[LT] Šis išradimas susijęs su vakcinos kompozicija, skirta gydyti nutukimą. Konkrečiau, šis išradimas apima apoliproteino B-100 epitopo mimezinius peptidus, jų konkatemerus ir modifikuotus peptidus, o taip pat juos turinčią vakcinos kompoziciją.
[EN] The present invention relates to vaccine compositions for treatment of obesity. More particularly, the present invention is directed to mimetic peptide for epitope of apoliproteine B-100, concatemer and modified peptides thereof, and the vaccine composition comprising the same.
[0001] Šis išradimas liečia vakcinos kompoziciją, skirtą nutukimo gydymui. Tiksliau, šis išradimas nukreiptas [vakcinos kompoziciją, kuri apima apoliproteino B-100 epitopo mimezinį peptidą, jo konkatemerus arba modifikuotus peptidus.
[0002] Kraujo serumo lipidai yra sudaryti iš cholesterolio, trigliceridų (TG), laisvųjų riebalų rūgščių, fosfolipidų ir kt., ir kraujotakoje egzistuoja lipoproteino formoje, kuri yra lipido ir apoliproteino komplesas.
[0003] Iš tokių lipoproteinų, mažo tankio lipoproteinas (LDL) yra pagrindinis TG ir cholesterolio nešiklis. Skaičius pacientų, kenčiančių nuo arteriosklerozės, koronarų arterijų ligos arba širdies infarkto, atsiradusių dėl pakilusio LDL-cholesterolio lygio kraujyje, žymiai padidėjo dėl mitybos režimo arba kitų faktorių pasikeitimo.
[0004] Taigi, gydymui pacientų, kenčiančių nuo aukščiau minėtų ligų, naudojami įvairūs tyrimai, skirti LDL-cholesterolio lygio sumažinimui ir aukščiau minėtų ligų priežasčių parodymui. LDL-cholesterolis, kaip pagrindinis suaugusiųjų ligų, surištų su lipidų metabolizmu etiologinis faktorius, gali būti makrofagu paverstas į didelio tankio lipoproteiną (HLD). Priedo, LDL-cholesterolis taip pat gali būti paverstas į kitą medžiagą arba kepenyse konvertuotas [tulžies rūgštį. (Brown, M.S. and Goldstein, J. L., 1983, Annu. Rev. Biochem., 52:223-261).
[0005] Apoliproteinas B-100 yra pagrindinė LDL baltymo dalis ir taip pat egzistuoja labai mažo tankio lipoproteine (VLDL) ir chilomikrone. Kraujo LDL-cholesterolis gali būti pašalintas per makrofagų fagocitozę tokiu atveju, jeigu antikūnas kraujotakoje stimuliuotas apoliproteino B-100 atpažinimu, kadangi apoliproteinas B-100 indukuoja LDL daleles prisirišti ant L D L-receptorių, esančių ant ląstelės paviršiaus (Dalum I., etai., 1997, Mol. Immunol., 34 (16-17): 1113-20).
[0006] Tokiu atveju, makromolekulė, tokia kaip antikūnas, surišta su apoliproteinu B-100, kuris egzistuoja ant LDL paviršiaus, tai lipazė, tokia kaip lipoproteino lipazė, negali hldolizuoti TG ir panašių medžiagų dėl sferinių trukdžių, sudaromų makromolekulės, prisirišusios prie apoliproteino B-100. Vadinasi, laisvųjų riebalų rūgščių, kaip pagrindinio nutukimo faktoriaus, susidarymas gali būti sustabdytas antikūnu, kuris gali susirišti su apoliproteinu B-100.
[0007] Šiuo metu, eilėje tyrimų, skirtų LDL-cholesterolio lygio sumažinimui ir aterosklerozės staigaus kilimo sustabdymui vartojant vakciną, bandoma įvairiuose gyvūnų modeliuose, tokiuose kaip pelės ir triušiai. Pavyzdžiui, C. R. Alvingas pranešė, kad cholesterolis gali būti modifikuotas metabolitais arba jo oksidacija, ir kad modifikuotas cholesterolis kai kuriais atvejais gali būti stipria antigenine determinante (Alving, C.R., et al., 1989, Biochem. Soc. Trans., 17(4): 637-9; Alving, C.R., et al., 1996, J. Lab. din. Med., 127:40-49; Alving, C.R., et al., 1996, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 210:181-6).
[0008] Be to, paskelbta, kad kraujo serume egzistuoja endogeninis antikūnas cholesteroliui (Wu, J.T., L.L., 1977, Clin. Lab. Med., 17(3):595-604, Apžvalga). Taip pat paskelbta, kad eksperimento sąlygomis, kuriose aterosklerozė ir hipercholesterolemija atsiranda triušiuose, kai jie maitinami cholesterolį turinčiu maistu, o hipercholesterolemijos ir aterosklerozės lygis triušiuose, imunizuotuose suleidus cholesterolio turinčią liposomą, žymiai nuslopinamas arba sumažinamas, palyginus su tais, kurie stebėti kontrolinėje grupėje.
[0009] Tokiu antikūnu, stimuliuotu cholesterolio vakcina, yra imunoglobulinas M (IgM), kuris rišasi su VLDL, vidutinio tankio lipoproteinu (IDL) ir LDL. Remiantis tuo, kas pasakyta aukščiau, tikėtina, kad galima gauti vakciną, skirtą gydyti arba apsaugoti nuo hiperlipodemijos arba aterosklerozės, atsirandančių dėl aukšto cholesterolio lygio (Bailey, J. M., 1994, Science, 264:1067-1068; Palinski, W. et al ., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92(3): 821-5; Wu R. et. al., 1999, Hypertension, 33(1):53-9).
[0010] Šio išradimo autoriai atrado, kad nuo nutukimo galima efektyviai apsisaugoti apoliproteino B-100 epitopo mimeziniu peptidu, ir remdamiesi tuo, kas pasakyta anksčiau, išrado vakcinos kompoziciją, skirtą gydyti nutukimą.
[0011] Taigi, šio išradimo tikslu yra apoliproteino B-100 epitopo mimezinio peptido, jo susijungusių ir modifikuotų peptidų pateikimas.
[0012] Kitu išradimo tikslu yra apoliproteino B-100 epitopo mimezinio peptido, jo konkatemerų ir modifikuotų peptidų gavimo būdo pateikimas.
[0013] Dar kitu šio išradimo tikslu yra vakcinos kompozicijos, skirtos gydyti arba apsaugoti nuo nutukimo, kuri apima aukščiau minėtą apoliproteino B-100 epitopo mimezinį peptidą, jo konkatemerų ir modifikuotų peptidų, pateikimas.
[0014] Šio išradimo tikslas pasiekiamas pateikiant apoliproteino B-100 epitopo mimezinį peptidą, jo konkatemerus ir modifikuotus peptidus.
[0015] Šiame išradime panaudota fago peptido bibliotekos sistema tam, kad atrinktų žmogaus apoliproteino B-100 epitopą, surištą monokloniniu antikūnu (MabB23). Aukščiau minėti atrinkti peptidai buvo mimeziniai peptidai, struktūriškai tapatūs antigeninei determinantei, kuri gali būti antikūno atpažinta, o šie mimeziniai peptidai susintetinti pagal atrinkto peptido aminorūgščių seką.
[0016] Peptido bibliotekos sistema yra viena iš būdo rūšių, skirtų surasti antigeninės determinantės trimatę formą. Tai yra DNR fragmentai, kurie koduoja atsitiktines peptidų sekas, įterpiami į DNR, kuri koduoja fago baltymo mažąjį apvalkalą, o tada aukščiau minėtos DNR įterpiamos į DNR skaitymo rėmelį (RF) ir jų ekspresijai transformuojamos į E. coli. Peptidai, ekspresuoti ant E. coli paviršiaus, reaguoja su antigenu tam, kad atrinktų peptidus, struktūriškai tapačius antigeninei determinantei.
[0017] Tam, kad pagamintų imuninį serumą, pelės buvo imunizuotos įvedant aukščiau minėtus mimezinius peptidus. Buvo patvirtinta, kad taip gautas imuninis serumas, tuo pačiu metu atpažįsta tikrąjį apoliproteiną B-100, mimezinius peptidus ir LDL ( Identification of Antigenic Determinants for the Murinę Monoclonal Antibodies Against Apoliprotein A- 1 and Apoliprotein B- 100 by Using Phage-displayed Random Peptide Library, [ Antigeninių determinančių identifikavimas pelės monokloniniams antikūnams prieš apoliproteiną- 1 ir apoliproteiną B- 100 naudojant fagu atpažintą atsitiktinę peptidų bibliotekai] Chi-Hoon Kim, Hanyang Univ., 1997).
[0018] Šio išradimo apoliproteino B-100 epitopo mimeziniai peptidai gali būti parinkti iš peptidų sekų SEQ. ID. Nr.1, SEQ. ID. Nr.2, SEQ. ID. Nr.3 arba jų mišinių.
[0019] Šio išradimo apoliproteino B-100 mimeziniai peptidai gali būti naudojami konkatemerų pavidalu tam, kad pagerintų jų antigenines determinantes. Kaip šio
[0020] išradimo įgyvendinimo pavyzdys, gali būti sujungti vienas su kitu du arba daugiau mimezinių peptidų. Pirmenybė teikiama konkatemerui, sudarytam iš nuo trijų (3) iki penkiolikos (15) peptidų. Pageidautina, kad šio išradimo konkatemeras turėtų sekos SEQ. ID. Nr.1 keturis (4) peptidus.
[0021] Šio išradimo aukščiau minėto mimezinio peptido "konkatemeras" reiškia polimerą, kuriame aukščiau mintų mimezinių peptidų galai susijungę vienas su kitu.
[0022] Šio išradimo aukščiau minėto mimezinio peptido "modifikuotas peptidas" reiškia mimezinių peptidų variantus, kurie gali būti atpažinti monokloniniu arba polikloniniu antikūnu, skirtu apoliproteinui B-100. Variantai apima pakeitimą, deleciją, prijungimą ir šio išradimo mimezinių peptidų vienos arba daugiau aminorūgščių cheminę pakaitų reakciją.
[0023] Kitu šio išradimo tikslu yra apoliproteino B-100 epitopo mimezinio peptido, jo konkatemero ir modifikuotųjų peptidų gavimo būdo pateikimas, kuris apima tokias pakopas: i) DNR, kurios koduoja aukščiau minėtą mimezin[ peptidą, jo susijungusius ir modifikuotus peptidus, įterpimą į vektorių, ii) minėto vektoriaus transformavimą į šeimininko ląstelę, o po to jos inkubavimą, ir iii) aukščiau minėto mimezinio peptido, jo konkatemero arba jo modifikuotų peptidų išskyrimą iš aukščiau minėtų ląstelių šeimininkių.
[0024] Šio išradimo vakcinos kompozicijos vaisto forma gali būti pagaminta bet kuriuo įprastu būdu, tinkamu mimeziniam peptidui, jo konkatemerui arba jo modifikuotiems peptidams. Aukščiau minėta vaisto forma, pageidautina, kad kompozicijoje, kurios gamyboje aktyvusis junginys būtų sumaišytas arba praskiestas su imuniniu adjuvantu, vaistu, sustiprinančiu imuninę sistemą, nešikliu, užpildu ir skiedikliu, parinkta iš grupės, susidedančios iš tabletės, piliulės, granulės, miltelių, oblatės, suspensijos, emulsijos, skysčio, sirupo, aerozolio, minkštos arba kietos želatinos kapsulės, sterilizuoto injekcijų skysčio, sterilizuotų miltelių ir pan.
[0025] Imuniniu adjuvantu, kuris gali būti naudojamas šio išradimo kompozicijoje, yra savotiška baltymų rūšis, kuri turi T-ląstelių epitopą (pvz., Hepatito B viruso paviršiaus baltymas), inertinis nešiklis, toks kaip aliuminio druska, bentoninas, lateksas, akrilinės dalelės ir pan., hidrofobinis antigenas, (pvz., lipidas), vandens aliejuje ir aliejaus vandenyje emulsijos, depo sudarytojas (pvz., polisacharidas), T-ląstelių aktyvatorius, toks kaip PPD, poliadeninas, poliuracilas ir pan.; B-ląstelių. aktyvatorius (pvz., B-ląstelės mitogenas), paviršinio aktyvumo medžiaga, tokia kaip saponinas, lizolecitinas, retinalis, kvil A, liposoma ir pan.; medžiaga, sustiprinanti makrofago aktyvumą; ir alternatyvus kelias, papildantis aktyvatoriais, tokiais kaip inulinas, zimosanas, endotozinas, lebamizolis, C. parvum ir pan.
[0026] Šiame išradime "baltymas nešiklis" reiškia farmaciškai leidžiamą medžiagą, tokią kaip proteinas arba aliuminio druska, kurie gali nešti kraujotaka šio išradimo mimezinį peptidą, jo konkatemerą ir jo modifikuotus peptidus.
[0027] Aliuminio druska, fenoksietiletanolis, vanduo, fiziologinis druskos tirpalas, laktozė, dekstrozė, sacharozė, sorbitolis, manitolis, kalcio silikatas, celiuliozė, metilceliuliozė, amorfinė celiuliozė, polivinilpirolidonas, metilhidroksibenzoatas, propilhidroksibenzoatas, talkas, magnio stearatas ir mineralinė alyva gali būti panaudoti kaip tinkami šio išradimo kompozicijos nešikliai, užpildai ir skiedikliai.
[0028] Priedo, šio išradimo kompozicija dar gali turėti užpildą, agentą nuo sukibimo, tepalą, drėkiklį, kvapiąją medžiagą, emulsiklį ir antiseptiką.
[0029] Šio išradimo kompozicija gali būti pagaminta įprastu būdu, gerai žinomu patyrusiems šios srities specialistams, kad sukeltų imuninį atsaką žinduoliams per vieną (1) kartą arba daugiau vakcinacijų.
[0030] Šio išradimo vakcinos kompozicija, skirta nutukimo gydymui, gali būti vartojama [vairiais būdais, tokiais kaip peroraliniu, dermaliniu, interdermaliniu, įšvirškiant į veną arba į raumenis, bet, geriausiai, intrakutaniniu būdu.
[0031] Šio išradimo vakcinos kompozicijos efektyvi dozė yra nuo 0,1 iki 10 ng (aktyviojo peptido) kilogramui kūno masės, geriau, kai nuo 0,5 iki 1,0 |Kj/kg. Tačiau vakcinos kompozicijos aktyviojo prado tikroji dozė gali būti nustatyta atsižvelgiant į eilę faktorių, tokių kaip imuninės sistemos būsena, vartojimo būdas, paciento būklė, amžius, lytis, kūno masė ir pan. Todėl minėtos dozės kiekio ribos jokiu būdu nelimituoja šio išradimo apimties.
[0032] Šio išradimo vakcinos kompozicijos pirmasis farmacinis efektas yra sustabdyti arba gydyti nutukimą per mechanizmą, kai žmogaus antikūnas sustiprintas mimeziniu peptidu, jo konkatemeru arba jo modifikuotais peptidais, susiriša su apoliproteino B-100 epitopu ant LDL paviršiaus, ir tokiu būdu lipaze erdviniai trukdo ir stabdo gamybą riebalų rūgščių, kaip pagrindinį etiologinį nutukimo faktorių.
[0033] Priedo, šio išradimo vakcinos kompozicija taip pat veikia malšindama hiperlipodemiją per mechanizmą, kuriame LDL yra aptinkama ir lengvai pašalinama makrofago pagalba dėka opsonizacijos, iššauktos žmogaus antikūnu, sustiprintu mimeziniu peptidu, jo konkatemeru arba jo modifikuotais peptidais ir konjuguotą su apoliproteino B-100 epitopu ant LDL paviršiaus, ir tokiu būdu sutrukdo LDL specifiškai prisitvirtinti ant LDL receptorių, esančių ant ląstelės paviršiaus.
[0034] Šio išradimo minėti tikslai ir kiti pasiekimai taps aiškesni detaliai aprašant jų pageidaujamus šio išradimo įgyvendinimo pavyzdžius su nuorodomis [pridedamus brėžinius, kuriuose:
[0035] nuo Fig. 1 a iki 1d pateiktos vektoriaus, ekspresuojančio šio išradimo mimezini peptidą struktūros ir sudedamosios. Fig 1a parodo vyraujančios (lyderio) kasetės struktūrą, Fig. 1b parodo LB kastės stuktūrą, Fig. 1c parodo BL kastės stuktūrą, o Fig. 1d parodo pBX4 ekspresijos vektoriaus struktūrą. Fig. 2 parodo vektorių pBX1 ir pBX4, ekspesuojančių šio išradimo mimezin[ peptidą, gavimo būdą. Fig. 3 parodo elektroforezės (PAGE) poliakrilamido gelyje LB kastės indentifikavimo rezultatą. Fig. 4 parodo PAGE LB kastės, įterptos įpBIue-BL plazmidę, identifikavimo rezultatą. Fig. 5 parodo PAGE rezultatą, patvirtintį DNR, įterptos į pazmides pBX1 ir pBX3, kryptį ir kopijų skaičių. Fig. 6 parodo vestern-blotingo rezultatą ekspresuoto PB14 peptido identifikacijai. Fig. 7 parodo natrio dodecilsulfato (SDS) PAGE rezultatą, patvirtinantį PB14 peptido išgryninimą Fig. 8 parodo vestern-blotingo rezultatą, patvirtinantį išgrynintoto PB14 peptido reaktyvumą prieš anti-PB14 serumą. Fig. 9 parodo pelės, indukuotos PB14 peptidu antikūno avidiškuo matavimo rezultatus, atliktus ELISA. Fig. 10 yra grafikas, kuris iliustruoja PB14 peptido efektą, stabdant didėjančią pelės kūno masę. Fig. 11a ir 11b yra grafikas, kuris iliustruoja pelių kūno masės pasikeitimo priklausomybę nuo šio išradimo PB14 vakcinos [vedimo po 20 savaičių po vaisto injekcijos, kuris gali sunaikinti hipotalamą. Fig. 12 yra grafikas, kuris parodo poveikį į lipido koncentraciją kraujo serume, priklausomai nuo PB14 vakcinos injekcijos.
[0036] Toliau, šis išradimas bus aprašytas detaliau. Tačiau, šis išradimas, paaiškintas žemiau, duotas tik šio išradimo įgyvendinimo paaiškinimais ir neketina limituoti šio išradimo apimties.
[0037] Pagal šio išradimo išradėjo prašymą oligonukleotidai cheminiu būdu buvo susintetinti Genemed Synthesis, Inc. (San Francisco, CA, JAV) firmoje. Tam, kad sufosforolintų oligonukleotidų 5' galą, .50 ^l 100 pmol/fil oligonukleotido inkubuota dvi (2) valandas su 10 jul 10 mM ATP, 3 nl 10 TV/^il T4 polinukleotido kinazės (Takara, Otsu, Japonija) ir 7 jil 10X kinazės buferio 37 °C temperatūroje.
[0038] Kiekviena po 10 pJ fosforilintų oligonukleotidų alikvotinė dalis sumaišytos kartu, pašildytos iki 80 °C 5 minutes, o po to labai lėtai aušinamos iki kambario temperatūros, taip suhibridizuojant iki komplementariųjų vijų specifinio suporavimo.
[0039] Susiuvimo mišinys paruoštas sumaišant 1 įiI DNR vektoriaus, 5 (ai DNR intarpo, 1 įiI DNR ligazės T4 (NEB, Beverly, MA, JAV), 1 (il 10X fermentinės reakcijos buferio tirpalo (NEB, Beverly, MA, JAV) ir 2 (il distiliuoto vandens, o po to inkubuota per naktį 16 °C temperatūroje. 3 pavyzdys: pBX ekspresijos vektoriaus, skirto apoliproteino B- 100 mimezinio peptido ekspresijai, konstravimas
[0040] Mimezinio peptido ekspresijos plazmidės vektorius kaip taisyklė apima vyraujančios sekos (lyderio) kasetę ir vieną arba daugiau PB1 peptido genų. Kaip pavaizduota Fig.1, plazmidė pBX1, kuri apima vieną (1) PB1 geną, gauta klonuojant lyderio kasetę (Fig. 1a) plazmidės pQE30 daugiakloninėje srityje (Qiagen, Hilden, Vokietija). Susidariusi plazmidė hidrolizuota Hindlll ir Sa1l pagalba, o mažieji fragmentai, pakeisti LB kasete (Fig. 1b), duoda pBX1 plazmidę, kuri tinkama lengvai įterpti didelį skaičių BL kasečių (Fig. 1c).
[0041] Tuo tarpu plazmidė pBluescript II SK+ buvo perkirpta su Sal\ ir Xho\ ir susiūta su BL kasetėmis, kuriose pavieniai įntarpai iš daugybinės kasetės BL kasetės vyko atsitiktinai. Laukiami pasikartojimai PB1 peptido genų plazmidėje pBlue-BL atrinkti, suskaldyti ir subklonuoti įpBX1 (Fig. 1d).
[0042] Lyderio kasetė pagaminta hibridizuojant SEQ. ID. Nr.10 ir SEQ. ID. Nr. 11 oligonukleotidus, susintetintus tokiu pat būdu kaip ir 1 ir 2 pavyzdžiuose. Po to, pQE30 vektorius (Qiagen, Hilden, Vokietija), kuris buvo asimiliuotas su Sa/I ir BamH\, susiūtas su minėta lyderio kasete, duoda pQE-lyderio plazmidę. Minėto pQE30 vektoriaus ekspresijos rezultate, šešios histidino liekanos buvo papildomai įterptos į ekspresuoto baltymo N-galus tam, kad baltymas būtų lengvai išgryninamas. Minėta lyderio kasetė buvo sukonstruota apimti enterokinazės atpažinimo sritis (DDDDKI; SEQ. ID. Nr.12) tam, kad sumažintų papildomas aminorūgštis iki minimumo.
[0043] Pagal 1 pavyzdžio būdą, keturi oligonukleotidai, kurių sekos pateiktos SEQ. ID. Nr. nuo 4 iki 7, susintetinti, fosforilinti, o po to hibridizuoti su atitinkamais komplementariaisiais oligonukleotidais tam, kad susintetintų Fig. 1b (SEQ. ID. Nr.13 ir 14) LB kasetę. Susiuvimo mišinys pagamintas iš 40 jul hibridizuotų oligonukleotidų, sumaišytų su 3 ^l 1 TV/ jai T4 DNR ligazės, 5 ^l 10X fermentinio buferio ir 2 (j.l distiliuoto vandens. Po to, susiuvimo mišinys inkubuojamas per naktį, susiuva oligonukleotidus vieną su kitu.
[0044] Po to, kai reakcija užsibaigia, reakcijos mišinys išpilamas ant 20 % poliakrilamido gelio ir vykdoma elektroforezė. LB kasetė (52 bazių porų (bp) oligonukleotidai) (Fig.3) identifikuota panardinant įgelįsu etidžio bromidu (EtBr).
[0045] Fig.3 juostoje M yra DNR 20 bp "laiptų" dėmė, o juostoje 1 yra reakcijos tirpalas. LB kasetė gauta iš gelio ekstrakcijos rinkinio (Qiagen, Hilden, Vokietija) QIAEX II gelio pagalba.
[0046] Minėtas pQE-lyderis suskaldytas su Hidlll ir Sa11, o po to susiūtas su minėta LB kasete pagal 2 pavyzdį, kad gautų PB1 mimezinio peptido ekspresijos vektorių. Gautas ekspresijos vektorius pavadintas pBX1, o peptidas, ekspresuotas vektoriaus, buvo pavadintas PB1 peptidu (nuoroda į.Fig.2). 3 pakopa: PB1 konkatemero ekspresijos vektoriaus gamyba Keturi oligonukleotidai, kurių sekos parodytos SEQ ID. Nr. 4, 5, 8 ir 9, pagal 1 pavyzdžio metodiką buvo susintetinti, sufosforilinti, o po to suhibridinti su atitinkamais komplementariaisiais oligonukleotidais tam, kad susintetintų Fig. 1c (SEQ. ID. Nr. 15 ir 16) LB kasetę. Vėliau tokie oligonukleotidai susiūti vienas su kitu pagal 2 pavyzdžio metodiką, o po to elektroforezei patalpinti ant 20 % poliakrilamido gelio. Nudažant EtBr, buvo identifikuotos penkiasdešimt penkios nukleotidų bp (lyderio kasetė). LB kasetė gauta iš gelio per QIAEX II gelio ekstrakcijos rinkinį ir suskaldyta su Satl \ rXho\.
[0047] Tuo tarpu, pBluescript II SK (Stratagene, La Jolla, CA, JAV) suskaldyta su Sa11 \ r Xho\. Vektorius paveiktas elektroforeze ant 0,8 % agarozės gelio, ir gautas iš gelio ekstrakcijos rinkinio (Qiagen, Hilden, Vokietija) QIAEX II gelio pagalba.
[0048] Pagal 2 pavyzdį buvo atliktos kelios susiuvimo reakcijos ir gauta pBlue-BL plazmidė naudojant 5 įj.I BL kasetės DNR ir 1 įiI minėtos DNR su suskaldytu vektoriumi.
[0049] pBlue-BL suskaldyta su Sa7l ir Xho\, o BL kasetė išekstrahuota. pBX2 plazmidė pagaminta įterpiant tokią BL kasetę į pagamintą pagal 2 pakopą vektoriaus pBX1 Sa11 sritį. Priedo, pBX3 ir pBX4 vektoriai pagaminti keičiant BL kasetės skaičių nuo dviejų (2) iki trijų (3), kurie įterpiami į pBX1 vektoriaus Sa11 sritį (nuoroda į Fig. 2).
[0050] Peptidai, ekspresuoti iš pBX2, pBX3 ir pBX4 vektorių, buvo konkatemerai, kurie turi nuo dviejų (2) iki keturių (4) PB1 peptidų. Jie pavadinti atitinkamai PBI2, PBI3 ir PBI4.
[0051] Ląstelė šeimininkė ( E. coli M15 [pREP4]; Qiagen, Hilden, Vokietija) buvo transformuota su pBlue-BL plazmidė ir išpurkšta ant 1 % agaro plokštelės, o po to 16 valandų inkubuota 37 °C temperatūroje taip, kad galėtų susidaryti E. coli kolonijos. Viena iš kolonijų, kuri susidarė ant agaro plokštelės, paskiepyta 10-tyje ml LB terpės ir inkubuota purtant 37 °C temperatūroje šešiolika (16) valandų, o po to plazmidė išskirta per DNR gryninimo sistemą (VVizard PLUS SV DNR minipreparatyvinė DNR gryninimo sistema; Promega, Madison, Wl, JAV). Plazmidė, išgauta iš transformuotos E. coli, buvo inkubuota vieną (1) vai. su Sa/I ir Xho\ restrikcijos fermentu tam, kad skaldytų 37 °C temperatūroje, ir išanalizuota naudojant 20 % PAGE (Fig. 4). Fig. 4 juosta M parodo 20 bp lyderinę DNR, 1 juosta parodo oligonukleotido produktą, gautą 3 pakopoje, 2 juosta parodo DNR BL kasetę, išskirtą naudojant 20 % PAGE, gautą 3 pakopoje, o 3 juosta reiškia rekombinantinę pBlue-BL plazmidę, paveiktą restrikcijos fermentu. Kaip rodo Fig. 4, tai patvirtina, kad pBlue-BL plazmidė turi BL kasetę.
[0052] E. coli (M15 [pREP4]) transformuota su pBX1 arba pBX3 plazmidė, o DNR plazmidė išskirta taip, kaip paaiškinta aukščiau tam, kad patvirtintų DNR kasetės įterpimų skaičių ir orientaciją. Išskirta plazmidė suskaldyta su Sali ir Hind\\\ restrikcijos fermentu, ir išanalizuota naudojant 20 % PAGE (Fig. 5). Fig 5 juosta M parodo 20 bp lyderinę DNR, 1 ir 3 juostos parodo pBX1 plazmidę, turinčią LB, bet ne BL kasetę, o 2 juosta parodo plazmidę, turinčią teisingos krypties vieną LB ir dvi BL kasetes. Iš kitos pusės, 4 juosta parodo plazmidę, turinčią vieną LB ir dvi BL kasetes, tačiau priešingos orientacijos. Kaip rodo Fig. 5, kiek B kasečių (BL ar LB kasetė) buvo [terpta ir kokia kryptimi jos buvo [terptos į pBX vektorių, galima identifikuoti restrikcijos fermento žymėjimą.
[0053] Priedo, B kasečių DNR seka, įterpta į plazmidę, kuri gali būti gauta iš transformuotos E. coli, patvirtinta, kad ji identiška pažymėtoms sekoms. Plazmidės pagamintos naudojantis VVizard'o PLUS DNR minipreparatyviniu rinkiniu ir buvo sekvenuotos naudojant Sequennase (Ver. 2.1) DNR sekvenavimo rinkinį
[0054] PBI4 peptido ekspresijos patvirtinimui buvo kultivuojamos trijų rūšių transformuotos E. coli M15[pREP4] ant LB agaro buljono, turinčio ampicilino ir kanamicino. Viena E. coli M15[pREP4] transformuota plazmidė pBX4, antra kopija transformuota pQE30, o dar kita buvo netransformuota E. coli M15[pREP4], Kiekviena iš kolonijų, gautų iš kietųjų kultūrų, buvo atitinkamai inokuliuota skystoje LB kultūros terpėje, kuri turėjo 100 jal/ml ampicilino ir 25 jal/ml kanamicino, o po to inkubuotos per naktį. Kultūra buvo inkubuota purtant 37 °C temperatūroje vieną (1) valandą iki O. D reikšmės, pasiektos nuo 0,5 iki 0,7 intervale prie 600 nm. Po to [ kultūros terpę pridėta 1 mM izopropil-tio-p-galaktopiranozido (IPTG), kad palengvintų rekombinantinio baltymo ekspresiją, o po to papildomai kultivuota 37 °C temperatūroje dar penkias (5) valandas. Paimtas 1 ml kultūros terpės ir centrifuguotas 14 000 apsisukimų/per minutę dviejų (2) minučių laikotarpyje, kad nusodintų bakterines ląsteles. Ląstelių gumuliukas suspeduotas 50-tyje įiI 2X SDS tirpale [100 mM Tris-CI pH 6,8, 20 % (masės/tūryje) glicerolio, 4 % (masės/tūryje) SDS, 2 % 2-merkaptoetanolio, 0,001 % bromfenolio mėlynojo] kad pateiktų [SDS-PAGE. Suspenduotas tirpalas šildytas 95 °C temperatūroje penkias (5) minutes, o po to 10 [i\ tirpalo patalpinama ant gerai išlieto gelio ir vykdoma elektroforezė 20 mA srovėje penkias (5) valandas (Mighty Small II, Hoefer, JAV). Panaudotų pakrautojo gelio ir skiriamojo gelio akrilamidų koncentracijos atitinkamai buvo 5 % ir 15 % , o iš anksto nudažytas standartinis SeeBlue (nuo 250 Kda iki 4 kDa; NOVEX, San Diego, CA, JAV) arba plačiai naudojamas standartinis Marki 2 (nuo 200 kDa iki 2,5 kDa) buvo panaudoti kaip standartinių dydžių pažymėti baltymai. Po elektroforezės gelis nudažytas vienai (1) valandai kūmasio briliantiniu mėlynuoju R-250, o dažas per dešimt (10) valandų išblukintas blukinančiu tirpalu (5 % metanolio ir 7 % acto rūgšties).
[0055] Patvirtinimui, kad ekspresuotas baltymas yra PB14 peptidas, baltymams elektroforezės gelyje [vykdytas vestern-blotingas naudojant triušio anti-PB1 antikūną (Fig. 6). Imuninis serumas pagamintas imunizuojant konjuguotu ovalbuminu, kuris buvo PB1 peptidas, cheminiu būdu susintetintas firmoje Bio-Synthesis, Inc. (Levvisville, TX, JAV). Fig. 6 juosta M parodo iš anksto nudažytą standarto SeeBlue žymę, juosta 1 parodo terpę, naudotą E. coli M15 [pREP4] inkubacijai, kuri buvo netransformuota, juosta 2 parodo terpę, naudotą E. coli M15 [pREP4] inkubacijai, kuri buvo transformuota vektoriumi pQE30, juosta 3 reiškia terpę, naudotą E. coli M15 [pREP4] inkubacijai, kuri buvo transformuota vektoriumi pBX4.
[0056] Kaip parodyta Fig. 6, tik vektoriumi pBX4 transformuota E. coli ekspresavo rekombinantinį PB14 peptidą ir parodė specifinį imunitetą su pelės anti-PB1 serumu.
[0057] E. coli M15 [pREP4], kuri buvo pakeista vektoriumi pBX4, inkubuota tokiu pat būdu, kaip ir 1 pakopoje. Ląstelių auginimui paimta 10 ml kultūros terpės ir nucentrifuguota, kad būtų gauta ląstelių. Ląstelių gumuliukai suspenduoti 5-se ml ląstelių lizvimo tirpale (300 mM NaCI, 50 mM NaH2P04, 10 mM imidazolo, pH 8,0), kad gautų iš ląstelių gryną baltymą. Atšaldžius, gmuliukų suspensijos tirpalas per 20 ciklų veikiamas ultragarsu viršgarsine banga, kad gautų lizuotas ląsteles. Supernatantas paimtas centrifuguojant 4 °C temperatūroje 10000 apsisukimų per minutę greičiu 30 minučių laikotarpyje. Toks pat tūris 2X SDS tirpalo sumaišytas su tirpalu, o SDS-PAGE taip pat vykdomas kaip aprašyta 1 pakopoje. Po to kiekvieną tirpalą šildė 95 °C temperatūroje 5 minutes. SDS-PAGE rezultatas patvirtina, kad PBI4 peptidas gali būti išskirtas ir išgrynintas iš tirpaus ekstrakto A, kuriame jis laikytas netirpiame nevalytame ekstrakte B.
[0058] Ni-NTA derva, kuri naudojama išgryninti His-pažymėtus baltymus, panaudota išgryninti 1 pakopos rekombinantinį peptidą. Afininė chromatografija, reikalaujanti įspūdingos jėgos tarp Ni+ prisotintos dervos ir histidino liekanos ekspresuoto baltymo gale, yra gerai žinomas būdas lengvai išgryninti reikiamą baltymą.
[0059] Pirmiausiai, E. coli M15 [pREP4], kuri buvo transformuota vektoriumi pBX4, inokuliuota 1-me I LB kultūros terpės ir inkubuota 37 °C temperatūroje iki tiek, kad O.D. reikšmė prie 600 nm būtų virš 0,6. Santykis tarp LB kultūros terpės ir pBX4 vektoriaus buvo penkiasdešimt (50) su vienu (1). Į galutinės koncentracijos tirpalą pridėta 1 mM IPTG ir vėl inkubuota penkias (5) valandas. Po inkubavimo kultūros terpė centrifuguota apie 30 min. prie 6,000 apsisukimų per minutę, o ląstelių gumuliukai laikyti -70 °C temperatūroje per nakt[. Ląstelių gumuliukai panardinti į ledą, o po to suspenduojami tirpinimo tirpale (300 mM NaCI, 50 mM NaH2P04, 10 mM imidazolo, pH 8,0), panaudojant 5 ml tirpinimo tirpalo 1 g gumuliukų. Ląstelės lizuojamos ardant ultragarsu pagal 2 pakopos metodiką, o po to centrifuguotos 30 min. kambario temperatūroje esant 10000 Xg. Toks pat tūris buferio (8 M karbamido, 0,1 M NaH2P04, 0,01 M Tris-HCI, pH 8,0) kaip ir gumuliukų pridėtas pakartotinam suirusios ląstelės suspendavimui ir čia esančių baltymų denatūravimui, o suspenduotas tirpalas paveiktas trumpai ultragarso banga taip, kad buferyje būtų ištirpinta kuo daugiau baltymų. Suspensija centrifuguota 8000 apsisukimų per minutę greičiu 30 minučių, kad būtų pašalintos suirusios ląstelės, kurios nesoliubilizuotos 8 M karbamide. [ 4 ml minėto supernatanto 4 °C temperatūroje pridėta 1 ml Ni-NTA dervos ir purtyta 2 valandas prie 200 apsisukimų per minutę greičiu tam, kad baltymai, turintys His-tag būtų pagauti.
[0060] Toks supernatantas, turintis baltymo/Ni-NTA kompleksą, rūpestingai supiltas į chromatografinę kolonėlę (2 cm pločio x 2,7 cm aukščio). Buferio perteklius išleistas atidarius kranelį, esantį po derva. Kolonėlė perplauta 20 -čia ml vidutinio pH buferio (8 M karbamido, 0,1 M Nah^PCU, 0,01 M Tris-HCI, pH 8,0) ir po to 20-čia ml kito buferio (8 M karbamido, 0,1 M NaH2P04, 0,01 M Tris-HCI, pH 6,3), kad būtų išplauti baltymai, kurie nespecifiškai surišti su Ni-NTA derva. Baltymai-taikiniai, turintys žymėtąjį His, eliuoti plaunant du (2) kartus 5-iais ml žemo pH buferiu (8 M karbamido, 0,1 M NaH2P04, 0,01 M Tris-HCI, pH 5,9), po to keturis (4) kartus 5 -iais ml stiprios rūgšties buferiu (8 M karbamido, 0,1 M NaH2P04, 0,01 M Tris-HCI, pH 4,5), o po to naudota SDS-PAGE, kad patvirtintų eliuotus baltymus-taikinius naudojant 15 % akrilamido gelį (fig. 7). Fig. 7 juosta M parodo iš anksto dažytą SeeBlue žymę, o juosta 1 parodo išgrynintą BU peptidą.
[0061] Aukščiau minėti išgryninti baltymai dializuoti ant PBS (8 g/l NaCI, 0,2 g/l KCI, 1,44 g/l Na2HPC>4 ir 0,24 g/l KH2PO4) tam, kad būtų gautos jų pirminės konformacijos. Naudojamas dializės vamzdelis yra 3500 Da pagal žemutinę molekulinės masės ribą. Dializės metu pirmas penkias (5) valandas sunaudota 3 I PBS, turinčio 2 M karbamido, o po to per naktį du (2) kartus 5 I PBS be karbamido.
[0062] Hidrofobinė chromatografija atliekama tam, kad padidintų PB14 peptido, gauto 3-1 pakopoje, grynumą.
[0063] Amonio sulfatas dedamas pamažu iki galutinės 20 % koncentracijos į tirpalą, turintį PB14 peptido, eliuoto nuo Ni-NTA dervos 3-1 pakopoje, o po to pH sureguliuojamas iki 7,0. Po to, kai amonio sulfato ištirpo pilnai iki 10 %, tirpalas paliekamas trims arba daugiau valandų, o po to tirpalas patalpinamas į fenilsefarozės kolonėlę [užpildas: greitosios srovės fenilsefarozės derva (Pharmacia, Švedija); kolonėlės dydis: 1 cm (plotis) x 3 cm (aukštis)].
[0064] Kiekviena frakcija, kuri eliuota iš kolonėlės pilant eliuavimo tirpalą (8 M. karbamido, 0,1 M NaH2P04, 0,01 M Tris-HCI, pH 6,3) į kolonėlę esant tekėjimo greičiui 0,5 ml/min prie amonio sulfato atvirkštinio gradiento nuo 10 % iki 0 %, patalpinta ant SDS-PAGE gelio. Frakcija, turinti PB14 peptidą, surinkta irdializuota buferio tirpale, kad taptų gėlinta, o karbamidas, kuris vartojamas kaip denatūravimo agentas, pašalintas tuo pačiu metu.
[0065] [ buferio tirpalą (50 ml NaCI, 20 mM Tris-HCI, 2 mM CaCI2, pH 7,4), kuris tinka pašalinti denatūravimo agentą ir imidazolą iš išgryninto His-žymėtojo baltymo, o taip pat suaktyvinti enterokinazę, pridėta 2 m karbamido. Dializuotas PB14 peptidas, kuris gautas 3-2 pakopoje, dar kartą dializuojamas naudojant aukščiau minėtą buferį, turintį karbamido, kad gėlintų PB14 peptidą, kurio metu karbamido koncentracija pamažu sumažėja vis kartojant dializę iki karbamidu nuskurdinto buferio. 3 TV/ml enterokinazės pridėta į PB14 peptidą, turintį tirpalą, kurio buferis pakeistas minėtu antruoju buferiu, ir inkubuota 23 °C temperatūroje. Tirpalas, kuris paimamas kas valandą, analizuojamas SDS-PAGE būdu tam, kad patikrintų His žymių kiekį, pašalintų iš His-žymėtųjų PB1 (PB14+hls) peptidų.
[0066] Nepageidaujami baltymai ir peptidai, kurie pasigamino paveikus enterokinazę, pašalinti jonų mainų chromatografija.
[0067] Tirpalas, turintis PB14~hls peptidą, gautą 3-3 pakopoje, dializuotas dializės buferyje (2 M karbamido, 0,1 M NaH2P04, 0,01 M Tris-HCI, pH 7,0), ir buferio kiekis buvo žymiai pakeistas. Dializuojamas tirpalas patalpintas ant DEAE sefarozės dervos (Pharmacia, Upsala, Švedija). Po to kolonėlė supusiausvirinta su pusiausvirinimo buferiu (50 ml natrio fosfato buferio, 2 M karbamido, pH 7,0) ir peptidas eliuotas pagal NaCI koncentracijos gradientą nuo 0 iki 1 M naudojant kitą buferį (50 ml natrio fosfato buferio, 2 M karbamido, 1M NaCI) (srovės greitis: 0,5 ml/min.). Kiekviena frakcija regeneruota ir norimą baltymą turinčios frakcijos sukaupiamos. Sukoncentravus dalis, PBVhls peptido buvimas patvirtintas SDS-PAGE. 4 pakopa: PBI4 kiekybinė analizė
[0068] Išgrynintas PB14 peptidas, kuris gautas pagal 3 pakopos metodiką, kiekybiškai išanalizuotas kolorimetinės analizės metodu naudojant mikro BCA reagentą (Pierce, Rokfordas, JAV). 5 pakopa: rekombinantinio PBI4 peptido charakteristikų patvirtinimas PBI4 peptidų, kurie išgryninti 3 pakopoje, grynumas ir imuninio serumo, kuris gautas naudojant sintetinį PBI4 peptidą kaip antigeną, imunogeniškumas patvirtinti wetern-bloto analize naudojant ECL (Amersham, Cleveland, UK). Atlikus SDS-PAGE (2 pavyzdys, 1 pakopa), gelis inkubuotas kartu su PVDF membrana buferyje (0,3 % Tris, 1,5 % glicinas, 20 % metanolis) pastovioje 60 V įtampoje tris (3) valandas tam, kad baltymas gelyje būtų perneštas į PVDF membraną. Po to įgertoji membrana inkubuota 1,5 valandos su 5 ml blokavimo tirpalo (TBS, pH 7,5, 5 % (masės/tūryje) nugriebto pieno miltelių, 0,02 % Tvino 20), o dar po to tris kartus plauta su TTBS (Tris-buferintas fiziologinio tirpalo tirpalas, turintis 0,1 % Tvino 20) atitinkamai 15, 5 ir 5 minutes. Imuninis serumas prieš PB1 peptidą
[0069] (nuoroda į 2 pavyzdžio 1 pakopą) praskiestas TTBS tirpalu santykiu vienas (1) su penkiais tūkstančiais (5000), o po to 1,5 valandos inkubuotas su membrana tam, kad būtų patvirtintas PB14 peptido ir imuninio serumo prieš PB14 peptidą grynumas (3 pavyzdys). Po gelio plovimo su TBBS paeiliui tris kartus 15, 5 ir dar 5 minutes, membrana inkubuota 1,5 valandos kambario temperatūroje su tirpalu, kuriame šarminis fosfatazės-F(ab)'2-ožkos anti-pelės IgG (H+L) (Zymed, San Francisko, CA) praskiestas su TTBS tirpalu santykiu vienas (1) su tūkstančiu
[0070] (1000). Membrana vėl plauta su TTBS tris kartus, o po to nudažyta pridedant BCIP/NBT (5-brom-4-chlor-3-indolilfosfatas/tetrazoliumo nitro mėlynasis (Sigma)). Po nudažymo, BCIP/NBT tirpalas pašalintas TTBS tirpalu. Kaip vestem-blotingo rezultatas, ekspresuotas PB14 peptidas gali būti atpažintas anti-PB14 serumu.
[0071] ECL atveju, vietoje nitroceliuliozės membranos naudota PVDF membrana (Gelman Science, BioTrace®). Priedo, pirmasis antikūnas naudotas santykiu vienas (1) su dešimt tūkstančiu (10000) ir HRP-konjuguoti triušio anti-pelės IgG (Pierce, Rokfordas, IL, JAV) buvo panaudoti kaip antrasis antikūnas santykiu vienas (1) su dešimt tūkstančiu (10000). Spalvinėje reakcijoje naudotas 1 ml A tirpalo ECL+vestern-blot agento (Amersham) 25-iuose ml B tirpalo. Kai spalva buvo pakankamai generuota, membrana buvo įterpta į kasetės plėvelę, atitinkamai 5, 10, 20 ir 30 sekundžių, kad eksponuotų ant plėvelės taip, kad ruoželiai ant gelio galėtų būti aptikti (Fig. 8). Fig. 8 juosta M reiškia ECL aptikimo žymę (Gibco BRL), o juosta 1 reiškia PB14 peptidą. Iš Fig. 8 matyti, kad ekspresuotas PB14 peptidas gali būti atpažintas anti-PB14 serumu.
[0072] Priedo, vestern-blotingo analizė, kurioje PB14 peptidas, naudojantis polikloninį antikūną, išskirtą iš triušio serumo, panaudojant Protein G kolonėlę
[0073] Čia naudotas PB14 peptidas yra PB14"hls peptidas, iš kurio pašalinta jo His-žymė pagal 2 pavyzdžio 3-3 pakopą.
[0074] Ovalbuminas (OVA), kaip baltymas nešiklis, pridėtas į išgrynintą PB14 peptidą pagal 2 pavyzdžio 3 pakopą moliniu santykiu vienas (1) su dešimt (10) ir inkubuotas vieną (1) valandą 4 °C temperatūroje. į PB14 -peptido-ovalbumino tirpalą tokiu pat tūriu pridėta 2 tūrio % glutaraldehido ir inkubuota vieną (1) valandą pastoviai purtant. Po to į reakcijos mišinį pridėta glicino, o kai galutinė koncentracija tampa 0,2 M, reakcija sustabdoma.
[0075] Reakcijai įvykus, likęs reakcijos mišinyje glutaraldehidas-glicinas pašalinami dialize naudojant MWCO 12000-14000 dializės membraną (Spectrum®, Dominguez, CA, JAV).
[0076] Peptidas, su kuriuo buvo sujungtas OVA 1 pakopoje, sukoncentruotas ir panaudotas pelės imunizavimui. Antigeno kiekis, suleistas pelei buvo 5 jig ir tai buvo PB14-peptido kiekis prieš sujungiant su OVA. Antigenas, kuris emulguotas su tokiu pat kiekiu adjuvanto, įvestas pelei į pilvo ertmę 0,2 ml kiekiu.
[0077] Pirmai injekcijai panaudotas pilnas Freundo adjuvanto komplektas (CFA), o nepilnas Freundo adjuvanto komplektas (iFA) panaudotas kaip adjuvantas pakartotiniam imunizavimui du (2) kartus dviejų (2) savaičių intervalu. Kontrolinei pelei suleistas BSA (jaučio serumo albuminas).
[0078] Po penkių (5) dienų nuo paskutinės injekcijos punktuojant širdį iš pelės paimamas kraujas, kuriam leidžiama krešėti 30 minučių 37 °C temperatūroje. Po to kraujas nucentrifuguotas per 30 minučių 4 °C temperatūroje 2500 apsisukimų per minutę greičiu, ir krešuliai pašalinti iš kraujo. Supernatantas (t. y., kraujo serumas) inkubuotas per naktį 4 °C temperatūroje, kad likę kraujo koaguliantai būtų visiškai sukoncentruoti, ir nucentrifuguotas per 20 minučių 10000 apsisukimų per minutę greičiu. Susidaręs supernatantas išpilstytas į keletą mėgintuvėlių. Kraujo serumas, kuris turi būti panaudotas eksperimente, laikytas 4 °C temperatūroje, o liekanos laikytos - 20 °C temperatūroje.
[0079] 3 pakopa: anti- PBVantikūno avidiškumo matavimas netiesioginiu ELISA metodu
[0080] Antikūno avidiškumas išmatuotas naudojant kraujo serumą, gautą 2 pakopoje. 100 įiI PB14-peptido paskirstyta į kiekvieną iš 96 mikrotitravimo plokštelės (Flakonas: pro-surišimas) duobutę ir palikta stovėti 4 °C temperatūroje 6 valandoms arba daugiau, o po to plauta tris (3) kartus TTBS buferiu (Tris fiziologinio tirpalo buferis, turintis 0,05 % Tvino 20). 200 įiI blokuojančio tirpalo (1 % BSA, esantis TTBS) pridedama į kiekvieną duobutę ir inkubuojamas 37 °C temperatūroje vieną (1) valandą, o po to plauta tris (3) kartus su TTBS. 100 nl išskirto serumo, kuris praskiestas su blokuojančiu tirpalu santykiu vienas (1) su nuo 102 iki 105 pridedami [ reakcijos tirpalą ir inkubuojama 37 °C temperatūroje vieną (1) valandą, o po to plauta tris (3) kartus su 200 \ x\ TTBS. 100 (al HPR-prijungto ožkos anti-triušio IgG antikūnas (Pierce, Rockford, IL), praskiestas su blokuojančiu tirpalu santykiu vienas (1) su 103, pridedamas į reakcijos tirpalą ir inkubuojamas 37 °C temperatūroje vieną (1) valandą, o po to plautas tris (3) kartus su 200 (al TTBS. HPR substrato rinkinio tirpalas A (Bio-Rad) sumaišytas su šio rinkinio tirpalu B santykiu devyni (9) su vienu (1). 100 jj.I susidariusio mišinio pridėta [reakcijos tirpalą ir dažyta trisdešimt (30) minučių, o po to reakcijos mišinio optinė sugertis išmatuota prie 405 nm naudojant ELISA lyderį (EL312e, Bio-Tek lns.)(Fig. 9). Fig 9 patvirtina, kad pelės antikūnas, specifinis PBVpeptidui, gali būti panaudotas vestern-blot ir ELISA metodų analizei, esant vienam (1) tūkstančiui klosčių (figūroje X ašies 3,0).
[0081] Čia panaudotos 5 savaičių amžiaus ICR pelės (Korea Center for Animal Experiment [Korėjos eksperimentinių gyvūnų centras], Ltd., Seulas, Korėja). Pelės augintos vivariume, kuriame temperatūra palaikoma nuo 17 iki 25 °C, ir maitintos
[0082] pašaro mišiniu (Sam Yang Feed Ltd., Seulas, Korėja [ingredientai: vanduo 11,8 %. arba daugiau, baltymai 20,0 % arba daugiau, nevalyti lipidai 3,0 % arba daugiau, ląstelienos žaliava 10,0 % arba mažiau, nevalyti pelenai 10,0 % arba mažiau, kalcis 0,6 % arba mažiau, ir fosforas 0,4 % arba daugiau]). Pelėms duota aukso tiogliukozė (GTG), kad sukeltų nutukimą. GTG turi savybę sukelti venteromedialinio hipotalaminio branduolio (VMH) jautrumo sumažėjimą.. Todėl pelės, gavusios GTG nejaučia sotumo ir pastoviai nori ėsti. Čia naudotas GTG yra labai nestabilus junginys, kuris lengvai suskyla vandenyje arba nuo drėgmės. Todėl 100 mg GTG (Sigma, Inc.) praskiestas su 1 ml sezamo aliejaus (Sigma, Inc.) ir buvo naudotas tokiu pat būdu kaip ir Brecherio su bendraautoriumi (Brechere G.,Waxler, S. H., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 70: 498-501 (1949)) tam, kad būtų pateiktas patikimas GTG kiekis.
[0083] Pelės padalintos, kad būtų suformuota tiriama grupė (dvidešimt (20) pelių) ir kontrolinė grupė (keturios 4) grupės), 25 ml GTG suleista bandomai grupei, o kontrolinei grupei nesuleista nieko.
[0084] Tiriamos grupės pelių kūno masė išmatuota prieš eksperimentą ir pelės, kurių kūno masės nukrypimas buvo nežymus, buvo atrinktos ir panaudotos eksperimentui. Pelių kūno masė, išmatuota po vienos (1) savaitės po GTG suleidimo buvo nuo 26,5 iki 29,5 gramo.
[0085] Septynių GTG injekuotų pelių grupė buvo su sukeltu nutukimu, tuo tarpu likusios - nebuvo. Pelėms, kurioms nutukimas nebuvo sukeltas, buvo vėl injekuotos GTG, po to nutukimas buvo sukeltas visoms pelėms.
[0086] Visos pelės su sukeltu nutukimu buvo padalintos į tris (3) grupes. Po savaitės, kai GTG buvo suleistas antrą kartą, pirmai tiriamai grupei, susidedančiai iš septynių (7) pelių buvo suleistas PBVpeptidas pagal 3 pavyzdžio 2 pakopą. Priedo, pelėms kitos grupės iš trijų (tiriamos 2 grupės, susidedančios iš septynių (7) pelių) vietoje PB14-peptido buvo suleistas ovalbuminas kaip tariamas eksperimentas, o vakcina nebuvo suleista kitai grupei (tiriamai 3 grupei, turinčiai šešias (6) peles), kad sukeltų nutukimą. Iš kitos pusės, 0,2 ml PBS buvo suleista kontrolinei grupei, kad sulygintų su tiriamomis grupėmis, kad patvirtintų šio išradimo vakcinos efektyvumą.
[0087] Priedo, čia vartojamas pašaras sumaišytas su kiaušinio tryniu ir džiovintas 50 °C temperatūroje, kad sukeltų cholesterolio suvartojimą taip, kad cholesterolio lygis galėtų pakilti pelės serume. Pašaras taip pat duotas pakankamu kiekiu, kad sukeltų ligas, susijusias su cholesterolio lygio padidėjimo sukeliamomis ligomis. Pelių kūno masė buvo matuojama kasdien.
[0088] Kaip parodyta Fig. 10, tiriamos 1 grupės (-A-A-) vakcina injekuotų pelių kūno masė per dvylika (12) savaičių nuo GTG injekcijos išaugo nuo 27 ± 0,4 g iki 52,2 ± 1,7 g. Duomenys patvirtina išvadą, kad nėra žymaus skirtumo išaugusios kūno masės tarp tiriamos 1 grupės ir kontrolinės grupės (-0-0 -). Tačiau pelių kūno masė tiriamoje 2 grupėje (- •- • -), kurioje ovalbuminas įvestas po to, kai pelės nutuko, ir tiriamos grupės (- ■ - ■ -), kurioje po nutukimo vakcina nebuvo įvesta, kūno masė augo pastoviai nuo 28,3 ± 0,5 g iki 68,9 ± 2,8 g. Todėl buvo patvirtinta, kad nutukimas galėjo būti sustabdytas PBl4-peptido vakcinos injekcija. Figūroje 10 G1 ir G2 reiškia GTG injekcijos laiką, o V1, V2 ir V3 reiškia PB14-peptido vakcinos injekcijos laiką. Figūroje 11 parodytas pelės su iššauktu nutukimu išorinis vaizdas. 20-ties savaičių pelė tiriamos 1 grupės (Fig. 11a: normalios pelės) palyginta su 20 savaičių pele tiriamos 3 grupės (fig. 11 b: nutukusios pelės). Kaip parodyta Fig 11, buvo patvirtinta, kad šio išradimo vakcina buvo efektyvi stabdant nutukimą.
[0089] Po pirmosios GTG injekcijos kraujo cholesterolio lygis 12-kos savaičių kontrolinės grupės pelių palygintas su 12-kos savaičių GTG-injekuotomis tiriamų 1 ir 2 grupių pelėmis. Bendrojo cholesterolio, trigliceridų, HDL-cholesterolio ir LDL-cholesterolio koncentracijos išmatuotos fermentiniu būdu naudojant Cholestezyme-V, Triglyzyme-V, HDL-C555 (Shin Yang Chemicals, Korėja) ir LDL-EX rinkinį (Denka Bio-Research, Ltd., Tokijas, Japonija). Kiekviename eksperimente paruoštos kalibravimo kreivės O.D reikšmėms naudojant standartą Calibrater-D (Denka Bio-Research Ltd., Tokijas, Japonija), kad būtų sumažintos eksperimento paklaidos. O.D reikšmės dėl intereso buvo išskaičiuotos remiantis kalibravimo kreive, kad patvirtintų lipidų koncentraciją ir kiekį, o rezultati pateikti 1 lentelėje ir Fig. 12.
[0090] Kaip parodyta 1 lentelėje ir Fig. 12, kaip nutukimo sukėlimo rezultatas gautas patvirtinimas, kad abiejose tiriamose grupėse nėra jokio žymaus skirtumo cholesterolio kiekyje, o kontrolinėje grupėje cholesterolio kiekis nepadidėjo, nes bendra cholesterolio koncentracija kraujyje, o taip HDL-C ir LDL-C pakilo labai nežymiai (Fig. 12).
[0091] Šio išradimo vakcina, kuri turi apoliproteino B-100 epitopo mimezinį peptidą, jo konkatemerus ir modifikuotus peptidus, gali sustabyti atsiradusį nutukimą nesukeliant organizme autoimuniteto.
[0092] Todėl kraujotakos ligos, surištos su LDL gali būti gydomos šio išradimo vakcina efektyviau, palyginus su laikinu arba brangiai kainuojančiu įprastu būdu, kuriame inhibuojamas fermentas, surištas su cholesterolio metabolizmu.
[0093] Išradimas pateiktas aiškiai ir aprašytas su nuorodomis į jo specifinius pavyzdžius ir turi būti suprantamas šios srities specialistams, kad galimi įvairūs formos ir detalių pasikeitimai, kurie neišeina už išradimo esmės ir apimties ribų, pateikiamoje pridėtoje išradimo apibrėžtyje.
1. Sekos SEQ. ID. Nr. 1 apoliproteino B-100 epitopo mimezinis peptidas ir jo konkatemeras.
2. Mimezinio peptido konkatemeras pagal 1 punktą, kuriame minėtas konkatemeras apima nuo vieno (1) iki penkiolikos (15) minėtųjų mimezinių peptidų.
3. Mimezinio peptido konkatemeras pagal 1 punktą, kuriame minėtas konkatemeras apima nuosekliai sujungtus keturis (4) minėtuosius peptidus.
4. Mimezinis peptidas ir jo konkatemeras pagal 1 punktą, kuriame minėtojo mimezinio peptido aminorūgščių seka modifikuota būdu, parinktu iš grupės, susidedančios iš prijungimo, delecijos ir cheminio pakeitimo reakcijų.
5. Sekos SEQ. ID. Nr. 2 apoliproteino B-100 epitopo mimezinis peptidas.
6. Mimezinis peptidas pagal 5 punktą, kuriame minėtas konkatemeras apima nuo vieno (1) iki penkiolikos (15) minėtųjų mimezinių peptidų.
7. Mimezinio peptido pagal 5 punktą konkatemeras, kuriame minėtas konkatemeras apima nuosekliai sujungtus keturis (4) minėtuosius peptidus.
8. Mimezinis peptidas pagal 5 punktą, kuriame minėtojo mimezinio peptido aminorūgščių seka modifikuota būdu, parinktu iš grupės, susidedančios iš prijungimo, delecijos ir cheminio pakeitimo reakcijų.
9. Sekos SEQ. ID. Nr. 3 apoliproteino B-100 epitopo mimezinis peptidas.
10. Mimezinio peptido pagal 9 punktą konkatemeras, kuriame minėtas konkatemeras apima nuo vieno (1) iki penkiolikos (15) minėtųjų mimezinių peptidų.
11: Mimezinio peptido pagal 9 punktą konkatemeras, kuriame minėtas, konkatemeras apima nuosekliai sujungtus keturis (4) minėtuosius peptidus.
12. Mimezinis peptidas pagal 9 punktą, kuriame minėtojo mimezinio peptido aminorūgščių seka modifikuota būdu, parinktu iš grupės, susidedančios iš prijungimo, delecijos ir cheminio pakeitimo reakcijų.
13. Vakcinos kompozicija, skirta gydyti nutukimą, besiskirianti tuo, kad ji apima peptidą, parinktą iš grupės, susidedančios iš sekų SEQ. ID Nr. 1, SEQ. ID Nr. 2 ir SEQ. ID Nr. 3 apoliproteino B-100 epitopo mimezinių peptidų, jų konkatemerų, jų modifikuotųjų peptidų ir jų mišinių.
14. Vakcinos kompozicija pagal 13 punktą, besiskirianti tuo, kad minėta vakcinos kompozicija skiriama intrakutaniniu būdu.
15. Vakcinos kompozicija pagal. 13 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtos vakcinos kompozicijos tipas parinktas iš grupės, susidedančios iš tablečių, piliulių, granulių, oblečių, eliksyrų, suspensijų, emulsijų, tirpalų, sirupų, aerozolių, minkštųjų arba kietųjų želatinos kapsulių, sterilizuotųjų injekcinių tirpalų ir sterilizuotųjų miltelių.
16. Apoliproteino B-100 epitopo mimezinio peptido, jo konkatemero ir jo modifikuotojo peptido gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis apimai) pakopą, skirtą DNR, kuri koduoja sekų SEQ. ID Nr. 1, SEQ. ID Nr. 2 ir SEQ. ID Nr. 3 apoliproteino B-100 epitopo mimezinių peptidų, jų konkatemerų, jų modifikuotųjų peptidų genetinę informaciją, įterpimui į vektorių;ii) pakopą, skirtą ląstelių-šeimininkių transformavimui su vektoriumi, gautu i) pakopoje ir jų inkubavimui;iii) pakopą, skirtą minėtojo apoliproteino B-100 epitopo mimezinio peptido, jo konkatemero ir jo modifikuotojo peptido išskyrimui iš ląstelių-šeiminikių.
i) pakopą, skirtą DNR, kuri koduoja sekų SEQ. ID Nr. 1, SEQ. ID Nr. 2 ir SEQ. ID Nr. 3 apoliproteino B-100 epitopo mimezinių peptidų, jų konkatemerų, jų modifikuotųjų peptidų genetinę informaciją, įterpimui į vektorių;ii) pakopą, skirtą ląstelių-šeimininkių transformavimui su vektoriumi, gautu i) pakopoje ir jų inkubavimui;iii) pakopą, skirtą minėtojo apoliproteino B-100 epitopo mimezinio peptido, jo konkatemero ir jo modifikuotojo peptido išskyrimui iš ląstelių-šeiminikių.17. DNR, koduojanti polipeptidą, sudarytą iš SEQ. ID Nr. 1 apoliproteino B-100 epitopo keturių (4) nuosekliai sujungtų mimezinių peptidų.
18. Ekspresijos vektorius, kuris apima DNR fragmentą, koduojantį polipeptidą, sudarytą iš SEQ. ID Nr. 1 apoliproteino B-100 epitopo keturių (4) nuosekliai sujungtų mimezinių peptidų.