LT4904B

NEPEPTIDINIAI GNRH AGENTAI, BŪDAI IR TARPINIAI JUNGINIAI JIEMS GAUTI

NON-PEPTIDE GNRH AGENTS, METHODS AND INTERMEDIATES FOR THEIR PREPARATION

Referatas

[LT] Išradime aprašyti nepeptidiniai GnRH agentai, galintys inhibuoti gonadotropiną išlaisvinančio hormono poveikį. Tokie junginiai ir jų farmaciškai priimtinos druskos, multimerai, provaistai ir veiklieji metabolitai yra tinkami žinduolių reprodukciniams sutrikimams ir nuo steroidinių hormonų priklausomiems augliams gydyti bei vaisingumui reguliuoti, kur gonadotropino išlaisvinimo slopinimas yra pageidautinas. taip pat aprašyti šių junginių ir jiems pagaminti tinkančių tarpinių junginių sintezės būdai.

[EN] Non-peptide GnRH agents capable of inhibiting the effect of gonadotropin-releasing hormone are described. Such compounds and their pharmaceutically acceptable salts, multimers, prodrugs, and active metabolites are suitable for treating mammalian reproductive disorders and steroid hormone-dependant tumors as well as for regulating fertility, where suppression of gonadotropin release is indicated. Methods for synthesizing the compounds and intermediates useful in their preparation are also descriebed.

Aprašymas

[0001] Išradimo technikos sritis ir galimybė pritaikyti pramonėje

[0002] Šis išradimas pagrindinai yra susijęs su junginiais, kurie veikia žmogaus gonadotropiną išlaisvinančio hormono (GnRH) poveikį. Tiksliau sakant, jis yra susijęs su nepeptidiniais GnRH antagonistais ir agonistais ir su jų pagaminimu. Šie nepeptidiniai GnRH agentai turi naudingas fizikines, chemines ir biologines savybes ir yra tinkami kaip vaistai ligoms arba būklėms, kuriose keičiasi hipofizės-gonados ašies moduliavimas. Šio išradimo junginiai išvengia peptidinių agentų degradacijos ir biopasiskirstymo problemų.

[0003] Išradimo kilmė

[0004] Gonadotropiną išlaisvinantis hormonas (GnRH), dar žinomas kaip luteinizuojantį hormoną išlaisvinantis hormonas (LH-RH), vaidina centrinį vaidmenį reprodukcijos biologijoje. Daugybė analogų yra naudojama vis didėjančiam skaičiui klinikinių indikacijų. GnRH dekapeptidas (piro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ arba p-EHWSYGLRPG-NH₂) yra gaminamas vidurinio pagrindinio pogumburio neuronuose iš didesnio pirmtako, vykstant fermentiniams virsmams. Šis dekapeptidas yra išskiriamas pulsuojančiai į hipofizės vartų venos kraujotakos sistemą kur GnRH sąveikauja su didelio giminingumo receptoriais (su 7-transmembraniniu G-baltymu sujungtais receptoriais) priešakinės hipofizės liaukoje, esančioje prie smegenų pagrindo. Hipofizėje GnRH sukelia gonadotropinių hormonų

[0005] (gonadotropinu) - luteinizuojančio hormono (LH) ir folikulas stimuliuojančio hormono (FSH) - išsiskyrimą. Sėklidėse ir kiaušidėse LH stimuliuoja atitinkamai testosterono ir estradiolio gaminimąsi. FSH stimuliuoja folikulių augimą moterims ir spermos susidarymą vyrams. Jeigu funkcionavimas yra normalus, laiko atžvilgiu pulsuojantis GnRH išlaisviminas ir jo koncentracijos yra be galo svarbios lytinės steroidogenezės palaikymui ir normalioms reprodukcijos funkcijoms, susijusioms su augimu ir lytiniu brendimu.

[0006] k i •*avi u Hipofizės atsakas į GnRH metams bėgant labai kinta. GnRH ir gonadotropinai pirmiausiai pasirodo vaisiuje maždaug dešimtą nėštumo savaitę. Jautrumas GnRH mažėja, po trumpo pakilimo per pirmuosius tris mėnesius po gimimo, iki lytinio subrendimo. Prieš lytinį subrendimą FSH atsakas į GnRH yra didesnis nei LH. Kai prasideda lytinis brendimas, jautrumas GnRH padidėja ir po to atsiranda pulsuojanti LH sekrecija. Vėlyvuoju brendimo laikotarpiu ir per reprodukcijos metus vyksta pulsacinis GnRH išsilaisvinimas per visą dieną esant didesniam LH reaktyvumui nei FSH. Pulsuojantis GnRH išlaisvinimas duoda pulsuojantį LH ir FSH išlaisvinimą taigi ir testosterono ir estradiolio išsiskyrimą iš lytinių organų. Po menopauzės FSH ir LH koncentracijos padidėja, ir FSH kiekiai po menopauzės yra didesni nei LH kiekiai.

[0007] Nuolatinis GnRH agonistų ir antagonistų įvedimas gyvūnams arba žmogui sukelia ir LH, ir FSH cirkuliuojančių kiekių sumažėjimą. GnRH agonistai yra junginiai, kurie imituoja endogeninį GnRH, stimuliuojantį receptorius ant hipofizės liaukos, ir to pasėkoje išsiskiria LH ir FSH. Po trumpalaikio lytinių hormonų kiekio padidėjimo arba-"šuolio", nuolatinis GnRH agonistų vartojimas duoda GnRH receptorių veiklos sumažėjimą. GnRH receptorių veiklos sumažėjimas ir hipofizės desensitizacija sumažina LH ir FSH cirkuliuojančius kiekius. Nepaisant atsiradusio simptomus paaštrinančio staigaus hormonų kiekio padidėjimo, GnRH agonistai yra pasirenkami nuo lytinių hormonų priklausančių patofiziologijų gydymui. Pavyzdžiui, GnRH agonistai buvo naudoti sumažinti testosterono gaminimuisi, tokiu būdu sumažinant prostatos tūrį gerybinės prostatos hiperplazijos (BPH) atveju ir sulėtinant auglio augimą prostatos vėžio atveju. Šie junginiai taip pat buvo naudojami krūties ir kiaušidžių vėžio gydymui.

[0008] Neseniai klinikiniams tyrimams tapo prieinami GnRH antagonistai. GnRH antagonistai turi betarpišką poveikį hipofizei be agonistų atveju stebimo staigaus šuolio. Literatūroje buvo aprašytas GnRH antagonistų (paprastai dekapeptidų) panaudojimas krūties, kiaušidžių ir prostatos vėžiui gydyti. Kitas antagonistų panašiai kaip ir agonistų, panaudojimas yra endometriozė

[0009] (įskaitant skausmingąją endometriozę), gimdos mioma, kiaušidžių ir pieno liaukos cistinės ligos (įskaitant policistinę kiaušidžių ligą), prostatos hipertrofija, amenorėja (pvz. antrinė amenorėja) ir per daug ankstyvas lytinis

[0010] brendimas. Šie junginiai taip pat gali būti naudingi priešmenstruacinio sindromo (PMS) simptomų palengvinimui. Be to, antagonistai gali būti taikomi reguliuoti žinduolių patinų gonadotropinu sekrecijai norint stabdyti spermatogenezę (pvz. kai kontraceptikai vyrams) ir gydant vyrus-seksualinius nusikaltėlius. Svarbu paminėti, kad GnRH antagonistai (ir agonistai) rado pritaikymą terapijoje, kur yra pageidautinas grįžtamasis hipofizės-gonados ašies slopinimas.

[0011] Jau 50 metų androgenų išsiskyrimo sulaikymas yra efektyviausias sisteminis prostatos metastazinės karcinomos gydymas. Tai kas racionalu, yra paprasta - prostatos liaukos tinkamam augimui, palaikymui ir funkcionavimui yra reikalingi androgenai. Prostatos vėžys ir gerybinė prostatos hiperplazija vis dar yra papiltę vyrų tarpe ir vystosi aplinkoje, kur visą laiką yra androgenų. Taigi, naudojant GnRH antagonistą hipofizės-gonados ašies pertraukimui, sumažinamas androgenų gaminimasis ir gaunama auglio augimo moduliacija. Be to, GnRH antagonistai gali turėti tiesioginį efektą į auglio augimą blokuodami receptorius ant auglio ląstelių. Šio tipo vėžio, kuris tiesiogiai reaguoja ir į lytinius hormonus, ir į GnRH atveju, antagonistai turėtų efektyviai lėtinti auglio augimą pagal du mechanizmus. Kadangi GnRH receptoriai yra ant daugelio prostatos ir krūties vėžio ląstelių, dabartiniu metu manoma, kad GnRH antagonistai taip pat gali būti efektyvūs gydant auglius, kurie priklauso ne nuo hormonų. Naujos literatūros pavyzdžiai rodo, kad GnRH receptorių yra daugelyje vėžinių ląstelių linijų, įskaitant: • prostatos vėžį: GnRH agonistai ir iri vitro, ir in vivo turi tiesioginį inhibicinį poveikį ir į priklausančių nuo androgenų (LNCaP), ir į nepriklausančių nuo androgenų (DU 145) žmogaus prostatos vėžio ląstelių linijas. Montagnani et al., Arch. Ital. Urol. Androl. 1997, 69( 4), 257-263. GnRH antagonistai inhibuoja beplaukiu pelių nepriklausančio nuo androgeno PC-3 prostatos

[0012] • kiaušidžių vėžį: GnRH receptorių akivaizdus parodymas žmogaus kiaušidžių vėžio atveju duoda loginį pagrindą panaudoti GnRH analogais paremtas terapines strategijas šiai ligai. Srkalovic et al., Int. J. Oncol. 1998, 12( 3), 489-498. L. I T?VT U • krūties vėžį: Krūties vėžys yra labiausiai paplitęs virš 40 metų amžiaus moterų vėžinis susirgimas ir yra pagrindinė su vėžiu susijusių moterų mirčių priežastis. Sisteminė endokrininė intervencija yra būdinga daugumai pasirenkamų gydymo būdų, kontroliuojant užleistą krūties vėžį, ypatingai esant priklausomam nuo estrogeno vėžiui. Gonadotropiną išlaisvinančio hormono receptoriaus genai yra ekspresuojami žmogaus krūtyje su fibrocistine liga ir vėžiu. Kottler et al.r Int. J. Cancer 1997, 71( 4), 595-599.

[0013] Iki šiol prieinami GnRH antagonistai pirmiausia buvo GnRH peptidiniai analogai. Žr., pvz., International Publication No. WO 93/03058. Peptidinių hormonų peptidiniai antagonistai yra dažnai gana veiksmingi, tačiau peptidinių antagonistų naudojimas dažnai yra susijęs su problemomis, kadangi peptidus skaldo fiziologiniai fermentai ir jie dažnai blogai pasiskirsto gydomame organizme. Taigi, kaip vaistai, jie turi ribotą pritaikymą. Iš to seka, kad dabartiniu metu egzistuoja peptidinio hormono GnRH nepeptidinių antagonistų poreikis.

[0014] Šio išradimo tikslas yra sukurti mažos molekulinės masės nepeptidinius GnRH antagonistus, kurie išnaudotų abu aukščiau aprašytus veikimo mechanizmus. Nepeptidiniai GnRH agentai turi tinkamesnes fizikines, chemines ir biologines savybes, lyginant su peptidais ir bus tinkami vaistai ligoms, kurios yra tarpininkaujamos per hipofizės-gonados ašį, ir tiesiogiai taikant į receptorius ant auglio ląstelių. Reikia sukurti vaistus, kurie veiktų į šiuos receptorius ir gydytų ir priklausantį nuo hormonų, ir nuo jų nepriklausantį vėžį.

[0015] Kitas šio išradimo tikslas yra pateikti nepeptidinius junginius, kurie yra GnRH agentai (agonistai arba antagonistai), besirišančius su GnRH receptoriais ir tokiu būdu moduliuojančius aktyvumą ypatingai tokius, kurie yra veiksmingi GnRH antagonistai. Dar kitas šio išradimo tikslas yra pateikti efektyvų gydymą individams, kuriems yra reikalingas terapinis GnRH reguliavimas ir pateikti ligų ir būklių, kuriose tarpininkauja GnRH reguliavimas, gydymo būdus.

[0016] Tokie tikslai buvo pasiekti panaudojant šio išradimo nepeptidinius GnRH junginius, kurie yra tinkami kaip vaistai indikacijoms, kuriose tarpininkauja GnRH reguliavimas. Šio išradimo junginiai turi privalumą prieš peptidinius junginius, kadangi jie duoda geresnį biopasiskirstymą ir yra atsparūs fiziologinių fermentų vykdomai degradacijai. Šiame išradime taip pat pateikiami šių junginių sintezės būdai bei tarpiniai junginiai, tinkantys šiems junginiams pagaminti.

[0017]

[0018] X yra pasirinktas iš C=0, C=S, S=0 ir S(0)₂;

[0019] yra 5-naris heterociklinis žiedas, turintis nuo 1 iki 4, geriausia 2 arba

[0020] 3, heteroatomų, pasirinktų iš N, O ir S, o žiedas gali būti sotus, dalinai nesotus arba pilnai nesotus ir gali būti aromatinis;

[0021] _R¹ ir R² nepriklausomai vienas nuo kito yra pasirinkti iš H ir žemesniojo alkilo;

[0022] _R³ yra pasirinktas iš H, halogeno ir turinčio arba neturinčio pakaitų alkilo, alkenilo, alkinilo, cikloalkilo, heterociklo, arilo, heteroarilo, CH₂OR, OR ir C(0)0R, kur R yra pasirinktas iš turinčio arba neturinčio pakaitų alkilo, alkenilo, alkinilo, cikloalkilo, heterociklo, arilo ir heteroarilo ir kur bendras esančių anglies atomų skaičius (neįskaitant jokių galimų pakaitų) yra 1-12 ribose,

[0023] _R⁴ ir R⁵ nepriklausomai vienas nuo kito yra pasirinkti iš H, halogeno ir turinčio arba neturinčio pakaitų alkilo, alkenilo, alkinilo, cikloalkilo, heterociklo, arilo, heteroarilo, CH₂OR, OR ir C(0)0R, kur R yra toks, kaip apibūdinta aukščiau, ir kur bendras esančių anglies atomų skaičius (neįskaitant jokių galimų pakaitų) yra 1-12 ribose;

[0024] _R⁶ ir R⁷ nepriklausomai vienas nuo kito yra pasirinkti iš H, halogeno ir turinčio arba neturinčio pakaitų alkilo, alkenilo, alkinilo, cikloalkilo, heterociklo, arilo, heteroarilo, CH₂OR, OR ir C(0)0R, kur R yra toks, kaip apibūdinta aukščiau, ir kur bendras esančių anglies atomų skaičius (neįskaitant jokių galimų pakaitų) yra 1-12 ribose; arba R⁶ ir R⁷ paimti kartu su atomais, prie kurių jie yra prijungti, sudaro galintį turėti pakaitų 5- arba 6-narį žiedą kuriame gali būti iki keturių heteroatomų, pasirinktų iš O, N ir S;

[0025] _R⁸ yra lipofilinė liekana, pasirinkta iš turinčio ir neturinčio pakaitų alkilo, alkenilo, alkinilo, cikloalkilo, heterociklo. arilo, heteroarilo, CH₂OR, OR ir C(0)0R, kur R yra toks, kaip apibūdinta aukščiau, ir kur bendras esančių anglies atomų skaičius (neįskaitant jokių galimų pakaitų) yra 6-20 ribose; ir

[0026] R⁹ yra pasirinktas iš H ir turinčio arba neturinčio pakaitų alkilo, geriau žemesniojo alkilo.

[0027] =0; ir/arba R⁸ taip pat gali būti vandenilis;

[0028] ir/arba R gali būti COR arba vandenilis; ir/arba R⁸ gali turėti bet kokį norimą anglies atomų skaičių;

[0029] i_r/arba R⁸ ir R⁹ taip pat gali sudaryti žiedą ir/arba bet kokios dvi gretimos R grupės, tokios kaip R⁵ ir R⁶ arba _R³ ir R⁴, gali sudaryti žiedą tokį,

[0030] kaip aprašytas prie R⁶ ir R⁷_;

[0031] ir/arba R⁶ gali būti COR; ir/arba (het) grupė gali turėti pakaitų arba neturėti pakaitų.

[0032] iš heterociklinių grupių arba bet kokio junginio, kuris sudaro amidinį ryšį su I formulės azotu. Tai yra R⁸ ir R⁹ gali būti bet kokios grupės, pradedant nuo anglies, prijungtos prie I bendrosios formulės azoto.

[0033]

[0034] kurioje kintamieji yra tokie, kaip apibūdinta aukščiau.

[0035] Ypatingai tinkami yra junginiai, kuriųformulė III:

[0036] kurioje R⁸ yra apibūdintas aukščiau. Tinkamiausios R grupės yra: arilas, - Ch_h-arilas, -Ch_h-heteroarilas, -Ch_h-cikloalkilas ir -(CH2) n-0-arilas, kur n yra sveikas skaičius nuo 1 iki 4.

[0037]

[0038] Apart aukščiau duotų formulių junginių, šio išradimo GnRH agentai apima tokių junginių farmaciškai priimtinas druskas, multimerines formas, provaistus ir veikliuosius metabolitus. Tokie nepeptidiniai agentai yra farmaciškai tinkamesni už peptidinius agentus, nes jie turi geresnį biopasiskirstymąir atsparumą degradacijai, kurią vykdo fiziologiniai fermentai.

[0039] Šis išradimas taip pat yra susijęs su farmacinėmis kompozicijomis, į kurias įeina terapiškai efektyvus kiekis šio išradimo GnRH agento derinyje su farmaciškai priimtinu nešikliu arba skiedikliu. Be to, išradimas yra susijęs su žinduolių gonadotropinu sekrecijos reguliavimo būdais, apimančiais šio išradimo GnRH agentų terapiškai efektyvaus kiekio skyrimą.

[0040] Šis išradimas taip pat yra susijęs su būdais ir tarpiniais junginiais, tinkančiais I formulės junginiams gauti.

[0041] Kitos išradimo ypatybės, tikslai ir privalumai paaiškės iš toliau duodamo smulkaus šio išradimo aprašymo ir tinkamiausių jo įgyvendinimo variantų.

[0042] Smulkus išradimo aprašymas ir tinkamiausi jo įgyvendinimo variantai

[0043] Kai kurie šio išradimo junginiai turi vieną arba daugiau asimetrinių centrų ir gali duoti enantiomerus, diastereoizomerus ir kitas stereoizomerines formas. Laikoma, kad išradimas apima visus tokius galimus stereoizomerus, o taip pat jų racemines ir optiškai grynas formas. Jeigu čia aprašytuose junginiuose yra olefininiai dvigubieji ryšiai, laikoma, kad išradimas apima ir E, ir Z geometrinius izomerus.

[0044] Čia pateikiamose formulėse gali būti tautomerijos reiškinys. Nors šiame aprašyme parodytos formulės vaizduoja tik vieną iš galimų tautomerinių formų, reikėtų suprasti, kad nepaisant to išradimas apima visas tautomerines formas.

[0045] Terminas "alkilas" reiškia tiesiosios ir šakotosios grandinės alkilo grupes, turinčias nuo vieno iki dvylikos anglies atomų. Alkilo grupių

[0046] pavyzdžiais yra metilas (Me)_t etilas, n-propilas, izopropilas, butilas, izobutilas, antr.-butilas, tret-butilas (tBu), pentilas, izopentilas, tret-pentilas, heksilas, izoheksilas ir pan. Terminas "žemesnysis alkilas" reiškia alkilą turintį 1-8 anglies atomus (C_i.₈-alkilas). Tinkami turintys pakaitų alkilai yra: fluormetilas, difluormetilas, trifluormetilas, 2-fluoretilas, 3-fluorpropilas, hidroksimetilas, 2-hidroksietilas, 3-hidroksipropilas ir panašūs.

[0047] Terminas "alkenilas" reiškia tiesiosios ir šakotosios grandinės alkenilo grupes, turinčias nuo 2 iki 12 anglies atomų. Iliustracinės alkileno grupės yra prop-2-enilas, but-2-enilas, but-3-enilas, 2-metilprop-2-enilas, heks-2-enilas ir panašios.

[0048] Terminas "alkinilas" reiškia tiesiosios ir šakotosios grandinės alkinilo grupes, turinčias nuo 2 iki 12 anglies atomų. Alkinilo grupių pavyzdžiais yra prop-2-inilas, 3-metilpent-4-inilas, heks-2-inilas ir panašios.

[0049] Terminas "karbociklas" reiškia monociklinę arba policiklinę žiedinę struktūrą iš anglies atomų (be heteroatomų), turinčią kiekviename žiede 3-7 anglies atomus, kuri gali būti soti, dalinai soti arba nesoti. Karbociklų pavyzdžiais yra cikloalkilai ir arilai.

[0050] Terminas "heterociklas" reiškia monociklinę arba policiklinę žiedinę struktūrą su vienu arba daugiau heteroatomų, pasirinktų iš N, O ir S, ir turinčią nuo 3 iki 7 atomų (anglies atomai plius bet kokie heteroatomai) kiekviename žiede, kuris gali būti sotus, dalinai sotus arba nesotus. Heterociklų pavyzdžiais yra tetrahidrofuranilas, tetrahidropiranilas, azetidinilas, pirolidnilas, piperidinilas, piperazinilas ir panašūs.

[0051] Čia naudojamas terminas "cikloalkilai" reiškia sočius karbociklus, turinčius 3-12 anglies atomų, įskaitant biciklines ir triciklines cikloalkilines struktūras. Tinkamais cikloalkilais yra ciklopropilas, ciklobutilas, ciklopentilas, cikloheksilas, cikloheptilas ir panašūs.

[0052] Terminai "arilai" ir "heteroarilai" reiškia monociklines ir policiklines nesočias arba aromatines žiedines struktūras, kur "arilas" reiškia karbociklines, o "heteroarilas" - heterociklines struktūras. Aromatinių žiedinių struktūrų pavyzdžiais yra fenilas, naftilas, 1,2,3,4-tetrahidronaftilas, furilas, tienilas, pirolilas, piridilas, piridinilas, pirazolilas, imidazolilas, pirazinilas, piridazinilas, 1,2,3-triazinilas, 1,2,4-oksadiazolilas, 1,3,4-oksadiazolilas, 1-H-tetrazol-5-ilas, indolilas, chinolinilas, benzofuranilas, benzotiofenilas

[0053] (tianaftalenilas) ir panašios. Tokiose liekanose gali būti vienas arba daugiau tinkamų pakaitų, pavyzdžiui, pakaitų, pasirinktų iš halogeno (F, Cl, Br arba I); žemesniojo alkilo; OH; NO₂; CN; CO₂H; O-žemesnysis alkilas; aril-žemesnysis alkilas; CO₂CH₃; CONH₂; OCH₂CONH₂; NH₂; SO₂NH₂; OCHF₂; CF₃; OCF₃; ir panašių. Tokiose liekanose pakaitais taip pat gali būti kondensuotos žiedinės struktūros arba tilteliai, pavyzdžiui 0CH₂-0.

[0054] Terminas "aril-žemesnysis alkilas" reiškia žemesnįjį alkilą kuris turi arilo liekaną. Pavyzdžiais yra benzilas, fenetilas, piridilmetilas, naftilmetilas ir pan. Aril-žemesniajame alkile gali būti pakaitų.

[0055] Bendru atveju I formulės kintamųjų įvairiose liekanose arba funkcinėse grupėse gali būti vienas arba daugiau tinkamų pakaitų. Pakaitų pavyzdžiais yra halogenas (F, Cl, Br arba I), žemesnysis alkilas, -OH, -NO₂, -CN, -CO₂H, - O-žemesnysis alkilas, -arilas, -aril-žemesnysis alkilas, -C0₂CH_3i -CONH₂, - OCH₂CONH₂, -NH₂, -SO₂NH₂, halogenalkilas (pvz., -CF₃, -CH₂CF₃), -0-halogenalkilas (pvz., -OCF₃, -OCHF₂) ir pan.

[0056] Apart I formulės junginių, šio išradimo GnRH agentai apima I formulės junginių farmaciškai priimtinas druskas, multimerines formas, provaistus ir veikliuosius metabolitus. Tokie nepeptidiniai agentai yra farmaciškai tinkamesni už peptidinius agentus, nes jie turi geresnį biopasiskirstymą ir atsparumą degradacijai, kurią vykdo fiziologiniai fermentai.

[0057] Be to, laikoma, kad I formulės junginiai apima, jeigu yra tinkamos, šių junginių solvatjjotas ir nesolvatuotas formas. Taigi, I formulė apima junginius, turinčius nurodytą struktūrą įskaitant hidratuotas ir nehidratuotas formas.

[0058] Kaip nurodyta aukščiau, šio išradimo GnRH agentai taip pat apima I formulės junginių veiklias tautomerines ir stereoizomerines formas, kurios gali būti nesunkiai gaunamos naudojant žinomus būdus. Pavyzdžiui, optiškai aktyvūs (R) ir (S) izomerai gali būti pagaminami panaudojant stereospecifinę sintezę, pvz. naudojant chiralinius sintonus ir chiralinius reagentus, arba perskiriant raceminius mišinius žinomais būdais.

[0059] GnRH agentai taip pat apima I formulės junginių veikliųjų formų multivalentines arba multimerines formas. Tokie "multimerai" gali būti pagaminti prijungiant arba sustatant daug veikliojo junginio kopijų labai arti viena kitos, pvz. panaudojant nešiklio liekanos duodamus tiltelius. Gali būti ištirti įvairių dimensijų multimerai (t.y. turintys įvairius veikliojo junginio kopijų skaičius), nustatant receptoriaus surišimo atžvilgiu optimalų multimero dydį. Tokių veikliųjų receptorių rišančių junginių multivalentinių formų su optimaliu atstumu tarp receptorių rišančių liekanų sukūrimas gali sustiprinti receptoriaus surišimą (žr. pavyzdžiui, Lee et al., Biochem., 1984, 23:4255). Specialistas gali kontroliuoti multivalentiškumą ir atstumus, pasirinkdamas tinkamą nešiklio liekaną arba jungių elementus. Tinkamos liekanos yra kieti molekuliniai nešikliai, turintys daug funkcinių grupių, kurios gali reaguoti su funkcinėmis grupėmis, sujungtomis su šio išradimo junginiais. Daugybė nešiklio liekanų gali būti naudojama labai aktyviems multimerams pagaminti, įskaitant baltymus, tokius kaip BSA (jaučio serumo albuminas) arba HAS, peptidus, tokius kaip pentapeptidai, dekapeptidai, pentadekapeptidai ir panašūs, bei nebiologinius junginius, pasirinktus dėl jų naudingų poveikių į sugebėjimą absorbuotis, transportą ir pastovumą tiksliniame organizme. Funkcinės grupės nešiklio liekanoje, tokios kaip amino-, sulfhidrilo, hjdroksilo ir alkilamino-grupės, gali būti pasirinktos taip, kad būtų gaunami stabilūs ryšiai su išradimo junginiais, optimalus atstumas tarp imobilizuotų junginių ir optimalios biologinės savybės.

[0060] Be to, šio išradimo GnRH agentai apima I formulės junginių farmaciškai priimtinas druskas. Terminas "farmaciškai priimtina" reiškia druskos formą kuri yra farmakologiškai tinkama ir iš esmės netoksiška subjektui, kuriam yra duodamas GnRH agentas. Farmaciškai priimtinos druskos apima įprastas adityvines druskas su rūgštimis arba adityvines druskas su bazėmis, sudarytas iš tinkamos netoksiškos organinių arba neorganinių rūgščių arba neorganinių bazių. Adityvinių druskų su rūgštimis pavyzdžiais yra druskos, gautos iš neorganinių rūgščių, tokių kaip hidrochlorido rūgštis, hidrobromido rūgštis, hidrojodido rūgštis, sulfato rūgštis, sulfamo rūgštis, fosfato rūgštis ir nitrato rūgštis, ir druskos, gautos iš organinių rūgščių, tokių kaip p-toluensulfonrūgštis, metansulfonrūgštis, etandisulfonrūgštis, izetono rūgštis, oksalo rūgštis, p-bromfenilsulfonrūgštis, karbonato rūgštis, gintaro rūgštis, citrinų rūgštis, benzenkarboksirūgštis, 2-acetoksibenzenkarboksirūgštis, acto rūgštis, fenilacto rūgštis, propiono rūgštis, glikolio rūgštis, stearino rūgštis, pieno rūgštis, obuolių rūgštis, vyno rūgštis, askorbo rūgštis, maleino rūgštis, hidroksimaleino rūgštis, glutamo rūgštis, salicilo rūgštis, sulfanilo rūgštis ir fumaro rūgštis. Adityvinių druskų su bazėmis pavyzdžiais yra druskos su amonio hidroksidais (pvz.t ketvirtiniu amonio hidroksidu, tokiu kaip tetrametilamonio hidroksidas), druskos su neorganinėmis bazėmis, tokiomis kaip šarminių arba žemės šarminių metalų (pvz., natrio, kalio, ličio, kalcio arba magnio) hidroksidai, ir druskos su organinėmis bazėmis, tokiomis kaip aminai, benzilaminai, piperidinai ir pirolidinai.

[0061] Terminas "provaistas" reiškia I formulės junginio metabolinį pirmtaką

[0062] (arba jo druską), kuris yra farmaciškai priimtinas. Provaistas gali būti neaktyvus, kai jį gauna subjektas, bet in vivo jis yra paverčiamas I formulės veikliuoju junginiu. Terminas "veiklusis metabolitas" reiškia I formulės junginio metabolinį produktą kuris yra farmaciškai priimtinas ir veiksmingas. I formulės junginių provaistai ir veiklieji metabolitai gali būti nustatyti naudojant specialistams žinomus būdus.

[0063] Įvairių junginių formų aktyvumo' lygiui GnRH sistemoje nustatyti gali būti naudojamį įvairiausi žinomi testai ir metodikos. Norint nustatyti sąveiką su dominančiu receptoriumi yra naudojami ligando surišimo testai. Kai domina surišimas, gali būti naudojamas žymėtas receptorius, kur žymė yra fluorescuojanti grupė, fermentas, radioizotopas arba panaši, kuri leidžia registruoti kiekybinį pokytį susijungiant su receptoriumi. Kitu atveju, specialistas gali pateikti antikūną receptoriui, kuris yra žymėtas ir gali duoti signalo stiprinimą. Surišimą taip pat galima nustatyti panaudojant su receptoriumi surišto ligando konkurencinį išstūmimą, kur ligandas yra pažymėtas dėtektuojama žyme. Kai domina agonisto ir/arba antagonisto aktyvumas, gali būti tiriamas sveikas organizmas arba ląstelė ir gali būti matuojami organizmo arba ląstelės funkcijų pokyčiai kaip atsakas į dominančio junginio surišimą. Ląstelių atsakui sekti yra įvairių prietaisų tokių kaip mikrofiziometras, gaunamas iš Molecular Devices, Redvvood City, California. Specialistams yra žinomi in vitro ir in vivo testai, tinkami matuoti GnRH antagonistų aktyvumui. Žr. pvz., Bovvers et al., "LH suppresion in cultured rat pitutary cells treated with 1 ng of LHRH", Endocrinology, 1980, 106:675-683 { in vitro) ir Corbin et al., "Antiovulatory activity (AOA) in rats", Endocr. Res. Commun. 1975, 2:1-23 ( in vivo). Konkrečios galimų naudoti testų metodikos yra aprašytos žemiau.

[0064] Pavyzdžiui, GnRH receptoriaus antagonistai gali būti funkciškai įvertinti matuojant ekstraląstelinio parūgštėjimo greičių pokytį tokiu būdu. Yra nustatoma junginių geoa blokuoti ekstraiąstennio parugstejimo, kuriame tarpininkauja GnRH HEK 293 ląstelėse, ekspresuojančiose žmogaus GnRH receptorius, greitį, kaip junginio antagonistinio aktyvumo matas in vitro. Maždaug 100000 ląstelių/kamerai yra imobilizuojama agarozės suspensijos terpėje (Molecular Devices) ir atliekama perfuzija su nebuferinta MEM terpe, naudojant Cytosensor® mikrofiziometrą (Molecular Devices). Ląstelėms leidžiama pasiekti pusiausvyrą kol bazinis parūgštėjimo greitis pasidaro stabilus (maždaug 1 vai.). Nustatomos kontrolinės dozės-atsako į GnRH (nuo 10"11 M iki 10'⁷ M) kreivės. Prieš stimuliuojant GnRH, junginiai inkubuojami 15 minučių ir įvertinamas antagonistinis aktyvumas. Po inkubacijos su tiriamaisiais junginiais gaunamos pakartotinės dozės-atsako į GnRH kreivės, nesant arba esant įvairioms tiriamojo junginio koncentracijoms. Atliekama Schild'o regresinė junginių analizė norint nustatyti, ar junginiai antagonizuoja GnRH tarpininkaujamus ekstraląstelinio parūgštėjimo greičių padidėjimus dėl konkurencinės sąveikos su GnRH receptoriumi.

[0065] Kitame teste gali būti matuojamas bendras inozitolfosfatų susikaupimas, panaudojant ekstrakciją iš ląstelių skruzdžių rūgštimi, o po to atskiriant fosfatus Dowex kolonėlėmis. Panaudojant tripsiną ląstelės yra suskaldomos, paskirstomos į 12 duobučių plokšteles ir pažymimos ³H-mioinozitoliu (0,5 Ci - 2 mCi mililitrui) laikant 16-18 vai. inozitolio neturinčioje terpėje. Po to terpė yra nusiurbiama ir reakcija stabdoma pridedant ledu atšaldytos 10 mM skruzdžių rūgšties, kuri taip pat tarnauja ląstelės lipidų ekstrakcijai. Inozitolfosfatai atskiriami jonų mainų chromatografija per Dowex kolonėles, kurios po to plaunamos 5 ml 10 mM mioinozitolio ir 10 mM skruzdžių rūgšties. Po to kolonėlės plaunamos 10 ml 60 mM natrio formiato ir 5 mM borakso, o bendras inozitolfosfatas eliuuojamas 4,5 ml 1M amonio formiato, 0,1 M skruzdžių rūgšties.

[0066] Tinkamiausi šio išradimo GnRH agentai yra tokie, kurie turi nanomolių eilės K_i reikšmę.

[0067] Tinkamiausi šio išradimo junginiai yra parodyti tolimesnėje lentelėje:

[0068] Šio išradimo farmacinės kompozicijos turi efektyviai GnRH slopinantį kiekį bent vieno šio išradimo GnRH agento ir inertinį arba farmaciškai priimtiną nešiklį arba skiediklį. Šios kompozicijos gali būti pagamintos vienetinių dozių forma, tinkančia norimam vartojimo būdui, pvz., parenteriniam arba peroraliniam.

[0069] Gydyti ligoms arba būklėms, kuriose tarpininkauja GnRH agonizmas arba antagonizmas, šio išradimo kompozicijos yra skiriamos tinkamos vaisto formos pavidalu, pagamintu sumaišant terapiškai efektyvų kiekį (t.y. GnRH moduliuojantį kiekį, kuris yra terapiškai veiksmingas) bent vieno šio išradimo GnRH agento (kaip veikliojo ingrediento) su vienu arba daugiau farmaciškai tinkamų nešiklių arba skiediklių. Tokios kompozicijos gali būti pagaminamos pagal įprastas metodikas, pvz. atitinkamai sumaišant, granuliuojant ir presuojant arba ištirpinant ingredientus žinomais būdais. Esant reikalui, farmacinėse kompozicijose gali būti naudojama vienas arba daugiau skirtingų veikliųjų ingredientų, tokių kaip skirtingi GnRH antagonistai.

[0070] Farmacinis nešiklis gali būti arba kietas, arba skystas. KieTų nesIKlTų pavyzdžiais yra laktozė, sacharozė, talkas, želatina, agaras, pektinas, gumiarabikas, magnio stearatas, stearino rūgštis ir pan. Iliustraciniais skystais nešikliais yra sirupas, žemės riešutų aliejus, alyvų aliejus, vanduo ir pan. Panašiui būdu, į nešiklį arba skiediklį gali įeiti specialistams žinomos uždelsto išskyrimo arba išskyrimo po tam tikro laiko medžiagos, tokios kaip glicerilmonostearatas arba glicerildistearatas, vienos arba derinyje su vašku, etilceliulioze, hidroksipropilmetilceliulioze, metilmetakrilatu arba pan.

[0071] Gali būti naudojamos įvairiausios farmacinės formos. Pavyzdžiui, jeigu yra naudojamas kietas nešiklis, preparatas gali būti talbletės, kietos želatininės kapsulės, miltelių, žirnelių, piliulių arba pastilių formos. Kieto nešiklio kiekis gali kisti plačiose ribose, pavyzdžiui, nuo maždaug 25 mg iki maždaug 1 g. Jeigu yra naudojamas-skystas nešiklis, preparatas gali būti sirupo, emulsijos, minkštos želatininės kapsulės, sterilių injekcinių tirpalų, suspensijos ampulėje arba buteliuke arba nevandeninės skystos suspensijos formos.

[0072] Norint gauti stabilią vandenyje tirpią dozuotą formą I formulės junginio farmaciškai priimtina druska gali būti ištirpinama organinės arba neorganinės rūgšties vandeniniame tirpale, tokiame kaip 0,3 M gintaro rūgšies tirpalas arba, dar geriau, citrinų rūgšties tirpalas. Jeigu tirpi druskos forma nėra prieinama, agentas gali būti ištirpinamas viename arba daugiau tinkamų kotirpiklių. Tinkamų kotirpiklių pavyzdžiais yra alkoholis, propilenglikolis, polietilenglikolis 300, polisorbatas 80, glicerolis ir panašūs, kurių koncentracijos yra nuo 0 % iki 60 % bendro tūrio. Pavyzdiniame įgyvendinimo variante I formulės junginys yra ištirpinamas DMSO ir praskiedžiamas vandeniu. Kompozicija taip pat gali būti I formulės junginio druskos tirpalo atitinkame vandeniniame tirpiklyje, tokiame kaip vanduo, izotoninis valgomosios druskos arba dekstrozės tirpalas, formos.

[0073] Šio išradimo farmacinės kompozicijos gali būti pagaminamos naudojant įprastas metodikas, pvz. sumaišymo, ištirpinimo, granuliavimo, žirnelių pagaminimo, nusodinimo, emulgavimo, įkapsuliavimo, įkorporavimo arba liofilizavimo būdus. Farmacinės kompozicijos gali būti sukomponuotos įprastu būdu, naudojant vieną arba daugiau fiziologiškai priimtinų nešiklių turinčių pagalbinių ir papildomų medžiagų kurios palengvina veikliojo junginio

[0074] pavertimą farmacijoje naudojamais preparatais. Atitinkamos receptūros yra pasirinktos atsižvelgiant į pasirinktą vartojimo būdą.

[0075] Gaminant injekcijoms skirtus preparatus, šio išradimo agentai gali būti sukomponuojami vandeniniuose tirpaluose, geriausia fiziologiškai priimtinuose buferiuose, tokiuose kaip Hanks'o tirpalas, Ringerio tirpalas arba fiziologinis druskos tirpalas. Vartojimo per gleivinę receptūrose yra naudojamos atitinkamos prasiskverbimą per barjerą didinančios medžiagos ir jos gali būti pasirinktos iš šioje srityje žinomų medžiagų.

[0076] Peroraliniam vartojimui agentai gali būti nesunkiai paversti vaisto forma sumaišant veiklųjį ingredientą(us) su specialistams žinomais farmaciškai priimtinais nešikliais. Tokie nešikliai leidžia šio išradimo junginius įkomponuoti į tabletes, piliules, dražė, kapsules, skysčius, gelius, sirupus, tirštas suspensijas, suspensijas ir pan., kurias gydomas pacientas turi sugerti. Peroralinio vartojimo farmaciniai preparatai gali 'būti gaunami, sumaišant vieną arba daugiau agentų su kieta pagalbine medžiaga, jeigu reikia, sumalant gautą mišinį, mišinį paverčiant granulėmis, ir, jeigu norima, pridėjus tinkamų pagalbinių medžiagų pagaminamos tabletės arba tablečių šerdys. Tinkamomis pagalbinėmis medžiagomis yra užpildai, tokie kaip cukrus (pvz., laktozė, sacharozė, manitolis arba sorbitolis); ir celiuliozės preparatai (pvz., kukurūzų krakmolas, kviečių krakmolas, ryžių krakmolas, bulvių krakmolas, želatina, tragakanto den_/a, metilceliuliozė, hidroksipropilmetilceliuliozė, natrio karboksimetilceliuliozė ir/arba polivinilpirolidonas (PVP)). Jeigu norima, galima pridėti dezintegrantų, tokių kaip susiūtas PVP, agaras arba algino rūgštis arba jos druska, kaip antai natrio alginatas.

[0077] Dražė šerdys yra padengiamos tinkamomis dangomis. Šiam tikslui gali būti naudojami koncentruoti cukraus tirpalai, kuriuose gali būti gumiarabiko, PVP, Carbopol™ gelio, polietilenglikolio, titano dioksido, lakavimo tirpalų ir/arba vienas arba daugiau tinkamų organinių tirpiklių arba tirpiklių mišinių. Į tablečių arba dražė dangas gali būti pridėta dažų arba pigmentų įvairių veikliojo junginio dozių identifikavimui arba charakterizavimui.

[0078] į farmacinių preparatų formas, kurios gali būti vartojamos peroraliniu būdu, įeina iš želatinos padarytos sumaunamos kapsulės, o taip pat ir minkštos, iš želatinos ir plastifikatoriaus, tokio kaip glicerolis arba sorbitolis, padarytos užlydytos kapsulės. Sumaunamose kapsulėse gali būti veiklusis

[0079] ingredientas mišinyje su vienu arba daugiau užpildų, tokių kaip laktozė, rišikliais, tokiais kaip krakmolai, ir/arba tepalais, tokiais kaip talkas arba magnio stearatas, ir, esant reikalui, stabilizatoriais. Minkštose kapsulėse veikliusis junginys gali būti ištirpintas arba suspenduotas tinkamame skystyje, tokiame kaip riebaliniai aliejai, skystas parafinas arba skystas polietilenglikolis. Be to, gali būti pridėta stabilizatorių. Žandinio vartojimo kompozicijos gali būti pagamintos tablečių arba piliulių formos įprastu būdu.

[0080] Vartojimui inhaliacijų būdu šio išradimo junginiai gali būti patogiai pateikiami aerozolinio purškimo iš vienodą slėgį palaikančių flakonų arba pulverizatorių forma, naudojant tinkamą propelentą pvz. dichlordifluormetaną trichlorfluormetaną dichlortetrafluoretaną anglies dioksidą arba kitas tinkamas dujas. Vienodą slėgį palaikančio aerozolio atveju dozė gali būti nustatyta įdedant vožtuvą kad būtų paduodamas apibrėžtas kiekis. Kapsulės ir patronai iš, pavyzdžiui, želatinos, skirti naudoti inhaliatoriuje arba įpūtiklyje, gali būti pagaminami įdedant junginio ir tinkamo miltelių pavidalo pagrindo, tokio kaip laktozė arba krakmolas, mišinį.

[0081] Agentai gali būti sukomponuoti parenteriniam vartojimui injekcijų būdu, pvz. dozuotomis injekcijomis, arba nepertraukiamai infuzijai. Injekcijoms skirtos vaisto formos gali būti pateikiamos vienetinėmis dozėmis, pvz. ampulėmis, arba daugelį dozių turinčiuose konteineriuose, pridėjus apsaugančios medžiagos. Kompozicijos gali būti suspensijų, tirpalų arba emulsijų alyvos tipo arba vandeniniuose tirpikliuose formos, ir jose gali būti formą palaikančių agentų, kaip antai suspenduojančių, stabilizuojančių ir/arba disperguojančių agentų.

[0082] Į parenteriniam varojimui skirtas vaisto formas įeina veikliojo junginio vandenyje tirpios formos vandeniniai tirpalai. Be to, gali būti pagamintos veikliųjų junginių suspensijos kaip atitinkamos injekcinės suspensijos aliejuose. Tinkamais lipofiliniais tirpikliais arba skiedikliais yra riebaliniai aliejai, tokie kaip sezamo aliejus, arba sintetiniai riebalų rūgščių esteriai, tokie kaip etiloleatas arba trigliceridai, arba liposomos. Vandeninėse injekcijoms skirtose suspensijose gali būti medžiagų, kurios padidina suspensijos klampumą, tokių kaip natrio karboksimetilceliuliozė, sorbitolis arba dekstranas. Esant reikalui, suspensijose gali būti tinkamų stabilizatorių arba

[0083] agentų, kurie padidina junginių tirpumą ir galimybę pagaminti labai koncentruotus tirpalus.

[0084] Kitu atveju, veiklusis ingredientas gali būti miltelių formoje, kuriuos prieš vartojimą reikia praskiesti tinkamu tirpikliu, pvz. steriliu pirogenų neturinčiu vandeniu. Junginiai taip pat gali būti įdėti ir į rektalines kompozicijas, tokias kaip žvakutės arba sulaikymo klizmos, pvz. turinčias įprastus žvakučių pagrindus, kaip antai kakavos sviestą arba kitus gliceridus.

[0085] Apart anksčiau aprašytų vaisto formų, junginiai gali boti sukomponuoti depo preparatų pavidalu. Tokios ilgai veikiančios vaisto formos gali būti vartojamos implantuojant (pavyzdžiui, po oda arba į raumenis) arba kaip intraraumeninės injekcijos. Pavyzdžiui, junginiai gali būti sukomponuoti su tinkamomis polimerinėmis arba hidrofobinėmis medžiagomis (pavyzdžiui, kaip emulsijos priimtiname aliejuje) arba įkomponuoti į jonitines dervas, arba pagaminti jų sunkiai tirpstantys dariniai, pavyzdžiui, sunkiai tirpstanti druska.

[0086] Tinkamo farmacinio nešiklio išradimo hidrofobiniams junginiams pavyzdys yra kotirpiklių sistema, į kurią įeina benzilo alkoholis, nepolinė paviršinio aktyvumo medžiaga, besimaišantis su vandeniu organinis polimeras ir vandeninė fazė. Kotirpiklių sistema gali būti VPD kotirpiklių sistema (VPD yra 3 % masė/tūris benzilo alkoholio, 8 % masė/tūris nepolinės paviršinio aktyvumo medžiagos - polisorbato 80 ir 65 % masė/tūris polietilenglikolio 300 tirpalas, praskiestas iki reikiamo tūrio absoliučiu etanoliu). VPD kotirpiklių sistema (VPD:5W) susideda iš VPD, praskiestos 1:1 5 % dekstroze vandens tirpale. Ši kotirpiklių sistema gerai tirpina hidrofobinius junginius, o gauta kompozicija turi mažą toksiškumą sistemiškai vartojant. Suprantama, kad kotirpiklių sistemos proporcijos gali būti keičiamos priklausomai nuo tirpumo ir toksiškumo charakteristikų. Be to, gali būti keičiama kotirpiklių komponentų tapatybė: pavyzdžiui, vietoj polisorbato 80 gali būti naudojamos kitos mažai toksiškos paviršinio aktyvumo medžiagos; gali būti keičiamas polietilenglikolio frakcijos dydis; galima pridėti vieną arba daugiau biologiškai priimtinų polimerų (pvz. PVP) arba jais pakeisti polietilenglikolį; o dekstrozė gali būti pakeista kitais cukrais arba polisacharidais.

[0087] Kitu atveju, hidrofobiniams farmaciniams junginiams gali būti naudojamos kitos įvedimo sistemos. Liposomos ir emulsijos yra gerai žinomi hidrofobinių vaistų įvedimo tirpiklių arba nešiklių pavyzdžiai ir gali būti naudojamos atitinkamiems preparatams pagaminti. Taip pat gali būti naudojami kai kurie organiniai tirpikliai, kaip antai dimetilsulfoksidas, nors tai gali sukelti toksiškumo padidėjimą. Be to, junginiai gali būti įvedami naudojant prolonguoto išskyrimo sistemą tokią kaip kietų hidrofobinių polimerų kuriuose yra terapinio agento, pusiau laidžias matricas. Buvo rastos įvairios prolonguoto išskyrimo medžiagos ir jas žino specialistai. Prolonguoto išskyrimo kapsulės, priklausomai nuo jų cheminės prigimties, išskiria junginius per laikotarpį nuo kelių savaičių iki daugiau nei 100 dienų. Priklausomai nuo terapinio reagento cheminės prigimties ir biologinio stabilumo gali būti naudojamos papildomos baltymo stabilizavimo strategijos.

[0088] Farmacinėse kompozicijose taip pat gali būti tinkamų kietos arba gelio fazės nešiklių arba pagalbinių medžiagų. Tokių nešiklių arba pagalbinių medžiagų pavyzdžiais yra kalcio karbonatas, kalcio fosfatas, cukrai, krakmolai, celiuliozės dariniai, želatina ir polimerai, tokie kaip polietilenglikoliai.

[0089] Kai kurie šio išradimo junginiai gali būti pateikiami kaip druskos su farmaciškai priimtinais priešjoniais. Farmaciškai priimtinos druskos gali būti sudarytos su daugeliu rūgščių, įskaitant hidrochlorido, sulfato, acto, pieno, vyno, obuolių gintaro ir panašias rūgštis. Druskos yra linkę geriau tirpti vandeniniuose arba kituose protoniniuose tirpikliuose nei atitinkamos laisvos bazės.

[0090] Reikėtų suprasti, kad konkrečios šio išradimo kompozicijose naudojamų agentų dozės keisis priklausomai nuo konkretaus naudojamo komplekso, konkrečios vaistine forma paverstos kompozicijos, vartojimo būdo ir konkrečios gydomos vietos, šeimininko ir ligos. Optimalias dozes išvardintoms būklėms gali nustatyti specialistai, naudodami įprastus dozės nustatymo testus, atsižvelgiant į duoto junginio eksperimentinius duomenis. Peroralinio vartojimo atveju pavyzdinė paprastai vartojama dienos dozė bus nuo maždaug 0,001 iki maždaug 1000 mg/kg kūno masės, gydymo kursus kartojant atitinkamais intervalais. Provaistų vartojimo atveju dozės bus imamos tokios, kurios yra chemiškai ekvivalentinės pilnai veikliųjų junginių dozėms.

[0091] Toliau yra duodami konkrečių sio išradimo farmacinių preparatų pavyzdžiai.

[0092] Parenterinė kompozicija: Norint pagaminti šio išradimo farmacinę kompoziciją tinkamą vartoti injekcijomis, 100 mg I formulės junginio farmaciškai priimtinos vandenyje tirpios druskos ištirpinama DMSO ir sumaišoma su 10 ml 0,9 % sterilaus valgomosios druskos tirpalo. Gautas mišinys supilamas į vienetines dozuotas formas, tinkamas vartoti injekcijų būdu.

[0093] Peroralinė kompozicija: Norint pagaminti peroraliniu būdu vartojamą farmacinę kompoziciją 100 mg j formulės junginio sumaišoma su 750 mg laktozės. Gautas mišinys sudedamas į vienetines dozuotas formas, tinkamas vartoti peroraliniu būdu, tokias kaip kieta želatininė kapsulė.

[0094] GnRH REAGENTU IR JUNGINIU SINTEZĖ

[0095] Konstrukciniai blokai naftalino pagrindu: Tinkamas acilinimo agentas pagaminamas panaudojant Frydelio-Kraftso alkilinimų seką kaip parodyta žemiau:

[0096] [ 3 I koncentruotos hidrochlorido rūgšties, esančios didelėje Erlenmejerio kolboje, dalimis pridedama 2,5-dimetil-2,5-heksandiolio (200 g, 1,37 mmol). Diolis greitai ištirpsta hidrochlorido rūgštyje ir iš tirpalo į nuosėdas iškrenta susidaręs norimas produktas - 2,5-dichlor-2,5-dimetilheksanas. Reakcijos mišinys maišomas kambario temperatūroje 4 valandas. Supilama 1 i ou _% etiiacetaio neKsanuose, aisKinamas organinis siuoKsnis ir plaunamas kelis kartus vandeniu (kol pagal pH popierėlį pasidaro neutralus). Organiniai tirpikliai nugarinami vakuume kambario temperatūroje. Negrynas 2,5-dichlor-2,5-dimetilheksanas ištirpinamas heksanuose ir perleidžiamas per silikagelio sluoksnį (10:1), išplaunant heksanais. Ši galutinė filtravimo stadija po organinio tirpiklio nugarinimo vakuume duoda baltą kietą medžiagą. Gryno 2,5-dichlor-2,5-dimetilheksano gauta 230 g, 92 % išeiga. ¹H BMR (CDCb, ₆): 1,96 (4H, s); 1,61 (12H, s).

[0097] Naudojant panašią metodiką 2,4-dimetil-2,4-pentandiolis buvo paverstas į 2,4-dichlor-2,4-dimetilpentaną. ¹H BMR (CDCb, S): 2,42 (2H, s); 1,73 (12H, s). 1 . 1 . 4 . 4 . 6 - Pentametil - 1 . 2 . 3 . 4 - tetraJiidronaftalenas 4: l 2,5-dichlor-2,5-dimetilheksano 2 (10 g, 54,7 mmol) tirpalą toluene (270 ml, 0,2 M) lėtai per 15 minučių pridedama kieto aliuminio trichlorido (5,47 g, 41 mmol). Reakcija pasibaigia po 10 min., kontroliuojant plonasluoksne chromatografija (TLC) heksanuose. Nesureagavęs aliuminio trichloridas lėtai per 10 min. suskaldomas vandeniu. Dar pridedama tolueno (250 ml) ir ekstrahuojamas produktas iš vandeninio sluoksnio. Organinis sluoksnis perleidžiamas per silikagelio sluoksnelį (40 g), eliuuojant toluenu. Organinis sluoksnis nugarinamas vakuume iki sausos liekanos ir gaunamas 1,1,4,4,6-pentametil-1,2,3,4-tetrahidronaftalenas 4 (11 g, 97 % išeiga). BMR: 1,29 (s, 6H), 1,28 (s, 6H), 1,69 (s, 4H), 2,32 (s, 3H), 7,22 (d, 1H), 7,12 (s, 1H), 6,97 (dd, 1H).

[0098] Metilo 5- 1( 3, 5, 5, 8, 8- pentametil- 5, 6, 7, 8- tetrahidro- 2- naftalenil) metil]- 2-furoatas 6: Į tirpalą kuriame yra 1,1 t4,4,6-pentametil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno 4 (20 g, 99 mmol) ir metilo 5-(chlormetil)-2-furoato 5 (17,28 g, 99 mmol) metileno chloride (500 ml, 0,2 M) metileno chlorido virimo temperatūroje lėtai pridedama kieto aliuminio trichlorido (16,46 g, 124 mmol). Tirpalas virinamas su grįžtamu šaldytuvu dar dvi valandas. Reakcija kontroliuojama TLC 10 % etilacetato/heksanų tirpale. Reakcijos mišinys atšaldomas iki kambario temperatūros ir per 15 min.'suskaldomas vandeniu nesureagavęs aliuminio trichloridas. Negrynas produktas ekstrahuojamas metileno chloridu, perleidžiamas per silikagelį (80 g) ir eliuuojamas metileno chloridu. Tirpiklis nugarinamas vakuume iki sirupo pavidalo liekanos. Negrynas produktas gryninamas perleidžiant per silikageliu (300 g) užpildytą filtravimo kolonėlę. Metilo 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoatas 6 eliuuojamas 2 % etilacetatu/heksanuose ir gaunama 15,4 g (46 % išeiga). BMR: 1,25 (s, 6H), 1,28 (s, 6H), 1,67 (s, 4H), 2,23 (s, 3H), 3,89 (s, 3H), 3,97 (s, 2H), 5,95 (d, 1 H). 7,09 (m, 3H).

[0099] 5-[( 3, 5, 5, 8, 8- Pentametil- 5, 6, 7, 8- tetrahidro- 2- nafialenil) metil]- 2- furan-karboksirūgštis 7: Į tirpalą kuriame yra metilo 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoato 6 (15,1 g, 44 mmol), MeOH (175 ml) ir vandenyje (175 ml) pridedamas NaOH (3,53 g, 88,3.-mmol) tirpalas vandenyje (29 ml), Reakcijos mišinys maišomas per naktį. Pasibaigus reakcijai, sprendžiant pagal TLC, tirpalas parūgštinamas 1M HCI iki pH 2. Negrynas produktas išekstrahuojamas į organinį sluoksnį • naudojant etilacetatą ir sukoncentravus gaunama 5-[(3,5,5,8₁8-pentametil-5,6₁7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furan-karboksirūgštis 7 (15,0 g, 99 % išeiga). BMR: 1,26 (s, 6H), 1,28 (s, 6H), 1,68 (s, 4H), 2,24 (s, 3H), 4,00 (S; 2H), 6,01 (d, 1 H), 7,10 (s, 2H), 7,23 (d, 1H).. \ /

[0100] 5-[( 3, 5, 5, 8, 8- PentametiI- 5, 6, 7, 8- tetrahidro- 2- naftalenil) metil]- 2-furoilchloridas 8: Į tirpalą kuriame yra 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furan-karboksirūgšties 7 (20,15 g, 61,77 mmol), metileno chloride (310 ml) pridedama tionilo chlorido (45 ml, 617 mmol). Reakcijos mišinys virinamas su grįžtamu šaldytuvu *5 vai. ir pridedama kita tionilo chlorido porcija (45 ml, 617 mmol). Reakcijos mišinys maišomas per naktį kambario temperatūroje. Tirpalas sukoncentruojamas iki sirupo pavidalo medžiagos, perleidžiamas per silikagelio sluoksnį (50 g), plaunant 3 % heksanais ir sukoncentravus vakuume gaunamas 5-[(3,5,5,8,8-pentarnetil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoilchloridas 8 (17 g, 80 % išeiga). BMR: ₁,26 (s, 6H), 1,28 (s, 6H), 1,68 (s, 4H). 2;25 (s, 3H), 4,00 (s, 2_H), 6,₁₁ (d, 1H). 7,10 (s, 1H), 7,11 (s, 1H), 7,41 (d, 1H). * ,

[0101] Šiomis reakcijos sąlygomis gali būti pagaminami kiti konstrukciniai blokai, kurie turi įvairias funkcines grupes, esančias aukščiau parodytoje bendrojoje formulėje.

[0102] Tolimesnėje schemoje parodyta keletas pavyzdžių, kuriuose gali būti naudojamos bendrosios žemiau duotos acilinimo metodikos.

[0103]

[0104] Aminai ištirpinami arba suspenduojami dichlormetane, dichloretane, etilacetate, acetonitrile arba panašiame tirpiklyje (0,2 M koncentracija), po to pridedama chloranhidridinio reagento (1,00 mmol..ekv.). Į mišinį pridedama trietilamino (5,00 mmol. ekv.), ir reakcijos mišinys maišomas kambario temperatūroje 12-48 vai. Tirpikliai nugarinami vakuume. Produktas gryninamas chromatografuojant per silikagelio kolonėlę, eliuuojant atitinkamu eliuavimo tirpikliu (pvz. 3:1 heksanais:etilacetate). Tirpikliai nugarinami vakuume ir gaunamas acilintas produktas.

[0105] Kitu atveju, reakcijos mišinys praskiedžiamas dichlormetanu (imamas penkis kartus didesnis dichlormetano tūris). ir plaunamas sočiu natrio rūgščiuoju karbonatu. Organinis sluoksnis džiovinamas magnio sulfatu ir nuriitruojamas. rroauKtas gryninamas cnromaiograiuojant per siiiKageno kolonėlę ir eliuuojamas atitinkamu eliuavimo tirpikliu (pvz. 3:1 heksanais:etilacetate). Tirpikliai nugarinami vakuume ir gaunamas acilintas produktas.

[0106] Naudojant bendrąją reakcijos metodiką galima nesunkiai pagaminti daug junginių ir ištirti jų (grynų arba negrynų medžiagų) aktyvumą. Ši metodika gerai tinka anilinams, aminams, benzilaminams, hidrazinams, hidrazidams, alkoholiams ir pan.

[0107] Žemiau parodyti konkretūs pavyzdžiai, rodantys įvairias pagal bendrąją metodiką gautas struktūras:

[0108]

[0109] džiovinamas MgSŪ₄ ir sukoncentruojamas. Produktas M-M4 B chromatografuojant per silikagelio kolonėlę, eliuuojant atitinkamu tirpikliu (kurį galima nesunkiai nustatyti, pvz,, naudojant 5 % MeOH dichlormetane, kaip išeities tašką). Tirpikliai nugarinami vakuume ir gaunamas 1-(N,N'-diBoc)-guanidinmetilo grupę turintis aminas. Blokuotai N,N'-diBoc-guanidino grupei įvesti į diaminus gali būti naudojami ir kiti reagentai, tokie kaip 1,3-bis(tret-butoksikarbonil)-2-metil-2-tiopseudokarbamidas (CAS No. 107819-90-0). Kitu atveju, vietoj aukščiau aprašyto tirpalo galima tiesiai pridėti kieto 1 -H-pirazol-1 -(N, N-bis(tret.-butoksikarbonil)karboksamidino.

[0110] 1( B) stadija: Į diamino (1,00 mmol. ekv.) tirpalą THF (0,07 M) dalimis (per 10 min.) pridedama kieto 1 -H-pirazol-1 -(N, N-bis(tret-butoksikarbonil)karboksamidino) (1,00 mmol. ekv.). Tirpalas maišomas kambario temperatūroje 0,5 vai. Tirpiklis nugarinamas sumažintame slėgyje ir gaunama sirupo pavidalo liekana, kuri ištirpinama etilacetate (0,5 karto didesnis kiekis nei reakcijoje panaudotas THF tūris, arba liekanai ištirpinti reikalingas tirpiklio kiekis) ir plaunama du kartus vandeniu. Atskiriami sluoksniai, ir produktas gryninamas chromatografuojant per silikagelio kolonėlę, eliuuojant 100 % etilacetatu nepolinėms priemaišoms pašalinti, po to 100 % izopropilo alkoholiu, ir gaunamas grynas produktas. Tirpikliai nugarinami vakuume ir gaunamas norimas produktas. Tipiškos TLC sąlygos yra 15:85:0,1 metanolio/chloroformo/acto rūgšties. Tipiškos norimo blokuoto junginio išeigos yra 40-44 % ribose.

[0111] gali būti vykdomas tinkamu būdu. Aldehidų ir ketonų redukcinį amininimą su natrio triacetoksiborhidridu, žr. pagrindinai: Abdel-Magid et al., J. Org. Chem., 1996, 61:3849. Žemiau yra aprašytos dvi alternatyvios redukcinio amininimo metodikos. 2 ( A ) stadiia: 3,5,5,8,8-Pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftaldehidas (1,00 mmol. ekv.) ir 1-(N,N'-diBoc)-guanidinmetilo grupę turintis aminas (1,00 mmol. ekv.) ištirpinami metanolyje (0,09 M). Tada pridedama 1 % ledinės acto rūgšties tirpalo metanolyje (10 % naudoto metanolio tūrio), o po to NaCNBH₃ (1,00 mmol. ekv.), ir reakcijos mišinys maišomas per naktį. Reakcijos mišinys kontroliuojamas TLC, išryškinant tris komponentus (aldehidą norimą produktą

[0112] ir pradinį guanidino darinį). Reakcija sustabdoma pridedant vandens (50 %

[0113] naudoto metanolio tūrio), ekstrahuojama dichlormetanu (10 kartų didesniu tūriu nei naudota metanolio) ir plaunama sočiu natrio rūgščiuoju karbonatu. Organinis sluoksnis džiovinamas magnio sulfatu, nufiltruojamas ir sukoncentruojamas. Produktas gryninamas chromatografuojant per silikagelio kolonėlę, eliuuojant atitinkamu eliuavimo tirpikliu (pvz., 3:1 etilacetatu heksanuose nesureagavusiam aldehidui pašalinti, po to eliuuojant 1:1 etilacetatu heksanuose), ir gaunamas norimas redukcinio amininimo produktas. Kai kuriais atvejais pavirinimas su grįžtamu šaldytuvu 2 vai. palengvina imino susidarymo reakciją. Žr. taip pat Abdel-Magid et al., J. Org. Chem., 1996, 61:3849, kur aprašomas aldehidų ir ketonų redukcinis amininimas natrio triacetoksiborhidridu.

[0114] 2fB) stadija: 3,5,5,8,8-Pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftaldehidas (1,00 mmol. ekv.) ir 1-(N,N'-diBoc)-guanidinmetilo grupę turintis aminas (1,00 mmol. ekv.) ištirpinami metanolyje (0,09 M). Tada pridedama NaBH₄ (1,00 mmol. ekv.) (etanolyje, panaudojant žemiau duotas mažų kiekių metodikas arba atsargiai dedant kietą medžiagą) ir reakcijos mišinys maišomas per naktį. Reakcijos mišinys kontroliuojamas TLC, išryškinant tris komponentus (aldehidą norimą produktą ir pradinį guanidino darinį). Reakcija sustabdoma pridedant vandens (50 % naudoto metanolio tūrio), ekstrahuojama dichlormetanu (10 kartų didesniu tūriu nei naudota metanolio) ir plaunama sočiu natrio rūgščiuoju karbonatu. Organinis sluoksnis džiovinamas magnio sulfatu, nufiltruojamas ir sukoncentruojamas. Produktas gryninamas chromatografuojant per silikagelio kolonėlę, eliuuojant atitinkamu eliuavimo tirpikliu (jį gali nesunkiai nustatyti specialistas arba, pvz., 3:1 etilacetatu heksanuose nesureagavusiam aldehidui pašalinti, po to eliuuojant 1:1 etilacetatu heksanuose), ir gaunamas norimas redukcinio amininimo produktas. Kai kuriais atvejais pavirinimas su grįžtamu šaldytuvu 2 vai. turėtų palengvinti imino susidarymo reakciją.

[0115] 3 stadija - Acilinimas: Redukcinio amininimo reakcijos produktai (1,00 mmol. ekv.) ištirpinami dichlormetane (nuo -0,2 iki 0,05 M, priklausomai nuo substratų tirpumų), po to pridedama trietilamino (2,00 mmol. ekv.) ir 2-furoilchloridinio reagento 8 (1,00 mmol. ekv.). Reakcijos mišinys maišomas per naktį kambario temperatūroje. Reakcijos mišinys praskiedžiamas

[0116] dichlormetanu (5 kartus didesniu kiekiu nei naudota dichlormetano) ir plaunama sočiu rūgščiuoju natrio karbonatu. Organinis sluoksnis džiovinamas magnio sulfatu ir nufiltruojamas. Produktas gryninamas chromatografuojant per silikagelio kolonėlę, eliuuojant atitinkamu eliuavimo tirpikliu (pvz. 3:1 heksanais:etilacetatu). Tirpiklius nugarinus vakuume, gaunamas acilintas produktas. 4 stadija - Bazinės grupės deblokavimas: Acilinimo stadijos produktas (₁,00 mmol. ekv.) ištirpinamas 25-50 % TFA tirpale dichlormetane (0,02 M) ir reakcijos mišinys maišomas kambario temperatūroje (15-20 minučių; tirpalas pasidaro šiek tiek rausvai oranžinis). Reakcijos mišinys maišomas dar 1 vai. 20 min. arba tol, kol BOC deblokavimas pilnai įvyksta. Reakcija pabaigiama sukoncentruojant vakuume, po to pridedama vandens/acetonitrilo (0,006 M) ir liofilizuojama per naktį. Galutinis junginys gryninamas didelio efektyvumo skystinės chromatografijos (HPLC) metodu. Tirpikliai nugarinami vakuume ir gaunamas produktas (išeigos yra 30-50 % intervale).

[0117] Kita N,N'-bis-BOC guanidinų deblokavimo metodika naudojant alavo tetrachloridą kuri gali duoti atitinkamas guanidinio chlorido druskas, yra aprašyta Miel et a!., Tetrahedron Letters, 1997, 38:7865-7866.

[0118] 9 junginys gali būti pagamintas pagal aukščiau parodytas stadijas, išskyrus 2 stadiją, kaip parodyta tolimesnėje schemoje:

[0119] Reagentu paruošimas: Junginių sintezei reikalingi reagentai gali būti gauti arba paruošti pagal šioje srityje žinomas metodikas. Pavyzdžiui, laisvų aminų gavimas iš įprastųjų druskų ir pradiniai tirpalai gali būti naudingi mažos apimties sintezėje. Taip pat žr. Abdel-Magid et al., "Reductive amination of aldehydes and ketones with sodium t_fiacetoksiborhydride", J . Org . Chem ., 1996,61:3849.

[0120] Laisvų bazių tirpalai metanolyje gali būti pagaminami iš hidrochlorido, dihidrochlorido, hidrobromido arba kitų druskų, kurių laisva bazė yra tirpi metanolyje. Šioje metodikoje, jeigu pridėta natrio metoksido, reikia saugoti, kad nepatektų oras, kadangi aminų laisvos bazės, ypatingai pirminiai aminai iš oro sugeria anglies dioksidą ir sudaro druskas. 10 ml 0,1 M laisvos bazės tirpalo metanolyje gali būti pagaminama tokiu būdu. Į taruotą Erlenmejerio kolbą su magnetinio maišiklio magnetu atsveriama 1,0 mmol monohidrochlorido ir pridedama 7 ml metanolio. [ maišomą suspensiją pridedama 229 įiI (1,0 mmol, 1 ekv.) natrio metoksido metanolyje (25 % magai masę, 4,37 M), kolba užkemšama ir mišinys intensyviai maišomas 2 valandas. Suspensija kartais pakeičia išvaizdą kadangi susidaro smulkios pieno pavidalo natrio chlorido nuosėdos. Suspensija nufiltruojama per 15 ml vidutinio tankumo stiklo filtrą medžiaga ant filtro perplaunama 1-2 ml metanolio, filtratas perpilamas į 20 ml talpos indą ir praskiedžiamas iki 10 ml metanoliu. Teorinė natrio chlorido išeiga yra beveik 59 mg, bet išskyrimas paprastai nėra kiekybinis, nes natrio chloridas yra šiek tiek tirpus metanolyje. Dihidrochlorido atveju reikia antro natrio metoksido ekvivalento (458 į. iI).

[0121] Natrio borhidrido 0,5 M tirpalas etanolyje gali būti pagaminamas tokiu būdu. Natrio borhidridas (520 mg, 13,8 mmol) maišomas gryname (nedenatūruotame) bevandeniame etanolyje (25 ml) -2-3 min. Suspensija nufiltruojama per vidutinio tankumo stiklinį filtrą nedideliam kiemcn neištirpusios kietos medžiagos pašalinti (paprastai apie 5 % nuo visos borhidrido masės, arba 25 mg). Filtratas turi būti bespalvis tirpalas, kuris išskiria labai nedaug vandenilio. Šis tirpalas turi būti naudojamas tuoj pat, nes per kelias valandas jis žymiai suskyla ir gaunamos želatinos pavidalo nuosėdos. Natrio borhidridas yra higroskopinis, taigi gaminant tirpalą atsvėrus kietą medžiagą reikia vengti ją laikyti ore. Natrio borhidrido tirpumas etanolyje kambario temperatūroje yra apie 4 %. Tai atitinka šiek tiek daugiau nei 0,8 M. Tačiau kartais, net ir pamaišius >5 minutes, lieka neištirpęs nedidelis kietos medžiagos kiekis nepriklausomai nuo gaminamos koncentracijos.

[0122] Norint atlikti nedidelės apimties I formulės junginių sintezę, žemiau aprašytos reakcijos gali būti vykdomos pagaminant [vairius reagentus, tinkančius aukščiau aprašytai reakcijos schemai. Likusioje aprašymo dalyje visos temperatūros yra duotos Celsijaus laipsniais, o visos dalys ir procentai yra pagal masę, jeigu nenurodyta kitaip.

[0123] [vairios pradinės medžiagos ir kiti reagentai gali būti gaunami iš prekybinių tiekėjų, tokių kaip Aldich Chemical Company arba Lancaster Synthesis Ltd., ir naudojami be papildomo gryninimo, jeigu nenurodyta kitaip. Tetrahidrofuranas (THF) ir N,N-dimetilformamidas (DMF) yra gauti iš Aldrich SureSeal^® buteliuose ir yra naudojami tokie, kokie gauti. Visi tirpikliai gryninami naudojant standartinius žinomus metodus, jeigu nenurodyta kitaip.

[0124] su džiovinimo vamzdeliu kambario temperatūroje (jeigu nenurodyta kitaip) bevandeniuose tirpikliuose, o reakcijos kolbos uždarytos guminėmis pertvaromis, kad substratus būtų galima įleisti švirkštu. Stikliniai indai buvo išdžiovinti krosnyje ir/arba karštyje. Analitinė plonasluoksnė chromatografija buvo vykdoma ant stiklinių silikagelio 60 F 254 plokštelių (Analtech, 0,25 mm)

[0125] ir eliuuojama atitinkamų santykų (tūris/tūris) tirpiklių mišiniais. Reakcijos buvo tikrinamos TLC ir nutrauktos tada, kai buvo nustatyta, kad susinaudojo pradinė medžiaga.

[0126] Plokštelės buvo ryškinamos apipurškiant p-anyžių aldehido reagentu arba fosfomolibdato rūgšties reagentu (Aldrich Chemical, 20 masės % etanolyje) ir aktyvuotos šiluma. Apdorojama paprastai padvigubinant reakcijos tūrį reakcijos tirpikliu arba ekstrakcijos tirpikliu ir tada plaunant nurodytais vandeniniais tirpalais, naudojant jų 25 % pagal tūrį nuo ekstrakcijos tūrio (jeigu nenurodyta kitaip). Produkto tirpalai buvo džiovinami bevandeniu Na2SC>4, po to filtruojami ir sumažintame slėgyje arba rotoriniu garintuvu nugarinami tirpikliai, ir tai pažymima, kad tirpikliai nugarinti vakuume. Sparčioji kolonėlių chromatografija (Still et al., J . Org . Chem ., 1978, 43:2923) buvo vykdoma naudojant Baker-grade silikagelį sparčiajai chromatografijai (47-61 mm), ir silikagelio:negrynos medžiagos santykį nuo maždaug 20:1 iki 50:1, jeigu nenurodyta kitaip. Hidrinimas buvo vykdomas esant nurodytiems slėgiams arba normaliame slėgyje.

[0127] 'H-BMR spektrai buvo užrašyti Bruker prietaisu, dirbančiu 300 MHz dažniu, o ¹³C-BMR spektrai užrašyti esant 75 MHz. NMR spektrai užrašyti CDCI3 tirpalų (duodama m.d.), etalonu naudojant chloroformą (7,25 m.d. ir 77,00 m.d.), CD₃OD (3,4 ir 4,8 m.d. ir 49,3 m.d.) arba, jeigu tinka, vidinį standartą - tetrametilsilaną (0,00 m.d.). Jeigu reikia, yra naudojami kiti BMR tirpikliai. Jeigu duodami smailių multipletiškumai, naudojami tokie sutrumpinimai: s = singletas, d = dubletas, t = tripletas, m = multipletas, pl. = platus, dd = dvigubas dubletas, dt = dvigubas tripletas. Sukinio-sukinio sąveikos konstantos, jeigu duotos, yra duotos hercais.

[0128] Infraraudonieji spektrai užrašyti Perkin-Elmer FTIR spektrometru grynų medžiagų, tablečių su KBr arba CDCI₃ tirpalų ir duoti bangų skaičiais (cm"¹). Masių spektrai gauti naudojant LSIMS arba elektronų srautą. Visos lydymosi temperatūros yra nekoreguotos.

[0129]

[0130] 1 -H-pirazol-1 -karboksamidinas yra pagaminamas pagal Bernatovvicz et al., J . Org . Chem ., 1992, 57:2497-2502 (ir jame esantys literatūros šaltiniai) ir

[0131] LI 4904 b po blokavimo di-tret-butildikarbonatu gaunamas 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(tret-butoksikarbonil)karboksamidinas) pagal Drake et al., Synth., 1994, 579-582.

[0132] 1-( N, N'- diBoc)- guanidinometil- 4- aminometilcikloheksano gavimas

[0133]

[0134] Į1,4-bis-aminometilciklohėksano 22 (20 g, 0,14 mol) tirpalą THF (200 ml) supilamas 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(tret-butoksikarbonil)karboksamidino) 21 (22,0 g, 0,07 mol) tirpalas THF (100 ml)#. (Atkreipkite dėmesį, kad 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(tret-butoksikarbonil)karboksamidino) nebūtina ištirpinti THF; į reakciją jį geriau pridėti gryną kaip kietą medžiagą). Tirpalas maišomas kambario temperatūroje 3 valandas. Tirpiklis nugarinamas sumažintame slėgyje ir gaunama sirupo pavidalo liekana, kuri ištirpinama etilacetate (500 ml) ir plaunama vandeniu iki neutralaus pH. Organinis sluoksnis plaunamas sočiu NaCI tirpalu, džiovinamas MgSC >4 ir sukoncentruojamas. Produktas gryninamas chromatografuojant per silikagelio kolonėlę, eliuuojamą 5 % MeOH dichlormetane. Tirpikliai nugarinami vakuume ir gaunama 11,6 g (43 % išeiga) 1-H-pirazol-1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-4-aminometilcikloheksano ( 23 junginys). ¹H BMR (CDCb) 6 11,5 (pl.s, 1H). 8,35 (pl.s, 1H), 3,26 (dt, 2H), 2,52 (dd, 2H), 1,82-0,97 (m, 28H, su singletu ties 1,5).

[0135] Kitas 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-4-aminometilcikloheksano gavimo būdas yra toks. I cis/ trans 1,4-bis-aminometilcikloheksano (9,0 g, 63,3 mmol) tirpalą THF (903 ml, 0,07 M) dalimis pridedama (per 10 min.) kieto 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(tret-butoksikarbonil)karboksamidino) (19,6 g, 63,3 mmol). Tirpalas maišomas kambario temperatūroje 0,5 valandas. Tirpiklis nugarinamas sumažintame slėgyje ir gaunama sirupo pavidalo liekana, kuri ištirpinama etilacetate (500 ml) ir plaunama vandeniu du kartus. Atskiriami sluoksniai ir produktas gryninamas chromatografuojant per silikagelio kolonėlę, eliuuojamą 100 % etilacetatu neporinėms priemaišoms pašalinti, po to eliuuojama 100 % izopropilo alkoholiu ir gaunamas grynas produktas. Tirpikliai nugarinami vakuume ir gaunama lU.^b g (_{4^ %} išeiga) 1-(N,N-diBoc)-guanidinometil- 4-aminometilcikloheksano ( 23 junginys). ¹H BMR (CDCb) 5 11,5 (pl.s, 1H), 8,35 (pl.s, 1H), 3,26 (dt, 2H), 2,52 (dd, 2H), 1,82-0,97 (m, 28H, su singletu ties 1,5).

[0136] Redukcinio amininimo produktas 25 (1,0 ekv.) ištirpinamas dichlormetane (10-15 ml), po to pridedama trietilamino (2 ekv.) ir 2-furoilchloridinio reagento (1,0 ekv.). Reakcijos mišinys maišomas per naktį kambario temperatūroje. Reakcijos mišinys praskiedžiamas dichlormetanu (50 ml) ir plaunamas sočiu rūgščiuoju natrio karbonatu. Organinis sluoksnis džiovinamas magnio sulfatu, nufiltruojamas ir išgryninamas chromatografuojant per kolonėlę, eliuuojamą naudojant 3:1 heksanus etilacetate. Tirpikliai nugarinami vakuume ir gaunamas 26 junginys.

[0137] Acilinimo reakcijos produktas 26 (1,0 ekv.) ištirpinamas 50 % TFA tirpale dichlormetane (20-25 ml) ir reakcijos mišinys maišomas kambario temperatūroje (15-20 min.; tirpalas pasidaro šiek tiek rausvai oranžinis). Reakcijos mišinys maišomas dar 1 vai. ir 20 min., kol pilnai [vyksta deblokavimas. Reakcija nutraukiama sukoncentruojant vakuume, po to pridedama vandens/acetonitrilo (-50 ml) ir liofilizuojama per naktį. Galutinis oi h . i w

[0138] junginys gryninamas HPLC metodais. Tirpiklius nugarinus vakuume, gaunamas 27 junginys.

[0139] Tolimesnis aptarimas yra susijęs su pavyzdinių junginių (e)-(k) gavimu. Junginiai (e)-(k) gali būti naudojami, kaip aprašyta aukščiau, atitinkamiems deblokuotiems junginiams (laisvas guanidinas) gauti, hidrolizuojant rūgštinėse sąlygose.

[0140] 1-( N, N'- diBoc)- guanidinometil- 3- aminometilcikloheksano gavimas

[0141]

[0142] l c/s/frans-1,3-bis-aminometilcikloheksano (7,5 g, 52,8 mmol) tirpalą THF (30 ml) per 0,5 vai. supilamas 1,3-bis(tret-butoksikarbonil)-2-metil-2-tiopseudokarbamido (7,65 g, 26,3 mmol) tirpalas THF (40 ml). Tirpalas maišomas kambario temperatūroje 5 vai. Tirpiklis nugarinamas sumažintame slėgyje ir produktas gryninamas chromatografuojant per silikagelio kolonėlę, eliuentu naudojant metileno chlorido/metanolio mišinį; gaunama 2,2 g (22 % išeiga) 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-3-aminometilcikloheksano ((e) junginys). ¹H BMR (CDCI₃) 8 11,53 (pl.s, 1H), 8,40 (pks_: 1H), 3,28-3,30 (m, 2H), 2,54-2,61 (m, 2H), 1,81 (pl.s, 2H), 1,27-1,58 (m, 26H), 0.89 (m, 1H), 0,65 (m, _1H).

[0143] Kitu atveju (e) junginį galima pagaminti taip. Į cis/ trans- 1,3-bis-aminometilcikloheksano (10,0 g, 70,3 mmol) tirpalą THF (1000 ml, 0,07 M) dalimis (per 10 min.) sudedamas kietas 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(tret-butoksikarbonil)karboksamidinas) (21,8 g, 70,3 mmol). Tirpalas maišomas kambario temperatūroje 0,5 vai. Tirpiklis nugarinamas sumažintame slėgyje, gaunant sirupo pavidalo liekaną, kuri ištirpinama etilacetate (500 ml) ir plaunama du kartus vandeniu. Atskiriami sluoksniai ir produktas gryninamas chromatografuojant per silikagelio kolonėlę, eliuuojant 100 % etilacetatu

[0144] OU ■— ■ ^VW-T W

[0145] visokioms nepolinėms priemaišoms pašalinti, po to eliuuojama 100 % izopropilo alkoholiu, gaunant gryną produktą. Tirpikliai nugarinami vakuume ir gaunama 11,4 g (41 % išeiga) 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-3-aminometilcikloheksano. ¹H BMR (CDCb) 5 11,53 (pl.s, 1H), 8,40 (pl.s, 1H), 3,28-3,30 (m, 2H), 2,54-2,61 (m, 2H), 1,81 (pl.s, 2H), 1,27-1,58 (m, 26H), 0,89 (m, 1H), 0,65 (m, 1H).

[0146] 1-( N, N'- diBoc)- guanidinometil- 4- aminometilbenzeno gavimas

[0147]

[0148] [ 1,4-diaminobutano (4,15 g, 47,1 mmol) tirpalą THF (30 ml) per 0,5 vai. supilamas 1,3-bis(tret-butoksikarbonil)-2-metil-2-tiopseudokarbamido (6,83 g, 23,6 mmol) tirpalas THF (40 ml). Tirpalas maišomas kambario temperatūroje 5 vai. Tirpiklis nugarinamas sumažintame slėgyje ir produktas gryninamas chromatografuojant per silikagelio kolonėlę, eliuentu naudojant metileno chlorido/metanolio mišinį; gaunama 3.0 g (40 % išeiga) 1-(N,N'-

[0149] diBoc)-guanidin-4-aminobutano ((h) junginys). ¹H BMR (CDCI3) 8 11,49 (pl.s, ₁H), 8,₃5 (pl.s, 1H), 3,42-3,47 (m, 2H), 2,72-2,76 (t, 2H), 0,86-1,65 (m, 24H).

[0150] Kita (h) junginio pagaminimo metodika yra tokia. Į 1,4-diaminobutano (₆,₀ g, 68,1 mmol) tirpalą THF (972 ml, 0,07 M) dalimis (per 10 min.) sudedamas kietas 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(tret-butoksikarbonil)-karboksamidinas) (21,5 g, 68,1 mmol). Tirpalas maišomas kambario temperatūroje 0,5 vai. Tirpiklis nugarinamas sumažintame slėgyje, gaunant sirupo pavidalo liekaną kuri ištirpinama etilacetate (500 ml) ir plaunama du kartus vandeniu. Atskiriami sluoksniai ir produktas gryninamas chromatografuojant per silikagelio kolonėlę, eliuuojant 100 % etilacetatu visokioms nepolinėms priemaišoms pašalinti, po to 100 % izopropilo alkoholiu, gaunant gryną produktą. Tirpikliai nugarinami vakuume ir gaunama 10,0 g (44 % išeiga) 1-(N,N'-diBoc)-guanidin-4-aminobutano. ¹H BMR (CDCI₃) 8 11,49 (pl.s, 1H), 8,35 (pl.s, 1H), 3,42-3,47 (m, 2H), 2,72-2,76 (t, 2H), 0,86-1,65 (m, 24H).

[0151]

[0152] Į o-ksililendiamino (7,14 g, 52,5 mmol) tirpalą THF (30 ml) per 0,5 vai. supilamas 1,3-bis(tret-butoksikarbonil)-2-metil-2-tiopseudokarbamido (7,57 g, 26,1 mmol) tirpalas THF (40 ml). Tirpalas maišomas kambario temperatūroje 5 vai. Tirpiklis nugarinamas sumažintame slėgyje ir produktas gryninamas chromatografuojant per silikagelio kolonėlę, eliuentu naudojant metileno chlorido/metanolio mišinį; gaunamas 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-2-aminometilbenzenas ((j) junginys).

[0153] Kitu atveju, (j) junginys gali būti pagaminamas būdu, analogišku aukščiau aprašytam alternatyviam (e) junginio pagaminimo būdui.

[0154] 1-( N, N'- diBoc)- guan:dinometil- 2- aminometilcikloheksano gavimas

[0155]

[0156] Į c/s/frans-1,2-bis-aminometilcikloheksano (7,5 g, 52,8 mmol) tirpalą THF (30 ml) per 0,5 vai. supilamas 1,3-bis(tret-butoksikarbonil)-2-metil-2-tiopseudokarbamido (7,65 g, 26,3 mmol) tirpalas THF (40 ml). Tirpalas maišomas kambario temperatūroje 5 vai. Tirpiklis nugarinamas sumažintame slėgyje ir produktas gryninamas chromatografuojant per silikagelio kolonėlę,

[0157] eliuentu naudojant metileno chlorido/metanolio mišinį; gaunamas 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-2-aminometilcikloheksanas ((k) junginys).

[0158] Kitu atveju (k) junginys gali būti pagaminamas būdu, analogišku aukščiau aprašytam alternatyviam (e) junginio pagaminimo būdui.

[0159] Pirimidinai gali būti naudojami sintezei pagal tokias metodikas:

[0160] Pirimidiną turinčių junginių sintezės bendroji metodika yra tokia. I 1,3-diamino 29 tirpalą THF pridedama 28, ir reakcijos mišinys virinamas su grįžtamu šaldytuvu 12 vai. Tirpikliai nugarinami vakuume ir norimas produktas gryninamas chromatografuojant per kolonėlę. Grynas 31 acilinamas pagal aukščiau duotą bendrąją metodiką ir gaunamas 11.

[0161] Patyrę specialistai supras, kad pagal aukščiau aprašytas metodikas gali būti pagaminti įvairiausi šio išradimo junginiai. Aukščiau aprašytos cheminės reakcijos turi bendrą pritaikomumą šio išradimo GnRH agentams gauti. Taigi, panaudojant tinkamas modifikacijas, gali būti panašiai pagaminami kiti GnRH agentai, ką nesunkiai supras specialistai, pvz. blokuojant trukdančias grupes, pritaikant naudoti kitus įprastus reagentus ir/arba panaudojant įprastas reakcijos sąlygų modifikacijas.

[0162] Ląstelių membranos, pagamintos iš pastoviai transfekuotų žmogaus GnRH receptoriaus cDNR žmogaus embrioninių inkstų 293 ląstelių, buvo suspenduotos surišimo testo buferyje, turinčiame 50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 2,5 mM MgCL₂ ir 0,1 % jaučio serumo albumino. Membranos (baltymo bendras kiekis 5-50 _Į.ig duobutėje, turinčioje maždaug 10-100 fmol GnRH receptoriaus) buvo inkubuojamas, imant po dvi vienodos sudėties duobutes, 96 duobučių plokštelėse 200 įiI bendrame tūryje su ¹²⁵l-GnRH-A (maždaug 0,05 nM) ir tiriamaisiais junginiais 1 valandą kambario temperatūroje. Visi junginiai buvo praskiesti 1 % DMSO (galutinė testo koncentracija) turinčiame surišimo testo buferyje. Nespecifinis surišimas buvo nustatytas esant 100 nM GnRH. Reakcijos buvo nutrauktos greitai nufiltruojant per 96 duobučių Packard GF/C filtrus, [mirkytus 0,1 % polietileniminu. Filtrai buvo plaunami tris kartus PBS buferiu, džiovinami ir skaičiuojamas radioaktyvumas Packard Topcount prietaisu, panaudojant skysčių scintiliacijų skaičiavimą.

[0163] Testo sąlygos buvo identiškos junginių aktyvumo [vertinimui ir imant kitas rūšis. Kiekvienos rūšies teste buvo panaudotas panašus skaičius GnRH receptorių. Žiurkių GnRH receptorių surišimui membranos buvo pagamintos iš žiurkių hipofizės ir buvo naudojama maždaug 25-30 Įig/duobutei bendro membraninio baltymo. Jaučio GnRH receptoriaus surišimui membranos buvo pagamintos iš "jaučio hipofizės ir naudota 40-50 |ag/duobutei. Pelės GnRH receptoriaus surišimui membranos buvo pagamintos iš 293 ląstelių, pastoviai ekspresuojančių pelės GnRH receptorius, ir buvo naudojama maždaug 25-30 _ng/duobutei. Kontrolinių peptidų ir tiriamųjų junginių IC₅₀ reikšmės buvo apskaičiuotos naudojant GraphPad Prism™ programą. Radioligando surišimo eksperimento rezultatai parodyti fig.1. 1 lentelėje parodytos [vairių peptidinių ir nepeptidinių junginių afiniškumo GnRH receptoriams iš keturių gyvūnų rūšių pakartotų eksperimentų vidutinės reikšmės.

[0164] Fig. 1 L.I43U4B Junginių efektai į 125l-GnRH-A surišimą su hGnRH

[0165] receptoriais HEK-293 ląstelių membranose

[0166]

[0167] Fig.1. Junginių efektai į 125l-GnRH-A surišimą su hGnRH receptoriais, ekspresuotais HEK-293 ląstelėse. Buvi tirta GnRH (kvadratai) ir 9 (trikampiai) geba išstumti ¹²⁵l-GnRH-A (maždaug 0,05 nM) surišimą su hGnRH receptoriais. Parodytos reikšmės yra iš vieno būdingo eksperimento, jį dubliuojant.

[0168] Pagal aukščiau aprašytą reakcijos schemą buvo sintezuoti įvairūs I formulės junginiai. Negryninti junginiai buvo tirti naudojant aukščiau aprašytą konkurencinio radioligando surišimo testą. GnRH konkurencinio surišimo rezultatai parodyti lentelėje (kiekvienas junginys tirtas imant 1 ir 10 _įj.M).

[0169] Norint įvertinti junginių, kaip agonistų arba antagonistų, aktyvumą buvo naudojamas testas, kuriame matuojamas bendras inozitolio fosfatų susikaupimas. 293 ląstelėmis, turinčiomis hGnRH receptorių, buvo padengtos 24 duobučių plokštelės (apytikriai 200000 ląstelių/duobutei), naudojant DMEM terpę. Kitą dieną ląstelės buvo užpiltos [³H]mioinozitoliu (0,5 Ci/ml) 16-18 valandų inozitolio neturinčioje terpėje. Terpė buvo nusiurbta ir ląstelės perplautos serumo neturinčia DMEM. Terpė buvo nusiurbta ir po to ląstelės buvo veikiamos tiriamaisiais junginiais arba tirpikliu 30 min. 37 °C temperatūroje. Po to į ląsteles pridedama pusė maksimalios GnRH koncentracijos (1 nM) arba tirpiklis ir palaikoma 37 °C temperatūroje 45 min., kad nusistovėtų pusiausvyra. Terpė pakeičiama ledo temperatūros 10 mM skruzdžių rūgštimi, kuri sustabdo reakciją ir taip pat tarnauja ląstelių lipidų ekstrakcijai, inozitolio fosfatai atskiriami panaudojant jonų mainų chromatografiją per Dowex'o kolonėles, kurios plaunamos 2,5 ml 10 mM mioinozitolio ir 10 mM skruzdžių rūgšties. Po to kolonėlės plaunamos 5 ml 60 mM natrio formiato ir 5 mM borakso, ir bendri inozitolio fosfatai eliuuojami 5 ml 1M amonio formiato ir 0,1 M skruzdžių rūgšties. Kolonėlių eliuatai supilami į skysčių scintiliacijos indus, turinčius 15 ml scintiliacijos mišinio ir skaičiuojamas radioaktyvumas skysčių scintiliacijų skaičiavimo būdu. Tipiško eksperimento rezultatai parodyti fig.2.

[0170] Fig. 2. Junginių poveikis į GnRH stimuliuojamą bendrojo inozitolio fosfato susikaupimą HEK-293 ląstelėse, ekspresuojančiose hGnRH receptorių. Buvo tirta peptidinio antagonisto - antido - ir nepeptidinio antagonisto - 9 junginio - geba blokuoti GnRH stimuliuojamą [³H)inozitolio fosfatų kiekio padidėjimą. Nei vienas iš šių atskirai paimtų junginių nestimuliavo bendro inozitolio fosfatų kiekio padidėjimo (neparodyta), bet abu junginiai galėjo inhibuoti pusės maksimalios GnRH peptido koncentracijos tarpininkaujamą stimuliavimą Vienas GnRH nuo dozės priklausančiu būdu didino [³H)inozitolio fosfato susikaupimą esant EC_so maždaug 0,8 nM. Parodytame eksperimente antido ir 9 junginio Kb reikšmės buvo nustatytos, panaudojant Cheng ir Prusoff metodą ( Biochem. Pharmacol. 22:3099-3108, 1973). Parodytos reikšmės yra iš vieno eksperimento, atlikto dubliuojant.

[0171] Eksperimento metodika: Sprague-Davvley žiurkių patinėliai (225-25₀ g) buvo iškastruoti ir palakyti 10 dienų, kad atsigautų po operacijos. Praėjus 10 dienų po kastravimo, gyvuliukams buvo įtaisyti neištraukiami kateteriai į šlaunies veną ir arteriją kad būtų lengviau iš tolo atlikti infuzijas ir paimti kraujo mėginius. Eksperimento dieną gyvuliukams .leidžiama aklimatizuotis procedūriniame kambaryje, jiems gyvenant įprastame narve. Iš visų gyvuliukų buvo paimti kraujo mėginiai palyginimui. Paėmus šiuos mėginius, į veną buvo suleidžiamas arba tirpiklis (10 % DMSO, 10 % kremoforas/fiziologinis druskos tirpalas), antidas (1,0 ng), arba 11 junginys (10 mg/kg). Kraujo mėginiai buvo imami praėjus 10, 60, 90, 120, 180, 240 min. po injekcijų. Kraujas buvo centrifuguojamas, surenkamas serumas ir laikomas -70° temperatūros šaldiklyje iki tyrimo. Serumo mėginiai buvo analizuojami naudojant DSL-4600 ACTIVE LH padengto vamzdelio tipo imunoradiometrinį testavimo rinkinį iš Diagnostic Systems Laboratories, Inc.

[0172] Rezultatai ir aptarimas: Lytinės liaukos pašalinimas eliminuoja neigiamą testosterono grįžtamąjį ryšį į pogumburį ir duoda padidintus GnRH, o tuo pačiu ir LH, kiekius. Fig.3 parodyti kontrolinių ir kastruotų žiurkių ir LH, ir testosterono kiekiai, praėjus 10 dienų po operacijos. Laukiama, kad šių žiurkių atveju GnRH antagonistas turėtų sumažinti GnRH tarpininkaujamų LH kiekių padidėjimą Antidas - peptidinis GnRH antagonistas - sumažina LH kiekius kastruotų žiurkių modelyje (fig.4). 11 junginys - mažos molekulinės masės GnRH antagonistas - taip pat slopina LH kastruotų žiurkių modelyje (fig.4).

[0173] Eksperimento metodika: Buvo paruoštos žiurkės su intraveniniais kateteriais, įvestais į viršutinę tuščiąją veną padarius pjūvi dešiniojoje išorinėje jungo venos pusėje, ir leidžiama sugyti. Vaistai buvo ištirpinti 10 % DMSO, 10 % kremaforo ir 80 % fiziologinio druskos tirpalo mišinyje ir įvesti i.v. būdu, imant 10 mg/kg dozę. Nurodytu laiku buvo imami kraujo mėginiai ir junginiai buvo išekstrahuojami iš 0,2 ml plazmos butilo chloridu, turinčiu vidinį standartą. Mėginiai buvo analizuojami HPLC metodu, leidžiant per Beta-Basic C18 4x50 mm kolonėlę 1 ml/min. greičiu ir naudojant 40-80 % acetonitrilo 10 mM amonio fosfato buferyje gradientą. Mėginiai detektuojami pagal UV sugertį, imant 260 nm bangos ilgį.

[0174] Rezultatai ir aptarimas: 11 junginys, kuris turi- puikų afiniškumą žiurkių GnRH receptoriaus atžvilgiu, turi maždaug trijų valandų gyvavimo puslaikį žiurkių plazmoje ir, praėjus 4 valandoms po i.v. injekcijos, jo koncentracija plazmoje yra 100-200 nM (fig. 5).

[0175] Etaloninių peptidų surišimas su žiurkės, pelės jaučio ir žmogaus GnRH receptoriais gerai sutampa su literatūriniais duomenimis. Nepeptidiniai šio išradimo junginiai rodo žymius jų surišimo rodiklių skirtumus tarp rūšių Kai kurie iš šių junginių rodo didelį afiniškumą (<100 nM) žmogaus GnRH receptoriui. Veiksmingumo prasme visi šie nepeptidiniai junginiai, kurių aktyvumas buvo įvertintas inozitolio fosfato teste, veikia kaip antagonistai į GnRH stimuliuojamą bendrą inozitolio fosfato susikaupimą ląstelėse, turinčiose rekombinantinius žmogaus GnRH receptorius. 11 junginio suleidimas į veną sumažino kastruotų žiurkių patinėlių (chroniško LH kiekio padidėjimo plazmoje modelis) LH kiekius plazmoje. Šis junginys turėjo trijų valandų gyvavimo puslaikį, o koncentracija plazmoje koreliuojasi su efektyvumu. Bendrai paėmus, šie duomenys leidžia manyti, kad šie nepeptidiniai junginiai turi būti naudingi kaip GnRH receptorių antagonistai.

[0176] Peptidiniai agonistai ir antagonistai, naudoti kaip etaloniniai junginiai:

[0177] GH₃ ląsteles, pastoviai transfekuotas žiurkės GnRH receptoriumi (GGH₃), pateikė Dr. VVilIiam Chin (Harvard Medical School, Boston, MA). Šios ląstelės buvo plačiai charakterizuotos anksčiau (Kaiser et al., 1997). Šios ląstelės buvo auginamos mažai gliukozės turinčioje Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (DMEM), turinčioje: 100 V/ml penicilino/streptomicino, 0,6 g/l G418 ir 10 % šiluma inaktyvuoto fetalinio veršiuko serumo (FBS).

[0178] Žmogaus GnRH receptoriaus cDNR buvo įklonuota į plazmidinį ekspresijos vektorių pcDNA 3 (In Vitrogen) ir pastoviai transfekuota į HEH 293 ląsteles (hGnRH-R/293). Šią ląstelių liniją pateikė dr. Stuart Sealfon, Mount Sinai Medical School, New York, NY. Šios ląstelės buvo auginamos DMEM, papildytoje 0,2 g/l G418 100 V/ml penicilino/streptomicino ir ₁0 % _FBS. Ir

[0179] GGh_b, ir hGnRH-R/293 ląstelės buvo naudotos ir .bendrojo inozitolio fosfato matavimui, ir junginių veiksmingumo mikrofiziometriniam įvertinimui.

[0180] Radioligandu buvo naudotas radioaktyviu jodu žymėtas GnRH agonistinis analogas - [des-Gly¹⁰,D-Ala⁶]GnRH etilamidas (¹²⁵l-GnRH-A). Vienas _j.ig GnRH, praskiestas 0,1 M acto rūgštimi, įdedamas į lodogen®-padengtą borsilikatinio stiklo mėgintuvėlį (Pierce), turintį 35 _j.il 0,05 M fosfatinio buferio (pH 7,4-7,6) ir 1 mCi Na[¹²⁵l], Reakcijos mišinys purtomas ir inkubuojamas 1 min. kambario temperatūroje. Po 1 min. mišinys purtomas ir leidžiama inkubuotis dar 1 min. I reakcijos mėgintuvėlį pridedama 2 ml 0,5 M acto rūgšties/1 % BSA, ir mišinys supilamas į C18 Sep-Pak patroną. Patronas plaunamas iš eilės 5 ml H₂O ir 5 ml 0,5 M acto rūgšties, po to eliuuojamas 5 x 1 ml 60 % CH₃CN/4O % 0,5 M acto rūgšties mišinio. Eliuatas praskiedžiamas 3 x didesniu tūriu HPLC buferio A (0,1 % TFA vandenyje) ir supilamas į C18 kolonėlę. Jodintas produktas eliuuojamas per 20-25 min. 25-100 % CH₃CN, turinčio 0,1 % TFA, gradientu. Radioaktyvios frakcijos (750 jil/frakcijai) surenkamos į švarius polipropileninius mėgintuvėlius, turinčius 100 _įaI 10 % BSA. Frakcijų biologinis aktyvumas įvertinamas pagal radioligando surišimą. Specifinis radioligando aktyvumas buvo apytikriai 2200 Ci/mmol.

[0181] Cytosensor® mikrofiziometras (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) yra realaus laiko, neinvazinė, neradioaktyvi puslaidininkinė sistema ląstelių atsakams į įvairius stimulus kontroliuoti. Ji yra paremta pH jautriu silicio jutikliu, šviesai jautriu potenciometriniu jutikliu, kurie sudaro dalį mikrotūrinio srauto kameros, kurioje yra imobilizuotos auginamos ląstelės (Pitchford et al., 1995; Parceet al., 1989; Owicki, et al. 1994).

[0182] Ovvicki, J.C., L.J. Bousse, D.G. Hafeman,. G.L Kirk, J.D. Olson, H.G. Wada, and J. W. Parce. The light-adressable potentiometric sensor: principles ₅₃

[0183] and biological applications. Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struc. 23:87-113, 1994.

[0184] Parce, J. W., J.C. Owicki, K.M. Kercso, G.B. Sigai, H.G. VVada, V.C. Muir, L.J. Bousse, K.L. Ross. B.l. Sikic, H.M. McConnelI. Detection of cell-affecting agents with a silicon biosensor. Science 246:243-247, 1989.

[0185] Pitchford, S., K. DeMoor, and B.S. GIaeser. nerve growth factor stimulates rapid metabolic responses in PC12 cells. Am. J. Physiol. 268 ( Cell Physiol. 37): C936-C943,1995.

[0186] GGH₃ ląstelės buvo pasėtos mažai buferintoje mkiimalioje pagrindinėje terpėje (MEM, Sigma), turinčioje 25 mM NaCI ir 0,1 % BSA, imant 500000 ląstelių/kapsulei tankį, ant ląstelių kapsulės taurelių polikarbonatinės membranos (3 jam poringumo) (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Kapsulės taurelės buvo perkeltos į jutiklio kameras, kur jutiklio kameroje ląstelės buvo laikomos prie pat silicio jutiklio, kuris matuoja mažus pH pokyčius jutiklio kameros mikrotūryje. Per ląsteles buvo pumpuojama mažai buferinta terpė maždaug 100 (.il/min. greičiu iš vieno iš dviejų esančių skysčio rezervuarų. Iš kurio rezervuaro pumpuoti ant ląstelių skystį apsprendžia selekcijos vožtuvas.

[0187] Cytosensor® mikrofiziometras kiekvieną sekGndę generuoja įtampos signalą kuris yra tiesinė pH funkcija. Norint išmatuoti rūgštėjimo greičius, srautas į jutiklio kamerą kurioje yra ląstelės, periodiškai pertraukiamas, leidžiant ekstraląsteliniame ląstelių skystyje pasigaminti išskiriamiems rūgštiesiems metabolitams. Šiuose eksperimentuose ląstelės buvo laikomos 37 °C temperatūroje dviejų minučių trukmės tekėjimo ciklą kuriame 80 sekundžių per ląsteles buvo leidžiama terpė, po to terpės srautas buvo sustabdytas 40 sekundžių. Šio 40 sekundžių intervalo metu 30 sekundžių buvo matuojami parūgštėjimo greičiai. Tokiu būdu atskiras parūgštėjimo greitis buvo skaičiuojamas kas dvi minutes. Cytosėn'sor® mikrofiziometras turi aštuonis tokius jutiklius, leidžiančius atlikti aštuonis eksperimentus vienu metu. Kiekvienas jutiklis buvo programuojamas atskirai, naudojant su sistema sujungtą kompiuterį.

[0188] GGH₃ ląstelės buvo iš pradžių laikomos mažai buferintoje MEM terpėje 30-60 min., kad pasiektų pusiausvyrą ir tuo metu buvo matuojami foniniai parūgštėjimo greičiai (matuojama _Į.iV/sek.) nesant jokio stimulo. Kai foninis parūgštėjimo greitis pakito mažiau nei 10 procentų per 20 minučių, buvo pradėtas eksperimentas. Prieš parūgštėjimo greičių matavimus ir ekspozicijos, reikalingos gauti maksimalius parūgštėjimo atsakus į įvairius agonistus, trukmę, buvo atlikti priklausomybės nuo laiko eksperimentai, norint nustatyti optimalų ekspozicijos su agonistu laiką. Iš šių laiko eksperimentų buvo nustatyta, kad ląstelės turi būti eksponuojamos su GnRH peptidiniais agonistais mažiausiai vieną minutę prieš pradedant rinkti parūgštėjimo greičio duomenis. Maksimalūs parūgštėjimo greičiai paprastai būna per pirmųjų dviejų minučių ekspozicijos ciklą. Norint nustatyti maksimalų atsaką į GnRH, ląstelės buvo eksponuojamos su agonistu iš viso keturias minutes. Su junginiais ląstelės buvo eksponuojamos 20-60 minučių prieš keturių minučių trukmės stimuliavimą vien tik su GnRH (1,0 nM - 10 jiM) arba jo derinyje su [vairiomis tiriamojo junginio koncentracijomis. Visi junginiai buvo tiriami esant 1 % galutinei DMSO koncentracijai aukščiau aprašytoje mažai buferintoje MEM terpėje.

[0189] Norint nustatyti junginių susirišimo su GnRH receptoriais specifiškumą junginiai buvo tiriami panaudojant įvarius susirišimo testus ir funkcinius aktyvumo testus. Toliau duodamoje 2 lentelėje parodytas 20 junginio aktyvumas kituose testuose.

[0190]

[0191] Į m-krezolį (4,0 g, 37 mmol) ir metilvinilketoną (3,2 ml 37 mmol) chloroforme (25 ml) pridedama diizopropiletilamino. Mišinys virinamas su grįžtamu šaldytuvu 16 vai., paliekamas atvėsti iki kambario temperatūros ir nugarinamas. Liekana turi 50 % produkto ir 50 ;% pradinės medžiagos. Pradinė medžiaga buvo atskirta t-butildimetilsililo esterio pavidalu. Produktas buvo išskirtas nufiltruojant per adsorbento sluoksnelį. Išeiga 4,5 g (68 %).

[0192]

[0193] Organinis sluoksnis atskiriamas, džiovinamas natrio sulfatu ir nufiltruojamas per silikagelio sluoksnelį. Bespalvė sirupo pavidalo medžiaga, 1,91 g (83 %).

[0194]

[0195] l cinko chloridą (950 mg, 6,97 mmol) nitrometane (20 ml) pridedama 4,4,7-trimetilchromano (1,23 g, 6,97 mmol) ir etil-5-chlormetil-2-furoato (656 mg, 3,48 mmol) nitrometane (15 ml). Mišinys maišomas kambario temperatūroje 16 vai. Nugarinama iki sausos liekanos ir trinama su etilacetatu-vandeniu (1:1, 100 ml). Organinis sluoksnis, jį įprastai apdorojus ir nufiltravus per sluoksnelį adsorbento, naudojant heksaną-etilacetatą (9:1), davė šių dviejų junginių mišinį. 1,34 g (46 % pagal chromaną).

[0196] N-( 2. 4. 6- trimetoksifenil)- 5- f( 4. 4. 7- trimetil- 3, 4- dihidro- 2H- chromen- 6- il) metill- 2-furamidas ir N-( 2. 4. 6- trimetoksifenil)- 5- ff4. 4. 7- trimetil- 3. 4- dihidro- 2H- chromen-8- inmetil1- 2- furamidas

[0197] I etil-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-chromen-6-il)metil]-2-furoato ir etil-5-[(4,4₁7-trimetil-3,4-dihidro-2H-chromen-8-il)metil]-2-furoato mišinį (1,34 g, 3,74 mmol) THF-Me0H-H₂0 (7:5:5, 20 ml) pridedama ličio hidroksido monohidrato (784 mg, 18,7 mmol). Mišinys maišomas 4 vai. kambario temperatūroje. Mišinys nugarinamas iki sausos liekanos, praskiedžiamas 30 ml etilacetato ir 50 ml vandens. Parūgštinus praskiesta HCI, etilacetato sluoksnis atskiriamas, džiovinamas, nugarinamas ir gaunamas atitinkamų rūgščių mišinys, 1,03 g (kiekybinė išeiga). Rūgščių negalima atskirti naudojant kolonėlių chromatografiją arba kristalinimą.

[0198] [ rūgščių mišinį (200 mg, 0,66 mmol) dichlormetane (30 ml) pridedama tionilo chlorido (392 mg, 3,3 mmol). Mišinys virinamas su grįžtamu šaldytuvu 1 vai. ir nugarinamas. Liekana ištirpinama heksane-etilacetate (9:1, 20 ml) ir nufiltruojama per silikagelio sluoksnelį (0,5 cm x 1,0 cm).

[0199] [ šią liekaną 10 ml etilacetato pridedama 2,4,6-trimetoksifenilamino hidrochlorido (145 mg, 0,66 mmol), po to diizopropiletilamino (256 mg, 1,98 mmol). Mišinys maišomas kambario temperatūroje 16 vai. Reakcija stabdoma vandeniu (10 ml) ir atskiriamas etilacetato sluoksnis. Kolonėlių chromatografijos ir HPLC derinys duoda 15 mg ir 21 mg atskirų komponentų

[0200] (12%).

[0201] Šio išradimo junginių bioprieinamumas yra parodytas toliau duodamoje lentelėje.

[0202] Kai kurių šio išradimo junginių in vivo farmakologija buvo tiriama taip:

[0203] Suaugusių Sprague-Davvley žiurkių patinėliai buvo gauti iš Harlan Sprague Davvley (San Diego). Gyvuliukai buvo apgyvendinti po du narve ir laikomi kontroliuojamos temperatūros (22±2 °C) kambaryje su 12 vai šviesos/12 vai. tamsos fotoperiodu (apšviečiama 06.00 vai). Žiurkių pašaras (Teklad žiurkių pašaras) ir vanduo iš čiaupo buvo duodami ad libitum.

[0204] Chirurginis lytinių liaukų išėmimas pašalina cirkuliuojantį testosteroną ir eliminuoja neigiamąjį testosterono grįžtamąjį ryšį į pogumburį. Dėl to GnRH kiekis padidėja, o tuo pačiu padidėja ir LH kiekis (fig. #7). Reikėtų laukti, kad GnRH antagonistas sumažins GnRH tarpininkaujamą LH kiekių padidėjimą. Antidas - GnRH peptidinis antagonistas - sumažina kastruotų žiurkių LH kiekius (fig. #8). Atrodo, kad šis modelis yra tinkamas mažos molekulinės masės GnRH antagonistams įvertinti.

[0205] Sprague-Davvley žiurkių patinėliai (200-225 g) buvo iškastruoti įeinant per kapšelį anestezavus halotanu. Prieš tyrimą gyvuliukams leidžiama 14 dienų sveikti po operacijos. Praėjus 13 dienų po kastravimo, gyvuliukai buvo anestezuojami halotanu ir įvedama neištraukiama kanulė į jungo veną. Kanulės įvedimo metodika buvo aprašyta anksčiau (Harms and Ojeda, 1974). Tyrimų dieną gyvuliukams leidžiama aklimatizuotis procedūrų kambaryje, paliekant juos jų narvuose. Iš visų gyvuliukų paimami foniniai kraujo mėginiai. Tuoj pat po foninių mėginių paėmimo, įvairiais įvedimo būdais įvedamas tirpiklis arba tiriamieji junginiai. Naudoti įvedimo būdai buvo: intraveninis (iv), intraraumeninis (im), intraperitoninis (ip), poodinis (sc) ir peroralinis (po). Kraujo mėginiai buvo imami į heparino turinčius mėgintuvėlius daugelyje laiko taškų po medžiagų įvedimo. Kraujas buvo tuoj pat centrifuguojamas, atskiriama plazma ir laikoma -20° šaldiklyje iki tyrimo. Plazmos mėginiai buvo analizuojami naudojant DSL-4600 ACTIVE LH padengto vamzdelio imunoradiometrinį testavimo rinkinį iš Diagnostic Systems Laboratories, Inc.

[0206] Kompozicija #1 (pažymėta ženkliuku ¹): 10 % DMSO, 10 % kremoforo EL ir 80 % fiziologinio druskos tirpalo.

[0207] Kompozicija #2 (pažymėta ženkliuku ²): 10 % kremoforo EL ir 90 % fiziologinio druskos tirpalo.

[0208] Testosteronas yra hormonas, kurį reguliuoja pogumburio-hipofizės-gonados ašis. GnRH išskiriamas pulsuojančiai iš pogumburio ir stimuliuoja priešakinę hipofizės liauką kad išsilaisvintų gonadotropiniai hormonai LH ir FSH. Testosteronas gaminasi tada, kai sėklides stimuliuoja LH. Išskiriamo testosterono kiekis didėja maždaug tiesiai proporcingai prieinamo LH kiekiui (Guyton, 1986). Laukiama, kad GnRH antagonistas sumažins testosterono kiekį inhibuodamas LH.

[0209] Sprague-Dawley žiurkių patinėliai (250-275 g) buvo apgyvendinti po vieną ir prieš tyrimą jiems leidžiama aklimatizuotis 1 savaitę. Tyrimo dieną gyvuliukams duodamas tirpiklis arba tiriamasis junginys, panaudojant įvairius įvedimo būdus, įskaitant ip, sc arba po. Kraujo mėginiai iš atskirų gyvuliukų paimami, panaudojant širdies punkciją anestezavus halotanu, nustatytuose laiko taškuose po medžiagos įvedimo. Kraujo mėginiai buvo imami į heparino turinčius mėgintuvėlius. Kraujas buvo tuoj pat centrifuguojamas, atskiriama plazma ir laikoma -20° šaldiklyje iki tyrimo. Plazmos mėginiai buvo analizuojami naudojant DSL-4600 ACTIVE testosteronu padengto vamzdelio imunoradiometrinį testavimo rinkinį iš Diagnostic Systems Laboratories, Inc.

[0210] Sprague-Davvley žiurkių patinėliai (250-275 g) buvo apgyvendinti po vieną ir prieš tyrimą jiems leidžiama aklimatizuotis 1 savaitę. Mes sukūrėme m_et_odiką, leidžiančią pakartotiną mėginių paėmimą iš jungo venos, panaudojant mikrorenataninius (MRE) kateterius, implantuotus prieš 7 dienas iki bandymo. Šios chirurginės procedūros detalės, buvo aprašytos anksčiau (Harms and Ojeda, 1974). Tyrimų dieną gyvuliukams leidžiama aklimatizuotis procedūrų kambaryje, paliekant juos jų narvuose. Iš visų gyvuliukų paimami foniniai kraujo mėginiai. Tuoj pat po foninių mėginių paėmimo, įvairiais įvedimo būdais duodamas tirpiklis arba tiriamieji junginiai. Naudoti įvedimo būdai buvo: intraveninis (iv), intraraumeninis (im) ir peroralinis (po). Kraujo mėginiai buvo imami į heparino turinčius mėgintuvėlius daugelyje laiko taškų

[0211] po medžiagų įvedimo. Kraujas buvo tuoj pat centrifuguojamas, atskiriama plazma ir laikoma -20° šaldiklyje iki tyrimo. Plazmos mėginiai buvo analizuojami naudojant DSL-4600 ACTIVE testosteronu padengto vamzdelio imunoradiometrinį testavimo rinkinį iš Diagnostic Systems Laboratories, Inc.

[0212] ir prieš tyrimą jiems leidžiama aklimatizuotis 1 savaitę. Kiekvieną dieną buvo įvedamas tirpiklis arba im, sc arba po būdu tarp 8:00 ir 9:00 vai. ryto septynias dienas. Aštuntą dieną tarp 8:00 ir 9:00 vai. ryto buvo paimami kraujo mėginiai, panaudojant širdies punkciją anestezavus halotanu. Procedūra trunka 45-60

[0213] sek. Per kitas 7 dienas viena gyvuliukų grupė toliau gavo tirpiklį, o kita gyvuliukų grupė nebuvo veikiama niekuo. Mėginiai buvo imami taip, kaip aprašyta aukščiau, po šio poveikio režimo 7tos dienos. Tirpikliu veiktų ir neveiktų gyvuliukų testosterono kiekiai nesiskyrė.

[0214] Kiekvieną dieną buvo leidžiama im būdu 134 junginio dozė (100 mg/kg) arba tirpiklis tarp 8:00 ir 9:00 vai. ryto septynias dienas. Mėginiai buvo imami taip, kaip aprašyta aukščiau, po 7tos poveikio dienos.

[0215] Visi kraujo mėginiai buvo imami į heparino turinčius mėgintuvėlius. Kraujas buvo tuoj pat centrifuguojamas, atskiriama plazma ir laikoma -20° šaldiklyje iki tyrimo kitą dieną. Plazmos mėginiai buvo analizuojami naudojant DSL-4600 ACTIVE testosteronu padengto vamzdelio imunoradiometrinį testavimo rinkinį iš Diagnostic Systems Laboratories, Inc.

[0216] Fig.7. Stulpelinis grafikas, rodantis kastruotų (CX) ir sveikų žiurkių bazinius LH ir testosterono kiekius. CX žiurkių LH yra padidintas. Testosterono CX žiurkėse nėra. . Fig.8. Linijinis grafikas, rodantis LH kiekius., _"išreikštus procentais nuo bazinės linijos, tirpikliu ir antidu paveiktuose gyvuliukuose. Antidas (2,0 ir 20 ug; sc) slopina LH CX žiurkėse. Fig.9. Linijinis grafikas, rodantis LH kiekius, išreikštus procentais nuo bazinės linijos, tirpikliu ir junginiu paveiktuose gyvuliukuose. 134 junginys (1,0, 5,0 ir 10 mg/kg; iv) duoda priklausantį nuo dozės LH slopinimą CX žiurkėse. Fig.10. Linijinis grafikas, rodantis LH kiekius, išreikštus procentais nuo bazinės linijos, tirpikliu ir junginiu paveiktuose gyvuliukuose. 134 junginys (20 ir 100 mg/kg; ip) slopina LH CX žiurkėsė. Fig.11. Linijinis grafikas, rodantis LH kiekius, išreikštus procentais nuo bazinės linijos, tirpikliu ir junginiu paveiktuose gyvuliukuose. 134 junginys (20 ir 100 mg/kg; ip) slopina LH CX žiurkėse.

[0217] Fig.12: Stulpelinis grafikas, rodantis tirpikliu ir junginiu paveiktų gyvuliukų testosterono kiekius praėjus 6 vai. po ip injekcijos. 136 junginys slopina testosterono kiekius, lyginant su tirpikliu paveiktais gyvuliukais

[0218] Fig.13: Linijinis grafikas, rodantis tirpikliu ir 134 junginiu paveiktų žiurkių testosterono kiekius 12 valandų eigoje ir 24 vai. taške. Tirpiklis ir 134 junginys buvo įvesti per gerklę panaudojant zondą. Didžiausia 134 junginio dozė slopino testosteroną per visą bandymą..

[0219] Fig. 14: Stulpelinis grafikas, rodantis tirpikliu, 134 junginiu paveiktų ir kontrolinių gyvuliukų testosterono kiekius. Balti stulpeliai atitinka testosterono kiekius po pirminio poveikio, o juodi stulpeliai atitinka testosterono kiekius po 7 dienų pakartotinio poveikio. 134 junginys žymiai slopino testosterono kiekius, lyginant su pirminio poveikio kiekiais, tirpikliu ir kontroliniais gyvuliukais. ^*=p<0,05, t-testas.

[0220] Literatūroje buvo aprašyta, kad kai kurios gyvūnų endokrininiuose tyrimuose paprastai naudojamos procedūros, tokios kaip anestezija, maisto trūkumas, chirurginė operacija, gali veikti tiriamųjų hormonų kiekius (B.E. Howland, etai., Experentia, 1974). Luteinizuojantis hormonas ir testosteronas yra jautrūs stresų sukėlėjams. Daugelis pranešimų' apie stresų sukėlėjų poveikį į HPG aš[ yra prieštaraujantys net ir tada, kai yra naudojamos tos pačios gyvūnų rūšys ir tie patys stresų sukėlėjai. Pavyzdžiui, buvo aprašyta, kad kai žiurkių patinėlių judėjimas buvo suvaržytas arba jie buvo imobilizuoti, jie turėjo žemas (Kruhlich et al._t 1974, DuRuisseaų et al., 1978), normalias (Tache et al., 1980; Charpenet et al., 1982; Coliu et al., 1984) arba padidintas LH koncentracijas (Briski et al., 1984). Panašiai, buvo aprašyta, kad testosterono kiekiai plazmoje keičiasi po poveikio stresu, bet vėlgi pasirodo, kad duomenys yra prieštaraujantys ir todėl sunku juos interpretuoti. Pavyzdžiui, buvo aprašyta, kad intensyvių fizinių pratimų metu testosterono kiekis plazmoje didėja (Dessypris et al., 1976), mažėja (Sutton et al., 1973) arba nepakinta (Lamb, 1975). Imobilizavimo poveikis į testosterono koncentracijas buvo labiau sutampantis tarp įvairių tyrinėtojų gautų duomenų, ir jie stebėjo cirkuliacinių reikšmių sumažėjimą (Tache et al., 1980; Charpenet et al., 1982; Coliu et al., 1984). Vis tik yra priimta, kad stresų sukėlėjai duoda cirkuliuojančio testosterono pokyčius, o panaudoto streso pobūdis, trukmė ir dydis sukelia skirtingus streso indukuotus testosterono koncentracijų pokyčius. Turėdami omenyje LH ir testosterono jautrumą stresui, mes

[0221] optimizavome metodikas, kad būtų galima įvertinti LH ir testosteroną sąlygomis, kurios sumažina stresą.

[0222] Šio išradimo junginiai, kurie buvo pagaminti, yra parodyti pridedamose

[0223] Junginiai gali būti pagaminti pagal aukščiau aprašytus bendruosius eksperimentinius principus. Toliau yra duodami konkretūs pavyzdžiai.

[0224] 2- Chlor- N-[( 2R)- tetrahidro- 2- furanmetil]- 4- pirimidinamino ( 1) ir 4- chlor- N-[( 2R)- tetrahidro- 2- furanmetil]- 2- pirimidinamino (2) gavimas

[0225] Į 250 ml talpos apvaliadugnę kolbą įdedama 2,4-dichlorpirimidino (5,0 g, 33,56 mmol) ir 200 ml THF. Į šį tirpalą pridedama trietilamino (14,0 ml, 100,68 mmol) ir (R)-tetrahidrofurfurjlamino. Tirpalas maišomas per naktį. Reakcijos mišinys supilamas į vandenį ir ekstrahuojamas metileno chloridu. Organinis sluoknis atskiriamas, plaunamas sočiu NaCI tirpalu, džiovinamas magnio sulfatu ir sukoncentruojamas rotoriniu garintuvu. Negrynas junginys gryninamas cHromatografuojant per silikagelį, eli.uuojant heksanu/etilacetatu (nuo 4:1 t/t iki 1:1 t/t), ir gaunamas 2 (1,3 g) ir 1 (3,98 g).

[0226] į m-ksilendiamino (28,76 g, 211,15 mmol) tirpalą THF (300 ml, 0,7 M) sulašinamas etiltrifluoracetato (10 g, 70,38 mmol) tirpalas THF (50 ml, 1,4 M). Tirpalas maišomas kambario temperatūroje per naktį. Reakcija kontroliuojama TLC. Tirpiklis sukoncentruojamas, liekana 4N HCI parūgštinama iki pH 2, ištirpinama vandenyje ir plaunama etilacetatu. Atskirtas vandeninis sluoksnis naudojant NH₄OH pašarminamas iki pH 11, ir junginys išekstrahuojamas dichlormetanu. Atskirtas organinis sluoksnis plaunamas vandeniu ir sočiu NaCI tirpalu, džiovinamas magnio sulfatu ir sukoncentravus gaunamas 3 (8,71 g, 53 % išeiga).

[0227]

[0228] Į N-[3-(aminometil)benzil]-2,2,2-trifluoracetamido 3 (10,6 g, 43,1 mmol) tirpalą pridedama etilchlorformiato (1 ekv.), o po to trietilamino. Reakcijos mišinys maišomas kambario temperatūroje 30' min. Negrynas produktas išekstrahuojamas metileno chloridu ir sukoncentravus gaunamas etilo 3-{[(trifluoracetil)amino]metil}benzilkarbamatas 4. Šis negrynas produktas ištirpinamas metanolyje (100 ml) ir 2N K₂C0₃ (100 ml) ir maišomas per naktį. Reakcijos mišinys pašarminamas iki pH 14 20 % NaOH, ekstrahuojamas metileno chloridu, plaunamas sočiu NaCI ir išdžiovinus magnio sulfatu gaunamas 5 (5,2 g).

[0229] Etilo 3{[( 2-{[( 2R)- tetrahidro- 2- furanilmetil] amin o}- 4- pirimidiniI) amino]-metil} benzilkarbamato ( 6) gavimas

[0230] [ etilo 3-(aminometil)benzilkarbamato 5, turinčio 4-chlor-N-[(2R)-tetrahidro-2-furanmetil]-2-pirimidino 2, tirpalą chlorbenzene pridedama trietilamino. Reakcijos mišinys virinamas su grįžtamu šaldytuvu per naktį. Tirpalas atšaldomas iki kambario temperatūros, supilamas į silikagelio kolonėlę ir eliuuojamas heksanu/etilacetatu (1:1 t/t); gaunamas etilo 3{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-4-pirimidinil)-amino]metil}benzil-karbamatas 6 (73 % išeiga).

[0231] Etilo 3{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-4-pirimidinil)-amino]-metiljbenzilkarbamatas 6 ištirpinamas etilenglikolyje ir kalio hidrokside (1:1 t/t). Tirpalas šildomas 100 °C temperatūroje per naktį. Mišinys atšaldomas iki kambario temperatūros ir ekstrahuojamas chloroformu, plaunamas sočiu NaCI tirpalu, džiovinamas magnio sulfatu ir gaunamas N^4-[3-(aminometil)benzil]-N^2-

[0232] [(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]-2,4-pirimidindiaminas 7 (82 % išeiga).

[0233] 5-[( 3, 5, 5, 8, 8- Pentametil- 5, 6, 7, 8- tetrahidro- 2- naftalenil) metil]- N-( 3-{[( 2-{[( 2R)- tetrahidro- 2- furanilmetil] amino}- 4- pirimidinil) amino] metil} benzil)-2- furamido ( 9) gavimas

[0234] Etilo 3{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-4-pirimidinil)-amino]-metiljbenzilkarbamatas 6 ištirpinamas etilenglikolyje ir kalio hidrokside (1:1 t/t). Tirpalas šildomas 100 °C temperatūroje per naktį. Mišinys atšaldomas iki kambario temperatūros ir ekstrahuojamas chloroformu, plaunamas sočiu NaCI tirpalu, džiovinamas magnio sulfatu ir gaunamas N^4-[3-(aminometil)benzil]-N^2-

[0235] [(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]-2,4-pirimidindiaminas 7 (82 % išeiga). Šis produktas (7) (182 mg, 580 mmol) ir 2-furoilchloridinis reagentas 8 ištirpinami dichlormetane, po to pridedama trietilamino. Reakcijos mišinys maišomas kambario temperatūroje per naktį. Negrynas produktas gryninamas chromatografuojant per silikagelio kolonėlę, eliuuojant etilacetatu/heksanu (4:1 t/t), ir gaunamas 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-N-(3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2-furanilmet_!l]amino}-4-pirimidinil)-amino]metil}benzil)-2-furamidas 9 (159,1 mg). 'H BMR (CDCb): 1,65 (m, 5H), 1,92 (m, 3H), 2,23 (s, 3H), 3,45 (m, 1H), 3,5 (m. 1H). 3,7 (m, 1H), 3.9 (m. 1H), 4,05 (m, 1H), 4,50 (d, 2H), 4,58 (d, 2H), 5,01 (pl, TH), 5,30 (pl, 1H),5,71 (d,

[0236] 1H), 6,03 (d, 1H), 6,61 (t, 1H), 6,99 (s, 1H), 7,06 (s, 1H), 7,28 (m, 4H), 7,80 (d. 1H). MS: 622,4 (M+1).

[0237]

[0238] Į m-krezolį (4,0 g, 37 mmol) ir metilvinilketoną (3,2 ml 37 mmol) chloroforme (25 ml) pridedama diizopropiletilamino. Mišinys virinamas su grįžtamu šaldytuvu 16 vai., paliekamas atvėsti iki kambario temperatūros ir nugarinamas. Liekana turi 50 % produkto ir 50 % pradinės medžiagos. Pradinė medžiaga buvo atskirta t-butildimetilsililo esterio pavidalu. Produktas buvo išskirtas nufiltruojant per silikgelio sluoksnelį, išplaunant 50 % heksanu/etilacetatu. Išeiga 4,5 g (68 %). Kita gryninimo metodika yra: negrynas reakcijos mišinys nugarinamas, ištirpinamas DMF (0,2 M) ir pridedama 0,5 ekvivalento imidazolo ir 0.5 ekvivalento tBDMSCI. Reakcijos mišinys maišomas 3 vai. kambario temperatūroje, po to tirpikliai nugarinami vakuume. į liekaną įpilama 75 ml etilacetato ir 75 ml vandens (santykis 1/1).

[0239] Etilacetato sluoksnis atskiriamas ir džiovinamas Na₂S0₄. Tirpikliai nugarinami vakuume. Negryna medžiaga uždedama ant silikagelio sluoksnelio ir sililintas m-krezolis pašalinamas heksanais. Produktas gaunamas eliuuojant 5-10 % etilacetatu heksanuose. Vakuume nugarinus tirpiklius, gaunamas norimas produktas. 1H BMR (CDCI₃): 7,15 (t, 1H), 6,65-6,80 (m, 2H), 4,25 (t, 2H), 2,75 (t, 2H), 2.25 ir 2,35 (2s, po 3H).

[0240]

[0241] Į metilmagnio bromidą eteryje (50 ml), pagamintą iš Mg (572 mg, 23,56 mmol) ir Mel (3,34 g, 23,56 mmol), pridedama 4-(3-metilfenoksi)-2-butanono (2,1 g, 11,78 mmol) 10 ml eterio. Tirpalas maišomas kambario temperatūroje 30 min., po to skaldomas vandeniu ir praskiestą hidrochlorido rūgštimi. Organinis sluoksnis atskiriamas, džiovinamas natrio sulfatu ir nufiltruojamas per silikagelio sluoksnelį ir gaunama bespalvė sirupo pavidalo medžiaga, 1,91 g (83 %). Masių spektras, naudojant APCI, +maš 177 (M^+-OH).

[0242]

[0243] l aliuminio chloridą (1,3 g, 9,79 mmol) 40 ml anglies disulfido pridedama 2-metil-4-(3-metilfenoksi)-2-butanolio (1,9 g, 9,79 mmol) 10 ml anglies disulfido. Mišinys virinamas su grįžtamu šaldytuvu 2 vai. Tirpiklis nugarinamas, liekana praskiedžiama 50 ml etilacetato ir 10 ml vandens. Organinis sluoksnis atskiriamas, džiovinamas natrio sulfatu ir išgryninus kolonėlių chromatografijos metodu gaunama "^:"gelsva sirupo pavidalo medžiaga, 1,5 g (87 %). ¹H BMR (CDCI₃): 7,05 (pl.d, 1H), 6,87 (dd, 1H), 6,69 (d, 1 H), 4,20 (t, 2H), 2,35 (s, 3H), 1,80 (t, 2H), 1,40 (s, 6H).

[0244] Etil- 5-[( 4, 4, 7- trimetil- 3, 4^ dihidro- 2H- chromen- 6- iljmGtil]- 2- furoatas ir etil-5.[( 4f4j. trimetil- 3, 4- dihidro- 2H- chromen- 8- il) metil]- 2- furoatas

[0245]

[0246] Į e_til-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-chromen-6-il)metil]-2-furoato ir etil-5-[(4_t4₎7-trimetil-3,4-dihidro-2H-chromen-8-il)metil]-2-furoato mišinį (1,34 g, 3,74 mmol) THF-MeOH-h_kO (7:5:5, 20 ml) pridedama ličio hidroksido monohidrato (784 mg, 18,7 mmol). Mišinys maišomas 4 vai. kambario temperatūroje. Mišinys nugarinamas iki sausos liekanos, praskiedžiamas 30 ml etilacetato ir 50 ml vandens. Parūgštinus praskiesta HCI, etilacetato sluoksnis atskiriamas, džiovinamas, ir nugarinus vakuume gaunamas atitinkamų rūgščių mišinys, 1,03 g (kiekybinė išeiga). Rūgščių negalima atskirti naudojant kolonėlių chromatografiją arba kristalinimą. Į šių rūgščių mišinį (200 mg, 0,66 mmol) dichlormetane (30 ml) pridedama tionilo chlorido (392 mg. 3,3 mmol). Mišinys virinamas su grįžtamu šaldytuvu 1 vai. ir nugarinamas. Liekana ištirpinama heksane-etilacetate (9:1, 20 ml) ir nufiltruojama per silikagelio sluoksnelį (0,5 cm x 1,0 .cm). [ šią liekaną 10 ml etilacetato pridedama 2,4,6-trimetoksifenilamino hidrochlorido (145 mg: ₀,66 mmol), po to diizopropiletilamino (256 mg, 1,98 mmol). Mišinys maišomas

[0247] ■— ■ -r#w"i v kambario temperatūroje 16 vai. Reakcija stabdoma vandeniu (10 ml) ir atskiriamas etilacetato sluoksnis. Kolonėlių chromatografijos ir HPLC derinys duoda 15 mg ir 21 mg atskirų komponentų (12 %). Izomerai buvo atskirti naudojant atvirkštinių fazių HPLC chromatografiją. Linijinis izomeras: ¹H BMR (CDGI_a): 7,46 (pl.s, 1H), 7,23 (pl.s, 1H), 7,14 (pl.s, ¹ H), 7,02 (s, 2H), 6,63 (s, 1H), 6,15 (s, 2H), 6,0 (d, 1H), 4,17 (t, 2H), 3,93 (s. 3H), 3,81, 3,80 (2s, po 3H), 2,2₁ (s, 3H), 1,81 (t, 2H), 1,29 (s, 6H). M" .466,2. Kampinis izometas. AXC07302: 7,25 (pl.s, 1H), 6,91 (d, 1H), 6,88 (d; paslėptas, 1H), 6,53 (d, 1H), 5,95 (s, 2H), 5,72 (d, 1H), 3,96 (t, 2H), 3,8 (s, 3H), 3,6 (s, 6H), 2,07 (s, 3H), 1,59 (t, 2H), 1,11 (s, 6H). M+ 466,1.

[0248]

[0249] Timolis (1,0 ekv., 33,3 mmol) ir metilo 5-(chlormetil)-2-furoatas (1,0 ekv., 33,3 mmol) ištirpinami nitrometane (120 ml, 0,2 M). Į šį tirpalą azoto atmosferoje supilamas aliuminio trichloridas (1,0 ekv., 33,3 mmol), ištirpintas 25 ml nitrometano, ir 10 min. lėtai virinama su grįžtamu šaldytuvu. Šildymas nutraukiamas ir paliekama azoto atmosferoje per naktį. Reakcija stabdoma pridedant 100 ml vandens ir ekstrahuojama dichlormetanu. Negrynas mišinys nugarinamas iki sausos liekanos ir suleidžiamas ant chromatografinės kolonėlės paviršinio sluoksnio (santykis: 1 g negrynos medžiagos/100 g silikagelio). Kolonėlė eliuuojama 7 ir 11 % etilacetato/heksanuose ir gaunamas norimas produktas (2,9 g, 30 %). Esteris'hidrolizuojamas į rūgštį ličio hidroksidu THF/Me0H/H20 (35/25/25).

[0250] 5-(4-Hidroksi-5-izopropil-2-metilbenzil)-2-furankarboksirūgštis (1,0 ekv., 3,6 mmol, 0,5M) ir 2,6-dimetoksianilinas (1,0 ekv., 3,6 mmol) ištirpinami DMF. Į šį mišinį pridedama HATU (1,0 ekv., 3,6 mmol) ir diizopropiletilamino (1,0 ekv., 3,6 mmol) ir maišoma per naktį. Mišinys pakaitinamas 10 min. 45 °C temperatūroje. Tirpalas supilamas į etilacetatą (3x didesnis tūris) ir plaunamas vandeniu. Organinis sluoksnis nugarinamas iki sirupo pavidalo liekanos ir eliuuojamas per trumpą chromatografinę kolonėlę_' (1:100 g negrynos medžiagos / g silikagelio) 30 ir 50 % etilacetatu/heksane; gaunamas N-(2,6-dimetiksifenil)-5-(4-hidroksi-5-izopropil-2-metilbenzil)-2-furamido (820 mg, 55 % išeiga). ¹H BMR (CDCI₃), m.d.: 7,22 (1H, t, J = 8,68 Hz), 7,08 (1H, d, J = 3,40 Hz), 6,99 (1H, s), 6,64 (2H, d, J = 8,68 Hz), 6,61 (1H, s), 5,97 (1H, d, J = 3,40 Hz), 3,95 (2H, s), 3,85 (6H, s), 3,17 (1H, pentetas, J = 6,8 Hz), 2,23 (3H, s), 1,25 (3H, s) ir 1,23 (3H, s).

[0251] Kalio t-butoksidas (1,05 ekv., 0,128 mmol) ištirpinamas MeOH (24 _į.U). _[ aukščiau aprašyto furamido (1,0 ekv., 0,122 mmol, 1M) tirpalą DMF, pridedamas t-butoksido tirpalas ir maišoma 30 min. Supilamas 2-brometilmetilo eteris (1,0 ekv., 0,122 mmol) (20 % MeOH/DMF, 1M), maišoma kambario temperatūroje 48 vai. ir išgryninus atvirkštinių fazių HPLC metodu (35-75 % acetonitrilas 0,1 % vandeniniame THF, 90 min) gaunama medžiaga (8,5 mg, 15 % išeiga). ¹H BMR (CDCI₃), m.d.: 7,04 (1 H, J = 8,31 Hz, t), 6,85 (1H, J = 3,40Hz, d), 6,80 (1H, s), 6,53 (1H, s), 6,48 (2H, J = 8,31 Hz, d), 5,76 (1H, J = 3,40 Hz, d), 3,88 (2H, J = 3,40/4,53 Hz, dd), 3,78 (2H, s), 3,58 (6H, s), 3,54 (2H, J = 3,40/4,54 Hz, dd), 3,20 (3H, s), 3,07 (1H, J = 7,2 Hz, pentetas), 2,04 (3H, s), 0,97 (3H, s), 0,95 (3H, s).

[0252] ^ w^r v

[0253] l.l.e-Trimetil-I^.S^-tetrahidronaftalenas buvo susintetintas pagal literatūros šaltinį: John J. Parlow, Tetrahedron, Vol. 49(13), 2577. Po to jis buvo sujungtas su metilo 5-(chlormetil)-2-furoatu pagal Frydelio-Kraftso reakciją kaip pažymėta anksčiau, ir gauti du pagrindiniai regioizomerai. Norimas izomeras buvo atskirtas po hidrolizės, naudojant 3-5 nuoseklius perkristalinimus iš 10 % acetono/heptano (1 g/10 ml) sistemos. Po to rūgštis buvo paversta chloranhidridu, panaudojant tionilo chloridą kaip pažymėta anksčiau.

[0254] Į 5-[(3_I8₁8-trimetil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoilo chlorido (1,0 ekv., 0,32 mmol, 0,2 M) tirpalą 2 ml etilacetato pridedama 2,4,6-trimetoksianilino mono HCI druskos *(1,0 ekv., 0,32 mmol). Į š[ mišinį pridedama trietilamino (perteklius) ir maišoma per naktį. Negrynas produktas džiovinamas vakuume ir gryninamas leidžiant per trumpą chromatografinę kolonėlę (santykis:1:100 negrynos medžiagos/silikagelio), kuri eliuuojama 20 ir 30 % etilacetato tirpalu heksane. Kai kuriais atvejais regioizomerai buvo atskirti perkristalinant iš 25 % etilacetato heksanuose (1 g junginio 75 ml tūryje), ir gautas N-(2,4₁6-trimetoksifenil)-5-[(3,8,8-trimetil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furamidas (120 mg, 82 % išeiga). ¹H BMR (CDCb), m.d.: 7,28 (1H, platus), 7,12 (1H, s), 7,08 (1H, J = 3,40 Hz, d), 6,89 (1H, s), 6,19 (2H, s), 6,00 (1H, J = 3,40 Hz, d), 3,97 (2H, s), 3,83 (3H, s), 3,82 (6H, s), 2,73 (2H, J = 6,05 Hz, t), 2,25 (3H, s), 1,84-1,76 (2H, multipletas), 1,69-1,63 (2H, multipletas), 1,59 (3H, s), 1,26 (6H, s). Elementinė analizė: laukiama C(72,55), H(7,18), N(3,02); rasta C(72,67), H(7,22), N(2,98).

[0255]

[0256] II junginys. Į 3,5-dimetoksianilino (I junginys, 1,53 g, 10 mmol) tirpalą DCM (20 ml) pridedama metansulfonilchlorido (0,88 ml, 10 mmol). Įlašinama TEA (1,40 ml, 10 mmol). Reakcijos mišinys maišomas kambario temperatūroje 15 vai. Negrynas produktas išdžiovinamas ir gryninamas sparčiosios chromatografijos metodu (30 % etilacetatas/heksanuose); gaunamas II junginys (2,10 g, 91 %), kuris yra balta kieta medžiaga. ¹H BM_R, (CDCh) 2,96 (s, 3H), 3,71 (s, 6H), 6,20 (d, 1H, J = 3 Hz), 6,34 (d, 2H, J = 3 Hz), 6,76 (s, 1H), APCI-MS m/z 232 (M+H)⁺.

[0257] III junginys. [ (CH₃)₄NN0₃ (1,12 g, 7,89 mmol) tirpalą DCM (10 ml) įlašinama triflo rūgšties anhidrido. Reakcijos mišinys maišomas 0 °C temperatūroje 1,5 vai. I lašinamąjį piltuvą supilamas II junginys (1,75 g, 7,51 mmol) 10 ml DCM, ir tirpalas sulašinamas į nitronio triflato reakcijos mišinį -78 °C temperatūroje. Reakcijos mišinys laikomas -78 °C temperatūroje 30 min., po to laipsniškai sušildomas iki kambario temperatūros. Jis maišomas 15 vai. Reakcija stabdoma 5 % NaHC0₃ (50 ml), mišinys maišomas 30 min. Vandeninis sluoksnis ekstrahuojamas DCM (3x20 ml). Sumaišyti DCM sluoksniai džiovinami Na₂S0₄. Negrynas produktas gryninamas HPLC metodu, ir gaunamas III junginys (250 mg. 11 %), kuris yra balta kieta medžiaga. ¹H BMR, CDCh) 3,03 (s, 3H), 3,87 (s, 3H), 3,90 (s, 3H), 6,32 (d, 1 H, J = 3 Hz), 6,88 (d, 1 H, J = 3 Hz), 8,31 (s, 1 H).APCI-MS m/z 275 (M-H)_'.

[0258] IV junginys. I III junginio (106 mg, 0,38 mmol) tirpalą EtOH (2 ml) pridedama 20 mg Pd/C ir NH₂NH₂ (1 ml). Reakcijos mišinys virinamas su

[0259] I» I 43U4 D grįžtamu šaldytuvu 9 vai. Reakcijos mišinys perleidžiamas per celito sluoksnį. Tirpalas nugarinamas iki sausos liekanos ir gaunamas IV junginys, kuris yra ruda kieta medžiaga (90 mg, 95 %). Šis junginys naudojamas tiesiogiai tolimesnėje stadijoje.

[0260] [ IV junginio (39 mg, 0,16 mmol) ir 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil]-2-furoilo chlorido (60 mg, 0,174 mmol) tirpalą DCM (1 ml) pridedama TEA (44 (j.l, 0,31 mmol). Reakcijos mišinys maišomas kambario temperatūroje per naktį. Po sparčiosios chromatografijos (30 % etilacetatas/heksanuose) gaunamas 228 junginys (65 mg, 74 %), kuris yra balta kieta medžiaga. 'H BMR (CDCb) 1,04 (m, 12H), 1,45 (m, 4H), 2,09 (s, 3H), 2,71 (s, 3H), 3,60 (s, 3H), 3,63 (s; 3H), 3,78 (s, 2H), 5,89 (d, 1H, J = 3 Hz), 6,17 (d, 1H, J = 3 Hz), 6,58 (d, 1H, J = 3 Hz), 6,85 (s, 1H), 6,90 (s, 1H), 6,96 (d, 1H, J = 3 Hz), 7,90 (s, 1H), 8,24 (s, 1H). APCI-MS m/z 556 (M+H)⁺.

[0261] ¹H BMR (CDCb) 1,26 (m, 12H), 1,66 (m, 4H), 2,28 (s, 3H), 3,82 (s, 6H), 3,96 (s, 2H), 6,04 (d, 1H, J = 6 Hz), 6,60 (s, 1H), 6,62 (s, 1H), 7.05 (m, 3H), 7,23 (t, 1 H, J = 6 Hz), 7,44 (s, 1 H). APCI-MS m/z 462 (M+H)⁺.

[0262] ¹H BMR (DMSO) 2,20 (s, 3H), 2,27 (s, 6H), 3,71 (s, 6H), 3,98 (s, 2H), 5,93 (d, 1H, J = 3 Hz), 6,68 (s, 1H), 6,69 (s, 1H), 6,86 (d, 2H, J = 3 Hz), 7,10 (d, 1H, J = 3 Hz), 7,23 (t, 1 H, J = 7 Hz), 9,04 (s, 1 H). APCI-MS m/z 379 (M+H)⁺.

[0263] ¹H BMR (DMSO) 2,20 (s, 3H), 2,28 (s, 6H),2,32 (s, 3H). 2,42 (s, 3H), 3,72 (s. 6H), 4,10 (s, 2H), 6,00 (d, 1H, J = 3 Hz), 6,60 (s, 1H), 6,68 (s, 1H), 6,71 (s, 1 H), 7,10 (m, 2H), 7,24 (t, 1H, J = 6 Hz), 9,04 (s, 1H). APCI-MS m/z 458

[0264] (M+H)⁺.

[0265] ¹H BMR (CDC_b) 3,76-3,83 (m, 15H), 4,07 (s, 2H). 5,95 (d, 1H, J = 3 Hz), 6,₆₀ (s, 1H), 6,57-6,62 (m, 3H), 6,78 (d, 1H, J = 9 Hz), 7,03 (d, 1H, J = 3 Hz), 7,₁₉ (t. 1 H, J = 6 Hz), 7,46 (s, 1 H). APCI-MS m/z 428 (M+H)⁺.

[0266] ¹H BMR (CDCb) 3,72-3,77 (m, 15H), 3,90 (s, 2H), 5,78 (d, 1H, J = 3 Hz), 6,08 (s, 2H), 6,52-6,55 (m, 3H), 6,94 (d, 1 H, J = 9 Hz), 7,12 (d, 1H, J = 9 Hz), 7,39 (s, 1 H). APCI-MS m/z 428 (M+H)⁺.

[0267] ¹H BMR (CD₃OD) 2,33-2,48 (m, 12H), 3,84 (s, 6H), 4,19 (s, 2H), 5,81 (d, 1 H. J = 3 Hz), 6,73 (d, 2H, J = 9 Hz), 7,06 (d, 1H, J = 3 Hz), 7,29 (t, 1H, J = 9 Hz). APCI-MS m/z 472 (M+H)+.

[0268] ¹H BMR (CDCb) 0,67 (t, 3H, J = 6 Hz), 1,27 (m, 6H), 1,70 (m, 2H), 3,62 (s, 3H), 3,80-3,83 (m, 6H), 4,02 (s, 2H), 6,02 (d, 1H, J = 3 Hz), 6,60 (d, 2H, J = 9 Hz), 6,83 (d, 1H, J = 9 Hz), 7,07-7,19 (m, 4H), 7,43 (s, 1H). APCI-MS m/z 438

[0269] (M+H)⁺.

[0270] ¹H BMR (CDCb) 0,66 (t, 3H, J = 6 Hz), 1,23 (m, 6H), 1,54-1,62 (m, 2H), 3,80-3,81 (m, 12H), 4,01 (s, 2H), 6,00 (d, 1H, J = 3 Hz), 6,81 (d, 1H, J = 9 Hz), 6,82 (d, 1H, J = 3 Hz), 7,06-7,28 (m, 4H). APCI-MS m/z 468 (M+H)⁺.

[0271]

[0272] Vykdoma 9 junginio (10 g, 57,3 mmol), metilo furoato (12,7 g, 68,7 mmol) ir AlCb (9,1 g, 68,7 mmol) Frydelio-Kraftso reakcija nitrometane 80 °C temperatūroje 2 valandas. Tirpalas supilamas į 200 ml ledinio vandens ir ekstrahuojamas etilacetatu. Organinis sluoksnis sukoncentruojamas ir išgryninus per silikagelio kolonėlę, eliuuojamą heksanu/etilacetate (9:1, t/t), gaunamas regioizomerų 10 ir 11 mišinys (15,5 g) santykiu 2:1.

[0273] Šis mišinys hidrolizuojamas 2N NaOH/MeOH (1:1 t/t) ir gaunamas atitinkamų rūgščių mišinys.

[0274] Rūgščių mišinys (2,3 g, 7,4 mmol), benzenboro rūgštis (1,1 g: 8,9 mmol), [P(Ph) 3]4Pd ir kalio karbonatas (2N, 1 ml) DMF (20 ml) šildomi 80 °C temperatūroje per naktį. Po apdorojimo vandeniu liekana perleidžiama per silikagelio kolonėlę, eliuuojant heksano/etilacetato/acto rūgšties (7:3:1 t/t/t) mišiniu, ir gaunamas dviejų regioizomerų mišinys, kurį perkristalinus iš heksano ir etilacetato, gaunamas 12 (610 mg). 12 junginys buvo kopuliuojamas su trimetoksianilinu pagal standartinę metodiką ir gera išeiga gaunamas AXC07468. ¹H BMR (CDCI₃): 5 2,24 (d, 3H), 2,33 (d, 3H), 3,82 (s, 6H), 3,84 (s, 3H), 4,02 (s, 2H), 6,03 (d, 1H), 6,18 (s, 2H), 7,06 (s, 2H), 7,12 (s, 1 H), 7,29-7,40 (m, 5H). MS (APCI): 472.1 (M+₁).

[0275] 5-[ 5-( 2, 2- Dimetilpropanoil)- 2, 4- dimetoksibenzil)- N-( 2, 4, 6- trimetoksifenil)-2- furamido sintezė

[0276]

[0277] Tinkamas tarpinis junginys gali būti pagaminamas taip:

[0278] Metilo 5-( chlormetil)- 2- furoato ( 2) 2, 88 molių partijos gavimo papunkčiui išdėstyta metodika

[0279] l 12 I trigurklę apvaliadugnę kolbą (a k.) įstatykite lašinamąjį piltuvą,

[0280] viršuje įtvirtintą elektrinį maišiklį, termoporą ir kolbą įdėkite į ledo vonią.

[0281] į a.k. įpilkite 2,2 I DCM, po to 2,2 I kone. HCI (nežymi egzoterminė

[0282] Į ląšinamąjį piltuvą jeigu telpa, įpilkite 1,1 I H₂SO₄. Reaktorių

[0283] atšaldykite iki 0-10 °C. Pradėkite pilti sieros rūgštį iš pradžių lašinant, kol sulėtėja egzoterminė reakcija (maždaug Vz tūrio), po to padidinkite

[0284] LI 49U4 D pylimo greitį iki silpnos srovelės. (Dėl atsargos temperatūrą laikykite žemiau 20 °C).

[0285] Pakeiskite šaldymo vonią [ kambario temperatūros vandens vonią. (Ji

[0286] Į a.k. įdėkite 0,371 kg metilo 2-furoato iš karto. (Egzoterminės reakcijos

[0287] įdėkite 0,520 kg ZnCb mažomis dalimis. (Šiek tiek burbuliuoja -

[0288] įtariamas HCI dujų susidarymas; egzoterminė reakcija kontroliuojama vandens vonia).

[0289] Į perplautą lašinamąjį piltuvą įpilkite 0,371 I formaldehido. Suleiskite jį į

[0290] reakciją per 2,5-3,5 vai. (Vandens vonios pagalba temperatūra palaikoma artima kambario temperatūrai; lėtesnis supylimas duoda

[0291] Kai pagal TLC (žr. toliau) reakcija pasibaigia, atskirkite ir išpilkite vandeninį sluoksnį. Organinį sluoksnį nufiltruokite per 0,550 kg silikagelio sluoksnį (sausai užpildyta, apie 10 cm storio). Eliuuokite maždaug 4 I DCM, kol pagal TLC daugiau nebeišsiplauna produktas.

[0292] (Užtikrinkite, kad ši stadija būtų vykdoma esant gerai ventiliacijai, nes

[0293] Sukoncentruokite iki alyvos, kurios spalva yra nuo geltonos iki rudos

[0294] Pridėkite tokį patį tūrį DCM (maždaug 0,5 I). Perplaukite 2 x 0,2 I

[0295] distiliuoto vandens. Po to organinį sluoksnį perplaukite 0,05 I sotaus NaHC0₃ ir 0,15 I distiliuoto vandens. (Užtikrinkite, kad pH būtų 7-10;

[0296] Atskirkite ir išpilkite vandeninį sluoksnį, o organinį sluoksnį džiovinkite Na₂S0₄- Nufiltruokite per 0,05 kg silikagelio (apie 5 cm storio).

[0297] Sukoncentruokite vakuuminiu garintuvu, naudojant paprastą vakuumą.

[0298] Po to per naktį vakuumuokite alyvą gilaus vakuumo siurbliu. (Geltona - rusva alyva).

[0299] Stebėjimas: reakcija sekama TLC (254 nm), naudojant 30 % EtOAc/heksanai. (Pradinės medžiagos Rf-0,52, produkto Rf-0,40).

[0300] HPLC: TFA metodas (metodika ir spektras pridėtas). Pradinės medžiagos sulaikymo laikas = 12,67 min., produkto sulaikymo laikas = 17,37 min.

[0301] BMR: ¹H (CDCI₃) (spektras pridėtas) 3,93 (s, 3H), 4,63 (s, 2H), 6,52 (d, 1H), 7,18 (d, 1H).

[0302] Jeigu reakcija pilnai neįvyko, kas 4 vai. galima pridėti formaldehido (10 % pradinio tūrio). Temperatūros poveikis nebuvo plačiai tirtas, bet patogu laikyti vonios temperatūrą kiekvienai stadijai nurodytame intervale. Organiniame sluoksnyje esančių rūgščių garai, net ir nufiltravus, sukelia manipuliavimo ne traukoje problemas, todėl reikia stengtis, kad medžiaga nebūtų išimama iš traukos, kol pH nėra neutralizuotas. Jeigu padidinamas formaldehido pylimo greitis, polimero susidarymas neleis reakcijai pilnai įvykti dėl formaldehido susinaudojimo. Prieš pradedant dirbti šiuo būdu, turi būti susitarta su saugos skyriumi, kad būtų pasiruošta pašalinti didelį tūrį rūgšties, esančios vandeniniame sluoksnyje. Šiam vandeniniam rūgšties sluoksniui neutralizuoti reikia didelio tūrio bazės, gaunamas didelis šilumos išsiskyrimas ir neutralizacijai reikia ilgo laiko, todėl ji yra nerekomenduotina. Galutinį produktą reikia laikyti šaltai, kadangi šio produkto stabilumo duomenų nėra. Laikant produktą Nalgeno konteineryje -20 °C temperatūroje, produktas išsikristalina, medžiaga šiek tie patamsėja, bet tai atrodo neturi reikšmės tolesnėms reakcijoms, kuriose naudojamas šis produktas.

[0303] 2. nuo hormonų nepriklausančias vėžio/auglių formas dėl tiesioginės sąveikos,

[0304] Laikoma, kad Pareiškėjų išradimas apima daug kitų įgyvendinimo variantų, kurie čia nėra konkrečiai aprašyti; taigi, šis aprašymas neturi būti aiškinamas kaip apribotas aukščiau duotais pavyzdžiais arba tinkamiausiais įgyvendinimo variantais.

[0305]

Apibrėžtis

1. Junginys, kurio formulė yra pasirinkta iš grupės, susidedančios iš.

2. Junginys, kurio formulė yra pasirinkta iš grupės, susidedančios iš:

3. Junginys, kurio formulė:HNN^Narba jo farmaciškai priimtina druska, multimeras, provaistas arba veiklusis metabolitas.

4. Junginys, kurio formulė yra pasirinkta iš grupės, susidedančios iš:O ir?.arba jo farmaciškai priimtina druska, multimeras, provaistas arba veiklusis metabolitas.

5. Junginys, kurio formulė:I arba jo farmaciškai priimtina druska, multimeras, provaistas arba veiklusis metabolitas.

6. Junginys, kurio formulė yra pasirinkta iš grupės, susidedančios iš:^co&V^V o J LT 4904 BC//^ GCt/Vo0\arba jo farmaciškai priimtina druska, multimeras, provaistas arba veiklusis metabolitas.

7. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad į ją įeina terapiškai efektyvus kiekis junginio, jo farmaciškai priimtinos druskos, multimero, provaisto arba veikliojo metabolito pagal bet kurį iš 1-6 punktų ir farmaciškai priimtinas nešiklis arba skiediklis.

8. Terapiškai efektyvaus kiekio junginio, jo farmaciškai priimtinos druskos, multimero, provaisto arba veikliojo metabolito pagal bet kurį iš 1-6 punktų panaudojimas vaisto, skirto žinduolių gonadotropinu sekrecijai reguliuoti, gamyboje.

9. Junginys, kurio formulė I:?⁵ K xr2R⁷-^N^R³ R9_R⁴ kurioje.X yra pasirinktas iš C=0, C=S, S=0 ir S(0)₂;—' yra 5-naris heterociklinis žiedas, turintis nuo 1 iki 4 heteroatomų pasirinktų iš N, O ir S; šis žiedas gali būti sotus, dalinai nesotus arba pilnai nesotus ir gali būti aromatinis;R¹ ir R² nepriklausomai vienas nuo kito yra pasirinkti iš H ir žemesniojo alkilo;R³ yra pasirinktas iš H, halogeno ir turinčio arba neturinčio pakaitų alkilo, alkenilo, alkinilo, cikloalkilo, heterociklo. arilo, heteroarilo, Ch_hOR, OR ir C(0)0R, kur R yra pasirinktas iš turinčio arba neturinčio pakaitų alkilo, alkenilo, alkinilo, cikloalkilo. heterociklo. arilo ir heteroarilo ir kur bendras esančių anglies atomų skaičius (neįskaitant jokių galimų pakaitų) yra 1-12 ribose; R⁴ ir R⁵ nepriklausomai vienas nuo kito yra pasirinkti iš H, halogeno ir turinčio arba neturinčio pakaitų alkilo, alkenilo, alkinilo, cikloalkilo, heterociklo, arilo. heteroarilo, CH₂OR, OR ir C(0)0R, kur R yra toks, kaip apibūdinta aukščiau, ir kur bendras esančių anglies atomų skaičius (neįskaitant jokių galimų pakaitų) yra 1-12 ribose;R⁶ ir R⁷ nepriklausomai vienas nuo kito yra pasirinkti iš H, halogeno ir turinčio arba neturinčio pakaitų alkilo, alkenilo. alkinilo. cikloalkilo. heterociklo, arilo, heteroarilo, CH₂OR, OR ir C(0)0R. kur R yra toks. kaip apibūdinta aukščiau, ir kur bendras esančių anglies atomų skaičius (neįskaitant jokių galimų pakaitų) yra 1-12 ribose; arba R⁶ ir R⁷ paimti kartu su atomais, prie kurių jie yra prijungti, sudaro galintį turėti pakaitų 5- arba 6-narį žiedą kuriame gali būti iki keturių heteroatomų, pasirinktų iš O, N ir S;kur bent vienas iš R³, R⁴, R⁵, R⁶ ir R⁷ yra ne vandenilis;R⁸ yra lipofilinė liekana, pasirinkta iš turinčio ir neturinčio pakaitų alkilo, alkenilo, alkinilo, cikloalkilo, heterociklo, arilo, heteroarilo, CH₂OR, OR ir C(0)0R, kur R yra toks, kaip apibūdinta aukščiau, ir kur bendras esančių anglies atomų skaičius (neįskaitant jokių galimų pakaitų) yra 6-20 ribose: irR⁹ yra pasirinktas iš H ir turinčio arba neturinčio pakaitų alkilo;arba jo farmaciškai priimtina druska, multimeras, provaistas arba veiklusis metabolitas.

10. Junginys, kurio formulė I:f < _R2RNi^T^")<Ntj'R8 i,R7-^V^R3 R9R⁴ kurioje.X yra pasirinktas iš C=0, C=S, S=0 ir S(0)₂;—> yra 5-naris heterociklinis žiedas, turintis nuo 1 iki 4 heteroatomų:pasirinktų iš N, O ir S; šis žiedas gali būti sotus, dalinai nesotus arba pilnai nesotus ir gali būti aromatinis;R¹ ir R² nepriklausomai vienas nuo kito yra pasirinkti iš H ir žemesniojo alkilo; _R³ yra pasirinktas iš H, halogeno ir turinčio arba neturinčio pakaitų alkilo, alkenilo, alkinilo, cikloalkilo, heterociklo, arilo. heteroarilo, CH_2OR, OR ir C(0)0R, kur R yra pasirinktas iš turinčio arba neturinčio pakaitų alkilo, alkenilo, alkinilo, cikloalkilo, heterociklo, arilo ir heteroarilo ir kur bendras esančių anglies atomų skaičius (neįskaitant jokių galimų pakaitų) yra 1-12 ribose:_R⁴ ir R⁵ nepriklausomai vienas nuo kito yra pasirinkti iš H, halogeno ir turinčio arba neturinčio pakaitų alkilo, alkenilo, alkinilo, cikloalkilo, heterociklo, arilo, heteroarilo, CH₂OR, OR ir C(0)0R, kur R yra toks, kaip apibūdinta aukščiau, ir kur bendras esančių anglies atomų skaičius (neįskaitant jokių galimų pakaitų) yra 1-12 ribose;R⁶ ir R⁷ nepriklausomai vienas nuo kito yra pasirinkti iš H, halogeno ir turinčio arba neturinčio pakaitų alkilo, alkenilo. alkinilo. cikloalkilo, heterociklo, arilo, heteroarilo, Ch_hOR, OR ir C(0)0R. kur R yra toks, kaip apibūdinta aukščiau, ir kur bendras esančių anglies atomų skaičius (neįskaitant jokių galimų pakaitų) yra 1-12 ribose; arba R⁶ ir R⁷ paimti kartu su atomais, prie kurių jie yra prijungti, sudaro galintį turėti pakaitų 5- arba 6-narį žiedą kuriame gali būti iki keturių heteroatomų, pasirinktų iš O, N ir S,kur bent vienas iš R³, R⁴, R⁵, R⁶ ir R⁷ yra ne vandenilis;R⁸ yra lipofilinė liekana, pasirinkta iš turinčio ir neturinčio pakaitų alkilo, alkenilo, alkinilo, cikloalkilo, heterociklo, arilo, heteroarilo, CH₂OR, OR ir C(0)0R, kur R yra toks, kaip apibūdinta aukščiau, ir kur bendras esančių anglies atomų skaičius (neįskaitant jokių galimų pakaitų) yra 6-20 ribose; irR⁹ yra pasirinktas iš H ir turinčio arba neturinčio pakaitų alkilo;arba _R¹ ir _R² gali būti -OH arba =_0: ir/arba R⁸ taip pat gali būti vandenilis;ir/arba R gali būti COR arba vandenilis; ir/arba R⁸ gali turėti bet kokį norimą anglies atomų skaičių;ir/arba R⁸ ir R⁹ taip pat gali sudadryti žiedą; ir/arba bet kokios gretimos R grupės, kaip antai _R⁵ ir _R⁶ arba _R³ ir R⁴, gali sudaryti žiedą, tokį kaip aprašytas _R⁶ ir R⁷ grupių atveju;ir/arba R⁶ gali būti COR; ir/arba (het) grupėje gali būti arba nebūti pakaitų. arba R⁸ ir/arba R⁹ gali būti pasirinkti iš heterociklinių grupių arba bet kokių junginių, kurie sudaro amidinį ryšį su I formulės azotu;arba jo farmaciškai priimtina druska, multimeras, provaistas arba veiklusis metabolitas.

11. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad į ją įeina:(a) terapiškai efektyvus kiekis junginio, kurio formulė I:

12. Junginio, kurio formulė I;

Brėžiniai