[LT] Nauji kieti stabilūs intarpiniai kompleksai, kurie yra sudaryti iš N-morfolino-N-nitrozaminoacetonitrilo ir ciklodekstrinų ar ciklodekstrinų darinių ir savo sudėtyje kaip katalizatorių ar stabilizatorių fakultatyviai turintys jonus. Kompleksai, ištirpinus vandenyje ar vandeninėse sistemose kambario temperatūroje, išskiria azoto oksidą. Jonai, pageidautina, yra karboksirūgšties anijonai, tokie kaip acetatas, formiatas, propionatas, askorbinatas, tartratas ir/arba laktatas, ir/arba neorganinės rūgšties anijonai, tokie kaip fosfatas, fosfitas, boratas, karbonatas, hidrokarbonatas, sulfatas, sulfitas ir/arba katijonai, tokie kaip šarminio metalo ir/arba amonio.@Farmacinės kompozicijos bei rinkiniai savo sudėtyje turi kompleksus. Rinkiniai yra naudojami kaip NO atlaisvinimo standartai, išskiriant NO nustatytu kiekiu ir greičiu, ištirpinus vandeninėje terpėje.@Kompleksų gavimo būdai susideda iš to, kad 3-morfolino-sidnoniminas prie atitinkamo pH veikiamas katalizuojančiais jonais, norint pakeisti pusiausvyrą į N-morfolino-N-nitrozaminoacetonitrilo susidarymą, esant ciklodekstrinams ar ciklodekstrinų dariniams, galintiems sudaryti intarpinius kompleksus, todėl susidaręs N-morfolino-N-nitrozaminoacetonitrilas nedelsiant kompleksinamas ir stabilizuojamas ir kietame pavidale išskiriami naujai gauti kompleksai, fakultatyviai turintys jonus.@Pateiktas būdas apima 3-morfolino-sidnoniminoir ciklodekstrino ar ciklodekstrino darinio reakciją kietame pavidale, dalyvaujant druskai kaip katalizatoriui, kruopščiai maišant ar sutrinant komponentus kartu arba šaldant-džiovinant vandeninį, neturintį deguonies komponentų tirpalą, po to, pageidautina, atliekant antrinį džiovinimą vakuume.
[EN] New inclusion complexes which are stable in their solid state formed of SIN-1A and cyclodextrins or cyclodextrin derivatives and optionally also containing ions as catalyst or stabilizer. The complexes release nitric oxide at room temperature upon dissolving in water or aqueous systems. Pharmaceutical compositions as well as kits containing the complexes. The kits are to be used as NO-liberating standarts to release NO in a predictable amount and rate on dissolving in aqueous media. Processes for the preparation of the complexes by subjecting at a suitable pH SIN-1 to the catalyst action of ions to shift the equilibrion towards formation of SIN-1A in the presence of cyclodextrins or cyclodextrin derivatives capable of forming inclusion complexes, whereby the SIN-1A formed is immediately complexed and stabilized and isolating in the solid state the obtained new complexes optionally containing ions.
[0001] Išradimas, apima fiziologiškai aktyvius azoto oksidą išskiriančius agentus, jų gavimo būdus, juos turinčias kompozicijas bei jų panaudojimo metodus.
[0002] Detaliau išradimas liečia naujus SIN-1A su intarpu kompleksus, kurie yra stabilūs, būdami kietame pavidale ir kurie sudaromi su ciklodekstrinais ar ciklodekstrinų dariniais ir kurie išskiria azoto oksidą kambario temperatūroje, ištirpinus vandenyje ar vandens sistemose, ir kurie taip pat fakultatyviai savo sudėtyje turi katalizuojančius arba stabilizuojančius jonus. Išradimas taip pat apima jų paruošimo būdus, juos turinčias kompozicijas bei jų panaudojimo metodus.
[0003] SIN-1A N-morfolino-N-nitrozaminoacetonitrilas SIN-1C cianometilen-amino-morfolinas
[0004] CDPSI joninis tirpus p-ciklodekstrino polimeras DIMEB heptakis-2,6-di-o-metil-0-ciklodekstrinas EDRF endotelinės kilmės atlaisvinantis faktorius HPPCD hidroksipropil- 0-ciklodekstrinas,«2,8
[0005] hidroksipropilo grupių pagal CD-vienetui
[0006] Molsidominas N-etoksikarbonil- 3-morfolino-sidnoniminas RAME B atsitiktinai metilintas - (JCD, « 12 metoksi
[0007] TRIMEB heptakis- 2 , 3,6 -tri-o-metil- p-ciklodekst -
[0008] Žinoma, jog azoto monoksidas gali turėti redukuotą formą (NO'), vadinamą azoto oksidu, ir oksiduotą formą
[0009] dalyvauja daugelyje svarbių bioreguliatorinių procesų. Donoro, išskiriančio NO, naudingumas priklauso nuo arterinį spaudimą mažinančio efekto vidurkio masto ir trukmės. Reikalingi ilgiau veikiantys NO-donorai, kurie išskiria NO, nevykstant donorų metabolitinei transformacijai, t.y., kurie nėra priklausomi nuo kepenų funkcijų. Be to, NO-donoras turi turėti .tam tikrų lipofilinių savybių, kad sutrukdytų ląstelių membranoms sustiprinti savo veikimą numatytuose organuose, audiniuose. Dėl to reliatyviai paprasti, neorganiniai junginiai šiam tikslui nėra tinkami.
[0010] Produkto projektas gali būti įgyvendintas trimis skirtingais keliais: a. NO-donoro vaistai-pirmtakai savo sudėtyje turi -N0-grupę, kuri išskiriama tiesiogiai metabolitinio proceso metu, arba atlikus enziminę hidrolizę, kurios metu pašalinama tam tikra apsauginė grupė. Šie procesai yra plačiai susiję su kepenimis (pav., Molsidominas). Sidnonimino tipo vaistai-pirmtakai (pav., Molsidominas) priklauso nuo kepenų sugebėjimo pašalinti apsauginę etoksikarbonilo grupę nuo molekulės, kad gauti pirmiausia SIN-1, o po to (sekančiame, nuo pH priklausančiame procese, katalizuojamame OH" jonų) susidaro labai nestabilus SIN-1A, kuris, nepriklausomai nuo pH, spontaniškai skyla, išsilaisvinant NO.
[0011] b. Azoto oksido aduktų ar kompleksų su įvairiais nukleofilais ruošimas.
[0012] Dažniausiai antrinio amino NO kompleksų sintezė yra sekanti: antrinis aminas, pav., bevandenis dietilaminas, ištirpinamas bevandeniame eteryje, panaudojant sauso acetono-ledo vonią, iš sistemos pašalinamas deguonis ir pro eterio tirpalą 3 vai. leidžiamas sausas NO -78°C temperatūroje, pageidautina, esant aukštam slėgiui (100 psi).
[0013] Žinomo dietilamino ir azoto adukto Et2-N-NH-(ONa)-N=0 (DEANO) gyvavimo pusperiodis sudaro apie 2 minutes, tuo tarpu poliaminspermino (SPNO) su azoto oksidu produktas turi 3 9 minučių gyvavimo pusperiodį• c. Vaistas - pirmtakas stabilizuojamas ciklodekstrino intarpo komplekso sudarymu, tuo tarpu NO išskiriamas spontaniškai, esant fiziologinėms sąlygoms. Žinomas ciklodekstrino kompleksinis vaistas-pirmtakas yra stabilus kietame pavidale.
[0014] Žinoma, jog SIN-1 yra stabilus junginys kietame pavidale, tačiau jo atviros grandinės tautomerinė SIN-1A forma yra ypatingai nestabili. Yra labai sunku išskirti geltoną, kristalinį produktą gryname pavidale ir jis gali būti laikomas tiktai -80°C temperatūroje azoto atmosferoje. Fotolizės metu SIN-1A kietame pavidale greitai išskiria vieną molį NO, o vandeniniame tirpale jis pereina į cianometilen-amino-morfoliną
[0015] SIN-1 laikomas vaistu-pirmtaku, o SIN-1C biologiškai inaktyviu degradacijos produktu. Pusiausvyra tarp stabilaus SIN-1 ir aktyvaus SIN-lA (kuris yra tikrasis vaistas) priklauso nuo aplinkinių faktorių (pH, temperatūros). Tačiau dėl ypatingo SIN-lA nestabilumo - ypač deguonies atžvilgiu- jis yra faktiškai trumpaamžis tarpinis junginys SIN-1 skilimo procese.
[0016] Šiuo metu SIN-1 parduodamas tiktai intraveniniam skyrimui ampulėse miltelių pavidale, prieš injekciją ampulių turinį reikia ištirpinti. SIN-1 vai s to-pirmtako peroralinis skyrimas yra neefektyvus, kadangi hiarolitinė stadija, reikalinga tam, kad susidarytų NO gaminanti SIN-lA forma, negali vykti, esant žemoms pH
[0017] reikšmėms, o prieš absorbciją ji greitai ir pilnai skyla į SIN-1C, esant aukštesniam pH skrandžio- žarnyno trakte.
[0018] Taip pat yra žinoma, jog SIN-1 gali būti stabilizuojamas, sudarant CD kompleksą, o pusiausvyra SIN-1—»SIN-1A-»SIN-1C gali keistis kompleksų sudarymo su ciklodekstrinų dariniais dėka (publikuota, paraiška W0 91/1468L. Parodyta, jog komplekso sudarymas su kai kuriais CD dariniais inhibuoja SIN-1C susidarymą. Tokiu būdu, stabilesni SIN-1/CDPSI kompleksai, įskaitant ir turinčius padidintą SIN-1A kiekį (pasižymintys biologiniu aktyvumu dėl didesnio NO išskyrimo), buvo gauti trumpai termiškai apdorojant liofilizacijos būdu gautą SIN-1/CDPSI kompleksą. Aprašytas pavyzdys su SIN-1/DIMEB kompleksu. Šie CD dariniai yra pasiūlyti farmaciniam vartojimui.
[0019] Ši paraiška mini SIN-l/CD kompleksus arba SIN-1/laktozės mišinį su 4,5% (pagal svorį) SIN-1 kiekiu, kur SIN-1A kiekis gautuose produktuose yra sekantis:
[0020]
[0021] Praktiškai nėra parodyta, jog net tada, kai kompleksinimo agentai pristatomi šalia CDPSI pagalba, kuris, kaip nustatyta, yra efektyviausias kompleksinimo agentas šiam tikslui, įvyksta pilna SIN-1 konversija į SIN-1A.
[0022] Dar daugiau: CDPSI ir DIMEB iki šiol nėra aprobuoti farmaciniam naudojimui. Tokiu būdu švaraus SIN-1A stabilios prekinės formos gavimas nėra išspręsta problema.
[0023] Kadangi SIN-1 gali būti taikomas tik intraveniniu būdu, jo vaistas-pirmtakas Molsidominas naudojamas širdies nepakankamumo pašalinimui peroraliniu būdu: Molsidominas enzimų pagalba kepenyse hidrolizinamas į SIN-1.
[0024] Šio išradimo pagrindinis tikslas yra taip stabilizuoti NO-donorą SIN-1A, kad užtikrinti kompoziciją, kuri gali būti skiriama tiek peroraliniu, tiek parenteraliniu būdu ir kurios nekenksmingumas yra patvirtintas pilna (net intravenine) toksikologine dokumentacija. Šiuo metu šį svarbiausią reikalavimą atitinka du ciklodekstrinų tipai: gammaCD ir HP(3CD.
[0025] Nors CDPSI ir DIMEB stabilizuojantis poveikis į SIN-1A vandeniniuose tirpaluose yra žinomas, tačiau iš to neseka, jog šiuo atžvilgiu taip pat yra efektyvus nejoninis gammaCD, ypač dėl jo ertmės platesnio diametro. Puikus CDPSI stabilizuojantis efektas yra priskiriamas jo polimerinei struktūrai, t.y., jungtinėms įvairių ciklodekstrino žiedų, pritvirtintų sferinėje kaimynystėj e,sąveikoms.
[0026] Šio išradimo objektai yra nauji SIN-1A intarpų kompleksai,kurie yra stabilūs kietame pavidale, sudaryti iš SIN-1A ir ciklodekstrinų ar ciklodekstrinų darinių ir išskiriantys azoto oksidą kambario temperatūroje, ištirpinus juos vandenyje ar vandeninėse sistemose, ir taip pat fakultatyviai turintys katalizuojantį ar stabilizuojantį joną.
[0027] Geriausiame variante kaip katalizatorių ar stabilizatorių jie turi fiziologiškai priimtiną anijoną, tokį kaip karboksirūgšties anijonai, pav., acetatas, formiatas, propionatas, askorbinatas, tartratas, ir/arba laktatas ir/arba neorganinės rūgšties anijonai, tokie, kaip fosfatas, fosfitas, boratas, karbonatas, hidrokarbonatas, sulfatas ir/arba sulfitas. Atrasta, jog šiam tikslui puikus anijonas yra acetatas. Anijonai gali būti pateikti druskų pavidalu, o atitinkami katijonai, pageidautina, gali būti amonio ar šarminių metalų jonai, tačiau lygiai taip pat gali būti naudojami kiti katijonai.
[0028] Kaip ciklodekstrino komponentą jie turi PCD, gammaCD arba aCD, ypač farmaciniam naudojimui.Jie taip pat gali turėti ciklodekstrino darinius, būtent, hidroksipropilintus ar metilintus ciklodekstrinus, tokius kaip HPpCD, DIMEB, RAMEB, TRIMEB ar CDPSI.
[0029] Kita išradimo ypatybė yra biologiškai aktyvios kompozicijos, turinčios kaip savo aktyvų ingredientą naujus SIN-lA/ciklodekstrino kompleksus kartu su pagalbiniais ir papildomais ingredientais, palengvinančiais jų panaudojimą. Tai apima, bet nėra ribojama farmacinėms kompozicijoms, kaip aktyvų ingredientą turinčioms SIN-1A intarpo kompleksus fakultatyviai su įprastomis pagalbinėmis ir papildomomis medžiagomis, naudojamomis farmacijoje peroraliniam, parenteraliniam ar kitokiam medicininiam taikymui. Pageidautina, jog formuluotės būtų miltelių formoje, kurie ištirpinami prieš pat naudojimą. Tokiu būdu, parenteralinės formuluotės yra, pageidautina, milteliai, ištirpinami prieš injekciją.
[0030] Pirmenybę turinčios yra tokios kompozicijos, kurios kaip aktyvų ingredientą turi SIN-1A intarpo kompleksus, kurie yra stabilūs savo kietame pavidale ir kurie yra sudaryti su PCD, gammaCD ar aCD ir turintys kaip katalizatorių ar stabilizatorių fiziologiškai priimtiną anijoną, tokį kaip karboksirūgšties anijonai, apimant acetatą, formiatą, propionatą, askorbinatą, tartratą ir /arba laktatą ir/arba neorganinės rūgšties anijonai, apimant fosfatą, fosfitą, boratą, karbonatą, hidrokarbonatą, sulfatą ir/arba sulfitą. Anijonai fakultatyviai gali būti savo druskų formoje, pav., amonio ar šarminių metalų druskų. Šiam tikslui geriausia druska yra amonio acetatas.
[0031] Sekantys šio išradimo objektai yra rinkiniai, naudotini kaip NO atlaisvinimo standartai, išskiriant NO numatytu kiekiu ir greičiu, ištirpinus vandeninėje terpėje, kurie kaip aktyvų ingredientą turi SIN-1A intarpo kompleksus, sutinkamai su šiuo išradimu.
[0032] Tai yra įmanoma, nes šis išradimas liečia gavimą ir stabilizaciją ypatingai labilaus SIN-1A, kuris, kai išlaisvinamas iš ciklodekstrino ertmės - net paprastai ištirpinus distiliuotame vandenyje - nedelsiant generuoja NO numatytu kiekiu ir greičiu, nereikalaujant jokio papildomo fermento ar sužadintojo.
[0033] Šis išradimas apima naujų SIN-1A intarpo kompleksų, kurie yra stabilūs savo kietame pavidale ir kurie yra sudaryti su ciklodekstrinais ar ciklodekstrinų dariniais, gavimo būdus, SIN-1 veikiant katalitiniais jonais tinkamose pH sąlygose, kad pakeisti pusiausvyrą į SIN-1A susidarymą, esant ciklodekstrinams ar ciklodekstrinų dariniams, sugebantiems sudaryti intarpo kompleksus, ko dėka susidaręs SIN-1A yra nedelsiant kompleksinamas ir stabilizuojamas, susidarant SIN-lA/ciklodekstrino intarpo kompleksams. Procesas apima gautų SIN-1A/CD kompleksų, fakultatyviai turinčių jonus, išskyrimą kietame pavidale.Jonai gali būti savo druskų pavidale.
[0034] Labiausiai išradimą atitinka būdas, reaguojant SIN-1 ir ciklodekstrinui ar ciklodekstrino dariniui kietame pavidale, pageidautina, esant katalizatoriui jonui jo druskos pavidale, kruopščiai sumaišant arba sutrinant komponentus kartu. Kitas kelias, sutinkamai su išradimu, eina per vandeninio komponentų tirpalo, neturinčio deguonies, šaldymą-džiovinimą, pageidautina, toliau sekant antriniam džiovinimui vakuume.
[0035] Kaip proceso katalizatorius, pageidautina, naudoti amonio ar šarminio metalo druskas, sudarytas, su karboksirūgšties anijonais, tokiais kaip acetatas, formiatas, propionatas, askorbinatas, tartratas ir/arba laktatas ir/arba neorganinės rūgšties anijonais, tokiais, kaip boratas, karbonatas, hidrokarbonatas, fosfatas, fosfitas, sulfatas, ir/arba sulfitas. Naudojamos druskos gali turėti lakius anijonus ar katijonus, tokius kaip amonio ar karbonato jonai, kurie dalinai ar pilnai pašalinami proceso metu.
[0036] Atliekant aukščiau minėtą procesą, reakciją geriau užbaigti prie pH reikšmių tarp 6-10 ir - kada vanduo naudojamas reakcijos terpe - taikyti antrinį džiovinimą 40-100°C temperatūroje, pageidautina, 50-7 0°C temperatūroj e.
[0037] Kaip matyti iš NO išskyrimo testų, SIN-lA/ciklodekstrino kompleksai nedelsiant gamina azoto oksidą, ištirpinus kietus kompleksus vandeninėse sistemose. Tokiu būdu, vienas iš kelių gauti kontroliuojamos sudėties SIN-1A ciklodekstrino kompleksą (turintį žemiausią SIN-1C kiekį) susideda iš SIN-1 tautomerizacijos ir tuo pačiu metu susidariusio SIN-1A kompleksinimo kietame pavidale.
[0038] Situacija panaši, kai komplekso gavimas vyksta šaldant-džiovinant. Šiuo atveju antra džiovinimo stadija (po liofilinimo) leidžia užtikrinti kieto katalitinio komplekso susidarymo sąlygas.
[0039] Kitas išradimo objektas glūdi gyvų ląstelių veikimo azoto oksidu metoduose. Tai apima, bet nesusiveda į nuo azoto oksidų priklausančius žmonių ir gyvulių simptomus, panašius į stenokardijos ir išeminius širdies nepakankamumus, fiziologinę kraujo spaudimo kontrolę, trombocitų agregaciją, peristaltikos įtempimo mažinimo tarpininkavimą, penio erekciją ir kitus poveikius. Tai yra įvykdoma, skiriant pacientams, kuriems tai reikalinga, pageidautina, peroraliniam ar parenteraliniam vartojimui, efektyvų kiekį naujo SIN-1A intarpo komplekso, kuris yra stabilus kietame pavidale ir kuris yra sudarytas su ciklodekstrinais ar su ciklodekstrinų dariniais ir kuris kaip katalizatorių ar stabilizatorių turi mažiausiai vieną joną ir kuris, ištirpinus vandenyje ar vandeninėse sistemose, išskiria azoto oksidą kambario temperatūroje.
[0040] Veiksmingiausia yra kompleksų, sudarytų tarp SIN-1A ir PCD, gammaCD ar aCD, fakultatyviai turinčių karboksi-rūgšties anijonus, tokius kaip acetatas, formiatas, propionatas, askorbinatas, tartratas ir/arba laktatas ir/arba neorganinės rūgšties anijonus, tokius, kaip fosfatas, fosfitas, boratas, karbonatas, hidrokarbonatas, sulfatas ir/ar sulfitas jų amonio ar šarminių metalų druskų formoje, paskyrimas.
[0041] Išradimas apima žmonių ar gyvulių nuo azoto oksido priklausomų simptomų reguliavimą, pacientui skiriant produktą, gautą SIN-1 kiekybinės konversijos į SIN-1A būdu, atliekamu joninės katalizės ir ciklodekstrinų stabilizuoto kieto būvio konversijos pagalba, kai dalyvaujantys ciklodekstrinas ar ciklodekstrino darinys nedelsiant gali sudaryti intarpo kompleksus. Pagrindiniai SIN-1A/CD kompleksų pranašumai, lyginant su SIN-1 ar kitais iki šiol žinomais NO-donorais, yra sekantys:
[0042] -pagaliau didesnis sugebėjimas pasiekti savo objektus (audinius).
[0043] Turint stabilią kompoziciją, pasidaro įmanoma pradėti naują etapą, naudojant azoto oksidą, kuris kai kurių autorių yra vadinamas "nelaukta nauja biochemijos superžvaigžde" (Chem.Ing.News Dec.19 93.psl.26 - 38) .
[0044] Sekantys pavyzdžiai iliustruoja, bet neriboja išradimo.
[0045] 2 g gammaCD ir 0.8 g amonio acetato ištirpinama 25 ml distiliuoto vandens, veikiant ultragarsu.Iš tirpalo pašalinamas deguonis, leidžiant per jį helio dujas, po to ištirpinama 200 mg SIN-1 medžiagos. Tirpalas nedelsiant šaldomas-džiovinamas, norint išskirti kompleksą kietame pavidale. Antras komplekso džiovinimas atliekamas 40-50°C temperatūroje 2 vai., kad būtų beveik pilnai pašalintas vanduo. Tiek tirpalas, tiek medžiaga saugomi nuo šviesos poveikio. Kompleksas yra šviesiai geltoni milteliai. Išeiga: 2 . 6± 0.1 g.Nuostolis džiovinant yra mažiau 1%.
[0046] Visuose pavyzdžiuose kartu nustatant SIN-1, SIN-1A ir SIN-1C, taikant HPLC, naudojamas sekantis metodas: Kolonėlė:Ultrasferinė I.P. analitinė kolonėlė (Beckman-Astec) 4.6x250 mm, dalelių dydis 5 p.m.
[0047] Joninė jėga: 0.05 gion/dm3 (koreguojama natrio sulfatu) Srovės greitis: 1 ml/min., p=19 0 bar.Pavyzdžio tūris: 20 nl.
[0048] - 230 nm BW: 6 (ref. 350 nm BW:80) SIN-1A ir SIN-1C tarp 0-8 minučių - 292 nm BW: 6 (ref. 400 nm BW:80) SIN-1 po 8 minučių Užsilaikymo laikai: SIN-1 9.6 min.
[0049] Kalibravimui naudojami naujai paruošti SIN-1 ir SIN-1C tirpalai, SIN-IA kiekis išreiškiamas SIN-1C ekvivalentu.
[0050] 16 g PCD (vandens kiekis 14%) ir 7 g amonio acetato ištirpinama 1000 ml distiliuoto vandens, veikiant ultragarsu. Iš tirpalo pašalinamas deguonis, leidžiant per jį helio dujas, po to ištirpinama 3 g SIN-1 medžiagos.Kietas kompleksas išskiriamas nedelsiant šaldant-džiovinant, o vanduo pašalinamas 40-50°C temperatūroje. Tiek tirpalas, tiek medžiaga saugomi nuo šviesos poveikio. Kompleksas yra gelsvi labai purūs milteliai.Išeiga: 20±1 g.Nuostolis džiovinant <1%. HPLC analizė: SIN-1 kiekis: nenustatyta
[0051] 2 g HPBCD (DS=2.8) ir 0.8 g amonio acetato ištirpinama 25 ml distiliuoto vandens, veikiant ultragarsu. Pašalinus deguonį, praleidžiant helio dujas, ištirpinama 200 mg SIN-1. Kietas kompleksas išskiriamas nedelsiant šaldant-džiovinant. Vanduo pašalinamas 40-50°C temperatūroje. Tiek tirpalas, tiek medžiaga saugomi nuo šviesos poveikio. Gaunama 2.8±0.1 g SIN-1A/HPBCD komplekso šviesiai geltonų miltelių pavidalu. Nuostolis džiovinant <1%.
[0052] SIN-1A: 11.6±0.2%
[0053] SIN-1C: 0.3 6±0.1%
[0054] 2 g RAMEB (DS=1.8) ir 0.8 g amonio acetato ištirpinama 25 ml distiliuoto vandens, veikiant ultragarsu. Pašalinus deguonį, praleidžiant helio dujas, ištirpinama 200 mg SIN-1 medžiagos, tirpalas šaldomas-džiovinamas ir išskirtas kietas kompleksas džiovinamas 2 vai. 40-50°C temperatūroje. Tirpalas ir medžiaga saugomi nuo šviesos poveikio.
[0055] Gaunama 2.8±0.1 g SIN-1A/RAMEB komplekso šviesiai geltonų miltelių pavidale. Nuostolis džiovinant <1%.
[0056] SIN-1A: 12.0±0.2%
[0057] SIN-1C: 0.6±0.1%
[0058] 1 g [3CD (vandens kiekis: 14%) ištirpinama 55 ml fosfatinio buferio tirpale, kurio pH=8.0, sutinkamai su USP XXII, veikiant ultragarsu.Pašalinus deguonį helio pagalba, ištirpinama 100 mg SIN-1. Tirpalas nedelsiant šaldomas-džiovinamas. Tirpalas ir medžiaga saugomi nuo šviesos poveikio.Gaunama 1±0.1 g SIN-1A/PCD gelsvos spalvos labai purių miltelių. Nuostolis džiovinant
[0059] < 1%.
[0060] 1 g PCD (vandens kiekis 14%), 100 mg SIN-1 hidrochlorido ir 100 mg amonio acetato kruopščiai maišomi grūstuvėlyje 15 min. Trumpai pagrūdus, mišinys tampa aiškiai geltonas.Išlaikius 2 dienas uždarame, nuo šviesos apsaugotame inde, HPLC analizė, sutinkamai su 1.1 pavyzdžiu, duoda sekančius rezultatus:
[0061] Panaudojant 1.6 pavyzdžio būdą, bet imant 50 mg amonio acetato, stebimas SIN-1A (geltona spalva) susidarymas yra lėtesnis, jis trunka keletą valandų.
[0062] SIN-1: 0.5±0.1%
[0063] SIN-1A: 6.9±0.2%
[0064] SIN-1C: 0.6±0.1%
[0065] Laikantis procedūros, aprašytos 1.6 pavyzdyje, bet panaudojant 300 mg amonio acetato, mišinio geltona spalva atsiranda praktiškai tuojau pat po komponentų sumaišymo.
[0066] HPLC analizė PCD kompleksui tą pačią dieną po paruošimo:
[0067] SIN-1A: 6.9±0.2%
[0068] SIN-1C: 0.5±0.1%
[0069] 1 g PCD (vandens kiekis 14%) , 100 mg SIN-1 hidroclorido ir 100 mg natrio acetato'3H20 kruopščiai maišomi grūstuvėl'yje 15 min. , po to mišinys apdorojamas termiškai 1 vai. 70°C temperatūroje.
[0070] SIN-1: nenustatyta SIN-1A: 7 . 1±0.2%
[0071] SIN-1C: 0 . 8±0.1%
[0072] Bandytas SIN-lA/pCD paruošimas su acto rūgštimi. Paruošimas atliekamas taip, kaip 1.2 pavyzdyje, bet vietoje vandens ir amonio acetato PCD ištirpinamas 0.1M acto rūgšties tirpale.
[0073] Tokiu būdu, kietas SIN-lA/pCD kompleksas neišskirtas.
[0074] Bandytas SIN-lA/pCD paruošimas su natrio hidroksidu.
[0075] Komplekso sudarymas atliekamas taip, kaip aprašyta 1.5 pavyzdyje, bet pCD ištirpinamas 55 ml vandeninio natrio hidroksido tirpale, kurio pH=8.4, vietoj naudoto amonio acetato. Gauto kieto produkto HPLC analizė: SIN-1: 10.5% SIN-1A: 0.40%
[0076] SIN-1C: nenustatyta SIN-1A/PCD kompleksas nėra išskirtas.
[0077] SIN-1A kompleksų stabilumas ir konversijos efektyvumas parodyti 1 lentelėje. Pavyzdžiai buvo laikyti 11 mėnesių kambario temperatūroje oro atmosferoje stikliniuose induose, apsaugotuose nuo šviesos poveikio. SIN-1A kiekis yra pateiktas SIN-1C ekvivalentu.
[0078] SIN-1A/PCD pavyzdys tuojau pat po jo paruošimo turi 11.47% SIN-1A. Išlaikius kambario temperatūroje 12 mėnesių, jis turi 8.36% SIN-1A, o praėjus 23 mėnesiams, jis turi 6.59% SIN-lA. SIN-1C kiekiai atitinkamai lygūs 0.18, 1.31 ir 1.57%.
[0079] Kompleksai, turėjo apytiksliai 5-8% intarpinio vandens, daugiausia prijungto prie ciklodekstrino ertmės.
[0080] Stabilumą didinantis temperatūrinio apdorojimo, atlikto po šaldymo - džiovinimo (antrinis džiovinimas), efektas parodytas 2 lentelėje.
[0081] NO išskyrimo iš SIN-lA/pCD komplekso greitis ir apimtis.
[0082] NO išskyrimas SIN-1A/CD tirpaluose buvo tiriamas cheminiais ir biologiniais metodais.
[0083] 250 mg komplekso (atitinka apytikriai 25 mg SIN-1A) ištirpinama 100 ml distiliuoto vandens.Iš karto po ištirpinimo NO išskyrimas netiesiogiai nustatomas vienu
[0084] metu matuojant SIN-1A kiekio sumažėjimą ir SIN-1C metabolito susidarymą HPLC pagalba kaip funkciją nuo laiko. Matavimai kartojami skirtingais laiko intervalais, saugojantis šviesos poveikio.
[0085] 3 lentelė parodo SIN-1A skilimo distiliuotame vandenyje kambario temperatūroje, esant PCD, gammaCD ir HPBCD, kinetiką.
[0086] Nustatytas kompleksų T i/2 (gyvavimo pusperiodis) , išskaičiuotas iš SIN-1A kiekio sumažėjimo, yra 53 rnin.-(iCD, 24 min. - gammaCD ir 70 min. - HPBCD.
[0087] NO išskyrimas labiau praskiestame SIN-lA/pCD tirpale (100 (.ig/ml SIN-IA/PCD komplekso atitinka 10 Įig/ml SIN-1A) nustatomas UV-spektrofotometriškai, matuojant SIN-1C metabolito susidarymą kaip nuo laiko priklausančią funkciją. Perėjimas SIN-1A-»SIN-1C lydimas labai būdingo UV-spektrinio pokyčio, nes SIN-1A turi UV maksimumą prie 230+1 nm ir nerodo absorbcijos prie 277±1 nm (^.max SIN-1C) . 10 mg SIN-1A/PCD komplekso (atitinka apytikriai 1 mg SIN-lA) ištirpinama 100 ml distiliuoto vandens. Tirpalo UV-spektras registruojamas tarp 200-350 nm nepraskiedus, nedelsiant po ištirpinimo, ir registravimas pakartojamas skirtingais laiko intervalais, saugantis šviesos poveikio. Susidaręs SIN-1C kiekis išskaičiuojamas iš absorbcijos prie 277±1 nm reikšmių, naudojant kalibracinę kreivę, standartu imant SIN-1C. SIN-1C koncentracija buvo mažesnė negu 0.7 |xg/ml iškart po ištirpinimo ir apytikriai buvo 7.8 Įig/ml po 270 min. Matyt, išskiriamas ekvivalentinis NO kiekis. Nustatytas komplekso gyvavimo pusperiodis: 90-100 min.
[0088] Fig.l iliustruoja UV-spektro kitimą kaip laiko funkciją: parodytas SIN-lA/flCD komplekso UV spektras 10 minučių intervalais iki 160 minučių, ištirpinus 10 mg komplekso 100 ml vandens. Yra stebima absorbcijos priklausomybė nuo bangos ilgio.
[0089] NO susidarymas nustatomas tiesiogiai, naudojant NO specifinį porfirininį mikrosensorinį detektorių. Metodas (Nature, Vol. 3 58 p.675,1992) įgalina kontroliuoti NO išsiskyrimą iki 10"20 molių vienoje ląstelėje biologinėse mikrosistemose amperometriniu ar voltametriniu metodu. 1 mM SIN-1A/PCD fosfatiniame buferyje, kurio pH=7.4, 37°C temperatūroje pirmas 5 minutes NO išskiria 2.37 |j.M/min. greičiu, o tarp 10-os ir 30-os minutės - 0.17 ĮiM/min. greičiu. Ištirpinant 0.1 mM medžiagos , reikšmės atitinkamai yra 0.42 jaM ir 0.07 p.M.
[0090] Trombocitų agregacijos inhibicija SIN-lA/fiCD komplekso pagalba: Azoto oksidas būdavo identifikuojamas kaip natūralus molekulinis rodiklis trombocitų agregacijos inhibicijoje, naudojant guanilato-ciklazės/ciklinę GMP sistemą (Blood, 57.946, 1981). SIN-1 ir SIN-lA/pCD komplekso biologiniai efektai buvo tiriami , lyginant jų trombocitų agregaciją inhibuojančius efektus.
[0091] Trombocitų agregacija buvo tyrinėjama trombocitais turtingoje triušio ir žmogaus plazmoje (J. Cardiovasc.Pharmacol. 14 suppl. 11; psl.120, 1989). Kiekvienoje trombocitais turtingoje triušių plazmos partijoje 8 dozių atsako kreivės buvo registruojamos tromboksano mimetiku U-46619 (0.25-4.0 įjM) , esant SIN-1A/PCD komplekso 0, 10"7,10"6 ar 10"5 molių koncentracijoms. Dozės atsako kreivės buvo atliekamos atsitiktine seka. Po to buvo naudojama fiksuota U-46619 (4įj.M) koncentracija, kad paruošti ištisas SIN-1 ir Sin-lA/pCD koncentracijos-inhibicijos kreives. U-46619 indukavo agregaciją priklausomai nuo koncentracijos. Visais atvejais agregaciją inhibuoj antis efektas, esant identiškai moliarinei koncentracijai, buvo žymiai didesnis SIN-lA/pCD komplekso, lyginant su SIN-1. pD2 (50% inhibiciją duodančios koncentracijos neigiamas logaritmas) reikšmės yra 5.57+0.11 (n=7) SIN-1 ir 6.3 6±0.07 (n=7) SIN-lA/pCD kompleksui, pažymint, jog šiame teste kompleksas buvo apie 6 kartus efektyvesnis negu SIN-1. Kituose panašiuose eksperimentuose nustatyta, jog SIN-lA/pCD kompleksas buvo apie 10 kartų efektyvesnis už SIN-1.
[0092] Eksperimentai, aprašyti III.7 pavyzdyje, pakartoti su SIN-1, naujai paruoštu SIN-1A/PCD kompleksu (SIN-1A kiekis 14.8%) ir su SIN-lA/pCD kompleksu, kuris buvo laikomas 23 mėnesius kambario temperatūroje (SIN-1A kiekis iš pradžių buvo 11.47%, po 23 mėnesių - 6.59%), panaudojant citruotą trombocitais turtingą plazmą. 4 lentelė iliustruoja rezultatus, rodančius neigiamus logaritmus (PD2) SIN-1 ir SIN-1A/PCD komplekso koncentracijos, sąlygojančios U46619 indukuotos agregacijos trombocitais turtingoje žmogaus plazmoje 50% inhibiciją.
[0093] Yra įvertinti tiek amplitudė, tiek agregacijos kreivės nuožulnumas. Skirtumas pD2 reikšmėse žymi, jog naujai paruoštas SIN-lA/pCD buvo apie 8 kartus efektyvesnis už SIN-1. Kompleksas, išlaikytas 23 mėnesius, buvo 3 kartus mažiau aktyvus už naujai paruoštą kompleksą, bet 3 kartus aktyvesnis už patį SIN-1.
[0094] In vivo testų rezultatai rodo, jog čia parodyti SIN-lA/pCD kompleksai yra naudingi trombocitų agregacijos in vivo inhibitoriai.
[0095] Kaip matyti iš gyvavimo pusperiodžio reikšmių, SIN-lA/ciklodekstrino kompleksai po vaistų įvedimo sugeba nepertraukiamai produkuoti azoto oksidą pastovesniu greičiu ilgesnį laiko tarpą.
[0096] Pirktinis SIN-1 (CORVASAL) lyginamas su SIN-1A/PCD kompleksu, įvedant jį per triušių miego arteriją. Nembutaliu anestezuotų triušių miego arterija perpjaunama, 3 mm ilgio žiedai imobilizuojami spaustuku ir patalpinami į organų vonias. Susitraukimas indukuojamas tris kartus su 3xl0'7 M fenileprino, po to praplaunant. Dozės atsako kreivės registruojamos nuo 3xl0"9 M iki 3xl0'5 M CORVASALo (nurodant SIN-1 kiekį) ir nuo 3xl0"9 M iki 3xl0'5 M SIN-1A/Į3CD (nurodant SIN-1A kiekį).
[0097] Fig.2 rodo susitraukimo, priklausomai nuo preparato koncentracijos, kreivę. Kaip matosi, PCD kompleksą su SIN-1A turintis preparatas apie 6 kartus efektyvesnis už laisvą SIN-1. Parodyti taškai pateikia 6 matavimų vidurkį.
1. Galinčio išskirti azoto oksidą agento intarpiniai kompleksai su ciklodekstrinais, besiskiriantys tuo, kad jie yra stabilūs kietoje būsenoje ir išskiria azoto oksidą kambario temperatūroje, ištirpinus vandenyje arba vandeninėje sistemoje, sudaryti iš N-morfolino-N-nitrozaminoacetonitrilo ir ciklodekstrinų ir/arba ciklodekstrinų darinių, be to gali turėti fiziologiškai priimtiną katalizuojantį arba stabilizuojantį joną.
2. Intarpiniai kompleksai pagal 1 punktą, besiskiriantys tuo, kad minėtas jonas yra karboksirūgšties anijonai, tokie kaip acetatas,-formiatas, propionatas, askorbinatas, tartratas ir/arba laktatas ir/arba neorganinės rūgšties anijonai, tokie kaip fosfatas, fosfitas, boratas, karbonatas, hidrokarbonatas, sulfatas, sulfitas ir/arba katijonai, tokie kaip šarminio metalo ir/arba amonio.
-formiatas, propionatas, askorbinatas, tartratas ir/arba laktatas ir/arba neorganinės rūgšties anijonai, tokie kaip fosfatas, fosfitas, boratas, karbonatas, hidrokarbonatas, sulfatas, sulfitas ir/arba katijonai, tokie kaip šarminio metalo ir/arba amonio.3. Intarpiniai kompleksai pagal 1 arba 2 punktus, besiskiriantys tuo, kad minėti ciklodekstrinai yra p-ciklodekstrinas, y-ciklodekstrinas arba a-ciklodekstrinas ir/arba ciklodekstrino dariniai yra hidroksipropilinti arba metilinti ciklodekstrinai, tokie kaip hidroksipropil-p-ciklodekstrinas, turintis vidutiniškai 2,8 hidroksipropilo grupių ciklodekstrino vienetui; heptakis -2,6 - di - o-metil - p - ciklodekstrinas, atsitiktinai metilintas p-ciklodekstrinas, turintis vidutiniškai 12 metoksigrupių ciklodekstrino vienetui; heptakis- 2,3,6 -tri- o-metil- p -ciklodekstrinas .
4. Farmacinės kompozicijos, fakultatyviai turinčios įprastas pagalbines ir papildomas medžiagas, naudojamas farmacijoje peroraliniam, parenteraliniam ar kitam medicininiam vartojimui, besiskiriančios tuo, kad kaip aktyvų ingredientą turi intarpinius kompleksus pagal 1-3 punktus, ir yra , optimaliai, miltelių, kurie ištirpinami prieš pat vartojimą, formoj e.
5.Farmacinės kompozicijos, besiskirian-čios tuo, kad kaip aktyvų ingredientą turi kietoje būsenoje stabilaus N-morfolino-N-nitrozaminoacetonitrilo intarpinius kompleksus su p-ciklodekstrinu, y-ciklodekstrinu arba a-ciklodekstrinu, galinčius turėti fiziologiškai priimtiną katalizuoj antį arba stabilizuojantį anijoną pagal 2 punktą, kuris gali būti amonio arba šarminio metalo druskos formoje, geriausiai acetatą.
6. Rinkiniai su ingredientu, išskiriančiu NO nustatytu kiekiu ir greičiu, ištirpinus vandeninėje terpėje, ir skirti naudoti kaip NO atlaisvinimo standartai, besiskiriantys tuo, kad savo sudėtyje kaip aktyvų ingredientą turi intarpinius kompleksus pagal bet kurį iš 1-3 punktų.
7. Stabilių kietoje būsenoje N-morfolino-N-nitrozaminoacetonitrilo intarpinių kompleksų su ciklodekstrinais arba ciklodekstrinu dariniais gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad tinkamose pH sąlygose ir esant ciklodekstrinams arba ciklodekstrinu dariniams, sugebantiems sudaryti intarpinius kompleksus, 3-morfolino-sidnoniminą veikia katalizuojančiais jonais, tuo būdu perkelia pusiausvyrą 4 N-morfolino-N-nitrozaminoacetonitrilo susidarymo pusę ir susidariusį N-morfolino-N-nitrozaminoacetonitrilą kompleksina ir stabilizuoja, nedelsiant išskiriant kietame pavidale gautus N-morfolino-N-nitrozaminoacetonitrilo ciklodekstrinų intarpinius kompleksus, galinčius turėti jonų, fakultatyviai atitinkamų druskų formoje.
8. Būdas pagal 7 punktą, besiskiriantis tuo, kad reakciją 3-morfolino-sidnonimino su ciklodekstrinu arba ciklodekstrino dariniu vykdo kietoje būsenoje, dalyvaujant katalizuojančiam jonui fakultatyviai jo druskos formoje, kruopščiai sumaišant arba sutrinant komponentus, arba šaldant-džiovinant vandeninį komponentų tirpalą, pašalinus iš jo deguonį; po to atlieka antrinį džiovinimą vakuume.
9. Būdas pagal bet kurį 7 arba 8 punktą, besiskiriantis tuo, kad katalizatoriais ar stabilizatoriais naudoja amonio ar šarminio metalo druskas su karboksirūgšties anijonais, tokiais kaip acetatas, formiatas, propionatas, askorbinatas, tartratas ir/arba neorganinės rūgšties anijonais, tokiais kaip boratas, karbonatas, hidrokarbonatas, fosfatas, fosfitas, sulfatas ir/arba sulfitas.
10. Būdas pagal bet kurį iš 7-9 punktų, besiskiriantis tuo, kad reakciją vykdo pH intervale 6-10 ir -kada vanduo naudojamas reakcijos terpe- atlieka antrinį džiovinimą 40-100°C temperatūroje, geriausiai, 50-70°C temperatūroje.