4005-4008, 1988). Alternatyviai, peptidai buvo sudaryti visiškai automatiškai ant takių dervų
[0226] (Atherton et. al., J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1151-2, 1981), panaudojant LKB Biolynx 4170 automatinį peptidų sintezatorių. Buvo įsigytos dervos, kurios turėjo apsaugotą reikalingą C-galo Fmoc-aminorūgšties liekaną. Grandinės pailginimas pasiektas įvairiai su šoninės grandinės apsaugotais Fmoc-aminorūgšties pentafluo-renilo esteriais (Kisf-aludy and Schoen, Synthesis, 325-327, 1983), panaudojant aktyvaciją su diciklohek-silkarbodiimido (DDC)/1-hidroksibenzotriazolu (HOBt)
[0227] arba panaudojant prijungimo reagentą PyBOP (Coste et al., Tetrahedron Lett., 31, 205-208, 1990). Lizino šoninės grandinės amino grupė buvo apsaugota su t-butiloksikarbonilo funkcija, glutamino arba asparagino rūgšties šoninės grandinės karboksilo grupės buvo apsaugotos kaip t-butilo esteriai.
[0228] Užbaigus norimų sekų kietos fazės surinkimą, peptidai atskirti nuo sintezės dervų, kartu vykstant šoninių grandinių deblokavimui, panaudojant trifluoracto rūgš-tį, prie kurios buvo pridėti jai tinkami valantys chemikalai (King et. al., Int. J. Peptide Protein Res., 35, 255-268- 1980). Po išgarinimo, peptidai buvo atskirti, nusodinant dietilo eteriu ir išdžiovinti. Gry-ninimas atliktas prsparatyvine atvirkščios fazės aukšto slėgio skystine chromatografija.
[0229]
[0230] Peptidas sintezuojamas, naudojant Labortec peptidų sintezatorių. X reakcijos kolbą įdedamas Fmoc-Lys(Boc) - Sasrin polimeras (1.0 g, 0.6 mmol; Bachem A.G. pakei-timas 0.6 mmol/g). Prie polimero pridėta (S)-2-(9-fluo-renilmetoksikarbonilamino)-5fenil-4-(E)-penten-l-o rūgš-ties (578 mg, 1.4 mmol), DCC (290 mg, 1.4 mmol) ir HOBt (211 mg, 1.4 ramol) DMF'e ir reakcijai leista vykti 9 valandas. Tada polimeras nuplautas CH2CL2 30% MeOH/CH2Cl2 ir DMF (neigiamas Kaiser'io testas).
[0231] Likusi sintezės dalis atliekama pagal standartinę me-todiką, panaudojant Fmoc-Asp (tBu)-Opfp (0.89 g, 1.5 mmol), Fmoc-Glu(OtBu)-Opfp (0.90 g, 1.5 mmol) ir pGlu-penta-chlorfenilo esteri, (0.57 g, 1.5 mmol). Kiekvienoje sujungimo stadijoje , kuriai leidžiama vykti 1 valandą, pridedama HOBt (0.23 mg, 1.5 mmol). Sujungimo pabaiga yra nustatoma Kaiser'io testu. Po sujungimo su Fmoc-aminorūgštimi, polimeras nuplaunamas DMF, apsauginė grupė atskeliama 20% piperidinu/DMF ir polimeras vėl nuplaunamas MeOH/CH2Cl2, bei CH2C12 ir išdžiovinamas. Peptidas yra atskeliamas nuo polimero TFA:CH2C12 1:1, perfiltruojamas (0.45 n) ir filtratas išdžiovinamas šaldant. Tolimesniam gryninimui nevalytas peptidas iš-tirpinamas vandenyje ir nukreipiamas preparatyvinei HPLC (aukšto slėgio skystinė chromatografija Beckman'o Ultrasferos ODS kolonėlėje ir tirpalas A 0.1% T FA vandenyje, B 0.1% -TFA/MeCN: H20 40:60. Grynas peptidas (>95%) gaunamas po surinktų frakcijų, kuriose yra homogeniško peptido, išdžiovinimo šaldant.
1. Peptidinio junginio darinys, sudarytas iš vien-grandžio hemoreguliacinio peptido, kurie negalinės ami-norūgšties Ca atomas yra pakeistas grupe -A ir prie minėto Ca atomo nėra natyvios -šoninės grandinės, kur A'-A yra grupė CRARA -Z,kurioje kiekvienas RA nepriklausomai yra vandenilio atomas arba -Rf", -0RA", -SR*", -NRa"ra", -CONRA"RA" arba-COORa grupė;Ra yra vandenilio atomas arba Ra grupė;Ra yra alkilas, cikloalkilas, alkanoilas, hidroksi-alkilas, anido grupė arba karbociklinė ar heterociklinė grupė;Z yra grupė -0RP, ~NR°RC, -CR R"'Rf arba pakeistas arba nepakeistas, aromatinis arba nearomatinis, karbociklinis arba heterociklinis žiedas, kicoks nei nepakeistas fenilas;kur kiekviena RB yra linijinės arba šakotos grandinės, prisotinta arba neprisotinta angliavandenilio grupė, tokia kaip alkilo, aralkilo arba arilo grupė, pasirinktinai pakeista viena ar daugiau RA grupėmis, kur RA yra tokia, kaip nurodyta aukščiau, ir i kurią pasirinktinai įterptas vienas arba daugiau -N-, -0- ar -S-heteroatomų;R C yra vandenilio atomas arba R B grupė;R D yra vandenilio atomas arba R F grupė;Re yra vandenilio atomas arba RF rgupė, arba kartu su R°grupe sudaro
2. Peptidinis junginys pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad -A yra -CH2-Z,kurioje Z yra pakeistas arba nepakeistas, aromatinis arba nearomatinis, karbociklinis arba heterociklinis žiedas, kitoks nei nepakeistas fenilas.
3. Peptidinis junginys pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad Z yra benzilo, indolilo, hidroksifenilo, imidazolilo, naftilo, tienilo, piridinilo, furanilo, izoksazolilo, 3,5-dimetilizoksazolilo arba cikloheksilo grupė.
4. Peptidinis junginys pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad -A yra grupė -CH2-Z,kurioje Z yra grupė -0R B (kur R B yra tokia, kaip nurodyta 1 punkte) arba -CHRDRF;Rd yra vandenilio atomas arba grupė -CH3;Rf yra alkilo grupė, pasirinktinai pakeista hidroksilo, amino ar azido grupėmis; arbaR° ir Rf kartu sudaro alkilidino grupę.
5. Peptidinis junginys pagal bet kuri, iš 1-4 punktų, besiskiriantis tuo, kad minėtas viengrandis hemoreguliacinis peptidas yra aprašomas I formule
6. Peptidiniai junginiai pagal 5 punktą, besiskiriantys tuo, kad aprašomi II formule
5 punkte.t
7. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad ją sudaro peptidinis junginys pagal bet kuri, iš 1-5 punktų ir farmacinis nešiklis arba užpildas.
8. Peptidinis junginys pagai bet kurį iš 1-5 punktų, skirtas naudoti mielopoezės arba kaulų čiulpų rege-neracijos inhibicijai.
9. Peptidinio junginio pagal bet kurį iš 1-5 punktų gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kada) bis-laktimo eterį metalina ir po to alkilina, gaudami bis-laktimo dipeptido eterį;b) vykdo a) stadijos bis-laktimo dipeptido eterio hid-rolizę, gaudami NH2-CH (A) -COOH formulės aminorūgšti,, kur A yra kaip nurodyta bet kuriame iš 1-4 punktų;c) likusias aminorūgštis įveda i, peptidinę grandinę; ird) vykdo bet kurios apsaugotos grupės deblokavimą.
a) bis-laktimo eterį metalina ir po to alkilina, gaudami bis-laktimo dipeptido eterį;b) vykdo a) stadijos bis-laktimo dipeptido eterio hid-rolizę, gaudami NH2-CH (A) -COOH formulės aminorūgšti,, kur A yra kaip nurodyta bet kuriame iš 1-4 punktų;c) likusias aminorūgštis įveda i, peptidinę grandinę; ird) vykdo bet kurios apsaugotos grupės deblokavimą. 10. Aminorūgšties darinys pagal formulę