[LT] Išradimas priklauso biotechnologijos sričiai ir nagrinėja naujų plazmidžių su sintetine DNR seka gavimą, kurios tinka ekspresuoti išankstinės stadijos rscu-PA baltymą (t.y. viengrandinės prourokinazės baltymo neglikozilintą dalį) enterobakterijose, dalinai E.coli, tokiais kiekiais, kurių išeiga žymiai viršija išeigą, pasiekiamą naudojant žinomas plazmides.@Patentuojamu būdu gautų plazmidžių operonas pasižymi reguliuojamu sintetiniu promotoriumi, Šain-Dalgarno seka, startiniu kodonu, sintetiniu struktūriniu genu ir esančiu žemiau struktūrinio geno bent vienu terminatoriumi. Naujos plazmidės irsintetinės DNR sekos gaunamos iš komercinių plazmidžių. Jas naudojant iš dideliu laipsniu ekspresuoto išankstinės stadijos baltymo žinomu būdu grįžtamąja reakcija gaunamas gydymui naudojamas kaip plazminogeno aktyvatoriaus rscu-PA, kuris po to taip pat žinomu kirpimo būdu gali būti panaudotas gaminant dideliais kiekiais dvigrandį neglikozilintą urokinazbaltymą (rtcu-PA).
[EN]
[0001] Išradimas priklauso biotechnologijos sričiai ir gali būti naudojamas naujų plazmidžių su sintetine DNR seka gavimui.
[0002] Gydant užsikimšiusias fibrinu kraujagysles, pvz. šir-dies infarktą, plaučių emboliją, galūnių arterinių
[0003] kraujagyslių susirgimus ir kt., plazminogeno aktyva-toriai vaidina svarbų vaidmenį. Jau penktojo dešimt-mečio pradžioje buvo žinoma, kad plazmonogenas virsta plazminu, t.y. fermentu, kuris sąlygoja fibrino skai-dymą į tirpius polipeptidus ir, tokiu būdu, fibrino są-lygojamų trombų ištirpinimą. Šis plazminogeno aktyvatorius buvo pavadintas urokinaze ir pasirodė, kad iš tikrųjų egzistuoja skirtingos urokinazės formos. Tačiau visos šios formos gaunamos tiesiogiai (betarpiškai) iš vienos molekulės - pirmtako, žinomos maždaug nuo 70-jų
[0004] metų vidurio kaip prourokinazės cimogenas. Tada buvo nustatyta, kad ši prourokinazė pasižymi viengrande struktūra ir ji buvo pavadinta "scu-PA" (viengrandis šlapimo plazminogeno aktyvatorius) . Ši scu-PA sudaryta iš 411 aminorūgščių ir glikozilinta gamtinėje pirminėje formoje iki 302 aminorūgščių.
[0005] Iš įvairių darbų žinomas genotechnologinis baltymo scu-PA, kuris pavadintas kaip "rscu-PA" (rekombinantinis scu-PA) arba turi trivialinį saruplazės pavadinimą, negliozi-lintos dalies gavimas. Naudojant rscu-PA gydymui pasiro-dė, kad stebimas jo veikimas ir suderinamumas viršija naudojamus fibrinolitikus (žr. "Lancet", 1989 m., 863-868 psl.).
[0006] Neglikozilinto plazminogeno aktyvatoriaus rscu-PA gavimui naudoja prokariotus, apie ką liudija kai kurie duo-menys literatūroje. Žinomi scu-PA gavimo būdai pagrįsti struktūrinio geno scu-PA, išskirto iš žmogaus audinių, pasireiškimu. Gaila, tačiau taip pasiekiamas tik ne-žymus ekspresijos laipsnis, kuris neužtikrina šio pro-dūkto gavimo dideliais kiekiais. Taip, pavyzdžiui, ap-rašytas Nibino ir kt ., rscu-PA gavimas iš E. coli duoda ekspresijos laipsni, tik 2 %, kuris išmatuotas nuo bendro bakterijos baltymo kiekio (Agric. Biol. Chem. 52, 1988 m. psl. 329-336). Iš kitos pusės, paraiškoje Europos paten-tui Nr. 92 182 A2, o taip pat (Holmes, W.E., Pennica, D., Blaber, M., Rey M.W., Gūnzler, W.A., Steffens, G.J., Heynecker, H.L.: Biotechnol. 3, 923-929 1985) pasiekiamas ekspresijos laipsnis tiksliai nenurodomas. Ta-čiau tikrinant šiuos duomenis įvairiuose kamienuose buvo gauta mažiaus nei 2 % bakterijos baltymo rscu-PA.
[0007] Daugeliu atveju eukariotinio baltymo ekspresija bakterijose gaunama taip pat ir rscu-PA ląstelėje, kaip de-natūruotas įjungtas kūnas, toliau vadinamas "išankstinės stadijos baltymus", kuris po tarpinio išskyrimo turi būti proteinochemiškai grąžintas į teisingą ketvirtinę rscu-PA struktūrą. Tokiu būdu gautą produktą po to galima pervesti susidariusio rscu-PA kiekio nustatymui, pavyzdžiui, pridedant plazminą, i, dvigrandinę negli-kozilintą urokinazę ("rtcu-PA), kurios aktyvumas nustatytas ir kuri gali būti susidariusio rscu-PA kiekio matu. Galima nustatyti išankstinės baltymo arba rscu-PA išeigą ir, tokiu būdu, ekspresijos laipsni,, pavyzdžiui, viso baltymo galinės elektroforezės densitometrinio įvertinimo pagalba.
[0008] Netikėtai buvo pastebėta, kad bakterijos, transfor-muotos pagal išradimą gautomis plazmidėmis, duoda daug kartų didesnę ekspresiją, nei kamienas šeimininkas, ži-nomais būdais identiškai transformuotas plazmidėmis. Todėl atitinkamai pagal išradimą gautos plazmidės tin-kamesnės baltymo gavimui negu visos iki šiol žinomos rscu-PA plazmidės arba jų išankstinės stadijos. Žinomu būdu aukščiau minėto analitiniams tikslams rscu-PA skaidymo, pavyzdžiui, plazminu, pagalba gali būti gautas taip pat ir rtcu- PA techniniais kiekiais. Dėka pasiūlyto išradimo rscu- PA tapo labai prieinamas.
[0009] Plazmidės, naudojamos gaunant plazminogeno aktyvatorių, gautos atitinkamai pagal išradimą, skiriasi tuo, kad jų operonai turi reguliuojamą sintetini, promotorių, akty-vią, kaip ribosomų surišimo vietą, Šain- Dalgarno seką, startini, kodoną, sintetini, struktūrini, geną scu- Pa- ei-ir priešingai struktūrinio geno atžvilgiu išsidėsčiusi,, bent jau vieną terminatorių. Pirmenybė teikiama vienas paskui kitą einantiems terminatoriams, dalinai kalbant apie trp A terminatorių ir/ arba tet A/ orf L termina-torių iš Tn 10* .
[0010] * ( Schollmeier, K., Gartner, D., Hillen, W. : Nucl. Acids Res. 13, 4227 - 4237 1985).
[0011] Reguliuojamojo promotoriaus atveju kalba eina, dalinai, apie trp- promotorių arba tac- promotorių.
[0012] Kontrolinėje zonoje gautos atitinkamai pagal išradimą plazmidės turi atstumą tarp Šain- Dalgarno sekos ir startinio kodono 6- 12, geriausiai 8- 10, nukleotidų.
[0013] Konstruojant naudojamą naujose plazmidėse struktūrini, geną, įstatomos, geriausiai, užkoduotos atitinkamoms aminorūgštims bazinės sekos, pateiktos sekančioje len-telėje. Be to, struktūriniame gene visi šie skiriamieji požymiai neturi būti išpildyti vienu metu.
[0014] Atitinkamai pagal išradimą atskiroms aminorūgštims struk-tūriniame gene pasirenkant kodoną, o taip pat aukščiau išvardintus kontrolinio geno skiriamuosius požymius, pilnai išvengiama stabilių antrinių struktūrų tarp struktūrinio geno ir kontrolinio regiono susidarymo.
[0015] Sintetinio struktūrinio geno gavimui iš pradžių sinte-zuojami turintys 40-80 bazių vienoje grandinėje oli-gonukleotidai. Juos tikslinga gauti 1 mm/mol masteliu kietų fazių metodu (Adams, S.P., Kavka, K.S., Wykes, E.I., Holder, S.B., Gallupi, G.R.: J. Am. Chem. Soc. 105, 661-663 1983). New Brunswick Scientific Co. firmos "Biosearch 8600" modelio DNR sintezatoriumi. Kaip monomerinis sintomas naudojami esantys pardavime P~ ciano-etildiizopropilamino-fosfoamidai atitinkamiems būtiniems dezoksiribonukleozidams. Atskėlus nešikli, esančios galuose tritil pakeistos grandinės gelfilt-racijos būdu steriliose sąlygose nudruskinamos, o po to dviem stadijomis pirmą kartą atskiriamos atvirkščių fazių didelio efektyvumo skyščių chromatografija
[0016] (HPLC) . Atitinkamas pagrindinis produktas detritili-namas ir po dviejų papildomų atvirkščių fazių HPLC
[0017] valymo stadijų gaunamas labai švarus norimas oligonukleotidas, ką parodo gelelektroforezės analizė (PAGE).
[0018] Iš 4-9 šių atskirų grandinių gauna apie 200 nukleotidų ilgio dvigubų grandinių fragmentus, kad negalinius at-skirus oligonukleotidus 5'-gale fosforilintų ir atitinkamas komplementarias grandines kartu su galiniais oligonukleotidais renatūruotų ir liguotų. Po ligavimo susidarę tinkami klonavimui dvigubi fragmentai po to panaudojami tinkamuose linearizuotuose vektoriuose. Papildomos priemonės išvardintos pateiktuose pavyz-džiuose .
[0019] DE 52 - firmos Watman anioninių mainų kolonėlė
[0020] PAGE - poliakrilamidgelektroforezė
[0021] Tris-HCl - trihidroksimetilaminometano hidrochloridas Tween-80 - polietilenoksido (20) sorbitanmonooleatas
[0022] Konstruojant atitinkamai pagal išradimą naujas plazmides, pirmenybė teikiama esamai pardavimo plazmidei pBR 322 (4363 b.p.). Geriausiai iš pradžių eliminuoti nic/bom sriti, ir/arba tetraciklinui atsparų geną. Be to, nebūtina pilnai pašalinti atsparų tetraciklinui geną, o dažniausiai pakanka, kad plazmidė neperduotų tokiu būdu transformuotam bakterijos kamienui atsparumo tetraciklinui. Šių priemonių (nic/bom srities ir dalies atsparumo tetraciklinui geno pašalinimas) pagalba gaunama taip vadinama "aukšto patikimumo plazmidė".
[0023] Konstruojant naują plazmidę atitinkamai pagal išradimą, remiantis modifikuota kaip buvo minėta aukščiau, plaz-midė pBR 322 (arba kita žinoma anksčiau plazmide), pirmenybė teikiama būdui, kuriame sekanti stadija yra sintetinės multiklonavimo vietos tarp Eco RI ir Hind III kirpimo vietų įstatymas. Ši multiklonavimo vieta (fig. 2) turi nustatytą kirpimo vietų eilę (seką), esančios tarp šių kirpimo vietų bazės yra laisvai pasirinktos, išskyrus sekas tarp Xba I ir Nde I, kurios turi ribosomų surišimo vietas (Šain-Dalgarno seka) iš Xvl-operono 5'-AAGGAG-3' B subtilis*, (Wilhelm, M., Hollenberg, C.P.: Nucl. Acids Res. 13. 5717 - 5722
[0024] (1985), o taip pat nustatytą atstumą tarp Š.D. sekos ir startinio kodono ATG. Einančios po Š.D. sekos bazės GAAAT perneštos iš minėto straipsnio ir surištos su CATATG," Nde I kirpimo vietoje. Tokiu būdu, atstumas tarp Š.D. sekos ir ATG yra 8 bazių poros. Atstumas tarp multiklonavimo vietos atskirų kirpimo vietų pagal klonavimo technologiją turi būti mažiausiai apie 20 nukleotidų, todėl palengvinamas tarpinių fragmentų pašalinimas.
[0025] Šios multiklonavimo vietos pagalba į plazmidę įvedamos kirpimo vietos, kurios, tikslingai įstačius transkripcijos terminatorių, įgalina sėkmingai įstatyti sekančią viena paskui kitą struktūrinio geno scu-PA dalinę seką, geriausiai, prasidedančią norimo baltymo C-galu, t.y. nuo 3'-DNR galo gaunamo struktūrinio geno, o taip pat įstatyti, pavyzdžiui, sintetinį arba taip pat išskirtą iš kitos plazmidės, arba esantį perdavime trp-promo-torių. Fig. 15 pateikta šiuo būdu gauto scu-PA struk-tūrinio geno pilna nukleotidų seka su atskiram kodonui atitinkančiomis aminorūgštimis.
[0026] Iš sukonstruotos, kaip aprašyta išradime, plazmidės ga-li būti gautos kitos naujos plazmidės. Pavyzdžiui, kerpant Eco RI ir Hind III gaunamas sintetinis scu-PA struktūrinis genas su visais reguliavimo vienetais ir po to jis įstatomas i, kitą, į enterobakterijos, dalinai, E. coli, automatiškai besidauginančią plazmidę, kurią po to linearizuoja arba sutrumpina kirpimo Eco RI ir Hind III pagalba. Tokiu būdu, tik naudojant ECo RI ir XBa I kirpimo vietas, gautoje atitinkamai pagal išradimą plazmidėje galima pakeisti taip pat, pavyz-džiui, trp-promotorių tac-promotoriumi (ir atvirkš-čiai) .
[0027] Analogiškai galima naudoti ir kitas žinomas plazmidės, kurios pasižymi vienintele Eco RI ir Hind III kirpimo vieta, pavyzdžiui, pUC 9, pUC 12, pUC 13, pUC 18, pUC 19 ir kt.
[0028] Naujas plazmidės su padidintu atstumu tarp Šain-Dalgarno sekos ir startinio kodono ATG galima gauti atitinkamai pagal išradimą taip, kad sukonstruota, kaip aprašyta aukščiau, plazmidė, kurioje minėtą atstumą, pavyzdžiui, 8 nukleotidų, kerpa Nde I, kuri užpildo gautą kirpimo vietą ir betarpiškai po to sujungia gautus galus, dėl ko susidaro pageidaujama nauja plazmidė, kurioje atstumas tarp Šain-Dalgarno sekos ir startinio kodono yra, pavyzdžiui, 10 nukleotidų.
[0029] Kaip jau buvo minėta, su bakterijomis, transformuotomis plazmidėmis, gautomis pagal išradimą, gali būti pa--siektas daug kartų didesnis ekspresijos laipsnis, negu naudojant žinomas plazmidės. Tinkančių kompetentingų organizmų - šeimininkų transformacija vykdoma žinomu būdu. Gautų pagal išradimą plazmidžių pasireiškimui ypatingai tinkami organizmai - šeimininkai yra E. coli tipo kamienai ir giminingos enterobakterijos, pavyz-džiui, kamienai Pseudomonas, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella arba Serratia.
[0030] Geriausi organizmai - šeimininkai yra E. coli tipo kamienai, pavyzdžiui, E. coli GRT-1 ir dalinai K 12 progrupio E. coli kamienai kaip, pavyzdžiui, E. coli K 12 JM 101 (ATCC 33876) . E. coli K 12 JM 103 (ATCC 39403), E. coli K 12 JM 105 (DSM 4162). E. coli K 12 ATCC 31446 arba E. coli K 12 DH1 (ATCC 33849) .
[0031] Ekspresijos įvedimą d, E. coli ekspresinę sistemą, kuri turi tac-promotorių, galima įvykdyti, pavyzdžiui, pridedant laktozės arba atimant gliukozę, bet geriausiai pridedant izopropil-(3-D-tiogalaktopiranozido. Tačiau, jei plazmidėje yra trp-promotorius, tai indukciją vykdo geriausiai indolakrilacto arba indolakrilpropiono rūgš-timi. Savaime aišku, kad gali būti taip pat panaudoti kiti žinomi induktoriai.
[0032] Po indukcijos pasiekus tam tikrą aukščiau minėtą ląs-telės tanki,, ląstelės atskiriamos centrifūguojant, o nuosėdos po centrifugavimo ir suspendavimo vandeniniame druskų tirpale, sudedamos, pavyzdžiui, i, homogeniza-torių, kuriame ląstelės dėl slėgio skirtumo atsiduria tam tikroje vietoje. Po naujo centrifugavimo nuosėdose gaunamas išankstinės stadijos rscu-PA baltymas kartu su vandenyje netirpstančiomis ląstelių nuolaužomis ir kt. Paveikus guanidino hidrochlorido tirpalu, išankstinės stadijos baltymas pereina i, tirpalą, po naujo centrifugavimo nusistovėjęs tirpalas paveikiamas red-oks sistema (pavyzdžiui, turinčia redukuotą ir oksiduotą glu-tationą), todėl susidaro natūrali konformacija, t.y. susidaro norimas rscu-PA. Tirpioje formoje jis yra reakcijos mišinyje ir paprastomis valymo stadijomis (pavyzdžiui, chromatografija ir tolesniu džiovinimu užšaldant) gali būti išskirtas grynas.
[0033] Analitiniams tikslams tikslinga fermentuoti transfor-muotą reikalinga ištyrimui plazmide E. coli kamieną ir, pasiekus aukščiau minėtą ląstelių suspensijos optimalų tankį, tinkamu induktoriumi indukuoti išankstinės stadijos rscu-PA-baltymo ekspresiją. Pasibaigus atitin-kamam fermentacijos laikui atrenkamos lygios dalys ir i.šcentrifuguotos iš jų ląstelės ištirpinamos lizocime (1 mg lizocirno 50 mmol trihidrochlorido buferio su pH 8,0, 50 mmol etilendiaminotetraacto rūgšties ir 15 % sacharozės) . Lizuotų ląstelių homogenatas soliubili-zuojamas 4-5 mol guanidinhidrochlorido tirpale ir pra-skiedus 1,2 mol guanidinhidrochlorido, pridėjus redu-kuojančios medžiagos (glutationo, merkaptoetanolio arba cisteino) po 2-5 valandų veikiamas atvirkštine reakcija (žr. taip pat Winkler, M.E., Blaber, M.: Biochem. 25, 4041-4045, 1986). Tokiu būdu gautas viengrandis rscu-PA, pridėjus plazmidę, paverčiamas į dvigrandini, rscu-PA, kurio aktyvumas nustatomas substrato S 24 4 4 (piro Glu-Glu-Arg-p-nitroanilidas; Kabi diagnostika, Švedija) pagalba, kuris (substratas) skaidomas tik nuo dvigran-dinės aktyvios urokinazės. Šis rscu-PA aktyvuojamas plazminu 50 mmol tris-buf ery j e, 12 mmol natrio chlorido, 0,02 % tvino-80; prie pH - 7,4 ir 37°C. Rscu-PA ir plazmino santykis turi būti apytikriai 100-1500:1, skaičiuojant moliaringumui, arba 8000-36000:1, skai-čiuojant fermentiniam vienetui. Testuojamą inkubacija atlieka 50 mmol tris-buferyje, 38 mmol natrio chlorido prie pH 8,8, esant 0,36 mml aprotinimo (plazmino stabdymui) ir 0,27 mmol S 2444 prie 37°C. Priklausomai nuo mėginio rscu-PA turinio po 5-60 minučių inkubacijos pridedant 90 % acto rūgšties reakciją sustabdo ir matuoja absorbciją 405 nm ilgio bangoje. Pagal substrato S 2444 gamintojo nurodymus, kai Šios išankstinės stadijos atveju ekstinkcijos pokytis yra 0,05 per minutę ties 405 mm, tai testuojamo tirpalo aktyvumas yra 25 PU/ml.
[0034] Rscu-PA, gautų iš išankstinės stadijos baltymo išeigos įvairiose bakterijose, naudojant pagal išradimą paga-mintas plazmides, pateiktos fig. 10, 12 ir 14.
[0035] Fig. Ia ir Ib. Plazmidės BF 158 konstrukcija iš pardavime esančios pBR 322 plazmidės. Šiuo atveju nuo-sekliai pašalintos nic/bom sritis ir didelė atsparumo tetraciklinui geno dalis. Fig. 2. Sintetinės "multiklonavimo vietos" nukleotidų seka. Fig. 3. Plazmidės pBF 158-01 konstrukcija. Parodytas sintetinės multiklonavimo vietos įvedimas i, pBF 158 plazmidę tarp EcoR I ir Hind III kirpimo vietų. Fig. 4. Plazmidės pBF 158-01T konstrukcija. Cla I x Hind III fragmentą pakeičia atitinkamu fragmentu "T" iš plazmidės pRT 61 (Jorgensen, R.A., Reznikoff, W.S.: J. Bacteriol. 138, 705 - 714, 1979), kurioje yra tetA/orf L terminatorius iš Tn 10 (Schollmeier, K., Gartner, D., Hillen, W. : Nucl. Acids Res..13, 4227 - 4237 1985). Fig. 5a-5g. Sintetinių geno, koduojančio žmogaus scu-PA, fragmentų nukleotidų sekos, jų įvedimas į plazmidę susidarant struktūriniam genui scu-Pa-ei, pagal išra-dimą, aprašytą ld-lf pavyzdžiuose ir pavaizduotą fig. 6, 7, 9, plazmidėje pBF 158-01T. Fig. 6a-6c. Plazmidės pBF 158-02T - pBF 158-06T konstrukcija, įvedant oligonukleotidinį fragmentą M4-M8 pra-dedant plazmide pBF 158-01T, remiantis norimo baltymo C galu (atitinkamai DNR grandinės 3' galo). Fig. la - lc . Plazmidės pBF 158-08T konstrukcija per pa-galbinę konstrukciją plazmidėje pUC 19 (žiūr. fig. lc) . Fig. 8. Sintetinio trp-promotoriaus nukleotidinė seka. Fig. 9. Ekspresinės plazmidės pBF 160, skirtos iš-ankstinės stadijos žmogaus baltymui rscu-PA, konstrukcija. Scu-PA struktūrinis genas pavaizduotas stora juoda linija tarp Nde 1 ir Cla I kirpimo vietų. Fig. 10. Išankstinės stadijos žmogaus baltymo rscu-PA ekspresijos laipsnis (nustatytas kaip rscu-PA aktyvumas pagal grįžtamą reakciją ir aktyvavimą) įvairiuose transformuotuose plazmide pBF 160 (o o) arba plaz-miae pUK 54 trp 207-1 (Holmes, W.E., Pennica, D., Blaber, M., Rey M.W., Gūnzler, W.A., Steffens, G.J., Heynecker, H.L.: biotechnol. 3, 923 - 929, 1985) (A- - -A) E. coli kamienuose, kontroliuojant trp-promotoriui, priklausomai nuo laiko po indukcijos su indolakriline rūgštimi iki nulinio (0) laiko momento. Nurodytas substrato S 2444 pagalba nustatytas tcu-PA-aktyvumas PU/fermentinės terpės mililitrui, kai optinis tankis esant 578 mm ilgio bangai lygus 1. Fig. 11. SDS-PAGE baltymų, gautų iš transformuotų pBF 161 pagalba E. coli K 12 JM 103 ląstelių, densitograma po jų fermentacijos prieš induktoriaus indolakrilinės rūgšties įvedimą (A) ir praėjus 6 valandoms (B). Fig. 12. Išankstinės stadijos žmogaus rscu-PA baltymo ekspresijos laipsnis (nustatytas kaip rtcu-PA aktyvumas po grįžtamos reakcijos ir aktyvavimo) , E. coli K 12 JM 103 ląstelėse, transformuotose pBF 171 pagalba, t.y. kontroliuojant tac-promotoriui. Indukcija buvo vykdoma 0 laiko momentu su izopropil-p-D-tiogalaktopiranozidu. Nurodytas rtcu-PA - aktyvumas nustatytas pagal substra-tą S 2444 PU fermentinės terpės mililitrui, kai optinis tankis esant 578 mm ilgio bangai lygus 1. Fig. 13. Atstumo tarp Š.D. sekos ir startinio kodono ATG padidinimas nuo 8 iki 10 bazių papildant Nde 1 kirpimo vieta ir toliau sujungiant atitinkamus bukus galus . Fig. 14. Išankstinės stadijos žmogaus rscu-PA baltymo ekspresijos laipsnis (nustatytas kaip rscu-PA aktyvumas po grįžtamos reakcijos ir aktyvavimo), kontroliuojant trp-promotoriui E. coli GRT-I bakterijose, transformuotose plazmidžių pBF 161 (o o) arba pBF 163 (A- - -A)pagalba. Indukcija vykdoma indolakriline rūgš-timi betarpiškai po 0 laiko momento. Nurodyti nustatyti substratu S 2444 tcu-PA aktyvumai PU fermentinės terpės mililitrui, kai optinis tankis esant 578 nm bangos ilgiui lygus 1. Fig. 15a ir 15b. Scu-PA-struktūrinio geno pilna nu-kleotidinė seka, nurodant aminorūgštis, atitinkančias atskirą kodoną.
[0036] Reakcijos sistemos, analizuojamos išradimą iliustruo-jančiuose pavyzdžiuose, yra žinomos (žr. pav. Nachr. Chem. Tech. Lb. 35, 939, 1987).
[0037] Kultūrinės terpės, naudojamos pavyzdžiuose klonų selek-cijai, sudėtis (1 litrui): 7,8 g peptono iš žuvies, 7,8 g peptono iš kazeino, 10 g mielių ekstrakto, 5,6 g natrio chlorido, 10 g gliukozės. Ši terpė šilumoje sumaišoma su 10 g/l agaro ir išpilstoma i, lėkšteles.
[0038] Ekspresinės plazmidės pBF 160 išankstinės stadijos rscu-PA baltymui su sintetiniu scu-PA-genu, kontroliuojant trp-promotoriui, konstravimas.
[0039] i) Iš plazmidės pBR 322 (Pharmacia, Nr. 27-4902, 4363 b.p.)
[0040] iškerpama nic/bom sritis, kuri yra tarp 2207 ir 2263 bazių (Winnacker E.L.: "Gene und Klone", VCH Ver-lagsgesellshaft, Weinheim, S. 298, 1985), pašalinama (žr. taip pat fig. 1) pBR 322 prie 2298 bazės su Nde I ir tokiu būdu linearizuojama. Išlindę galai užpildomi "užpildymo reakcija" ir, tokiu būdu, gaunami buki galai (Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J.: "Molecular Cloning", A A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Po to prie 2068 bazės kerpama Pvu II pagalba ir likusios pBR 322 dalies abu buki galai įprastine technika T4-ligazės pagalba vėl liguojami. Betarpiškai po šio ligavimo intarpas atitinkamose E. coli K 12 JM 103 ląstelėse (ATCC 39403) trans-formuojasi (Hanahan I.: "DNA cloning", Vol. 1, ed. D.M. Glover, IRL Press, Oxford, S. 109-135, 1985) . Trans-formuotos ląstelės kultivuojamos terpėje, pridėjus 150 ng/ml ampicilino. Iš gautų klonų atrenkami tokie, kurie turi plazmidę pBF 157, kuri skiriasi nuo pradinės plazmidės pBF 322 228 nukleotidais a) Pst I x BspM II-,
[0041] b) Pst I x Bal I-, C) Pst I x Ava I - fragmentais. Abiejų vienintelių kirpimo vietų Pvu II ir Nde I pBR
[0042] ii) Iš pBF 157 pašalinama didžioji tetraciklino sekos dalis, kerpant EcoRV x Nru I pagalba ir atsiradusius bukus galus toliau liguojant. Po E. coli K 12 JM 103 transformavimo ir kultivavimo terpėje, turinčioje 150 (ig/ml ampicilino, gaunami klonai, iš kurių at-
[0043] renkami tie, kurie turi plazmidę pBF 158. Ji 787 nukleotidais trumpesnė nei pBF 157 ir skiriasi tuo, kad neturi Bam H I kirpimo vietos. Bakterijų kamienų transformacija pBF 158 pagalba nesuteikia joms rezix-tentiškumo tetraciklinui. b) pBF 158-01 konstravimas, sintetinės multiklonavimo vietos įvedimas.
[0044] Kerpant Eco R I x Hind III pagalba, iš pBF 158 pa-šalinamas 31 nukleotido fragmentas ir liguojama sinte-tinė multiklonavimo vieta, kurios seka pateikta fig. 2. Po ligacijos intarpo transformacijos d, E. coli K 12 JM 103 ir kultivavimo terpėje, turinčioje 150 Įig/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi plazmidę pBF 158-01. Jie skiriasi nuo pBF 158 papildomomis vie-nintelėmis Xba I, Nde I, Sac I, Eag I, Kpn I, Spe I kirpimo vietomis, o taip pat antra Pst I kirpimo vieta (fig. 3) . c).' pBF 158-01 T konstravimas, transkripcijos terminatoriaus įvedimas.
[0045] Iš pBF 158-01 pašalinamas multiklonavimo vietos Cla I x Hind III fragmentas ir pakeičiamas Cla I x Hind III fragmentu iš pRT 61 (Jorgensen, R.A., Reznikoff, W.S.: J. Bacteriol. 138, 705 - 714, 1979), kuriame yra tet A/orf L terminatorius iš Th 10 (Schollmeier, K., Gartner, D., Hillen, W.: Nucl. Acids Res. 13, 4227 - 4237, 1985).
[0046] Po transformacijos E. coli K 12 Jm 103 kamiene ir kultivavimo terpėje, turinčioje 150 jag/ml ampicilino, buvo atrinkti tie klonai, kurie turėjo plazmidę pBF 158-01 T. Ji skiriasi nuo pBF 158-01 plazmidės Cla I x Hind III fragmentu, kuris 297 nukleotidais didesnis (fig. 4). d) Sintetinio fragmento M4- M8 scu- PA- genui įvedimas, plazmidžių pBF 158- 02 T - pBF 158- 06 T konstrukcija.
[0047] Visi sintetiniai fragmentai pavaizduoti fig. 5a- 5g. Jie įvedami j, atitinkamus vektorius kaip maždaug dvigubos 200 nukleotidų ilgio spiralės fragmentai. Šiam tikslui vektoriai kerpami liekamaisiais fermentais, kurie atitinka paminėtas kirpimo vietas, ir elektroforezės agaroziniame gelyje, elektroeliuavimo ir valymo pagalba atskiriami per DE 52 nuo skirtų pašalinimui fragmentų. Po to T4- ligazės pagalba liguojama priskirtu jam sintetiniu dvigubos grandinės fragmentu, vykdoma transformacija E . coli K 12 JM 103 ( fig. 6a- 6c) ir selekcija terpėje, turinčioje ampiciliną.
[0048] i) M 8 fragmento tarp Bam H I ir Cla I ligavimas plaz-miaėje pBF 158- 01 T.
[0049] 019 oligonukleotidas koduojamas scu- PA C- terminalinei sekai. Už stop kodono TAA yra Nhe I kirpimo vieta, kuri tęsiasi nuo papildomos trpA- terminatoriaus transkripcijos sekos ( Christie, G. E., Farnham, F. J., Platt, T. : Proc. Natl. Acad. Sci, USA 78, 4180- 4184, 1981) iki Cla I.
[0050] ii) M 7 fragmento tarp Spe I ir Bam H1 ligavimas plaz-midėje pBF 158- 02 T.
[0051] iii) M 6 fragmento tarp Kpn I ir Spe I ligavimas plaz-miaėje pBF 15S- 03 T.
[0052] iv) M 5 fragmento tarp Eag I ir Kpn I ligavimas plaz-midėje pBF 158-04 T.
[0053] v) M 4 fragmento tarp Sac I ir Eag I ligavimas plaz-midėje pBF 158-05 T.
[0054] Iš gautų i-v klonų atrenkami atitinkamai tie, kurie skiriasi nuo atitinkamo pirmtako papildomoje patik-rintoje teisingoje sekoje i,vestu nauju fragmentu. e) Sintetinių M2 ir M 3 fragmentų scu-PA genui ."įve-dimas, pBF 158-08 T konstravimas.
[0055] Kadangi M 2 ir M "3 fragmentų įvedimui būtinas Pst-I kirpimas ir šiam tikslui naudojamoje pBF 158 plazmidėje yra dar Pst-I kirpimo vieta (ampicilino sekoje), kuri trukdytų tolimesniam klonavimui, todėl elgiamasi fig. 7a-7c pavaizduotu būdu.
[0056] i) Iš esamos pardavime (pvz. "Pharmacia") pUC 19 plaz-midės pašalinama multiklonavimo vieta ir papildomai 212 nukleotidų i, viršų nuo Nde I x Hind III fragmento. Po to gautame tarpe liguoja sintetinę multiklonavimo vietą iš pBF 158-04-3 T kaip Nde I x Hind III fragmentą. Ši pBF 158-04-3 T plazmidė gaunama iš pBF 158-02 T (žr. fig. I di), i,vedant M 6 oligonukleotidinį fragmentą, ir atitinka plazmidę pBF 158-04 T be M 7 fragmento. Po transformacijos E. coli K 12 JM 103 ląstelėse ir kultivavimo terpėje, turinčioje 150 jig/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi pUC 19-04-3 plazmidę. Ji skiriasi nuo pUC 19 plazmiaės tuo, kad turi Nde I x Hind III 712 nukleotidų ilgio fragmentą.
[0057] ii) iš pUC 19-04-3 plazmidės pašalinamas Pst I x Sac I fragmentas, išskiriamas linearizuotas vektorius, ir liguojamas oligonukleotidinis M 3 fragmentas. Po transformacijos E. coli K 12 JM 103 ląstelėse ir kultivavimo terpėje, turinčioje 150 fjg/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi pUC 19-07 plazmidę. Ji skiriasi nuo pUC 19-04-3 plazmidės Pst I x Sac I 189 nukleotidų ilgio fragmentu, kuris turi M 3 fragmentą su teisinga seka.
[0058] iii) Iš aukščiau aprašytos pUC 19-07 plazmidės pa-šalinamas Nde I x Pst I fragmentas ir tarpas liguojamas M 2 fragmentu. Po transformacijos E. coli K 12 JM 103 ląstelėse ir kultivavimo terpėje, turinčioje 150 fig/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi pUC 19-08 plazmidę. Ji skiriasi nuo pUC 19-07 plazmidės Nde I x Pst I 246 b.p. fragmentu, kuris turi M 3 fragmentą su teisinga papildomai patikrinta seka.
[0059] iv) Iš pUC 19-08 plazmidės pašalinami M 2 ir M 3 fragmentai kaip Nde I x Sac I fragmentas ir liguojama gauta po kirpimo Nde I x Sac I pagalba didelė pBF 158-06 T dalis. Po transformacijos E. coli K 12 JM 103 ląstelėse ir kultivavimo terpėje, turinčioje 150 ng/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi plazmidę pBF 158-08 T. Ji skiriasi nuo pBF 158-06 T Nde I x Sac I 435 nukleotidų ilgio fragmentu. f) Plazmidės pBF 160 konstravimas, sintetinio trp-promotoriaus įvedimas.
[0060] Aprašyta (De Boer, H.A., Comstock, L.J., Vasser, M.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25, 1983) trp-promotoriaus seka yra iki Xba I kirpimo vietos ir ilginama nuo 5' galo sekos 5'-AATTCTGAAAT-3' pagalba. Taip kons-truojama Eco R I kirpimo vieta (fig., M 1 fragmentas). Atskiros grandinės 021 ir 021 A renatūruojamos ir li-cguoįamos i, pBF 158-08 T plazmidę, kuri kirpta Eco R I x -ba I (fig. 9) . Po transformacijos E. coli K 12 JM 103 "ląstelėse ir kultivavimo terpėje, turinčioje 150 |ag/ml ^ampicilino, atrenkami tie kionai, kurie turi pBF 160. :Plazmidė pBF 160 skiriasi nuo visų aukščiau aprašytų -pirmtakių tuo, kad, tokiu būdu transformuotų E. coli -bakterijų kamienai, pridėjus indolakrilinės rūgšties, ęekspręsuoj a išankstinės stadijos rscu-PA baltymą.
[0061] ^Transformuoti pBF 160 plazmide įvairūs E. coli kamienai, pavyzdžiui, E. coli GRT-I, E. coli K 12 JM 103, o taip pat E. coli K 12 ATCC 31446, atitinkamose vienodose ^sąlygose fermentuojami terpėje, turinčioje 38 mmolio -amonio sulfato, 56 mmolio fosfatinio buferio -su pH 7,0, 1 :mmolio magnio sulfato, 1 % mielių ekstrakto, 1 % gliukozės, 150 mg ampicilino litrui ir 62 mg/l indo-lakrilinės rūgšties pagalba indukuojama išankstinės .stadijos rscu-PA baltymo ekspresija. Palyginimui išvar-dinti kamienai transformuojami aukščiau aprašyta plazmide., kuri turi žmogaus prourokinazės geną iš cDNR banko, gautą iš Detroito 562 mRMR ląstelių (Holmes, V^.E.., Pennica, D., Blaber, M., Rey M.W., Gūnzler, W.A., Steffens, G.-J., Heynecker, H. L.: Biotechnol. 3, 923-929, 1983), pažymėtą pUK 54 trp 207-1, po to vienodose sąlygose fermentuojami ir indukuojami.
[0062] Prieš indukciją ir 6 valandas po indukcijos kiekvieną valandą atitinkamai centrifuguoja 1 ml ląstelių suspensijos, kai optinis tankis lygus 1, 578 nm bangos ilgyje ir naudoja ekspresijos laipsnio testavimui.
[0063] ii) Išankstinės stadijos rscu-PA baltymo grįžtamoji reakcija, jo suskaidymas iki rtcu-PA ir aktyvumo ma-tavimas .
[0064] Ląstelės, atskirtos centrifuguojant aprašytu būdu, su-jungiamos su lizocimu ir šis lizuotų ląstelių homogenatas naudojamas aktyvumo aprašytu būdu nustatymui.
[0065] Fig. 10 pateikti ekspresijos laipsniai, nustatyti išma-tavus rtcu-PA, susidariusios iš rscu-PA, gautos iš iš-ankstinės stadijos baltymo, aktyvumą. Iš čia matyti, kad E. coli kamienai, kurie buvo transformuoti plazmidės pBF 160 pagalba, duoda 10-15 kartų didesnę ekspresijos išeigą, nei pUK 54 trp 207-1 plazmide (Holmes ir kt.) transformuoti tokie pat E. coli kamienai. Pasirodė, kad visuose kamienuose priklausomai nuo transformacijai naudotos plazmidės ekspresijos išeiga yra apytiksliai vienoda, t.y. nepriklausomai nuo atskirų E. coli ka-mienų, transformuoti pBF plazmide kamienai visada duoda daug didesnį ekspresijos laipsnį nei identiški kamienai, transformuoti žinoma plazmide pUK 54 trp 207-1.
[0066] Ekspresinių plazmidžių išankstinės stadijos rscu-PA baltymui su sintetiniu scu-PA-genu, kontroliuojant trp-promotoriui, konstravimas.
[0067] Plazmide pBR 322 kerpama Eco ir Hind III pagalba.
[0068] Gautas 31 nukleotidų ilgio fragmentas atskiriamas pa-ruošiamosios elektroforezės agaroziniame gelyje pagalba. Likusi pBR 322 dalis eliuojama elektroeliuavimo iš gelio būdu ir valoma DE 52 chromatografijos pagalba.
[0069] Plazmidė pBF 160 (fig. lf) taip pat kerpama Eco R I ir Hind III pagalba, 1684 nukleotidų ilgio Eco RI x Hind III fragmentas, kuris turi sintetini, scu-PA-geną su visais reguliavimo vienetais (trp-promotorius), atskiriamas elektroforezės agaroziniame gelyje pagalba ir, kaip aprašyta aukščiau, eliuojamas bei valomas.
[0070] Tokiu būdu gauti fragmentai įprastu būdu T4-ligazės pagalba liguojami ir po to transformuojami i, E. coli K 12 JM 103. Po kultivavimo terpėje, turinčioje 150 (ag/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi 1684 nu-kleotidų ilgio Eco R I x Hind III fragmentą ir pridėjus indolakrilinės rūgšties, atrenkamas išankstinės stadijos rscu-PA baltymas. Šie klonai turi plazmidę pBF 161.
[0071] E. coli GRT-I, E. coli K 12 JM 103 ir E. coli ATCC 31 466
[0072] transformuojamos pBF 161 pagalba, fermentuojamos (kaip fig. Ig) ir išmėginamas ekspresijos rezultatas. Išanks-tinės stadijos rscu-PA baltymo išeiga nustatoma kaip rtcu-PA aktyvumas per 1-6 valandas po indukcijos ir palyginama su pateiktomis fig. 10 išeigos reikšmėmis, naudojamomis plazmidės pBF 160 transformacijai.
[0073] Centrifiguoj ant gautos analogiškai fig I gi ląstelių nuosėdos gali būti ištirpintos virinant 0,25 mol tris HCl-buferyje, pH 8,0 su 4 % natriododecilsulfato, 1 % merkaptoetanolio ir 20 % glicerino. Tokiu būdu iš-tirpinti baltymai atskiriami SDS-PAGE pagalba ir iš-ryškinami Coomassie-Blue (Blakesley, R.W., Boezi, J.A.: Anai. Biochem. 82, 580 - 582, 1977) . Nudažyti geliai įvertinami densimetriškai ir integruojamos dėmės tarp pikų. Po indolakrilinės rūgšties indukcijos susidaręs išankstinės stadijos rscu-PA baltymo kiekis nustatomas dėmių ekstrakcijos pagalba, identifikuotų kaip iš-ankstinės stadijos baltymo juostų, gautų, prieš ir po indukcijos. Fig. 11 pateikta iš E. coli K 12 JM 103 ląstelių gauto baltymo densitograma. Šiame pavyzdyje išankstinės stadijos rscu-PA baltymo kiekis po indukcijos sudaro 17,9 masės % nuo viso bakterinio baltymo. Kiti pavyzdžiai nurodyti lentelėje.
[0074] Išankstinės stadijos baltymo rscu-PA kiekis nuo bendro baltymo kiekio (procentais)
[0075]
[0076] Išankstinės stadijos rscu-PA baltymo su sintetiniu scu-A-genu, kontroliuojant trp-promotoriui, ekspresinės plazmidės konstravimas plazmidėje pBR 322 su geno-resistentiškume trūkumu tetraciklinui.
[0077] Plazmidė pBR 322 kerpama Eco RV ir Nru I pagalba.
[0078] Gautas 787 nukleotidų ilgio fragmentas pašalinamas agarozgelektroforezės pagalba, likęs pBR 322 kiekis elektroeliuavimo pagalba iš gelio eliuojamas ir valomas per DE 52. Likusios pBR 322 Eco RV x Nru I dalies buki galai įprastu būdu liguojami T4-ligazės pagalba. Po transformacijos E. coli K 12 JM 103 ląstelėje ir kultivavimo terpėje, turinčioje 150 |ag/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, iš kurių lygi dalis po pernešimo terpę, turinčią 25 Įig/ml tetraciklino, neišauga, t.y., nepasižymi tetraciklinine rezistencija. Klonai turi plazmidę pBR 322 del, kuri skiriasi nuo pBR 322 tuo, kad yra 787 nukleotidais trumpesnė, todėl daugiau ne-gali būti kerpama Eco RV ir Nru I pagalba.
[0079] Plazmidė pBR 322 del kerpama Eco RI ir Hind III pagalba. Tokiu būdu gautas 31 nukleotido ilgio fragmentas atskiriamas preparatyvinės agarozgelelektroforezės pagalba, o likusi pBR 322 del dalis eliuojama elektroeliuavimo iš gelio pagalba ir valoma DE 52.
[0080] Tokiu būdu iš pBF 160 gaunamas 1684 nukleotidų ilgio Eco R I x Hind III fragmentas, kuris turi sintetinį scu-PA-geną su visais reguliavimo vienetais (trp-promotorius) .
[0081] Abu fragmentai įprastu būdu liguojami T4-ligaze ir po to transformuojami i, E. coli K 12 JM 103 ląsteles. Po kultivavimo terpėje, turinčioje 150 pig/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi 1684 nukleotidų ilgio Eco R1 x Hind III fragmentą ir, pridėjus 62 (ig/ml indolakrilinės rūgšties, gaunamas išankstinės stadijos rscu-PA baltymas. Šie klonai turi plazmidę pBF 162.
[0082] E. coli GRT-1 transformuojama pBF 162 pagalba, po to
[0083] fermentuojama, kaip aprašyta lg pav., ir išmėginamas ekspresijos rezultatas. Išankstinės stadijos rscu-PA baltymo išeiga nustatoma kaip rtcu-PA aktyvumas per 6 valandas po indukcijos, kuri sudaro 1300 PU/ml ląste-lės suspensijos, kai optinis tankis 1, ir palyginama su
[0084] fig. 10 pateiktomis ekspresijos išeigos reikšmėmis po E. coli GRT--1 transformacijos pBF 160 plazmide.
[0085] Išankstinės stadijos rscu-PA baltymo su sintetiniu scu-PA-genu, kontroliuojant tac-promotoriui, ekspresinės plazmidės konstravimas
[0086] Plazmidė pBF 162 kerpama Eco RI ir Xba I pagalba.
[0087] Gautas 74 nukleotidų ilgio fragmentas atskiriamas pre-paratyvinės agarozgelelektroforezės pagalba, likusi plazmidės dalis eiiuojama elektrceliuavimo pagalba ir po to valoma DE 52.
[0088] Iš plazmidės p tac SDT (DSM 5018) išskiriamos Eco RI x Xba I fragmentas, kuris turi tac-promotorių. Šiam tikslui Eco RI x Xba I pagalba kerpama p tac SDT ir fragmentas atskiriamas preparatyvinės PAGE pagalba. Pašildžius iki 65°C amonio acetato/SDS buferyje prie pH 8,0 iš mechaniškai susmulkinto poliakrilamido fragmentas eliuojamas ir valomas daug kartų ekstraguojant fenolu, prisotintu 1 mol tris-buferiu, pH 8,0.
[0089] Tokiu būdu gauti abu fragmentai įprastu būdu liguojami T4-ligaze ir transformuojami i, E. coli K 12 JM 103. Po kultivavimo terpėje, turinčioje 150 jig/ml ampicilino, atrenkant tokie klonai, kurie pridėjus IPTG, produkcija išankstinės stadijos rscu-PA baltymą. Šie klonai turi plazmidę pBF 171.
[0090] E. coli K 12 JM 103 transformuojama pBF 171 pagalba,
[0091] fermentuojama, kaip aprašyta Ig pavyzdyje ir ištiriamas
[0092] ekspresijos rezultatas. Indukcija vykdoma su IPTG (ga-lutinė koncentracija 0,5 irimo 1) .
[0093] Išankstinės stadijos rscu-PA-baltymo išeiga nustatyta kaip rtcu-PA aktyvumas per 1-6 valandas po indukcijos ir pateikta fig. 12. Ją galima lyginti su fig. 10 pateiktomis išeigos reikšmėmis, gautomis vienoduose E. coli kamienuose panaudojus plazmidę pBF 160.
[0094] Išankstinės stadijos rscu-PA baltymo su sintetiniu scu-PA-genu, kontroliuojant tac-promotoriui, ekspresinės plazmidės konstravimas plazmidėje pBR 322 su rezisten-tiškumo tatracklinui trūkumu gene.
[0095] Plazmidė pBR 322 del (žr. fig. 3a) kerpama Eco RI x
[0096] Hind III pagalba. Gautas 31 nukleotido ilgio fragmentas atskiriamas preparatyvinės agarozgelinės elektroforezės pagalba, likusi pBR 322 del dalis eliuojama elektroeliuavimo iš gelio pagalba ir po to valoma DE 52.
[0097] Tokiu pat būdu iš pBF 171 (fig. 4a) gaunamas Eco RI x Hind III fragmentas, kuris turi sintetini, scu-PA geną su visais reguliavimo vienetais (tac-promotorius).
[0098] Abu fragmentai liguojami įprastu būdu T4-ligaze ir po to transformuojami i, E. coli K 12 JM 103. ląsteles. Po kultivavimo terpėje, turinčioje 150 fig/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie esant 0,5 mmol IPTG produkcija išankstinės stadijos rscu-PA baltymą. Šie klonai turi plazmide pBF 172.
[0099] E. coli K 12 JM 103 transformuojama pBF 172 pagalba,
[0100] fermentuojama, kaip aprašyta Ig pav. ir ištiriamas ekspresijos rezultatas. Indukcija/■ tačiau vykdoma su IPTG (galutinė koncentracija 0,5 mmol). Išankstinės stadijos rscu-PA-baltymo išeiga nustatoma kaip rtcu-PA aktyvumas per 1-6 vai. po indukcijos ir tai sudaro apytiksliai 1100 PU/m.1 ląstelės suspensijos, kai optinis tankis 1. Ši rezultatą palygina su fig. 10 pateiktomis išeigos reikšmėmis, gautomis tame pačiame E. coli kamiene panaudojus plazmidę pBF 160.
[0101] Atstumo tarp Š.D. sekos ir startinio kodono išankstinės stadijos rscu-PA baltymo ekspresinėje plazmidėje pa-keitimas.
[0102] Visose 1-5 pavyzdžių konstrukcijose aprašytas startinis kodonas ATG yra Nde I kirpimo vietos - CATATG - su-dėtinė dalis. Nde I kerpa už pirmojo A heksonukle-otidinę seką ir duoda 5' galus, kurie perkloja 2 bazes. Užpildomi 3' galai, t.y., konstruojami buki galai, ir po to vėl liguojama taip, kad atitinkama seka pail-ginama bazių poromis. Tuo pat metu pašalinama Nde I kirpimo vieta. Kaip matyti fig. 13 pateiktame pavyzdyje atstumas nuo Š.D. sekos iki startinio kodono pailgėja nuo 8 iki 10 bazių porų. Tolimesni eksperimentai aiškinami pavyzdyje.
[0103] Plazmidė pBF 161 kerpama Nde I pagalba, po to išsikišę
[0104] galai užpildomi I DNR polimerazės Klionovo fragmentu (Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J.: "Molecular Cloning", A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
[0105] Laboratory, 1982). Po to DNR įprastu būdu liguojama T4-ligaze ir transformuojama i, E. coli K 12 JM 103. Po kultivavimo terpėje, turinčioje 150 jig/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi plazmidę pBF 163. Ji skiriasi nuo pBF 161, nes neturi vienos Nde I kirpimo vietos ir ankstesnės Nde I (vietos srityje turi pa-pildomas-TA-bazes (fig. 13).
[0106] E. coli GRT-I transformuojama plazmide pBF 163, fermentuojama, kaip aprašyta Ig pav. ir ištiriamas ekspresijos rezultatas. Išankstinės stadijos rscu-PA baltymo išeigos, nustatytos po grįžtamos reakcijos ir-aktyvavimo, kaip rtcu-PA aktyvumas mililitrui ląstelės suspensijos, kai optinis tankis 1, per 1-6 valandas po indukcijos su 62 mg/l indolakrilinės rūgšties, pateiktos fig. 14. Rezultatus galima palyginti su fig. 10 pateiktomis išeigos reikšmėmis, gautomis tame pačiame E. coli kamiene panaudojus plazmidę pBF 160.
1. Naujų plazmidžių, naudojamų gaunant plazminogeno aktyvatorių, gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad i, plazmidę pBR 322, iš kurios pašalinta nic/bom sritis ir/arba bent rezistentiškurno tetraciklinui dalis, tarp multiklonavimo vietos Xba I ir Nde I kirpimo vietų i, veda nurodytą fig. 2 nukleotid'ų seką (fig. 2 yra šio apibrėžties punkto dalis), kuri tarp Xba I ir Nde I kirpimo vietų turi Šain-Dalgarno seką, ir 6-12, geriausiai 8-10, nukleotidų atstumu startini, kodoną ATG ir jo pagalba žinomu būdu i, vieną arba du transkripcijos terminatorius .įstato scu-PA struktūrinio geno sintetinę dalinę seką, geriausiai prasidedančią nuo struktūrinio geno 3' galo, o taip pat reguliuojamą promotorių, ir tokiu būdu gauna plazmides, kurios pasižymi šiais skiriamaisias požymias:a) plazmides operonas turi reguliuojamą promotorių, kaipribosomų surišimo vietą - Šain-Dalgarno seką, startini, kodoną, viengrandžio uroplazminogeno "scu-PA"sintetini, struktūrini, geną, turinti, 411 aminorūgšių liekanų ir žemiau nuo struktūrinio geno vieną-du terminatorius;b) plazmides tinka išankstinės stadijos rscu-PA baltymo ekspresijai su ekspresijos laipsniu, mažiausiai 10 nuo viso susidariusio enterobakterijos baltymo, geriausiai Escherichia coli kamienuose.
a) plazmides operonas turi reguliuojamą promotorių, kaipribosomų surišimo vietą - Šain-Dalgarno seką, startini, kodoną, viengrandžio uroplazminogeno "scu-PA"sintetini, struktūrini, geną, turinti, 411 aminorūgšių liekanų ir žemiau nuo struktūrinio geno vieną-du terminatorius;b) plazmides tinka išankstinės stadijos rscu-PA baltymo ekspresijai su ekspresijos laipsniu, mažiausiai 10 nuo viso susidariusio enterobakterijos baltymo, geriausiai Escherichia coli kamienuose.2. Naujų plazmidžių gavimo būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad reguliuojamą promotorių multiklonavimo vietos pagalba įstato trp arba tac- promotorius.
3. Naujų plazmidžių gavimo būdas pagal 1 ir 2 punktus, besiskiriantis tuo, kad kaip reguliuojamą promotorių įstato sintetini, trp- promotorių, kurio nu-kleotidų seka pateikta fig. 8, o fig. 8 yra šios apibrėžties punkto dalis.
4. Naujų plazmidžių gavimo būdas pagal 1 ir 2 punktus, besiskiriantis tuo, kad kaip reguliuojamą promotorių įstato tac- promotorių iš plazmidės ptac SDT ( DSM 5018) .
5. Naujų plazmidžių gavimo būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad i, naujų plazmidžių operoną kaip einančius vienas paskui kitą transkripcijos terminatorius įstato trp A terminatorių ir/ arba tet A/ orf L terminatorių iš Tn 10.
6. Naujų plazmidžių gavimo būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad inultiplikavimo vietos pagalba tarpinėje stadijoje įstato struktūrinį geną, kurio nukleotidų seka nurodyta fig. 15, o fig 15 yra šios apibrėžties punkto dalis.
7. Naujų plazmidžių gavimo būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, k3d Eco RI Hind III fragmentą iš gautos atitinkamai pagal 1- 6 punktus plazmidės panaudoja kaip ekspresinę kasetę kitoje, enterobakaterinėje, geriausiai galinčioje automatiškai daugintis Escherichia coli plazmidėje.
8. Naujų plazmidžių gavimo būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad gautoje atitinkamai pagal 1- 7 punktus plazmidėje atstumą tarp Šain- Dalgarno sekos ir startinio kodono padidina kerpant Nde I pagalba, užpildant gautas kirpimo vietas ir sujungiant bukus galus.i
9. Plazmidės, gautos pagal 1- 8 punktus panaudojimas plazminogeno aktyvatoriaus gavimui, besiski-r i a n t i s tuo, kad šia plazmide žinomu būdu transformuoja enterobakterinį, geriausiai, Escherichiacoli kamieną, indukuoja scu-PA struktūrinio geno eks-presiją, susidariusi tarpinės stadijos rscu-PA baltymą atskiria nuo terpės, ir lizuotas bakterines ląsteles, išankstinės stadijos baltymą soliubilizuoja ir po to paveikiant red-oks sistema, atlieka grįžtarnają reakciją iki rscu-PA.
10. Plazmidės, gautos pagal 1-8 punktus panaudojimas pagal 9 punktą, besi "skiriantis tuo, kad prieš įgyvendinant 9 punktą, šia plazmide transformuoja Escherichia coli tipo, geriausiai, Escherichia coli K 12 kamieną.