[LT] Nustatyta, kad pentapeptidai ir jų dariniai, įskaitant darinius, turinčius vieną ar daugiau papildomų aminorūgščių, įvestų į seką ir/arba prijungtų C- arba N-gale, pasižymi dideliu efektyvumu inhibuojant kamieninių ląstelių proliferaciją.@Be to, atskleidžiamos naujų peptidų grupės, pasižyminčios pagerintu ir/arba specifiškai nukreiptu inhibuojančiu poveikiu.
[EN]
[0001] Išradimas skirtas pritaikymui peptidų pasižyminčių inhibuojančiu veikimu į ląstelių proliferazę ir naujiems peptidams, pasižymintiems specifiniu ir/arba bendru inhibuojančiu poveikiu.
[0002] Daugelis tyrimų nukreipti pieno liaukų ląstelių, kurių struktūra ir funkcijos pasižymi didele įvairove, vys-tymosi ir diferencijacijos mechanizmų nustatymui.
[0003] Žinoma, kad nuolat kintančių ląstelių sistemos mecha-nizmas paprastai apima rezervą polipotentinių kamie-ninių ląstelių, kurios dalosi' ir pastoviai tiekia nau-jas ląsteles i, sistemą. Tuo tarpu pradžioje homogeninės kamieninės ląstelės, tiekiamos iš "rezervo", greitai įgauna vieną ar kitą morfologiją ir to pasekoje tampa reikiamomis funkcinėmis ląstelėmis.
[0004] Tokių kamieninių ląstelių sistemų pavyzdžiai apima kau-lų čiulpų hemopoetinę (kraujodaros) sistemą ir epite-linę bei epiderminę sistemas.
[0005] Yra žinoma, kad ribotos bendros formulės peptidai gali inhibuoti hemopoezę (kraujo susidarymą) (žiūrėti EP-A-0112656), o tuo tarpu nežymiai išplėstos bendros formulės dimerinių peptidų, surištų disulfidiniais tilteliai, grupė gali stimuliuoti hemopoezę (žiūrėti W0 088/03535). Vienok, abiem atvejais nepastebėta jokio poveikio kitoms sistemoms, išskyrus hemopoezę.
[0006] Šiuo metu netikėtai rasta, kad peptidų klasė, įskaitant kai kuriuos peptidus, atskleistus EP-A-01126256, gali inhibuoti ląstelių proliferaciją ir, kad nežymi amino-rūgščių sekos modifikacija ir/arba esminių grupių blo-kavimas šoninėje grandinėje, gali nukreipti peptidų po-veikį specifinėms sistemoms.
[0007] Mūsų duomenys remiasi pastebėjimu, kad tam tikros pen-tapeptidinės sekos, atskleistos aukščiau nurodytuose patentų paraiškų aprašymuose, randamos tam tikruose, vadinamuose G-baltymuose, būtent Gai baltymuose. G baltymai buvo aptikti vidinėje ląstelių membranų pusėje ir jie užtikrina būtiną ryši, tarp transmem-braninių recep-torių ir efektorių, išsidėsčiusių apie G baltymus ląs-telės viduje. Priklausomai nuo efektorių, su kuriais jie surišti, jie dalyvauja daugelyje ląstelių funkcijų. Jie susideda iš trijų susijusių subvienetų a, P ir y, be to, a subvienetas dalyvauja aktyvuojant kaimynini, efektorių. G baltymai skiriasi pagal jų funkciją ir G baltymų subklasė yra pradžioje rasti baltymai, inhi-buojantys adenilatciklazę. Šie duomenys leidžia laikyti aplamai peptidus epitelinių ir epiderminių sistemų proliferacijos ir ląstelių sistemų inhibitoriais.
[0008] Tokiu būdu, išradime siūlome naudoti jungini,, kurio formulė (I):
[0009] „b
[0010] R yra
[0011] T->C
[0012] R yra
[0013]
[0014] nd
[0015] R yra
[0016]
[0017] T-, e
[0018] R yra
[0019]
[0020] kuriose n ir m nepriklausomai yra 0 arba 1;
[0021] p ir q nepriklausomai yra 1 arba 2;
[0022] R 1 i. r R 2 abu yra anglies atomai arba kartu sudaro okso grupę;
[0023] R 3 ir R 4 abu yra vandenilio atomai arba kartu sudaro anglis-anglis jungti,;
[0024] R5 yra vandenilis arba acilo grupė;
[0025] R6 ir R7 nepriklausomai yra hidroksilo grupė arba amino grupė;
[0026] R g yra vandenilis, C2-6 alkilo grupė;
[0027] C7-20 Yra aralkilo grupė, kuri gali turėti vieną arba daugiau hidroksilo, amino arba metoksi pakaitų arba metaboliškai labilią S-apsauginę grupę;
[0028] R yra vandenilis arba metilo grupė;
[0029] R10 yra hidroksilo arba amino grupė, aminorūgšties glutamino liekana arba peptidas, turintis glutamino grandį N-gale, išskyrus alaniną, kuris gali būti D arba L formos, ir gliciną, visos nurodytos aminorūgščių liekanos yra L-formos) gaunant vaistinę medžiagą nehe-mopoetinės ląstelės proliferacijos inhibavimui.
[0030] Tais atvejais, kai dalyvauja R5 grupė, apsauganti N-galą, ji gali būti, kaip nurodyta aukščiau, acilo grupe, turinčia 1-20 anglies atomų, pavyzdžiui, žemesniojo alkanoilo grupe, turinčia 1-5 anglies atomus, tokia kaip acetilo grupė, turinti 7-20 anglies atomus, tokia kaip benzoilo arba fenilacetilo grupė.
[0031] R5 taip pat gali būti acilo grupė, gauta iš amino-rūgšties arba peptidinės grandinės. Pavyzdžiui, R5 gali būti acilo grupė, gauta iš serino arba bet kurio iš
[0032] peptidų, gautų iš aminorūgščių eilės pašalinus vieną po kitos sekančias N-galines aminorūgštis:
[0033] Žemiau smulkiai išaiškinta, kad aukščiau užrašytos eilės arba jos dalies peptidai yra aukšto homologijos laipsnio Gai baltymams, kurie, kaip žinoma, kontroliuoja ląstelės funkcijų skaičių, įskaitant augimo inhibavimą. (I) bendros formulės peptido galinė grupė geriau ap-saugoma, pavyzdžiui, acilinant alkanoilo, aralkanoilo arba aroilo grupe.
[0034] Tais atvejais, kai R g yra C2-6 alkilo grupė, tai gali būti, pavyzdžiui, etilo, butilo arba heksilo grupe. Kai R yra aralkilo grupė, paprastai ji gali būti aril-metilo grupe, tokia kaip benzilo, difenilmetilo arba trifenilmetilo. Tais atvejais, kai R yra metaboliškai labili grupė, ji gali būti, pavyzdžiui, ariltiogrupe, turinčia 5-10 anglies atomus, pavyzdžiui, piridiltio grupė arba acilo grupė, kaip nurodyta aukščiau.
[0035] Geriau, kai išradimo junginiai yra pentapeptidai, tai yra n yra geriau O.
[0036] Geriau, kai ciklinės grupės Ra liekanoje yra penkia-narės, tai yra m yra geriau O.
[0037] Išradimo pentapeptidų savybės inhibuojant didelio ląs-telių skaičiaus proliferaciją kartu su hemopoetine sistema arba netgi be hemopoetinės sistemos yra vertingos medicinai, pavyzdžiui, žvynelinės atveju, kai reikia paveikti ypač didelę ląstelių proliferaciją, pvz. pso-riazės atveju arba kai pageidautina vėžio terapija, kai reikia pažeisti atskirą ląstelių populiaciją. Daugelis ląstelių tipų ypač jautrūs citotoksinėms vaistinėms medžiagoms arba švitinimui, naudojamam priešvėžinėje terapijoje, ir, taikant vieną žinomą metodiką, naudojamas vaistinis preparatas, inhibuojantis hemopetinės sistemos ląstelių proliferaciją priešvėžinės terapijos metu, po to atstatant normalią proliferaciją, kai inhi-buojančios vaistinės medžiagos veikimas baigiasi. Ma-tyt, duoto išradimo peptidų biologinis gyvavimo puspe-riodis yra atitinkamai trumpas tokiai terapijai. Ana-logiškai, pasirinktų ląstelių, jautrių vėžinei terapijai, populiacijos proliferacija gali būti inhibuojama kartu su vėžinėmis ląstelėmis ir priešvėžinė terapija iniciuojama tik tada, kai vėžinės ląstelės pasiekia jautrią proliferacijos fazę, tuo metu, kai normalios ląstelės yra mažiau jautrioje fazėje.
[0038] Gali būti toks ląstelių proliferacijos tipas, kai kaulų čiulpų ląstelės, fagocitai arba granulocitai stimuliuo-jami CSF vaistiniais preparatais terapijos metu. Ląs-telių augimo inhibavimas gali atstatyti normalų tokių ląstelių augimo greiti,.
[0039] Esant daugeliui autoimuninių susirgimų, subjektas ga-mina leukocitus, veikiančius prieš jų pačių medžiagą. Inhibuojant leukocitinę funkciją, bent tam tikram lai-kui tokios autoimuninės reakcijos gali būti žymiai sumažintos.
[0040] Įjungiant i, Gai baltimini, tarpląstelini, signalini, me-chanizmą, kitos funkcijos, kontroliuojamos Gai baltymų, gali būti modifikuojamos aktyvių peptidų pagalba, pa-vyzdžiui, ląstelės judrumas kalcio metabolizmo procese ir citoplazminiai ląsteliniai procesai medijuojami Gai baltymu.
[0041] Tokiu būdu išradimas taip pat skirtas naujiems po-lipeptidams, kurių pilnos arba dalinės sekos yra iš es-mės homologiškos Gai baltymams, aprašytiems aukščiau, būtent Lys-Ile-Ile-His-Glu-Asp-Gly-Tyr-Ser-Ra-Rb-Rc-Rd-Re-Rf-Glu-Tyr arba jų daliai arba nedidelėms jų variacijoms, tokioms kaip polipeptidai, aprašyti Ann. Rev. Biochem. _56, pp. 624-625 (1987) ir Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8J5, pp. 3066-3070 (1988) . Tokios sekos geriau turi bent vieną Tyr liekaną, kuri padeda mar-kiruoti polipeptidą. Kaip nurodyta žemiau, NH2 N-gale geriau apsaugomas, pavyzdžiui, N-acilinimu. Ten, kur aminorūgšties liekana N-gale turi būti Glu, tokioje ho-mologinėje sekoje ją galima geriau pakeisti p - Glu.
[0042] Tokius polipeptidus reikėtų pažymėti (Ia) formule ir juos galima apibūdinti, kaip> (I) formulės junginius, kur R5 yra acilo grupė, gauta iš serino amino rūgšties liekanos arba peptidinės grandinės, kurioje serino grandis yra C-gale, ir/arba R10 yra glutamino amino-rūgšties arba peptido, turinčio glutamino grandį N-ga-le, liekana. Geriau jei jie turi sumoje iki 12 amino-rūgščių liekanų, dar geriau 10 arba mažiau.
[0043] Bendrai, geriau, kai NH2 bet kurios prijungtos pepti-dinės sekos N-gale būtų apsaugota, pavyzdžiui, acilinant. Tai padeda išvengti fermentatyvinės peptido de-gradacijos. Daugelį iš Ra liekanų, galimų (I) formu-lėje, neįmanoma sujungti i, aminorūgščių seką be deblo-kavimo arba analogiško pavertimo liekanomis, turin-čiomis laisvą NH2 grupę. Tokiu būdu, ten, kur R5 yra acilo grupė, kitą, nei acilo grupė, gautą iš amino-rūgšties arba peptido, būtina deacilinti. Analogiškai, ten, kur R 1 ir R 2 kartu sudaro okso grupę, kaip p-Glu grandyse, būtina paversti atitinkama atviros grandinės liekana, tokia kaip Glu arba Gln.
[0044] Tokiu būdu, išradime pritaikomas peptidų poveikis ci-toplazminiams ląsteliniams procesams, medijuojamiems Gai baltymu.
[0045] Tik junginiai, aprašyti mūsų ankstesnio EP Nr. 112656 aprašyme, anksčiau buvo aprašyti, kaip tinkami medici-noje. Visi kiti (I) formulės junginiai, kaip nurodyta anksčiau, yra arba nauji, arba buvo aprašyti tik kaip tarpiniai junginiai. Todėl, pagal kitą išradimo požymį, mes siūlome (I) formulės junginius, apibūdintus aukš-čiau, išskyrus
[0046]
[0047] Kai kurie peptidai, išrinkti iš aukščiau minėtos (I) formulės, yra nauji ir, kaip nustatyta, pasižymi rei-kiamų savybių kombinacijomis. Tokiu būdu, pagal vieną iš išradimo aspektų, mes siūlome junginius, kurių for-mulė :
[0048] Rasta, kad junginiai, turintys blokuotas šio tipo cisteino liekanas, pasižymi žymiai didesniu stabilumu in vivo ir efektyvumu, inhibuojant ląstelių proliferaciją.
[0049] Gali būti gauti aukščiau minėtų benzil-cisteino jun-ginių analogai, kur fenil-pakeitimas yra mažiau labi-lus, be to, tokie junginiai turi fenilalanino liekaną, vietoje cisteino liekanos 4-padėtyje.
[0050] Tokiu būdu sekančiu išradimo aspektu mes siūlome junginius, kurių formulė:
[0051] Atvirkščiai, taip pat galima gauti peptidus su meta-boliškai labilia blokuojančia grupe, kad galima būtų lėtai atpalaiduoti neblokuotą peptidą in vivo. Tokiu būdu, sekančiu išradimo aspektu mes siūlome junginius, kurių formulė:
[0052] kurioje Ra, Rb, Rc, Re ir n yra pažymėti (I) formulėje, R 12 yra metaboliškai labili grupė, pavyzdžiui, 2-piridiltio grupė, o visos aminorūgštys yra chiralinės formos, nustatytos (I) formulei.
[0053] junginys, kuris pasižymi sulėtintu inhibuojančiu poveikiu hemopoezei, pasireiškiančiu po 3 dienų in vivo, palyginus su 1 diena neblokuotam analogui.
[0054] Leukocitinės funkcijos inhibavimas (įskaitant imuninę sistemą) kartu su hemopoeze gali būti pasiekiamas lengvai modifikuojant aminorūgšties seką, pavyzdžiui, pa-keičiant Glu2 i, Gly2. Tokiu būdu, sekančiu išradimo aspektu mes siūlome junginius, kurių formulė:
[0055]
[0056] o pastarasis, kaip rasta, inhibuodamas hemopoezę, pa-pildomai inhibuoja granulocitų ir makrofagų migraciją in vivo (suformuojant jūros kiaulyčių odoje langą ir stimuliuojant BCG vietiniu būdu) ir absorbuoja granu-locitais staphylococcus aureus in vitro (išmatuota ci-tometriškai sraute) .
[0057] Peptidų grupė, kuri nepasižymi inhibuojančiu poveikiu hemopoezei, o inhibuoja epideminę ir epitelinę ląstelių proliferazę, gali būti gaunama pakeičiant 4 padėtyje cisteino liekana. Tokių išradimo junginių formulė:
[0058] Šie junginiai ypač tinka inhibuojant nehemopoetinę ląs-telių proliferaciją, veikiant piktybines hemopoetines ląsteles selektyviu citostatiniu būdu, o taip pat slopinant piktybines epidermines ir epitelines ląs-teles, kurios atsiranda, pavyzdžiui, progresuojančiais žvynelinės karcinomos ir psoriazės atvejais.
[0059] Pagaliau, pagal išradimą peptidus galima naudoti "tai-kiniu" kitoms molekulėms, surišant molekules su pep-tidine grandine.
[0060] (a) junginius terapiniam naudojimui, diagnostikai ir analizei, įskaitant radioizotopą arba pažymėtą radio-izotopu ligandą, tiesiogiai ar netiesiogiai kovalen-tiškai sujungtą su išradimo peptidu, (c) junginius diagnostikai ir analizei, įskaitant fluorochromini, ligandą, kovalentiškai sujungtą su išra-dimo peptidu.
[0061] Bendrai, norint išryškinti apsaugini, poveiki, cito-toksinių vaistinių medžiagų fone, išradimo peptidai gali būti įvedami žmogui injekcijoms 1-10 mg dozės ribose, pavyzdžiui, 4-5 mg 70 kg kūno svorio per dieną. Naudojant infuzini, būdą arba panašias metodikas, dozė gali būti 30-300 mg diapazone 70 kg kūno svorio, pa-vyzdžiui, apie 100 mg šešių dienų bėgyje. Aplamai, pa-geidaujama peptido koncentracija yra apytiksliai 10~n - 10 7M neląsteliniame paciento skystyje.
[0062] Bendrai, taikant kombinuotą terapiją su citotoksiniais vaistiniais preparatais, tokiais kaip citozin-arabi-nozidas, reikia kruopščiai chronometruoti, užtikrinant mielopoetinės sistemos apsaugojimą, kol dar veikia citotoksinis vaistinis preparatas.
[0063] Pagal dar vieną išradimo tikslą sukuriama farmacinė kompozicija, apimanti iš (Ia), (II), (III) , (IV), (V) arba (VI) formulės jungini, arba fiziologiškai tinkamų jo druskų su farmaciniu nešikliu arba užpildu. Išradimo kompozicijos gali būti formoje, kuri, pavyzdžiui, tinkama peroraliniam, nazaliniam, parenteriniam ar rek-taliniam įvedimui.
[0064] Naudojamas terminas "farmacinis" apima išradimo taikymą veterinarijoje.
[0065] Išradimo junginiai gali būti įprastose farmakologinėse formose, tokiose kaip tabletės, padengtos tabletės, aerozoliai nosiai, tirpalai, emulsijos, milteliai, kap-sulės arba prailginto veikimo formos. Šių formų gavimui gali būti naudojami įprasti farmaciniai užpildai, o taip pat įprasti gavimo būdai.. Tabletės gali būti gaunamos, pavyzdžiui, sumaišant aktyvų ingredientą arba ingredientus su žinomais užpildais, tokiais kaip, pa-vyzdžiui, skiedikliai, tokie kaip kalcio karbonatas, kalcio fosfatas arba laktozė, dezintegruojančiomis me-džiagomis, tokiomis kaip kukurūzų krakmolas arba algino rūgštis, surišikliais, tokiais kaip krakmolas arba že-latina, tepalais, tokiais kaip magnio stearatas arba talkas, ir/arba medžiagomis prailginto veikimo formai, tokiomis kaip karboksipolimetilenas, karboksimetilce-liuliozė, celiuliozės ftalatacetatas arba polivinil-acetatas.
[0066] Jeigu reikia, tabletės gali būti kelių sluoksnių. Padengtos tabletės gali būti gaunamos, padengiant bran-duolį, gautą tabletėms įprastu būdu medžiagomis, paprastai naudojamomis tablečių padengimui, pavyzdžiui, polivinilpirolidonu arba šelaku, arabiškais sakais, titano dioksidu arba cukrumi. Norint gauti prailginto veikimo efektą arba išvengti nesuderinamumo, branduolys taip pat gali būti kelių sluoksnių. Padengta tabletė taip pat gali būti kelių sluoksnių tam, kad būtų gautas prailgintas išskyrimas, ir tuo atveju gali būti naudojami užpildai, minėti aukščiau tabletėms.
[0067] Tirpalai injekcijoms gali būti gauti įprastu būdu, pa-vyzdžiui, pridedant konservuojančių medžiagų, tokių kaip p-hidroksibenzoatai, arba stabilizatoriai, tokie kaip EDTA. Po to tirpalais užpildomi mėgintuvėliai arba ampulės injekcijoms. Prailgintas injekcijų išskyrimas gali būti užtikrinamas taip vadinamais minisiurbliais.
[0068] Aerozoliai nosiai gali būti sukomponuojami analogiškai vandeniniame tirpale ir įpakuojami konteineriuose iš-purškimui arba su priemone aerozoliniam išpurškimui, arba su priemone rankiniam suspaudimui. Kapsulės su vienu ar keliais aktyviais ingredientais gali būti gaunamos, pavyzdžiui, sumaišant aktyvius ingredientus su inertiškais nešikliais, tokiais kaip laktozė arba sorbitas ir užpildant mase želatinines kapsules.
[0069] Tinkamos žvakutės gali, pavyzdžiui, būti gaunamos, su-maišant aktyvų ingredientą arba kombinuojant aktyvų ingredientą su įprastais nešikliais tam tikslui, tokiais kaip natūralūs riebalai arba polietilenglikolis arba jų dariniai.
[0070] Vienkartinėse šio išradimo junginių dozėse yra geriau, kai yra 1-10 mg, pavyzdžiui, 4-5 mg peptido.
[0071] Išradimo peptidai gali būti sintetinami bet kuriuo patogiu būdu. Paprastai, šoninių grandinių chemiškai aktyvios grupės (amino, tiolo ir/arba karboksilo) turi būti apsaugomos sąveikos reakcijos metu visos sintezės eigoje, bet galima palikti kelias neapsaugotas grupes atšakose (hidroksilo grupes, imidazolo grupes, pirmines amidines grupes, amidines grupes ciklinėse amino-rūgštyse, kaip piro Glu) visos sintezės eigoje.
[0072] Tokiu būdu, galutinė stadija turi būti pilnai apsaugoto ar dalinai apsaugoto (I) bendros formulės peptido darinio deprotekcij a (apsaugos pašalinimas) ir šie budai nagrinėjami toliau.
[0073] Peptidinių grandinių didinimą iš principo galima pradėti arba nuo C-galo, arba nuo N-galo, nors paprastai naudojama metodika, kai didinimas pradedamas nuo C-galo.
[0074] Tokiu būdu, galima pradėti nuo C-galo, reaguojant tin-kamam apsaugomam dariniui, pavyzdžiui, lizinui, su tin-kamu apsaugotu cisteino dariniu. Lizino darinys turi turėti laisvą a-amino grupę, tuo tarpu kitas reaktantas turi turėti arba laisvą, arba aktyvuotą karboksilo grupę ir apsaugotą amino grupę. Po sąveikos tarpinis junginys gali būti išvalomas, pavyzdžiui, chromatogra-fiškai, o po to selektyviai pašalinama N-apsauga, kad galėtų prisijungti kita N-apsaugota ir laisva arba ak-tyvuota aminorūgšties liekana. Ši procedūra tęsiasi tol, kol susidaro reikiama aminorūgščių seka.
[0075] Pakaitai, aktyvuojantys karboninę rūgštį, kuriuos, pa-vyzdžiui, galima naudoti, apima simetrinius ir mišrius anhidridus arba aktyvuotus esterius, tokius kaip, pa-vyzdžiui, p-nitrofenilesterįf 2,4,5-trichlorfenilo este-rį, N-hidroksibenzotriazolo esteri, (OBt) , N-hidroksi-sukcinimidilo esteri, (0S4) arba pentafluormetilo esteri,
[0076] Laisvų amino ir karboksilinių grupių sąveika gali vykti, pavyzdžiui, dalyvaujant dicikloheksilkarbodiimi-dui (DCK). Gali būti naudojama kita jungianti medžiaga, pavyzdžiui, N-etoksikarbonil-2-etoksi-l, 2-dihidrochino-linas (EEDCH).
[0077] Paprastai patogu sąveikos reakcijas vykdyti žemose temperatūrose, pavyzdžiui, -20°C - aplinkos temperatū-roje, tinkamame tirpiklyje, pavyzdžiui, tetrahidrofu-rane, dioksane, dimetilformamide, metilenchloride arba tų tirpiklių mišinyje.
[0078] Ypač patogu sintetinti ant kietafazinio polimerinio pa-grindo. Vienas tinkamiausių pagrindų tipų yra chlor-metilintas polistirenas (susiūtas su 1 % divinilben-zeno), tuo atveju sintezė prasidės nuo C-galo, pavyz-džiui, sujungiant N-apsaugotą liziną su pagrindu.
[0079] Eilė tinkamų kietafazinių metodikų aprašyta Eric Atherton, Christopher I. Logan, and Robert C. Sheppard, J. Chem. Soc. Perkin I 538-46 (1981); James P. Tam, Foe S. Tjoeng, and R.B., Merrifield J. Am. Chem. Soc. 102, 6117-27 (1980); James P. Tam, Richard D. Dimarchi and R. B. Merrifield Int. J. Peptide Protein Res _16 412-25
[0080] (1980); Manfred Mutter and Dieter Bellof, Helvetica Actą 67 2009-16 (1984).
[0081] Žinomas platus aminorūgščių apsauginių grupių pasi-rinkimas ir jos iliustruojamos Schroder, E., and Lūbke, K., The Peptides, Vols. 1 and 2, Academic Press, New York and London, 1965 and 1966; Pettit, G. R., Synthetic Peptides, Vols. 1-4 Van Nostrand, Reinhold, New York 1970, 1971, 1975 and 1976; Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Synthese von Peptiden, Band 15, Georg Thieme Verlag Stuttgart, NY, 1983; The Peptides, Analysis, Synthesis, biology 1-7, Ed: Erhard Gross, Jojannes Meienhofer, Academic Press, NY, San Fransisco, London; Solid phase peptide sintesis 2nd ect., John M. Stewaet, Janis D. Youg, Pierce Chemical Company.
[0082] Tokiu būdu, pavyzdžiui, grupės, kurios gali būti nau-dojamos amino apsaugojimui, apima apsaugines grupes, tokias kaip karbobenzoksi (Z-), t-butoksikarbonilo (Bok-), 4-metoksi-2,3,6- trimetilbenzensulfonilo (Mtr-), ir 9-fluormetilfenoksi-karbonilo (F moc-). Reikia turėti omenyje, kad, kai peptidas pradedamas nuo C-galo, grupė, apsauganti aminą, turi būti prie kiek-vienos pridedamos naujos liekanos a- amino grupės ir turi būti selektyviai pašalinama iki kitos prijungimo stadijos. Viena iš labiausiai tinkamų tokiam laikinam amino apsaugojimui yra Fmoc grupė, kuri gali būti selektyviai pašalinama, veikiant piperidinu organiniame tirpiklyje.
[0083] Grupės, kurias galima panaudoti karboksilo apsaugojimui, apima lengvai skylančias esterių grupes, tokias kaip benzilo (- 0BZ1), p- nitrobenzilo (- ONB) arba t-butilo (- tOBu), o taip pat sąveiką su kietais pag-rindais, pavyzdžiui, metilo grupėmis, sujungtomis su polistirenu.
[0084] Tiolą apsaugančios grupės apima p- metoksibenzilą ( MOB), tritilą ( Trt) ir acetamidometilą ( Acm).
[0085] Reikia turėti omenyje, kad egzistuoja daug kitų tokių grupių, pavyzdžiui, smulkiai aprašytų aukščiau minėtoje literatūroje, ir visų tokių grupių naudojimas čia ir anksčiau aprašytuose būduose, yra duoto išradimo apim-ties ribose.
[0086] Egzistuoja daugybė metodikų amino ir karboksilo ap-sauginių grupių pašalinimui. Tačiau, jos turi būti de-rinamos su naudojama sintetinimo strategija. Apsauginės grupės atšakose turi būti stabilios tomis sąlygomis, kai pašalinamas laikinai a- aminą apsaugančios grupės iki kitos prijungimo stadijos.
[0087] Aminą apsaugančios grupės, tokios kaip Boc, ir karbok-silą apsaugančios grupės, tokios kaip tOBu, gali būti pašalinamos kartu, veikiant rūgštimi, pavyzdžiui, trifluoracto rūgštimi.
[0088] Tiolą apsaugančios grupės, tokios kaip Trt, gali būti selektyviai pašalinamos, naudojant oksiduojančią me-džiagą, tokią kaip jodas.
[0089] Cisteinas, turintis peptidų, gali būti sintetinamas tekste aprašytais metodais, pašalinant visas apsaugines grupes, įskaitant tiolą apsaugančias grupes paskutinėje sintezės stadijoje.
[0090] Sekantys pavyzdžiai pateikti iliustravimo tikslu.
[0091] Tirpikliai buvo pakartotinai nudistiliuoti iš komer-cinės medžiagos ir buvo laikomi tokiu būdu: dimetil-formamidas ( DMF) virš 4A molekulinio sieto, dichlor-metanas ( DCHM) virš CaCl2, trietilaminas ( TEA) virš Na/ Pb lydinio ( Baker) ir trifluoracto rūgštis ( TFK) virš 4A molekulinio sieto.
[0092] S3: silicio dioksidas RP 8/ 0 1% TFA 5% EtOH ( vand.)
[0093] Išvalyti galutiniai produktai analizuojami grįžtamos fazės labai efektyvia skysta chromatografija ( HPLC). HPLC sistema susideda iš HP 1090M chromatografo su įstatytu automatiniu mėginių surinkikliu ir HP 1040 diodų masyvu ( Hewlett- Packard, Waldbronn, FRG), ir kolonėlės supelcosil LC- 18 ( 250X4, 6 mm, 6 m dalelės). Pavyzdžiai ištirpinami 0, 1% ( tūris/ tūris) TFR ( vand.) ir išplaunami linijiniu 0- 30% acetonitrilo 0, 1% TFR ( vand.) gradientu. Srauto greitis 2 ml/ min. Eliuentas stebimas 214 nm, esant 4 nm linijos pločiui. Tirpiklio chromatograma atskaitoma elektronikos pagalba, o rezul-tatai pateikiami procentiniais ploto vienetais.
[0094] Cistinas, turintis peptidų, oksiduojamas perskrūzdžių rūgštimi, pakeičiant rūgščią cistino liekaną rūgščia stabilia cisteino rūgštimi, be to, vykdant 16 valandų rūgštinę hidrolizę 6M HC1 110°C temperatūroje. Po to sausi hidrolizatai pakeičiami naudojant fenilizocianatą ir analizuojami, kaip aprašyta Heinrikson (Anai. Bioch. 136, 65-74, 1984) metodikoje. • 1 pavyzdys L- piroglutamil- L- glubamil- L- aspartil- L- cisteinil- L-lizinas:
[0095] ( a) t- Bok-( S- p- metoksibenzil)- L- cisteinil-( E- benziloksikarbonil)- L- lizino benzilo esteris ( I)
[0096] E - benziloksikarbonillizino benzilo esterio hidrochlo-ridas ištirpinamas 3 ml DMF ir TEA dedamas tol, kol laisvas TEA bus aptinkamas garų fazėje popieriniu pH indikatoriumi. Į ši, tirpalą pridedama 491 mg t-Bok- (s-p-metoksi-benzil)-L-cistein-N-hidroksisukcinimido esterio, ištirpinto 3 ml DMF. Silpna šarminė terpė pa-laikoma, pridedant atitinkamais laiko intervalais TEA porcijas. Mišinys paliekamas nakčiai kambario tempe-ratūroje, patikrinama, ar ninhidrininė reakcija neigiama, po to mišiniu užkraunama 2,5x75 cm kolonėlė su Sephadex LH-20, supusiausvyrinta DMF ir kalibruota standartiniais reagentais (pavyzdžiui, duotame pavyz-dyje t-Bok-(y-benzil)-L-glutamino rūgštis-p-nitrofenilo esteris ir p-nitrofenolis). Srautas kolonėlėje palaikomas gravitaciniu tekėjimu ir išbėgantis srautas analizuojamas, esant 280 nm, kol surenkamos frakcijos apytiksliai po 10 ml. Produktas gali būti identifi-kuojamas kiekvieną frakciją tiriant plonasluoksnės chromatografijos metodu {p.s.ch.), be to surenkamos atitinkamos frakcijos ir vakuumuojamos, išeiga: 700 mg (100%) riebalinio, homogeniško produkto (p.s.ch., chlo-roformas/acetonas) (9/1), Rf=0,64.
[0097] ( b) t- Bok- ( p- benzil)- L- aspartil-( S- p- metoksibenzil)- L-cisteinil- ( E- benziloksikarbonil)- L- licino benzilo esteris ( II)
[0098] 700 mg blokuoto ir apsaugoto dipeptido (I) ištirpinama 25 ml bevandenio DChM ir pridedama 25 ml bevandenės TFR. Rūgštis ir tirpiklis pašalinami vakuume po 30 mi-nučių. Liekana ištirpinama DChM ir vėl išgarinama. Tirpalo likutis DMF (3 ml) lengvai pašarminamas TEA, pridedamas (488 mg) t-Bok-( P-benzil)-aspargino rūgšties p-nitrofenilo esterio tirpalas 3 ml DMF. Šarmingumas daž-nai tikrinamas ir palaikomas, pridedant nedidelius TEA kiekius. Kai inhidridinė reakcija tampa neigiama (apytiksliai po 2 valandų), reakcijos mišiniu užkraunama kolonėlę su Sephadex LH-20 (2,5x75 cm) ir išvaloma aukščiau aprašytu būdu. Vakuumuojama gaunant 900 mg (100%) kristalinio, homogeninio produkto (p.s.ch., chloroformas/acetonas (9/1)), Rf=0,70.
[0099] ( c) t- Bok- ( y- benzil) - L- glutamin- ( P- benzil) - L- aspartil-( S- p- metomsibensil)- L- cisteinil-( E- benziloksikarbonil)-L- lizino benzilo esteris ( III)
[0100] 900 mg blokuoto II tripeptidino darinio deblokuojama TFR aukščiau aprašytu būdu, ištirpinama 3 ml DMF ir lengvai pašarminama TEA. Į šį tirpalą pridedama 504 mg t-Bok- (y-benzil)-L-glutamino rūgšties p-nitrofenilo esterio (3 ml DMF). Po 2,5 valandos ninhidrininė reak-
[0101] cija tampa neigiama ir mišinys išvalomas per kolonėlę su Sephadex LH-20 anksčiau aprašytu būdu. Šio reakcijos mišinio komponentų išskyrimas ir kontroliavimas p.s.ch. gali būti vykdomas aukščiau aprašytu būdu. Surenkamos atitinkamos frakcijos (9-15 šiuo atveju), išgarinamos ir išdžiovinamos. Išeiga: 1140 mg (100%) šviesiai geltonos, homogeniškos alyvos (p.s.ch., chloro-formas/acetonas (9/1)), Rf=0,53.
[0102] ( d) Benziloksikarbonil- L- piroglutamil- ( y- benzil- L- glutamil-( p- benzil)- L- aspartil-( S- p- metoksibenzil)- L- cisteinil-( E- benzil- oksikarbonil)- L- licino benzilo esteris ( IV) .
[0103] 1140 mg III tetrapeptidinio darinio deblokuojama TFR DChM-e pagal I dariniui aprašytą metodiką ir ištir-pinama 3 ml DMF. Tirpalas lengvai pašarminamas TEA ir pridedama 423 mg benziloksikarbonil-L-piroglutamino rūgšties p-nitrofenilo esterio tirpalo 3 ml DMF. Reakcijos mišinio šarminimas pastoviai tikrinamas ir, jei reikia, pridedama TEA. Po apytiksliai 3 valandų gau-namas neigiamas ninhidrininis testas ir IV pentopep-tidinis darinys išvlomas aukščiau aprašytu būdu.
[0104] Išeiga 1230 mg (96%) vos vos geltonos homogeninės alyvos (p.s.ch., chloroformas/acetonas (9/1)), Rf=0,44 (su galine frakcija).
[0105] ( e) L- piroglutamil- L- glutamil- L- aspartil- L- cisteinil- L-lizinas
[0106] 50 mg apsaugoto IV pentapeptidinio darinio ištirpinama 50 ml skysto fluoro vandenilio 0°C temperatūroje, pridedant 500 mg metionino akceptoriaus ir paliekama 1 va-landai . Po to fluoro vandenilis sausai išgarinamas vakuume 0°C temperatūroje ir liekana sumaišoma su etil-acetatu. Etilacetatinė dalis nupilama. Likusi medžiaga ištirpinama praskiestoje acto rūgštyje ir liofi-lizuoj ama.
[0107] Liofilizuota medžiaga (2 mg) gali būti išvaloma grįž-tamos fązės HPLC, naudojant C 18-kolonėlę 10 mm x 10 cm, esant 2,8 ml/min srauto greičiui, išplaunant tirpalo A:0,1% vandeninio trifluoracto rūgšties tirpalo ir tirpalo B:0,1% trifluoracto rūgšties tirpalo acetonit-rile gradientu, be to, 0,10% B tirpalas pridedamas 30 minučių bėgyje. Nustatoma, absorbuojant 214 nm ult-raviolete ir naudojant piridindisulfidini, reagentą (SH-grupėms).
[0108] Kitų peptidų eilė gali būti sintetinama pagal 1 Pa-vyzdžiui aprašytą metodiką. Jie identifikuoti ir api-būdinti toliau pateikiamoje lentelėje.
[0109] Peptidas sintetinamas LKB Biolynx 4170 pilnai automa-tiniame peptidų sintezatoriuje, tikrinant 304 nm UV. Laikina N-apsaugine grupe ir UV indikatoriumi naudojamas Fmoc. C-galo aminorūgštis sujungiama su polimeru rūgščiu labiliu indikatoriumi anm.
[0110]
[0111] Pilnai apsaugotas pentapeptidas pagaliau praplaunamas, polimeras pašalinamas etilo eteriu ir džiovinamas ore. Peptidas pilnai deblokuojamas ir atskiriamas nuo po-limero viena operacija 1 valandą apdirbant 95% van-deniniu TFR. Filtruojama, praplaunama TFR ir išgari-nama, o galutinis peptidas išvalomas RP 8 kolonėlėje ir išplaunamas etanoliu 0,1% TFR.
[0112] Grynumas: Daugiau, negu 92% (HPLC RP18, 214 nm)
[0113] Aminorūgščių analizė: patenkinamai.
1. (I) formulės junginiai, turintys bendrą formulę (I)
2. (I) formulės junginiai pagal 1 punktą, išskyrus
3. (I) formulės junginiai, nurodyti 1 punkte, besiskiriantys tuo, kad R5 yra serino aminorūgšties arba peptido, turinčio seriną C-gale, liekana ir/arba R10 yra glutamino aminorūgšties arba peptido, turinčio N-gale glutaminą, liekana.
4. Junginiai, kurių formulė (II):
5. Junginiai, kurių formulė (III)
6. Junginiai, kurių formulė (IV):
7. Junginiai, kurių formulė (V):
8. Junginiai, kurių formulė (VI):
9. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad i, ją įeina bent vienas junginys pagal bet kuri, iš 3 - 8 punktų arba jo fiziologiškai tinkama druska su farmaciniu nešikliu arba užpildu.
10. Junginio pagal 3-8 punktus gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad gauna pilnai arba dalinai apsaugotą nurodyto junginio darini,, o po to ji, de-blokuoja .
11. Junginiai, nurodyti 1 punkte, skirti panaudoti žmo-gaus arba gyvūno nehemopoetinės ląstelių proliferacijos slopinimui.
12. Junginys pagal bet kuri, iš 3-6 punktų, skirtas panaudoti žmogaus arba gyvūno ląstelių proliferacijos ir/arba leukocitinės funkcijos slopinimui.
13. Junginys pagal 7 punktą, skirtas žmogaus arba gy-vūno ląstelių proliferacijos ir/arba leukocitinės funkcijos slopinimui.
14. Junginys pagal 8 punktą, skirtas panaudoti žmogaus arba gyvūno epiderminės ir/ arba epitelinės ląstelių proliferacijos slopinimui.