LT5053B

ŠAPERONAI DNAK, DNAJ IR GRPE IŠ MEIOTHERMUS RUBER, PASIŽYMINTYS PADIDINTU TERMINIU STABILUMU IR BALTYMŲ AKTYVIOS STRUKTŪROS ATSTATYMO (REFOLDAVIMO) IN VITRO SISTEMA IR BŪDAS

CHAPERONS DNAK, DNAJ AND GRPE FROM MEIOTHERMUS RUBER HAVING INCREASED THERMAL STABILITY AND SYSTEM AND PROCESS FOR REFOLDING PROTEINS IN VITRO

Referatas

[LT] Išradimas apibūdina baltymų aktyvios struktūros atstatymo (refoldavimo) sistemą panaudojant termofilinius šaperonus, klonuotus iš mezofilinio mikroorganizmo Meiothermus ruber. Minėti šaperonai pasižymi padidintu terminiu stabilumu ir didesniu refoldavimo aktyvumu nei anksčiau žinomi šaperonai. Pasiūlyta refoldavimo sistema (refoldavimo buferis) be denatūruoto baltymo savo sudėtyje turi neorganinių druskų, trijų išgrynintų termofilinių šaperonų mišinį (DnaK, DnaJ ir GrpE) bei adenozintrifosfatą. Išradimas priklauso biotechnologijos sričiai ir gali būti panaudotas natūralių arba rekombinantiniųbaltymų aktyvios struktūros atstatymui in vitro jų gamybos procese.

[EN] The present invention claims protein refolding system which includes thermophilic chaperons cloned from mezophilic microorganism Meiothermus rubber. The chaperons mentioned above are characterized by increased thermal stability and refolding activity compared to chaperons known previously. The refolding system claimed (the refolding buffer) consists of denaturated protein, neorganic salts, the mixture of three purified thermophilic chaperons (DnaK, DnaJ and GrpE) and adenosintriphosphate. The invention belongs to biotechnology and may be useful in restoring in vitro the active structure of native and recombinant proteins in the process of their preparation.

Aprašymas

[0001] Šis išradimas priskirtinas baltymų biotechnologijos sričiai. Jo esmė - naujų šaperonų panaudojimas atstatant aktyvią baltymų struktūrą (refolduojant denatūruotus baltymus) in vitro.

[0002] Molekuliniais šaperonais vadinami baltymai, kurie atstato denatūruotų arba dar nesusiformavusių baltymų tretinę struktūrą (konformaciją), o tai pastariesiems sudaro galimybę įgauti jiems būdingą biocheminį ar fiziologinį aktyvumą. Jei atstatomas denatūruotų fermentų aktyvumas, tai šis refoldavimo atvejis vadinamas reaktyvacija. Termofiliniai šaperonai DnaK, DnaJ ir GrpE — tai rekombinantiniai baltymai, klonuoti iš Meiothermus ruber ( M. ruber) ir ekspresuoti E. coli (toliau termofiliniai šaperonų baltymai žymimi Mru.DnaK, M_"w.DnaJ, Mru.GrpE, o jų genai, atitinkamai, Mru. dnaK, Mru. dnaJ, Mru. grpE). Visi šie baltymai yra išgryninti iš E. coli ir panaudoti denatūruotų baltymų struktūros atstatymo (refoldavimo) in vitro sistemoje.

[0003] Yra žinomi keli patentai, nagrinėjantys šaperonų baltymų arba genų panaudojimą aktyvios konformacijos baltymų gavimui, paminėtini: EP0885967 (su ekvivalentais JP11009274, US6159708), EP1016724 (su ekvivalentais JP 2000189163, US6197547), EP0998485, W09905163, EP1149909, W00071723.

[0004] Patentų EP0998485, W09905163 autoriai baltymų refoldavimui siūlo naudoti šaperoninus Hsp60 (GroEL) arba jų fragmentus kartu su foldazėmis, tai gali būti peptidilprolil-izomerazės arba tiol/disulfid-oksidoreduktazės (dažnai vadinamos protein-disulfid-izomerazėmis). Patentų EP1149909, W00071723 autoriai tiems pat tikslams naudoja in vitro netermofilinius šaperonus DnaK, DnaJ ir GrpE iš įvairių šaltinių ( E. coli, mielių, augalų ir žinduolių) kartu su kitos grupės šaperonais ClpB ir ClpS. Pastarieji autoriai ir patentų EP0885967, EP1016724 autoriai siūlo šaperonų DnaK, DnaJ, GrpE, GroES ir GroEL koekspresijos su pasirinktu tiksliniu baltymu variantus, norėdami gauti juos aktyvioje konformacijoje in vivo. Tačiau nei vienas nagrinėjamas analogas baltymų refoldavimui nepanaudojo termofilinių šaperonų. Be to, kaip bus parodyta toliau, šiame išradime siūlomi unikalūs termofiliniai šaperonai savo aktyvumu pranoksta analogus iš kitų šaltinių.

[0005] Šio išradimo tikslas buvo sukurti baltymų refoldavimo in vitro sistemą, panaudojant rekombinantinius termofilinius šaperonus. Tam tikslui pasiekti termofiliniai šaperonų Mru. dnaK, Mru. dnaJ ir Mru. grpE genai buvo klonuoti iš mezofilinio mikroorganizmo M. ruber, perkelti į E. coli ir ekspresuoti. Tokiu būdu gauti nauji rekombinantiniai šaperonai buvo išgryninti ir panaudoti, komponuojant baltymų refoldavimo sistemas in vitro. Buvo surastos tokios šaperonų sistemos, kurios efektyviai atstato denatūruotų baltymų struktūrą ir gali būti panaudotos įvairios paskirties baltymų aktyvumo atstatymui biotechnologiniuose procesuose.

[0006] Šio išradimo DnaK, DnaJ ir GrpE šaperonų baltymai buvo identifikuoti, klonuoti ir ekspresuoti pirmą kartą, be to, pademonstruotas jų didelis aktyvumas baltymų refoldavimo procese. Pilna M. ruber dnaK (hsp70) operono seka atskleista ir deponuota autorių vardu GenBank duomenų bazėje, numeris AF507046 (http://www.nebi.nlm.nih.gov/).

[0007] Šaperonai Mru. DnaK, Mru.DnaJ ir Mru. GrpE yra termofiliniai ir skiriasi nuo anksčiau žinomų pagal savo kilmę, atsparumą aukštai temperatūrai ir didesnį refoldavimo aktyvumą. Nauji termofiliniai šaperonai iš M. ruber turi charakteristikas, pateiktas 1 lentelėje:

[0008]

[0009] Naujiems šaperonų baltymams gauti buvo naudotos rekombinantinės plazmidės pUC19-TR1, pUC 19-TR2 ir pUC19-TR3; šios plazmidės saugomos Biotechnologijos instituto (Vilnius) Rekombinantinių baltymų tyrimo laboratorijoje ir joms suteikti numeriai BI-TR1, BI-TR2, BI-TR3, atitinkamai.

[0010] Rekombinantinė plazmidė pUC19-TRl (deponavimo numeris BI-TR1) pasižymi tokiomis savybėmis: - ji koduoja dalį M. ruber dnaK operono; - jos bendras ilgis 5500 bazių porų;

[0011] EcoRI- HindlII 2,7 tūkst. bazių porų dydžio pUC19 plazmidės fragmento, turinčio geną, apsprendžiantį atsparumą ampicilinui ir pMBl replikono (ori srities);

[0012] EcoRl- HindllI fragmento 2,8 tūkst. bazių porų dydžio, koduojančio dalį geno

[0013] Plazmidės pUC19-TR2 (deponavimo numeris BI-TR2) bendras ilgis 3500 bp, ji koduoja dalį M. ruber dnaK operono ir susideda iš sekančių elementų: EcoRl- HindllI 2,7 tūkst. bazių porų dydžio pUC19 plazmidės fragmento, turinčio geną, apsprendžiantį atsparumą ampicilinui ir pMB 1 replikono (ori srities);

[0014] EcoRI- HindlII 0,8 tūkst. bazių porų dydžio fragmento, koduojančio 5'-galinę

[0015] Plazmidė pUC19-TR3 (deponavimo numeris BI-TR3) bendras ilgis 5500 bp, ji koduoja dalį M. ruber dnaK operono ir susideda iš sekančių elementų: £ c/136II 2,7 tūkst. bazių porų dydžio pUC19 plazmidės fragmento, turinčio geną, apsprendžiantį atsparumą ampicilinui ir pMBl replikono (ori srities);

[0016] £ c/136II 2,8 tūkst. bazių porų dydžio fragmento, koduojančio dalį geno Mru. grpE ir visą Mru. dnaJ geną.

[0017] Baltymų aktyvios struktūros atstatymo (refoldavimo) in vitro sistema apima praradusį aktyvią struktūrą baltymą, buferį, turintį palaikančių joninę jėgą druskų, disulfidinius baltymo tiltelius redukuojantį agentą, adenozintrifosfatą ir klonuotus termofilinius A/rw.DnaK, Mru.DnaJ ir Mru.GrpE šaperonus pagal šį išradimą. Sistema yra vandeninio tirpalo formoje, ir komponentų kiekis nustatomas iš sąlygų:

[0018] Baltymų aktyvios struktūros atstatymo in vitro būdas, panaudojant šaperonus pagal išradimą, pasižymi tuo, kad denatūruotą baltymą praskiedžia buferiu, pavyzdžiui, TRIS-HC1, pH 7,5 ±0,1, turinčiu joninę jėgą palaikančių druskų, pavyzdžiui, Na2SC>4, KC1, Mg(CH₃COO)₂, prideda disulfidinių baltymo tiltelių redukavimui ditiotreitolio iki 2-5 jiM, po to prideda termofilinių Mru. DnaK, A/ru.DnaJ ir Mru.GrpE šaperonų mišinį, optimaliai, santykiu 10:10:1, po inkubavimo 37°C dar prideda adenozintrifosfato iki koncentracijos 10 + 1 mM ir išlaiko mažiausiai 5 min.

[0019] Išradimo baltymų refoldavimo in vitro sistema, panaudojant rekombinantinius termofilinius šaperonus, yra iliustruojama informacija, pateikta Fig 1 - Fig. 11, kartu nurodant naudotas metodikas. Fig. l pateikta Mru.DnaK termofilinių šaperonų pagal išradimą aminorūgščių seka; Fig. 2 pateikta Mru. GųiE termofilinių šaperonų pagal išradimą aminorūgščių seka; Fig. 3 pateikta Mru. DnaJ termofilinių šaperonų pagal išradimą aminorūgščių seka; Fig. 4 pateikta M. ruber operono, koduojančio Mru. dnaK, Mru. dnaJ, Mru. grpE genus, nukleotidų seka. Genas Mru. dnaK nuo 634 iki 2499 nukleotido, genas Mru. grpE nuo 2578 iki 3108 nukleotido, genas Mru. dnaJ nuo 3182 iki 4063 nukleotido. Fig. 5 atkartoja Meiothermus ruber chromosominės DNR Southern'o bloto vaizdą, naudojant [32P]-žymėtą dnaK geno fragmentą. Pažymėti naudoti klonavimui fragmentai.

[0020]

[0021] 1 - baltymo molekulinės masės standartai, ( iš viršaus: 116, 66. 2, 45, 35, 25, 18. 4, 14. 4 kDa),

[0022] Fig. 8 pavaizduotos Mru.DnaJ baltymo gryninimo stadijos, frakcijų analizę atliekant elektroforezės būdu SDS-PAA geliuose (12%, redukuojančios sąlygos), kur A Chromatografija naudojant LRY2KT -Sefarozės kolonėlę: 1 - baltymo molekulinės masės standartai, ( iš viršaus: 116, 66. 2, 45, 35, 25, 18. 4, 14. 4 kDa).

[0023] 4-10 yra frakcijos iš LRY2KT -Sefarozės kolonėlės;

[0024] 2 - jungtinės atrinktos frakcijos po LRY2KT- Sefarozės kolonėlės;

[0025] Fig. 9 pavaizduotos Mru.GrpE baltymo gryninimo stadijos, frakcijų analizė -elektroforezės būdu SDS-PAA geliuose (15%, redukuojančios sąlygos), kur

[0026] 3 - nesorbuota frakcija;

[0027] 1 - baltymo molekulinės masės standartai, ( iš viršaus: 116, 66. 2, 45, 35, 25, 18. 4, 14. 4 kDa),

[0028] 1 - baltymo molekulinės masės standartai, ( iš viršaus: 116, 66. 2, 45, 35, 25, 18. 4, 14. 4 kDa),

[0029] Fig. 10 parodo rekombinantinių Mru. DnaK (Hsp70) ir Mru. DnaJ (Hsp40) terminį stabilumą.

[0030] a- MDH + M. ruber šaperonai; b - MDH + E. coli šaperonai; c - MDH spontaninė

[0031] reaktyvacija;

[0032] Naujų šaperonų genų klonavimo, genų ekspresijos E. coli, gautų šaperonų gryninimo bei jų terminio stabilumo nustatymo detalės aprašytos toliau pateiktuose pavyzdžiuose. Šie pavyzdžiai, kaip ir baltymų aktyvios struktūros atstatymo (refoldavimo) sistemos su termofiliniais šaperonais Mru. DnaK, Mru. DnaJ ir Mru. GrpE paruošimo ir panaudojimo pavyzdys malatdehidrogenazės aktyvumo atstatymui, neapriboja išradimo apibrėžtyje nurodytos išradimo esmės.

[0033] Termofilinių šaperonų klonavimui pasirinktas bakterinis kamienas Meiothermus ruber, kuris buvo išskirtas iš Kamčiatkos (RU) geizerių. Kamieną maloniai suteikė MBI Fermentas (Vilnius). M. ruber yra gramneigiamos bakterijos, neformuojančios sporų ir turinčios augimo temperatūros optimumą 60-65°C. Chromosominė DNR, išskirta iš M. ruber kamieno buvo restriktuota keliomis restriktazėmis, elektroforetiškai frakcionuota 1% agarozėje ir blotuota su [³²P]-žymėtu M. ruber dnaK geno fragmentu, gautu polimerazinės grandininės reakcijos (PGR) būdu amplifikavus konservatyvią dnaK geno 5'-dalį su degeneruotais pradmenimis, kurie parinkti analizuojant E. coli ir Thermus thermophilus dnaK genų sekas:

[0034] M. ruber chromosominės DNR fragmentai (2,8 ir 0,8kb), gauti naudojant EheI restriktazę, buvo pasirinkti klonavimui. Šie fragmentai buvo išskirti iš preparatyvinės elektroforezės gelio ir liguoti į plazmidės pUC19 Ecll36II taikinį bei transformuoti į E. coli. Gauti klonai pakartotinai hibridizuoti su aukščiau minėtu M. ruber dnaK geno fragmentu ir atrinktos dvi kolonijos, turinčios plazmidės su 2,8 ir 0,8 kb fragmentais. Šios plazmidės (pUC19-TRl ir pUC19-TR2) buvo sekvenuotos. Išanalizavus gautus duomenis paaiškėjo, kad jų fragmentai apima didžiąją dalį M. ruber operono su dnaK, grpE ir dnaJ genais (Fig. 6).

[0035] Nustačius, kad Mru. dnaJ genas plazmidėje pUC19-TRl yra nepilnas, aukščiau aprašytu hibridizacijos būdu buvo identifikuotas dar vienas klonas, turintis plazmidę pUC19-TR3 su Ecll36- Cfr42I fragmentu (2,8 kb). Sekvenavimo duomenys patvirtino, kad plazmidė pUC19-TR3 turi likusią dnaJ geno dalį. Pilna M. ruber dnaK-grpE-dnaJ operono seka pateikta Fig. 4.

[0036] Termofilinių šaperonų Mru . dnaK , MriudnaJ ir Mru . grpE genų ekspresija E . coli Termofilinių šaperonų genai Mru. dnaK, Mru. dnaJ ir Mru. grpE iš plazmidžių pUC19-TRl ir pUC19-TR3 buvo perkelti į ekspresinę plazmidę pET21b(+) (Novagen, publikuota patente US4952496). Tai buvo atlikta PGR metodu į kiekvieno geno 5'-galinę dalį įvedus NdeI taikinius, o į 3'-galinę dalį - BamHI taikinius. Taip modifikuoti atitinkamų genų fragmentai buvo liguoti su pET21b(+) plazmidę, perskelta per Ndel- BamHl taikinius. Atrinktos plazmidės pET21-Mru-dnaK, pET21-Mru-dnaJ ir pET21-Mru-grpE toliau transformuotos į ekspresinį kamieną E. coli BL(DE3). Atrinktos kolonijos, kurios ekspresuoja didelį kiekį (10-20% nuo visų ląstelinių baltymų) rekombinantinio termofilinio šaperono po indukcijos 1 mM izopropil-P-D-tiogalaktopiranozidu (IPTG). Tokie kamienai tinka tolimesniam termofilinių šaperonų gryninimui, gaunant pakankamus jų kiekius baltymų refoldavimui in vitro tirti.

[0037] Rekombinantinių šaperonų Mru.DnaK ir Mru.DnaJ gryninimas analitiniais kiekiais buvo atliekamas tokiu būdu. Kamienai E. coli BL(DE3) pET21-Mru.dnaK ir E. coli BL(DE3) pET21-Mru.dnaJ buvo auginami iki optinio tankio OD_6oonm=0,6-l,0 ir indukuojami 2-3 vai. pridėjus lmM IPTG. Gauta biomasė nucentrifuguojama, resuspenduojama lOmM TRIS-HCl, pH 7.8, lmM EDTA buferyje ir ardoma ultragarsu. Po lizato centrifugavimo supernatantas su Mru .DnaJ skiedžiamas 10 kartų su 20mM CH₃COONa, pH 5.6 buferiu. Tirpalas užnešamas ant lml SP-Sefarozės Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) kolonėlės (chromatografinė sistema AKTA explorer) ir leidžiamas 0-1M NaCl gradientas 20mM CH_jCOONa, pH 5.6 buferyje. Mru.DnaK atveju supernatantas buvo skiedžiamas 10 kartu 50mM TRIS-HCl, pH 8.5 buferyje. Tirpalas užnešamas ant lml Q-Sefarozės Fast Flow kolonėlės ir leidžiamas 0-1M NaCl gradientas 50mM TRIS-HCl, pH 8.5 buferis. Išanalizavus gautas frakcijas ant SDS-PAA gelio, atrenkamos tos, kurios turi švaresnius A/rw.DnaK arba Mru .DnaJ baltymus.

[0038] Rekombinantinių Mru . DnaK, Mru . DnaJ ir MuGrpE gryninimas preparatyviniais kiekiais atliekamas taikant individualų metodą kiekvienam iš baltymų, priklaisomai nuo jo fiziko-cheminių savybių, tokių kaip izoelektrinis taškas (pi), hidrofobiškumas, histidino aminorūgščių skaičius ir pozicija.

[0039] Mru . DnaK (pi 5,17) gryninamas per tris chromatografines stadijas: ant DEAE-Sefarozės, ant Fenil-Sefarozės ir ant Sefakrilo S-300 kolonėlių (Fig. 7).

[0040] A/rw.DnaJ (pi 9,22) buvo išgrynintas per dvi chromatografines stadijas: ant LRY2KT-Sefarozės (sorbentas su biomimetiniu dažu - šviesai atsparus geltonasis, turintis vario jonų) ir ant CM-Sefarozės (Fig. 8).

[0041] Afru.GrpE (pi 4,86) buvo gryninamas per tris chromatografines stadijas: ant DEAE-Sefarozės, ant Oktil-Sefarozės ir Sefakrilo S-100 (Fig. 9). Pritaikyta gryninimo metodologija davė patenkinamą rezultatą - daugiau negu 85% švarumą M . ruber šaperonų Mru . DnaK, Mru . DnaJ, Mru . GrpE preparatams.

[0042] Šaperonų Mm. DnaK ir Mru . DnaJ terminio stabilumo nustatymas Šaperonų A/r«.DnaK ir Mru.DnaJ terminis atsparumas tikrintas indukuotų biomasių ultragarsiniuose nuskaidrintuose ekstraktuose. E.coli ląstelės, ekspresuojančios Mru . DnaJ (Fig. 10, takeliai 2-7) ir Mru . DnaK (Fig. 10, takeliai 8, 9), buvo nucentrifuguotos ir resuspenduotos 10 mM TRIS-HCl, 1 mM EDTA buferiuose su pH reikšmėmis 7.4; 7.8; 8.2 (25°C). Ląstelės suardytos ultragarsu ir tirpi lizato frakcija inkubuota 37°C 10 min., perkelta į 65°C 10 min. ir nucentrifuguota. Tirpi frakcija (S) ir nuosėdos (P) analizuotos elektroforetiškai

[0043] 12% SDS-PAA gelyje. Fig. 10 takelis 1 - baltymo molekulinės masės standartai (iš viršaus: 116,66.2,45,35,25, 18.4,14.4 kDa).

[0044] Pastebėta, kad rekombinantinio Mru. DnaJ terminis stabilumas didėja kylant buferio pH reikšmei (Fig. 10). Esant pH 7.4 M_h/.DnaJ išsėda pilnai, o jau esant pH 7.8 jis tampa pusiau tirpus. Baltymas Mru. DnaJ lieka termoatsparus kai pH yra 8.2 (Fig. 10, takeliai 6 ir 7). Rekombinantinio Mru. DnaK terminis atsparumas yra nepriklausomas nuo pH. Šis baltymas buvo tirpus pH intervale nuo 7.4 iki 8.2 (Fig. 10, takeliai 8 ir 9).

[0045] Baltymų aktyvios struktūros atstatymo ( refoldavimo) sistemos su termofiliniais šaperonais Mru . DnaK, Mr«. DnaJ ir Mru . GrpE paruošimas ir panaudojimas malatdehidrogenazės aktyvumo atstatymui.

[0046] Šaperonų aktyvumas buvo nustatinėjamas tokiu būdu. 3.8 ( J.M mitochondrinės malat-dehidrogenazės (MDH) buvo denatūruota buferyje su 3 M guanidino hidrochlorido 1 vai. 37°C temperatūroje ir tada praskiesta 30 kartų (iki 0.127 įiM) foldavimo buferyje (25 mM TRIS-HC1, pH 7.5, 0.25 M Na₂S0₄, 150 mM KC1, 20 mM Mg(CH₃COO)₂, 3 mM DTT) su šaperonais 3.5įiM Mru.DnaK, 3.5jaM Mra.DnaJ ir 0.35(iM Mru.GrpE arba su tokias pat kiekiais E. coli rekombinantinių šaperonų DnaK, DnaJ ir GrpE. Mišinys buvo inkubuojamas 5 min. 37°C temperatūroje, o tada pridedama 10 mM adenozintrifosfato (ATF). Mitochondrinės malatdehidrogenazės aktyvumo atstatymas (reaktyvacija) buvo matuojamas 10 min. intervalais 2 vai. bėgyje. MDH aktyvumas buvo matuojamas pagal žinomą metodiką (Sanchez SA, Hazlett TL, Brunet JU, Jameson DM, 1998, Aggregation statės of mitochondrial malate dehydrogenase. Protein Sci 7: 2184-2189). Kontrolinis mėginys su denatūruota MDH buvo inkubuojamas be šaperonų, tai MDH spontaninės reaktyvacijos mėginys.

[0047] Iš Fig. 11 grafiko akivaizdu, kad mėginyje su M. ruber šaperonais MDH refoldavimas vyksta apie 10 kartų intensyviau, negu spontaninė MDH reaktyvacija ir apie 3 kartus intensyviau nei naudojant analogišką sistemą su E. coli šaperonais. Taigi galima teigti, kad baltymų aktyvios struktūros atstatymo (refoldavimo) sistema, naudojant rekombinantinius šaperoninius M. ruber baltymus pagal išradimą yra pranašesnė, lyginant su analogiškais baltymais iš E. coli.

Apibrėžtis

1. Baltymų aktyvios struktūros atstatymo (refoldavimo) baltymas Mru. DnaK - klonuotas termofilinis šaperonas, kurio aminorūgščių seka pateikta Fig. 1.

2. Baltymų aktyvios struktūros atstatatymo (refoldavimo) baltymas MuGrpE - klonuotas termofilinis šaperonas, kurio aminorūgščių seka pateikta Fig. 2.

3. Baltymų aktyvios struktūros atstatymo (refoldavimo) baltymas Mru.DnaJ - klonuotas termofilinis šaperonas, kurio aminorūgščių seka pateikta Fig. 3.

4. Baltymų aktyvios struktūros atstatymo (refoldavimo) šaperonai pagal 1-3 punktus, pasižymintys padidintu terminiu stabilumu 62-65°C temperatūroje pH 8,2-8,5 intervale.

5. M. ruber operonas, koduojantis Mru. dnaK, Mru. dnaJ, Mru. grpE genus, kurio nukleotidų seka pateikta Fig. 4.

6. Rekombinantinė plazmidė pUC19-TRl, deponavimo numeris BI-TR1, bendras ilgis 5500 bazių porų, koduojanti dalį Mru dnaK operono ir susidedanti iš sekančių elementų:EcoRI- HindIII2J tūkst. bazių porų dydžio pUC19 plazmidės fragmento, turinčio geną, apsprendžiantį atsparumą ampicilinui ir pMBl replikono (ori srities);EcoRI- HindlII fragmento 2,8 tūkst. bazių porų dydžio, koduojančio dalį geno Mru. dnaK, visą Mru. grpE ir dalį Mru. dnaJgeno.

7. Rekombinantinė plazmidė pUC19-TR2, deponavimo numeris BI-TR2, bendras ilgis 3500 bazių porų, koduojanti dalį Mru dnaK operono ir susidedanti iš sekančių elementų:EcoRI- HindlII 2,7 tūkst. bazių porų dydžio pUC19 plazmidės fragmento, turinčio geną, apsprendžiantį atsparumą ampicilinui ir pMBl replikono (ori srities);EcoRI- HindlII 0,8 tūkst. bazių porų dydžio fragmento, koduojančio 5'-galinę Mru. dnaK geno dalį ir jo promotorių.

8. Rekombinantinė plazmidė pUC19-TR3, deponavimo numeris BI-TR3, bendras ilgis 5500 bazių porų, koduojanti dalį Mru dnaK operono ir susidedanti iš sekančių elementų:£ c/136II 2,7 tūkst. bazių porų dydžio pUCl9 plazmidės fragmento, turinčio geną, apsprendžiantį atsparumą ampicilinui irpMBl replikono (ori srities);£ c/136II 2,8 tūkst. bazių porų dydžio fragmento, koduojančio dalį geno Mru. grpE ir visą Mru. dnaJ geną.

9. Baltymų aktyvios struktūros atstatymo (refoldavimo) in vitro sistema, turinti praradusį aktyvią struktūrą baltymą, buferį, palaikančias joninę jėgą druskas, disulfidinius baltymo tiltelius redukuojantį agentą, adenozintrifosfatąir šaperonus, besiskirianti tuo, kad tai yra vandeninis tirpalas, šaperonais naudojami klonuoti termofiliniai Mru. DnaK, A/h/.DnaJ ir A/ru.GrpE šaperonai pagal 1-4 punktus, ir sistemos komponentų kiekis nustatomas iš sekančių sąlygų:

10. Baltymų aktyvios struktūros atstatymo in vitro būdas panaudojant šaperonus refoldavimo sistemoje, besiskiriantis tuo, kad denatūruotą baltymą praskiedžia buferiu, pavyzdžiui, TRIS-HC1 pH 7,5 ± 0,1, turinčiu joninę jėgą palaikančių druskų, pavyzdžiui, Na₂S0₄, KC1, Mg(CH3COO) 2, disulfidinių baltymo tiltelių redukavimui prideda ditiotreitolio iki koncentracijos 2-5 (iM, po to prideda termofilinių Mru.DnaK, A/ra.DnaJ ir A/ru.GrpE šaperonų pagal 1-4 punktus mišinį, optimaliai, moliniu santykiu 10:10:1, po inkubavimo 37°C temperatūroje prideda adenozintrifosfato iki koncentracijos 10+1 mM ir išlaiko bent 5 min.

Brėžiniai