[LT] Aprašomas preproinsulinių aminorūgščių grandinės specifinis hidrolizės būdas, panaudojant klostripaną, susidarant atitinkamiems intermediatams.Šie intermeditai, esant reikalui, paverčiami į atitinkamus insulinus, panaudojant karboksipeptidazę B.
[EN]
[0001] A grandinės, kuri sudaryta iš 21 aminorūgšties liekanos, ir B grandinės, kuri sudaryta iš 30 aminorūgščių liekanų. A ir B grandinės sujungtos tarpusavyje dviem disulfidiniais tilteliais - cisteino liekanos A7 ir B7 padėtyse, bei A20 ir BĮ9 padėtyse sujungtos viena su kita. Trečias disulfidinis tiltelis yra tarp A6 ir Ali. Gyvulių ir žmogaus insulinai susidaro kasoje preproinsulinų formoje. Pavyzdžiui, žmogaus preproinsulinas susideda iš 24 aminorūgščių liekanas turinčio prepeptido, prie kurio prisijungia proinsulinas, turintis 86 aminorūgščių liekanas. Jo struktūra yra:
[0002] kur C yra grandinė, susidedanti iš 31 aminorūgšties liekanos. Išskiriant iš kasos salelių (Langergenso salelių), prepeptidas atskyla ir susidaro proinsulinas. Galų gale proteolitiškai suskyla C grandinė ir susidaro veiklus žmogaus insulinas.
[0003] Genų technologijos metodai vis didėjančiais kiekiais leidžia pagaminti preproinsulinus mikroorganizmuose (EP Nr. A 347781, EP Nr. A 367163). Presekos skaldymas, kaip taisyklė, atliekamas chemiškai ir/arba fermentiniu būdu (DE Nr. P-3440988, EP Nr. A024250) . Žinomi fermentiniai metodai yra paremti skaldymu, veikiant tripsinui ir karboksipeptidazei B (Kemmler W ir kt.) . Biol. Chem. 24, 678-791 (1971), EP Nr. A 95691, EP Nr. B 89007). Šių metodų trūkumas yra tas, kad susidaro dideli pašalinių produktų kiekiai, kuriuos labai sunku atskirti iš reakcijos tirpalo. Ypatingai paverčiant žmogaus preproinsuliną į žmogaus insuliną
[0004] (Humaninsulin, HI), gaunamas didelis kiekis Des-Thr (B30) - žmogaus insulino (Des-Thr (B30)-HI). Šis pašalinis produktas nuo HI skiriasi tik tuo, kad HI
[0005] nėra galinės aminorūgšties, ir jis labai sunkiai atskiriamas iš reakcijos tirpalo.
[0006] Norint sumažinti šio pašalinio produkto susidarymą, gali būti pridedama tam tikrų sunkiųjų metalų, kaip skaldymo priedų, būtent nikelio (EP Nr. A 0264250). Tačiau tokia reakcijos eiga stambiatonažinės gamybos požiūriu yra nepageidautina, nes labai užteršiami sunkiaisiais metalais nutekamieji vandenys. Todėl reikia sukurti specifinį ir ekologiškai tinkamą preproinsulino skaldymo metodą.
[0007] Klostripanas (klostriopeptidazė B, EC 3.4.22.8) fermentas, išskiriamas iš Clostridium histolyticum kultūros terpės, kurio molekulinis svoris yra apytikriai nuo 30 000 iki 80 000, pasižymi tiek proteolitiniu, tiek ir amidaz-esteraziniu aktyvumu (Mitchell, W.M., Harringtom, W.F., J. Biol. Chem., 243 (18), 4688-4692 (1968)).
[0008] Jis išsiskiria dideliu specifiškumu Arg-Gly jungčių atžvilgiu. Pavyzdžiui, izoliuotos insulino B grandinės Arg-Gly jungti, klostripanas skaldo 500 kartų greičiau, negu Lys-Ala jungti,, o gliukagone skaldomos tik Arg-Arg, Arg-Ala ir Lys-Tyr jungtys. Šių jungčių hidrolizės greičių santykiai yra 1/7 ir 1/300 (Labouesse, b., Bull. Soc. Chim. Biol., 42, 1293 (1960)).
[0009] Netikėtai buvo rasta, kad klostripanas specifiškai skaldo preproinsuliną nuo C-galo už arginino, o aminorūgščių grandinės, esančios už arginino (B22), esančio B-grandinėje, skaldymo nepastebėta.
[0010] Taigi, išradimas priskiriamas preproinsulino, kurio formulė (I)
[0011] R1 yra n aminorūgščių, kur n yra sveikas skaičius ir
[0012] R yra vandenilis, chemiškai arba fermentiniu būdu atskeliama aminorūgštis arba peptidas, sudarytas iš 2-10 aminorūgščių liekanų,
[0013] R3 yra oksigrupė, aminorūgštis arba peptidas,
[0014] X yra L-argininas arba peptidas, sudarytas iš 2-45 aminorūgščių liekanų, kurio C-gale arba N-gale yra L-arginino radikalas,
[0015] A1-A20 arba B2-B29 yra gamtinė arba pakeista,
[0016] pakeičiant vieną arba keletą aminorūgščių, žmogaus arba gyvulio insulino aminorūgščių seka,
[0017] aminorūgščių grandinės hidrolizės būdui, kuris skiriasi tuo, kad preproinsulinas hidrolizuojamas, esant klostripanui, ir šiomis sąlygomis paverčiamas insulinu karboksipeptidazės B pagalba.
[0018] Peptidų ir proteinų aminorūgščių seka nurodoma nuo aminorūgščių grandinės N-galo. Proteazės hidrolizuoja peptidinę jungti, tarp peptidų arba proteinų aminorūgščių. Klostripanas hidrolizuoja peptidus arba proteinus, turinčius L-argininą esanti, už arginino. Preproinsulino hidrolizės reakcijos produktas yra insulino dariniai arba polipeptidai, kurie C-gale turi arginino grupę, arba aminorūgštys.
[0019] Gamtinėmis aminorūgštimis vadinamos aminorūgštys, pavyzdžiui, Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro, Hyp, Trp, Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit arba His.
[0020] Genetiškai koduojamomis aminorūgštimis laikomos aminorūgštys, pavyzdžiui, Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro arba selenocisteinas.
[0021] Tinkamiausi yra (I) formulės preproinsulinai, kuriuose R1 yra fenilalaninas (Phe),
[0022] R yra vandenilis, gamtinė am norūgštis arba peptidas, sudarytas iš 2-30 gamtinių aminorūgščių, kurio C-gale yra L-argininas,
[0023] R3 yra oksigrupė, gamtinė aminorūgštis arba peptidas,
[0024] X yra L-argininas arba žmogaus arba gyvulio proinsulino C-grandinė,
[0025] Z yra aminorugštis iš Asn, Gln, Asp, Glu, Gly, Ser,
[0026] A1-A20 arba B2-B29 yra žmogaus arba gyvulio insulino
[0027] Ypatingai tinkami yra (I) formulės preproinsulinai, kuriuose
[0028] R2 yra vandenilis arba peptidas, sudarytas iš 2-30 gamtinių aminorūgščių, kurio C-gale yra L-argininas,
[0029] R3 yra oksigrupė, gamtinė aminorugštis arba peptidas,
[0030] X yra L-argininas arba žmogaus, kiaulės arba
[0031] A1-A20 arba B2-B29 yra žmogaus, kiaulės arba raguočių
[0032] Be to, tinkami yra insulinai, kurie buvo siūlyti Vokietijos patentų paraiškose Nr. P 39 19 852 ir Nr. P 40 12 818 0. Pavyzdžiui, InsuArg, kuris turi tokią aminorūgščių seką: H2N-Asp Thr Thr Vai Ser Glu Pro Asp Pro Asn Ser Asn Gly Arg Phe Vai Asn Glu His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Vai Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn-COOH
[0033] Klostripanas (EC 3.4.22.8) - tai ekstraceliuliarinė tiolproteazė iš klostridijų (Clostridien). Fermentas yra heterodimeras ir nėra kitų žinomų tiolproteazių homologas. Jis yra ypatingai specifiškas jungčių Arg-XXX, ypač Arg-Pro, atžvilgiu. Fermentas charakteri-zuojamas molekuliniu svoriu nuo 30 000 iki 80 000 ir izoelektriniu tašku, pH nuo 4,8 iki 4,9. Kaip aktyvatoriai veikia, pavyzdžiui, cisteinas, merkaptoetanolis, ditiotreitolis arba kalcio jonai.
[0034] Esant, pavyzdžiui, tozil-L-lizin-chlormetilketonui, vandenilio peroksidui, EDTA, Co2+, Cu2+, Cd2+ jonams arba citratui, klostripanas inhibuoj amas.
[0035] Klostripanas gaminamas iš mikroorganizmų fermentacijos būdu. Šiame gavimo būde klostridijos (Clostridien) kultivuojamos tol, kol maitinančioje terpėje susikaupia klostripanas. Tinkamos yra, pavyzdžiui, Clostridium histoliticum, būtent Clostridium histoliticum DSM 627. Taip pat tinkami yra minėtų mikroorganizmų mutantai ir variantai, jeigu jie sintezuoja klostripaną.
[0036] Auginama anaerobinėse sąlygose individualiai arba mišrioje kultūroje, pavyzdžiui, panardinus nejudrioje kultūroje, nesant deguonies, arba fermentatoriuose azoto, inertinių dujų arba kitų dujų atmosferoje, išskyrus deguonį. Fermentacija atliekama nuo 10 iki 45°C, geriausia apytikriai nuo 25 iki 40°C, ypač nuo 30 iki 38°C temperatūrų intervale. Fermentacija vyksta pH srityje nuo 5 iki 8,5, geriausia nuo 5,5 iki 8.
[0037] Šiomis sąlygomis kultūriniame buljone po maždaug 1-3 dienų susikaupia pastebimas fermento kiekis. Klostripano sintezė prasideda vėlyvoje log- fazėje ir pasiekia maksimumą standartinėje augimo fazėje. Fermento pasigaminimą galima kontroliuoti, panaudojant aktyvumo testą ( Mitchell, W., Meth. Enzymol., vol. 47, p. 165- 170, 1977).
[0038] Klostripano gavimui naudojamame maitinančiame tirpale yra nuo 0, 2 iki 6%, geriausia nuo 0, 5 iki 3%, organinių azoto junginių bei neorganinių druskų. Organiniais azoto junginiais gali būti: aminorūgštys, peptonai bei mėsos ekstraktai, sumaltos sėklos, pavyzdžiui, kuku-rūzų, kviečių, pupų, sojos arba medvilnės, alkoholio gamybos distiliacijos atliekos, mėsos miltai arba mielių ekstraktai. Kaip neorganinės druskos maiti-nančiame tirpale gali būti pavyzdžiui, šarminių arba žemės šarminių metalų, geležies, cinko ir mangano chloridai, karbonatai, sulfatai arba fosfatai, o taip pat ir amonio druskos bei nitratai.
[0039] Optimalios fermentacijos sąlygos kiekvienam mikro-organizmui nors ir skiriasi, tačiau jos yra arba žinomos tyrinėtojui, arba gali būti lengvai parenkamos, panaudojant paruošiamųjų bandymų duomenis. Klostripanas gali būti valomas klasikiniais metodais, pavyzdžiui, nusodinimu ( NH4) 2S04, jonitinės arba gel- skvarbos chromatografijos metodais. Fermentų sujungimas gali būti atliktas pagal žinomus metodus ( Colowick ir Kaplan, Meth. Enzymol., vol. XLIV).
[0040] Fermentinėje reakcijoje gali būti naudojamos tiek sveikos ląstelės laisvoje arba imobilizuotoje formoje, o taip pat ir išskirtas fermentinis produktas, kuris taip pat gali būti " surištas" su nešikliu ( pagrindu). (I) formulės preproinsulino skaldymas, panaudojant klostripaną, yra atliekamas vandeninėje terpėje, i, kurią gali būti pridėta besimaišančių su vandeniu organinių komponenčių, kaip pavyzdžiui, alkoholių, ketonų, šlapalo, N,N-dimetilformamido. Tarp kitko, norint geriau kontroliuoti pH, i, pradini, reakcijos mišinį gali būti pridedama atitinkamų organinių arba neorganinių buferių, tokių kaip fosfatas, Tris, glicinas, HEPES ir kt. Preproinsulino koncentracija skaldymo mišinyje yra, pavyzdžiui, 0,01 mg/ml ir 100 mg/ml intervale, geriausia nuo 0,1 mg/ml iki 10 mg/ml. Preproinsulino santykis su klostripanu (mg: aktyvumo vienetai (U)) yra nuo 1:0,01 iki 1:1000, geriausia nuo 1:0,1 iki 1:50.
[0041] Reakcijos terpės rūgštingumas gali kisti nuo pH 4 iki pH 12, ypatingai tinkama yra sritis nuo pH 6 iki pH 9.
[0042] Laikas, reikalingas suskaldyti preproinsulinui iki atitinkamo intermediato, gali kisti priklausomai nuo reakcijos sąlygų plačiose ribose, pavyzdžiui, nuo 15 minučių iki 48 valandų, geriausia reakciją vykdyti nuo 1 iki 6 valandų.
[0043] Prieš naudojant fermentą, jis atitinkamai aktyvuojamas, esant merkaptanui. Merkaptanais laikomi iš esmės visi junginiai, kurie turi SH-grupes; geriausiai tinka DTT, DTE, merkaptoetanolis, tioglikolinė rūgštis arba cisteinas. Merkaptanų koncentracija gali kisti plačiose ribose; geriausiai tinka koncentracijos nuo 0,1 mM iki 100 mM. Toliau, aktyvuojančiame buferyje yra Ca24" jonai, geriausia CaCl2. Aktyvacija vykdoma, esant pH reikšmėms nuo 4 iki 12, geriau nuo pH 6 iki pH 8, ypatingai tinkamos ribos yra nuo pH 7 iki pH 8. pH palaikymui gali būti pridedama buferinių medžiagų, pavyzdžiui, Tris HEPES, glicino ir kt. Aktyvacijos temperatūra gali būti nuo 0°C iki 60°C, geriau nuo 0°C iki 10°C, ypatingai tinkamas intervalas yra nuo 0°C iki 5°C. Taip aktyvuotas fermentas gali būti naudojamas tiesiogiai, arba duotose sąlygose iš jo pašalinamas aktyvuoj antis buferis, panaudojant chromatografiją per Ultrogelį AcA 202 (®Ultrogel AcA 202) .
[0044] Skaldant (I) formulės preproinsuliną išradime aprašomu būdu, gaunami insulino dariniai, turintys insulino C-gale arginino liekanas, ir atitinkamos atskeltos aminorūgštys ir/arba peptidai. Esant reikalui, insulino darinius galima paversti i, atitinkamus insulinus, panaudojant karboksipeptidazę B. Karboksipeptidazę B galima pridėti i, tą patį pradini, reakcijos mišinį kartu su klostripanu, arba aukščiau minėtomis reakcijos sąlygomis galima juos pridėti vienas po kito; be to, insulino darinys minėtomis sąlygomis, prieš pridedant karboksipeptidazę, gali būti išskirtas žinomais metodais, tokiais kaip, pavyzdžiui, chromatografija arba kristalizacija. Karboksipeptidazę B galima naudoti ištirpintoje arba imobilizuotoje formoje. Karboksi-peptidazės B ir insulino darinio santykis (pagal svorį) yra apytikriai nuo 1:10 iki 1:5000, geriausia apie 1:500 iki 1:3500 ir ypatingai tinkamas yra apytikriai nuo 1:1000 iki 1:3000.
[0045] Karboksipeptidazės B ir klostripano santykis (pagal svorį) yra apytikriai nuo 1:1 iki 10:1, geriausia nuo 2:1 iki 5:1.
[0046] Klostripano ir/arba karboksipeptidazės B skaldymo reakcijos produktai gali, pavyzdžiui, būti nusodinami, sumažinus pH reikšmę, ir/arba išskiriami ir išvalomi, panaudojant žinomus kolonėlių chromatografijos metodus. Taip gautas insulinas gali būti paruošiamas naudojimui įprastomis formomis ir panaudojamas kaip vaistai, gydant diabetą.
[0047] Toliau duodamose pavyzdžiuose iš dalies aprašomas išradime siūlomas būdas. Jeigu atskirai nepaminėta, duodami % yra svorio %.
[0048] Clostridium histoliticum DSM 627 kultivavimas buvo atliktas -tirpale, kuriame yra:
[0049] Predkultūra (pirminė kultūra) užkrečiama 1% mikro-organizmų. Kultivuojama uždarame inde anaerobinėmis sąlygomis 37°C temperatūroje 2 dienas. Mikroorganizmų štamai išlaikomi aukščiau minėtame maitinimo tirpale, turinčiame 50% glicerino, -20°C temperatūroje. Fermentatoriuje įskiepijama predkultūra (1%). Įskiepijamo (užkrečiamo) maitinančio tirpalo kiekis fermentatoriuje buvo nuo 10 iki 8 1. Kultivavimas atliekamas, įsotinant azotu, 33°C temperatūroje 24 valandas, esant pastoviam pH 7,0. Kultūrinio skysčio išmatuotas fermentinis aktyvumas sudarė 20 000 U/l (Mitchell W., Meth. Enzymol., 47 t., p. 165-170, 1977).
[0050] Gautas skystis buvo apdorojamas centrifūguoj ant ląsteles esant 6000 g, steriliai filtruojant per filtrą, kurio porų dydis buvo 0,22 |im, ir pridedant 60%-nio ledinio (-20°C) metilo alkoholio \ filtratą. Tirpalas išlaikytas 24 valandas -20°C temperatūroje ir vėl centrifūguoj amas (8000 g) . Nuosėdos tirpinamos sterilioje terpėje ir vėl centrifūguojama ( 12 000 g) . Fermentinis aktyvumas, išmatuotas nuosėdose, buvo 300 U/ ml, 200 U/ baltymo mg. Išeiga sudarė 75% išmatuoto fermentatoriuje aktyvumo.
[0051] Ląstelės buvo praskiestos, kaip aprašyta 1 pavyzdyje.
[0052]
[0053] ir buvo įskiepyta ( užkrėta) 2% predkultūros. Klostripano aktyvumas kultūriniame skystyje buvo 45 000 U/ ml.
[0054] Gautas skystis buvo apdirbamas, filtruojant per 0, 3 įim membranas ( Filtron Omega Membran) , norint atskirti ląsteles, ir filtruojant tangentinio srauto ( Tangential- Flow) sistemoje per 10 KD membranas, norint sukoncentruoti ištirpusį klostripaną. Sukoncentravimo koeficientas buvo 20. Po to, iš koncentrato buvo pašalintos druskos ir chromatografuojama per DEAE-celiuliozę. Klostripano aktyvumas nuo 1000 U/ ml, išeiga 85%. Preparatas iki panaudojimo buvo laikomas - 20°C temperatūroje.
[0055] 50 (il fermentinio preparato (200 U/ml, 286 U/mg) iš
[0056]
[0057] - Skaldymo reakcijai atlikti fermentas praskiedžiamas 1:40 25 mM Tris/HCl buferiu, pH 7,8. B. Skaldymo, norint išskirti (B31) Arg-insuliną, klostripano pradinis mišinys
[0058] Inkubuojama 1-2 valandas 28°C temperatūroje, reakciją
[0059] galima lengvai kontroliuoti aukšto slėgio skystinės chromatografijos (HPLC) pagalba, po to nutraukti, panaudojant tozil-L-lizinchlormetilketoną (TLCK)
[0060] Rezultatas:žmogaus insulinas-Arg. Pagal HPLC duomenis,
[0061] C. Skaldymo, norint išskirti žmogaus insuliną, karboksipeptidazės B pradinis mišinys
[0062] 200 Įil skaldymui skirto klostripano pradinio mišinio, 10 Įil karboksipeptidazės B (praskiedimas 1:100)
[0063] - Karboksipeptidazės kiekis pradiniame mišinyje: 2,5 mg/m
[0064] Inkubuojama 2-4 valandas 28°C temperatūroje; reakciją
[0065] lengvai galima kontroliuoti HPLC chromatografijos pagalba
[0066] - Karboksipeptidazė B (759 U/ml, 150 U/mg iš kiaulės kasos), skirta reakcijai, praskiedžiama 1:1000 25 mM Tris/HCl buferiu, pH 7,8. Rezultatas: žmogaus insulinas. Medžiaga "insulinas(DesB30)" pagal HPLC duomenis nesusidaro. D. HPLC-analizė
[0067] Skilimo kontrolei buvo naudojama kolonėlė RP 18 (0,125 M (NH„)2S04, su H2SO< nustatomas pH4, 25-50% acetonitrilo gradientas) arba kolonėlė Ce (0,1% TFA, 20-50% acetonitrilo gradientas).
[0068] Pradinis mišinys: 35,7 mg žmogaus pre-B-grandis-A-grandis-insulin-sulfonato
[0069] 315 Įil 1 M merkaptoetanolio 105 fil 1 M askorbino rūgšties
[0070] 100 ml 20 mM glicino buferio, pH 10,7. 200 įj.1 skaldymui skirto klostripano pradinio mišinio, 10 |il karboksipeptidazės B (praskiedimas 1:100) - Karboksipeptidazės B kiekis pradiniame mišinyje:
[0071] Inkubuojama 2-4 valandas 28°C temperatūroje; reakciją
[0072] - Karboksipeptidazė B (759 U/ml, 150 U/ml, iš kiaulės kasos) praskiedžiama 1:1000 25 mM Tris/HCl buferiu, pH 7,8. Rezultatas: žmogaus insulinas. Medžiaga "insulinas (DesB30)", pagal HPLC duomenis, nesusidaro.
[0073] HPLC-analizė
[0074] Skilimo kontrolei buvo naudojama kolonėlė RP 18 (0,125 M (NH4)2S04, su H2S04 nustatomas pH4, 25-50% acetonitrilo gradientas) arba kolonėlė C8 (0,1% TFA, 20-50% acetonitrilo gradientas).
[0075] Pradinis mišinys: 35,7 mg žmogaus pre-B-grandis-A-grandis-insulin-sulfonato 315 1 1 M merkaptoetanolio 105 1 1 M askorbino rūgšties 100 ml 20 mM glicino buferio, pH 10,7
[0076] Pradinio mišinio susiformavimas buvo vykdomas per nakti, šaldytuve, 4°C temperatūroje, išeiga 0,152 mg/ml. Priemaišos atskiriamos, sumažinant pH reikšmę iki 5,0, po to pridedama Tris iki galutinės koncentracijos 50 mM ir su HC1 nureguliuo j ama pH reikšmė lygi 7,8. Po to buvo pridėta 30 įj.1 fermento tirpalo. Skaldymas atliekamas 30°C temperatūroje ir kontroliuojamas HPLC chromatografijos pagalba.
[0077] Rezultatas: aukščiau minėtas preproinsulinas suskyla iki žmogaus insulino Arg. Susidaro minimalus kiekis insulino (DesB30).
1. Insulino gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad atlieka preproinsulino, kurio formulė ( I) :
2. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad naudoja ( I) formulės preproinsuliną, kuriame R1 yra fenilas ( Phe),R yra vandenilis, gamtinė aminorūgštis arbapeptidas, sudarytas iš 2- 30 gamtinių aminorūgščių, kurio C- gale yra L- argininas,R3 yra oksigrupė, gamtinė aminorūgštis arba peptidas,sudarytas iš 2- 10 gamtinių aminorūgščių,X yra L- argininas arba žmogaus arba gyvulioproinsulino C- grandinė,Y yra aminorūgštis iš Thr, Ala arba Ser grupės,Z yra aminorūgštis iš Asn, Gly, Asp, Glu, Gln, Ser,Thr, Ala arba Met grupės,A1- A20 arba B2- B29 yra žmogaus arba gyvulio insulinoaminorūgščių seka.
3. Būdas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad naudoja ( I) formulės insulinus, kuriuoseR1 yra fenilas ( Phe), R 2 yra vandenili,s arba peptidas, sudarytas iš 2-30 aminorūgščių, kurio C-gale yra L-argininas,R3 yra oksigrupė, gamtinė aminorūgštis arba peptidas,sudarytas iš 2-10 gamtinių aminorūgščių,X yra L-argininas, arba žmogaus, kiaulės arba karvėsproinsulino C-grandinė,Y yra Thr,Z yra Asn,A1-A20 arba B2-B29 yra žmogaus, kiaulės arba karvėsinsulino aminorūgščių seka.
4. Būdas pagal vieną arba keletą iš 1-3 punktų, besiskiriantis tuo, kad skaldymą atlieka, esant pH reikšmės nuo 4 iki 12, geriausia nuo 6 iki 9.
5. Būdas pagal vieną arba keletą iš 1-4 punktų, besiskiriantis tuo, kad (I) formulės preproinsulino koncentracija yra nuo 0,01 mg/ml iki 100 mg/ml, geriausia nuo 0,1 mg/ml iki 10 mg/ml.
6. Būdas pagal vieną arba keletą iš 1-5 punktų, besiskiriantis tuo, kad preproinsulino ir klostripano santykis (mg ir aktyvumo vienetų santykis) yra nuo 1:0,01 iki 1:1000, geriausia nuo 1:0,1 iki 1:50.
7. Būdas pagal vieną arba keletą iš 1-6 punktų, besiskiriantis tuo, kad reakcijos temperatūra yra nuo 0°C iki +80°C, geriausia nuo +20°C iki +40°C.
8. Būdas pagal vieną arba keletą iš 1-7 punktų, besiskiriantis tuo, kad karboksipeptizė B dalyvauja kartu arba panaudojama po skaldymo klostripanu.
9. Būdas pagal vieną keletą iš 1-8 punktų, besiskiriantis tuo, kad klostripanas ir/arba karboksipeptidazė B naudojami imobilizuotoje formoje.