[LT] Pateikiami būdai, skirti naujų grandinei specifinių nikuojančių endonukleazių identifikavimui, panaudojant mutagenizuotų restrikcijos endonukleazės genų in vitro atgalinius kryžminimus su jų laukinio tipo atitikmeniu ir gautų nikuojančių endonukleazių identifikavimą, nustatant jų skaidymo aktyvumą ir specifiškumą grandinei. Nikuojančių endonukleazių, identifikuotų šiuo būdu, pavyzdžiai yra NtBsaI ir Nb.BsaI, Nt.BsmAI ir Nb.BsmAI, ir Nt.BsmBI.
[EN] Method are provided for identifying novel strand-specific nicking endonucleases by means of in vitro backcrosses of mutagenized restriction endonucklease genes with their wild -type counterpart and identifying the resulting nicking endonucleases by their cleavage activity and their strand specificity. Examples of nicking endonucleases identified by this method include Nt.Bsa I and Nb.BsaI, Nt.BsmAI and Nb.BsmAI and Nt.BsmBI.
[0001] IŠRADIMO PAGRINDIMAS
[0002] Yra per 240 II tipo restrikcijos endonukleazių, pasižyminčių unikaliu specifiškumu, išskirtų iš bakterinės ir virusinės kilmės šaltinių, kurios yra naudojamos tyrimo ir diagnostikos tikslais. Tačiau tik septyni nikuojantys fermentai yra komerciškai prieinami: N.BstNBI, N.AlwI, N.BbvCIA ir N.BbCIB (NEB katalogas, 2002/2003) (New England Biolabs, Inc.); N.Bpul0I (Fermentas catalog, 2002, Fermentas, Inc., Hanover, MD); ir N.CviQXI (CviNY2A) ir N .CviPII (CviNYSI) Megabase Research Products, Lincoln, NE
[0003] (www.cvienzymes.com).Be šių, aukščiau nurodytų fermentų, yra dar keletas fago koduojamų nikuojančių fermentų, tokių kaip bakteriofago f1 geno II baltymas (gpII), kuris esmingai svarbus virusinės DNR replikacijai. Geno II baltymas sukelia viengrandininį trūkį (+) grandinėje tam, kad prasidėtų riedanti žiedinė replikacija. Jis taip pat dalyvauja liguojant išstumtą (+) grandinę, ko pasėkoje susidaro viengrandininė fago DNR (Geidei ir kt., J. Biol. Chem. 257: 6488-6493 (1982); Higashitani ir kt., J. Mol. Biol. 237: 388-400 (1994)) GpII baltymas ir egzonukleazė III gali būti naudojami kartu sukuriant viengrandininę DNR mutagenezei ir naudojant ją kaip matricą naujos DNR grandininės sintezei in vitro.
[0004] Gamtoje egzistuojantys nikuojantys fermentai N.CviQXI (CviNY2A) ir N.CviPII (CviNYSI) buvo išskirti iš Chlorella algae virusų lizatų, (Zhang, Y. ir kt., Virology 240:366-375 (1988); Xia, Y. ir kt., Nucl. Acids Res. 16:9477-9487 (1988)) ir nikuojančios endonukleazės N.BstNBI ir N.BstSEI buvo išskirtas iš bakterijų (Morgan R.D. ir kt., Bio!. Chem. 381:1123-5 (2000); Abdurashitov ir kt., Mol. Biol. (Mosk) 30: 1261-1267 (1966)) Tam tikras kiekis nikuojančių fermentų taip pat buvo gautas perdarant IIA tipo restrikcijos fermentus (US 6191267; US 6395523; EP 1176204).
[0005] Auksčiau aprašytos nikuojančios endonukleazės plačiai naudojamos genetinėje inžinerijoje (žiūr., pavyzdžiui, US 6660475 ir WO 03/087301). Todėl būtų naudinga turėti prieinamą platesnį įvairaus specifiškumo nikuojančių endonukleazių pasirinkimą. Buvo aprašyti būdai, kaip gauti nikuojančias endonukleazes modifikuojant restrikcijos endonukleazes. Tačiau šie būdai turi tam tikrų apribojimų, kuriuos būtų pageidautina apeiti.
[0006] Pavyzdžiui, Xu Y. ir kt. (Proc. Natl. AcadSci. USA, 98:12990-12995 (2001)) aprašo nikuojančios endonukleazės N.AIWI sukūrimo būdą panaudojant domenų mainus. Šis būdas turi tą trūkumą, kad iš anksto reikia žinoti, kad dimerizacijos domenas bus lokalizuotas tarp AlWI ir homologiško nikuojančio fermento N.BstNBI. Naujai sukurtas fermentas N.AIWI negali formuoti dimero ir nikuoja DNR kaip monomeras; šią savybę jam suteikia domenas, gautas iš N.BstNBI.
[0007] Besnier, C.E. ir Kong, H. EMBO Report 2:782-786 (2001), Kong, H. ir kt. US patentas 6395523, (2002) MlyI variantų gavimui panaudojo sait-nukreiptą mutagenezę. Laukinio tipo fermento dirnerizacijos funkcija buvo panaikinta.
[0008] Stahl F. ir kt. (Proc. Natl. Acad Sci. USA, 93: 6175-80 (1996) aprašė nikuojančios endonuklezės (mikozės), kuri nebuvo specifinė tam tikrai dvigubos DNR grandinei, sukūrimo būdą, Šis būdas apėmė EcoRV mutantų sukūrimą, kurie buvo modifikuoti jų suliejimui panaudojus skirtingas peptidų tags. Po to EcoRV nikuojantis fermentas buvo sukurtas iš subvieneto, pasižyminčio katalitiniu inaktyvumu, ir antrojo subvieneto, nesugebančio jungtis su DNR. Kadangi šie mutantai, sukurti tokiu būdu, savo nikuojančiomis savybėmis nebuvo specifiniai kurios nors DNR grandinės atžvilgiu, jų panaudojimo naudingumas, dirbant su DNR, yra menkesnis.
[0009] Kiti mutagenezės bandymai, skirti EcoRI restrikcijos endonukleazei, taip pat leido sukurti keletą mutantų, kurie labiau nikavo (pasižymėjo viengrandininiu skaidymu) DNR nei skaidė dvigubą DNR. Pavyzdžiui, EcoRI R200C mutantinis baltymas pagamino daugiau nikuotos žiedinės DNR negu wtEcoRI fermentas (Heitman, 1. Ir Medel, P., Proteins: Structure, Functions, and Genetics 7:185-197 (1990)). Ir vėlgi, kadangi šie mutantai nėra specifiniai kurios nors DNR grandinės atžvilgiu, jie nėra plačiai naudojami molekulinės biologijos metodinėms reikmėms.
[0010] Janulaitis A. ir kt. (EP 1176204 Al) aprašė DNR sekai specifinių nikuojančių fermentų gavimo būdą iš IIT tipo restrikcijos endonukleazių. IIT tipui priklauso fermentai, sudaryti iš heterodimerinių subvienetų tokių, kaip BpulOI, BbvCI ir BsII. Sekai specifinį nikuojantį fermentą (nikazę) galima sukurti inaktyvuojant IIT tipo restrikcijos endonukleazės a subvieneto katalitinį aktyvumą ir po to suformuojant heterodimerą su laukinio tipo β subvienetu.
[0011] Heiter D. ir kt. (US patento paraiška 2003-0100094) aprašė BbvCI ir kitų restrikcijos endonukleazių perdarymo į nikuojančius fermentus būdą, kur gauti fermentai atitinka II tipo restrikcijos endonukleazes, turinčias griežtai apibrėžtus ir išsaugotus katalitinius saitus.
[0012] Heitman ir Model aprašo EcoRI restrikcijos endonukleazės atsitiktinės mutagenezės būdą (Heitman, 1. ir Model, P., EMBO J. 9:3369-3378 (1990)). Kaip mutagenas naudojamas nitrozoguanidinas, kuriuo paveikiamos E. coli ląstelės, turinčios ecoR1R geną. ecoR1R geną turinti plazmidė taip pat buvo mutagenizuota perIeidžiant ją per mutatorinį mutD kamieną.
[0013] Buvo išskirti EcoRI variantai (nuliniai mutantai, mažo aktyvumo mutantai, laisvo specifiškumo mutantai ir nikuojantys mutantai).
[0014] Xu ir Schildkraut aprašo atsitiktinės mutagenezės būdą, skirtą bamHIR geno mutagenizacijai, panaudojant hidroksilaminą (Xu, S.-y. ir Schildkraut, J., J Bio!. Chem. 266:4425-4429 (1991)) Buvo išskirti atsitiktinės mutagenezės metu atsiradę BamHI variantai (nuliniai mutantai, mažo aktyvumo mutantai, katalitiniai mutantai, gebantys jungtis su DNR, bet neskaidantys).
[0015] Roberts R.J. ir kt. (Nucl. Acids Res. 31:1805-1812 (2003)) klasifikavo II tipo restrikcijos endonukleazių įvairius potipius. IIA tipo restrikcijos endonukleazės turi asimetrines DNR atpažinimo sekas. Skaidymo vieta gali būti pačios atpažinimo sekos ribose arba už atpažinimo sekų ribų pasroviui. Pavyzdžiu gali būti BsmI (GAA TGC 1 I-I, viršutinės grandinės skaidymas pasroviui viena baze nuo atpažinimo sekos, apatinės grandinės skaidymas pačios atpažinimo sekos ribose), AcH (CCGC -31 -1), BssSI (CACGAG -51 -1) ir BsaI (GGTCTC 115). IIA tipui priklauso lIG tipo, IIH tipo, llS tipo ir IIT tipo restrikcijos endonukleazės, turinčios asimetrinę DNR atpažinimo seką. Daugelis fermentų gali būti daugiau negu vieno potipio. Pavyzdžiui, BsaI yra tiek IIA tipo, tiek ir llS tipo fermentas.
[0016] llS tipo restrikcijos endonukleazės turi asimetrines DNR atpažinimo sekas ir skaido DNR už savo atpažinimo sekų ribų, t.y. skaidymas nuo 1 iki 10 bazių už DNR atpažinimo sekos ribos. Pavyzdžiai: BsmAI (GTCTC 115), BsmBI (CGTCTC 115), FokI (GGATG 9/13) ir SapI (GCTCTTC Y4).
[0017] lIG tipo restrikcijos endonukleazės turi susiliejusius endonukleazės ir metilazės domenus. Todėl lIG tipo fermentai pasižymi ir endonukleaziniu, ir metilaziniu aktyvumais, ir šiuos aktyvumus galima skatinti pridedant AdoMet. lIG tipo fermentų DNR atpažinimo sekos gali būti simetrinės ir asimetrinės. Asimetrinius saitus turi BpmI (CTGGAG 16/14) ir BseRI (GAGGAG 10/8). lIG tipo fermentai gali būti IIA tipo arba llS tipo.
[0018] IIH tipo restrikcijos endonukleazių genetinė sandara panaši į I tipo restrikcijos-modifikacijos sistemą. DNR atpažinimo seka gali būti simetrinė ar asimetrinė. Pavyzdžiai:
[0019] BegI (10/12 CGANsTGC 12/10) (SEQ ID No:43) ir BAEI (10/15 AC N4 GTAYC 1217) (SEQ ID No: 44).
[0020] IIT tipo restrikcijos endonukleazės yra heterodimerai arba tetramerai (2x heterodimerai). DNR atpažinimo seka gali būti simetrinė arba asimetrinė. Pavyzdžiai:
[0021] Bpul0I (CCTNAGC -5/-2), BbvCI (CCTCAGC -51-2) ir BslI (CCNNNNNINNGG).
[0022] Yra per 200 restrikcijos endonukleazių, aprašytų Rebase®. Tarp jų - daugiau nei 79 - IIA tipo restrikcijos endonukleazės, turinčios asimetrines atpažinimo sekas ir unikalų specifiškumą (http://rebase.neb.com/rebaseQ.Dauguma šių restrikcijos-modifikacijos sistemų buvo klonuotos ir ekspresuotos heterologiniuose šeimininkuose (Rebase®). Norėtųsi sukurti bendrą nikuojančių endonukleazių gavimo būdą iš restrikcijos fermentų, turinčių asimetrinį atpažinimo saitą, kad būtų sukurti sekai specifiniai ir grandinei specifiniai nikuojantys fermentai.
[0023] IŠRADIMO ESMĖ
[0024] Išradimą sudaro būdas, skirtas grandinei specifinės nikuojančios endonukleazės sukūrimui, susidedantis iš šių pakopų: (a) pirmosios ląstelių- šeimininkių, neturinčių metilazių apsaugos, populiacijos transformacijos, tam tikslui panaudojant plazmides, turinčias atsitiktinai mutagenizuotą restrikcijos endonukleazės geną; (b) (a) pakopoje gautų transformuotų ląstelių-šeimininkių kultivavimo ir po to atlikto plazrnidžių išskyrimo; (c) (b) pakopoje gauto mutagenizuoto restrikcijos endonukleazės geno ir atitinkamo laukinio tipo restrikcijos endonukleazės geno skaidymo į fragmentus; (d) (c) pakopoje gautų laukinio tipo ir mutagenizuoto restrikcijos endonukleazės fragmentų in vitro atgalinio kryžminimo (hibridinimo) ir liguoto geno gavimo; (e) (d) pakopoje gauto liguoto geno ekspresuojamo baltymo grandinei specifinio nikuojančio aktyvumo nustatymo; ir (f) sukurtos grandinei specifinės nikuojančios endonukleazės identifikavimo.
[0025] Sukurta grandinei specifinė nikuojanti endonukleazė gali nikuoti tik dsDNR (dvigrandininę DNR) ar gali nikuoti DNRlRNR hibridus vienoje arba abiejose grandinėse arba gali nikuoti RNRlRNR dupleksus. Šis būdas leidžia naudoti heterogeninį plazmidžių mišinį arba homogeninį plazmidžių mišinį bet kurį turintį vieną ar daugiau skirtingų tipų restrikcijos endonukleazes arba restrikcijos endonukleazių subvienetus. Mutagenizuoti fragmentai gali būti suskaidyti į du ar daugiau fragmentų. Tačiau atgalinio kryžminimo metu po ligavimo gautas genas turi gebėti ekspresuoti baltymą.
[0026] Aukščiau aprašytoje (c) pakopoje geną skaidyti galima veikiant restrikcijos endonukleazėmis, ir po to gauti geno fragmentai išskiriami agarozės gelyje. Aukščiau aprašytoje (d) pakopoje antroji ląstelių-šeimininkių populiacija yra transformuojama veikiant liguotu genu, ir gauti transformantai (transformuotos ląstelės-šeimininkės) yra apsaugom i nuo ekspresuojamo geno sukeIto skaidymo žalingų poveikių metilinimu, kurį atlieka giminingos ar negiminingos metilazėmis. Po to seka transformantų klonavimas. Šios kolonijos gali būti individualiai ieškomos pagal jų nikuojantį aktyvumą, tam tikslui naudojant superspiralinę DNR kaip substratą. Skryningas gali būti atliekamas naudojant visas ląsteles kultivavimo terpėje arba naudojant ląstelių ekstraktą.
[0027] Šiame išradime DNR, koduojančios nikuojančią endonuklezę, mutacijos vieta ir tipas yra apibrėžti (determinuoti). Ši mutacija gali būti delecija (iškrita), insercija (įtarpas) ar vieno ar daugiau nukleotidų pakaita. Pavyzdžiui, mutagenizuotas genas gali turėti nuo 3 (mažiausiai) iki 600 (daugiausiai) nukleotidų deleciją arba kokią kitą tarpinio dydžio deleciją. Dar daugiau, mutagenizuotas genas gali turėti vieną ar daugybines mutacijas. Mutacijos gali būti sukauptos ekspresuoto baltymo C-terminaliniame arba N-terminaliniame gale, arba abiejuose. Identifikuota mutacija ar mutacijos po to gali būti įterptos site-nukreiptos mutagenezės būdu į restrikcijos endonukleazės izošizomerą ar neošizomerą, Palyginus restrikcijos endonukleazes, izošizomero ar neošizomero amino rūgščių identiškumas gali būti nuo 15% iki 99%. Papildoma mutacija gali būti suteikiama nikuojančiai endonukleazei pagal aukščiau aprašytą būdą arba panaudojant antrą atsitiktinės mutagenezės ciklą, arba naudojant sait-nukreiptą mutagenezę tam, kad būtų pagausintos nikuojančios endonukleazės savybės. Pavyzdžiui, gali būti pageidaujama padidinti nikuojantį aktyvumą, sumažinti dvigubą grandinę skaidantį aktyvumą ir/ar padidinti specifiškumą grandinei.
[0028] Šiame būde nurodytos ląstelės-šeimininkės gali būti prokariotinės ar eukariotinės ląstelės. Kuomet naudojamos prokariotinės ląstelės, ląstelės-šeimininkės gali būti gram-teigiamos ar gram-neigiamos ląstelės, pavyzdžiui, E. coli ląstelės ar Bacillus kamienų ląstelės.
[0029] Šiame išradimo įgyvendinime nikuojanti endonukleazė yra termofilinė nikuojanti endonukleazė. Pavyzdžiui, nikuojanti endonukleazė gali būti gauta iš BsaI, BsmAI ar BsmBI.
[0030] Šiame išradimo įgyvendinime nikuojančios endonukleazės specifiškumas dvigubos DNR grandinei yra determinuotas. Pavyzdžiui, nikuojanti endonukleazė gali būti viršutinės grandinės nikuojanti endonukleazė arba apatinės grandinės nikuojanti endonukleazė.
[0031] Šiame išradimo įgyvendinime pateiktas būdas, kaip sukelti vieną ar daugiau vietai specifinių viengrandininių trūkių prieš tai pasirinktoje dvigubos DNR grandinėje; būdas, apimantis dvigubos DNR skaidymą panaudojant nikuojančią endonukleazę, sukurtą aukščiau aprašytu būdu, naudojant nikuojančiam aktyvumui palankias sąlygas.
[0032] Šiame išradimo įgyvendinime pateiktas būdas, kaip pagausinti (amplifikuoti) taikininę seką, apimantis: (a) viengrandininio nukleino rūgščių fragmento, turinčio taikininę seką, gavimą, kur fragmentas turi 5' galą ir 3' galą; (b) amplifikacijos pradmens nuo grandinės priklausomai amplifikacijai (SDA) pririšimą prie fragmento 3' galo taip, kad pradmuo sudarytų 5' viengrandininę užlaidą, kur amplifikacijos pradmuo turi sintetinės nikuojančios endonukleazės, sukurtos aprašytu būdu, atpažinimo/skaidymo saitą; (c) amplifikacijos pradmens pailginimą fragmente, kai nėra derivatinių ar pakaitinių dezoksinukleozido tri fosfatų ir yra DNR polimerazė, pasižyminti grandinės išstūmimo aktyvumu ir neturinti 5'-3' egzonukleazės aktyvumo, ir esant keturiems dezoksinukleozido trifosfatams; ir (d) amplifikuotos dvigrandininės taikininės sekos skaidymą panaudojant nikuojančią endonukleazę, tęsiančią skaidymą po DNR polimerazės poveikio, tokiu būdu išstumiant pirmąją naujai susintetintą grandinę nuo fragmento ir generuojant antrąjį pagausinimo produktą, susidedantį iš antros naujai sintezuotos grandinės, ir nikuojančio skaidymo, pailginimo ir išstūmimo pakopų kartoj imą gaunant taikininės sekos pagausinimą (amplifikaciją).
[0033] Šiame išradimo įgyvendinime pateiktas būdas, kaip sukurti fermentą, pasižymintį modifikuotu specifiškumu substratui ir aktyvumu, ir apimantis: (a) atsitiktinai mutagenizuotų DNR bibliotekos sukūrimą, kur biblioteka turi vieną ar daugiau genų, koduojančių visą ar dalį mutavusio geno, mutavęs genas yra neaktyvus substrato atžvilgiu ir šis substrato atžvilgiu neaktyvus fermentas turi N-terminalinį ir C-terminalinį galus, kur inaktyvacija įvyksta dėl mutacijos laukinio tipo fermento N-terminaliniame ar C-terminaliniame gale; (b) vieno ar daugiau genų, ekspresuojančių inaktyvuotą endonukleazę, skaidymą į mažiausiai pirmąjį bei antrąjį fragmentus, kur pirmasis fragmentas koduoja fermento C-terminalinį galą, o antrasis fragmentas koduoja fermento N-terminalinį galą; (c) suliejimą (ligavimą) fragmentų, atrinktų iš: pirmojo fragmento ir trečiojo fragmento, koduojančio laukinio tipo fermento N-terminalinį galą; antrojo fragmento su ketvirtuoju fragmentu, koduojančiu laukinio tipo fermento C-terminalinį galą; arba abiejų pirmojo ir antrojo fragmento atitinkamai su trečiuoju ir ketvirtuoju fragmentais; ir (d) liguotos DNR ekspresiją ląstelėje-šeimininkėje.
[0034] Šiame išradimo įgyvendinime pateiktas būdas, kaip pagausinti (amplifikuoti) taikininę nukleino rūgštį, apimantis (a) mažiausiai vienos grandinės nikavimą dvigrandininėje taikininėje nukleino rūgštyje daugelyje vietų, tam tikslui panaudojant nikuojantį fermentą, sukurtą pagal apibrėžties 1 punktą taip, kad pasigamintų mažiausiai du nauji 3' galai; (b) pailginimą (ekstensiją) vieno ar daugiau iš dviejų naujų 3' galų tam tikslui panaudojant DNR polimerazę; (c) (b) pakopoje gauto ekstensijos produkto nikuojantį (viengrandininį) skaidymą; (d) (c) pakopoje gauto nikuojančio skaidymo produkto pailginimą, amplifikuojant bent dalį viengrandininės taikininės nukleino rūgšties.
[0035] Šiame išradimo įgyvendinime pateiktas būdas, kaip greitai atrinkti nikuojančių fermentų variantus, panaudojant ląsteles-šeimininkes ir kultivavimo terpę DNR nikavimo reakcijoje, kai naudojama superspiralinė DNR kaip substratas.
[0036] TRUMPAS FIGŪRŲ APRAŠYMAS
[0037] Fig. 1 parodyta norimo gauti baltymo sukūrimo, skirto vietai specifinių ir grandinei specifinių DNR nikuojančių fermentų gavimui, bendra schema.
[0038] Fig. 2 parodyti DNR nikuojančių variantų skryningo rezultatai, kur panaudotos ląstelių kultūros, gautos per naktį kultivavus mutantus. Panaudojant elektroforezę agarozės gelyje ištirta 40 izoliatų (1-40). # k11 ir #26 izoliatai (11 ir 26 takeliai) rodo nikuojantį aktyvumą. #36 ir #40 izoliatai (36 ir 40 takeliai) rodo tiek nikuojantį, tiek ir dsDNR skaidantį aktyvumą, N, nikuota žiedinė DNR; L, linijinė DNR; S, superspiralinė DNR.
[0039] Fig. 3 parodyti izoliatų nikuojančio aktyvumo, analizuoto elektroforezės agarozės gelyje būdu, skryningo rezultatai.
[0040] Fig. 3A: Nt.BsaI (K150RlR2236G) DNR nikuojantis aktyvumas naudojant superspiralinę DNR kaip substratą. Nt - viršutines grandinės nikavimas. N - nikuota žiedinė DNR; L - linijinė DNR; S - superspiralinė DNR. 1 takelis - 1 kb DNR masės žymuo; 2 - neskiestas ląstelių ekstraktas; 3-10 takelis - ląstelių ekstrakto dukartiniai serijiniai skiedimai; 11 takelis - superspiralinė pUC 19 DNR.
[0041] Fig. 3B: Nt.BsaI (R236D) DNR nikuojantis aktyvumas naudojant superspiralinę DNR kaip substratą. 1 takelis - 1 kb DNR masės žymuo; 2 takelis - neskiestas ląstelių ekstraktas; 3-10 takelis - ląstelių ekstrakto dukartiniai serijiniai skiedimai; 11 takelis - pUC 19 substratas; 12 takelis - N.BstNBI. N - nikuota žiedinė DNR; L -linijinė DNR; S - superspiralinė DNR.
[0042] Fig. 4 parodyta, kaip DNR nikavimo saitas gali būti nustatytas panaudojant run- off sekvenavimą Nt.BsaI (R236D) nikavimo saito nustatymui. 5' GGTCTCNANNNN 3' (SEQ ID NO: 1) 3' CCAGAGNNNNN 5'
[0043] Nikuotos žiedinės DNR produktas buvo gelyje išvalytas ir pateiktas "run-off'sekvenavimui. Taq DNR polimerazė prikabina adenino (A) bazę prie DNR galo (nuo matricos nepriklausomas DNR transferazinis aktyvumas).
[0044] Fig. 5 parodyti izoliatų nikuojančio aktyvumo skryningo rezultatai.
[0045] Fig. 5A: Nt.BsaI DNR nikuojantis aktyvumas naudojant kaip substratą superspiralinę DNR. Nb rodo nikuojantį aktyvumą apatinei grandinei. 1 takelis - 1 kb DNR masės žymuo; 2-9 takelis - ląstelių ekstrakto dukartiniai serijiniai skiedimai nuo 4 iki 512; 10 takelis -nN.BstNBI; 11 takelis -pUCI9 DNR; 12 takelis -BsaI skaidyta DNR. N - nikuota žiedinė DNR; L -linijinė DNR; S - superspiralinė DNR.
[0046] 5B paveikslas: DNR nikuojančio aktyvumo tyrimai naudojant ląstelių ekstrakto 10-kartinius serijinius skiedimus. 1 takelis - I kb DNR masės žymuo; 2-6 takelis - BsaI variantas N441D1R442G; 7-11 - BsaI L1(446-544); 12-16 - BsaIL1(440-544); 17-19 takelis - ekstraktai, paruošti iš ląstelių, turinčių pUC 19. 20 takelis - Bsal skaidyta pUCI9. 1, 7, 12, ir 17 takelis-neskiesti ląstelių ekstraktai; 3-6, 8-11, 13-16, 18-19 - IO-kartiniai serijiniai ląstelių ekstraktų skiedimai.
[0047] Fig. 6 parodyta, kaip run-offsekvenavimas buvo panaudotas Nb.BsaI nikavimo saito nustatymui.
[0048] 5' GGTCTCNNNNN 3' (SEQ ID NO: 1)
[0049] 3' CCAGAGNNNNN"\ 5'
[0050] Nikuota žiedinė DNR buvo gelyje išvalyta ir pateikta run-off sekvenavimui. Tag DNR polimerazė prikabina adenino (A) bazę prie DNR galo (nuo matricos nepriklausomas DNR transferazinis aktyvumas).
[0051] Fig. 7 parodytos amino rūgščių pakaitų vietos, esančios BsaI, kurių dėka įgytas DNR viengrandininio skaidymo aktyvumas. * rodo nenupieštas aminorūgščių pakaitų vietas. Pilno ilgio BsaI endonukleazė turi 544 aminorūgščių liekanas. L1 rodo iškritas.
[0052] Fig. 8 parodytas BsaI ir BsmBI restrikcijos endonukleazių aminorūgščių sekų išsidėstymo palyginimas, gautas naudojant GCG "Bestfit" programą. Kritinės Arg ® liekanos pažymėtos užjuodintai ir pabrauktos. Dviejų baltymų identiškos aminorūgščių liekanos pažymėtos tiesia linija. Panašių ypatumų aminorūgščių liekanos pažymėtos 1 arba 2 taškeliais. Viršutinė seka = BsmBI aminorūgščių sekai (SEQ ID NO:31). Apatinė seka = BsaI aminorūgščių sekai (SEQ ID NO:32).
[0053] Fig. 9 parodyti izoliatų nikuojančios aktyvumo skryningo rezultatai, gauti elektroforezės agarozės gelyje būdu.
[0054] Fig. 9A: Nb.BsmBI (R438D)DNR nikuojantis aktyvumas. 1 takelis - I kb DNR masės žymuo; 2 takelis - Ix ląstelių ekstraktas; 3-9 takelis - ląstelių ekstrakto 2-kartiniai serijiniai skiedimai(1/2, Y4, 1/6, 1/8, 1/16, 1/32, 1164, ir 1/128); 10 takelis - pBR322 DNR; 11 takelis-BsmBI skaidyta pBR322 DNR; 12 takelis -N.BstNBI nikuota pBR322. N - nikuota žiedinė DNR; L - linijinė DNR; S - superspiralinė DNR.
[0055] Fig. 10 parodyta, kaip kaip run-off sekvenavimas gali būti panaudotas Nt.BsmBI nikavimo saito nustatymui.
[0056] Nt.BsmBI nikavimo saitas:
[0057] 5' CGTCTCNANNNN
[0058] 3' (SEQ ID NO: 2)
[0059] 3' GCAGAGNNNNN 5'
[0060] Fig. 11 parodyta, kaip run-off sekvenavimas gali būti panaudotas Nb.BsmBI nikavimo saito nustatymui.
[0061] Nb.BsmBI nikavimo saitas:
[0062] 5' CGTCTCNNNNN 3' (SEQ ID NO: 2)
[0063] 3' GCAGAGNNNNN 5'
[0064] Fig. 12 parodytas BsaI ir BsmAI restrikcijos endonukleazių amino rūgščių sekų išsidėstymo palyginimas, gautas naudojant GCG "Bestfit" programą. Kritinės Arg (R) liekanos pažymėtos užjuodintai ir pabrauktos. Dviejų baltymų identiškos aminorūgščių liekanos pažymėtos tiesia linija. Identiškos abiem baltymams aminorūgščių liekanos pažymėtos tiesia linija. Panašių ypatumų aminorūgščių liekanos pažymėtos 1 arba 2 taškeliais. Viršutinė seka = BsmAI aminorūgščių sekai (SEQ ID NO:37). Apatinė seka = BsaI amino rūgščių sekai (SEQ ID NO:37).
[0065] Fig. 13 parodyti izoliatų nikuojančios aktyvumo skryningo rezultatai, gauti elektroforezės agarozės gelyje būdu.
[0066] Fig. 13A: Nt.BsmAI (R221D)DNR nikuojantis aktyvumas. 1 takelis - 1 kb DNR masės žymuo; 2, 3 takelis - μ1, ląstelių ekstraktas; 3-9 takelis – μ1 , ląstelių ekstrakto 2-kartiniai serijiniai skiedimai; 10 takelis - neskaidytos pBR322 DNR substratas; 11 takelis -BsmAI skaidymas; 12 takelis -N .BstNBI.
[0067] Fig. 13B: Nb.BsmAI (N415DfR416G) DNR nikuojantis aktyvumas. 1 takelis - 1 kb DNR masės žymuo; 2, 3 takelis - μ1, ląstelių ekstraktas; 3-9 takelis - μ1, ląstelių ekstrakto 2-kartiniai serijiniai skiedimai; 10 takelis - neskaidytos pBR322 DNR substratas; 11 takelis - BsmAI skaidymas; 12 takelis -N.BstNBI.
[0068] Fig. 14 parodyta, kaip run-off sekvenavimas gali būti panaudotas Nt.BsmAI (R221 D) nikavimo saito nustatymui.
[0069] Nt.BsmAI nikavimo saitas:
[0070] 5' GTCTCNANNNN 3' (SEQ ID NO: 3)
[0071] 3' CAGAGNNNNN 5'
[0072] Fig. 15 parodyta, kaip run-off sekvenavimas gali būti panaudotas Nb.BsmAI. nikavimo saito nustatymui.
[0073] BsmAI nikavimo saitas:
[0074] 5' GTCTCNNNNN 3' (SEQ ID NO: 3)
[0075] 3' CAGAGNNNNNA 5'
[0076] Fig. 16 parodytas N.BsmAI variantų, išskirtų panaudojant atsitiktinę mutagenezę, nikuojantis aktyvumas ir jų genetinis skryningas elektroforezės agarozės gelyje būdu. 2-4 takelis - N.BsmAI izoliato #40 Ix, 1/10, 1/100 ląstelių ekstrakto skiedimai; 5-7 takelis - N.BsmAI izoliato #48 lx, lilO, 11100 ląstelių ekstrakto skiedimai; 8-10 takelis - N.BsmAI izoliato #55 Ix, 1/10, 11100 ląstelių ekstrakto skiedimai; 11-13 takelis - N.BsmAI izoliato # 10 1 I x, 1/10, 1/100 ląstelių ekstrakto skiedimai; 14-16 takelis - N.BsmAI izoliato # 197, 1 x, 1110, 1/100 ląstelių ekstrakto skiedimai; 17 takelis - pBR322 DNR; 18 takelis - BsmAI skaidyta pBR322; 19 takelis - N.BstNBI nikuota pBR322.
[0077] DETALUS IŠRADIMO APRAŠYMAS
[0078] Išradime aprašyta sukūrimo būdo strategija apima restrikcijos endonukleazės atsitiktinę mutagenezę ir mutantų rinkinio (bibliotekos) sukūrimą. Strategijos pavyzdys gali būti geno, koduojančio IIAIIIS tipo restrikcijos endonukleazes, turinčias asimetrines atpažinimo sekas, panaudojimas. Svarbu, kad naudojant šį būdą, galima kurti nikuojančias endonukleazes be išankstinio baltymo sandaros ir aktyvių saitų žinojimo. Tuo atveju, jei mutacijos inaktyvuoja restrikcijos endonukleazės dvigubą DNR skaidantį aktyvumą, tai bet kuriam iš fermentų nebėra apribojimų dėl mutacijos padėties pirmenybės. Restrikcijos endonukleazės skaido dsDNR (dvigrandininę DNR) ir yra toksiškos ląstelėms, stokojančioms fermento skaidymo saitų apsauginio metilinimo. Todėl, kuomet mutantinių restrikcijos endonukleazių genų rinkinys (biblioteka) transformacijos būdu yra pernešamas į šeimininkę, neturinčią savosios DNR apsauginės modifikacijos aktyvumo, tokios ląstelės po transformacijos DNR, koduojančia aktyvias restrikcijos endonukleazes, nebeišgyvena ir to pasėkoje visi likę genai, koduojantys labai aktyvius alelius, yra pašalinami iš mutantų pulo.
[0079] Po to gauti endonukleazių genų mutantiniai ir laukinio tipo pulai yra restrikciškai skaidomi tam, kad būtų gauti endonukleazių genų fragmentai. Nors pagal išradimo aprašymą galima mutantinius ar laukinio tipo endonukleazių genus skaidyti į daugiau nei du fragmentus, tačiau labiau pageidautinas yra endonukleazės geno skaidymas į du fragmentus. Genas gali būti suskaidytas panaudojant restrikcijos endonukleazę ir suskyla į dvi dalis, kur šių dalių procentinis santykis gali svyruoti nuo 5/95 iki 50/50, pavyzdžiui, 50/50, 55/45, 60/40, 65/35, ar 70/30.
[0080] Mutantinių ar laukinio tipo genų skaidymo saito lokalizacija gali varijuoti nuo centrinės padėties, kuomet skaidant gaunami du maždaug vienodo dydžio fragmentai, iki asimetrinės padėties, kuomet skaidant gaunami du skirtingo dydžio fragmentai. Tačiau pageidautina, kad fragmente išliktų nikavimo ar jungimosi specifiškumo domenai. Tokiu būdu, labiau pageidautina yra skaidymo vietos centrinė padėtis nei periferinė.
[0081] Po to mutantinis fragmentas yra rekombinuojamas arba liguojamas su laukinio tipo fragmentu, kad būtų gautas genas, koduojantis veiklią nikuojančią endonuklezę. Vienas iš privalumų, gaunamų sukūrus laukinio tipo ir mutagenizuotų fragmentų pulą, yra tai, kad tuo sumažinamas mutacijų poveikis endonukleazės aktyvumui ir leidžiama endonukleazės reaktyvacija. Būdo aprašyme pirmenybė teikiama tam, kad in vitro rekombinacija atliekama po restrikcijos endonukleazės atsitiktinės mutagenezės, kur beveik pusė mutagenizuotų (inaktyvuotų) alelių ir laukinio tipo (wt) koduojančių sekų yra rekombinuojami in vitro restrikcijos fragmento mainų ir ligavimo būdu.
[0082] Ląstelė-šeimininkė, apsaugota modifikuojant, yra transformuojama, panaudojant liguotą DNR, kuri geriau, kad būtų plazmidėje arba vektoriuje. Svarbu, kad čia parodyta, kad visa ląstelių kultūra (ląstelės plius kultivavimo terpė) arba ląstelių lizatai gali būti tiriami skryningo būdu ieškant individualių transformantų DNR nikuojančio aktyvumo, kad būtų išgauti norimi kandidatai. Mutantinius alelius galima sekvenuoti ir identifikuoti genetines mutacijas ir aminorūgščių pakaitas. Papildomai, optimizuoto nikuojančio aktyvumo variantai gali būti sukurti panaudojant sa it-nukreiptą mutagenezę tų liekanų, kurios prieš tai skryningo metu buvo identifikuotos.
[0083] Hibridinė restrikcijos endonukleazė yra atrenkama pagal tai, kaip ji esminiai sugeba skaidyti specifinėje vietoje ir/arba pagal jos skaidymo specifiškumą grandinei. Nikuojančio skaidymo tikslu nebūtina, kad dvigubos DNR 100% tik viena grandinė būtų skaidoma, nei, kad tik 0% antrosios grandinės būtų skaidoma. Tačiau pageidautina, kad būtų pasiektas kuo didesnis nikuojančio skaidymo aktyvumo procentas, toks kaip 95% ar daugiau.
[0084] Sekantys terminai yra aprašyti, atsižvelgiant į jų naudojimą išradimo aprašymo pirmenybiniuose variantuose.
[0085] Terminu "sintetinė nikuojanti endonukleazė" nurodoma modifikuota rekombinantinė nikuojanti endonukleazė, kuri yra fragmentų mainų tarp DNR, koduojančios laukinio tipo ir mutagenizuotą restrikcijos endonukleazę, produktas. Sintetinė nikuojanti endonukleazė skiriasi nuo gamtinio nikuojančio antrininko mažiausiai viena aminorūgštimi. Sintetinė nikuojanti endonukleazė gali būti toliau skiriama nuo nikuojančios endonukleazės, sukurtos pagal būdą, aprašytą US patento paraiškoje 2003-148275, atsitiktine mutacija fermento C-gale, dar tiksliau, iškritos (delecijos) mutacija C-gale aa tarpiniame rajone.
[0086] Terminu baltymo "C-terminalinis galas" nurodoma pusė baltymo sekų, prasidedančių nuo paskutinės C-terminalinės aminorūgšties. Panašiai, N-terminalinis galas atitinka pusei baltymo sekų, prasidedančių nuo paskutinės N-terminalinės aminorūgšties.
[0087] Terminu "mutacija" nurodoma iškrita (delecija), įtarpa (insercija) aa aminorūgščių pakaita. Mutacija gali apimti vieną aa daugiau amino rūgščių tam tikroje baltymo vietoje ir, be to, tai gali nutikti ir daugelyje vietų.
[0088] Terminu "genas" nurodoma nukleino rūgščių seka, koduojanti baltymą arba peptidą. Terminu "restrikcijos endonukleazė" nurodoma atitinkamame kontekste minimi aktyvūs, neaktyvūs fermentai.
[0089] Terminu "inaktyvuota", kai naudojamas restrikcijos endonukleazių atžvilgiu, nurodomos restrikcijos endonukleazės, kurios nėra toksiškos ląstelėms-šeimininkėms, turinčioms nemodifikuotą DNR.
[0090] Žemiau pateikiamas nikuojančių endonukleazių sukūrimo būdo pirmenybinės eigos aprašymas.
[0091] 1. Panaudojant restrikcijos endonukleazės geno atsitiktinę mutagenezę, sukuriamas mutantinių endonukleazių rinkinys (biblioteka), tam tikslui panaudojant, pavyzdžiui, linkusią klysti atvirkštinę POR. Mutagenizuota DNR yra transformuojama į E. coli apsauginių metilazių nebuvimo sąlygomis. DNR iš išgyvenusių kolonijų yra surenkama ir amplifikuojama (pagausinama) tam, kad būtų sukurtas mutantinių plazmidžių, turinčių inaktyvuoų endonuklezių genus, rinkinys (biblioteka). Klonuoti endonukleazių genai, esantys išgyvenusiose ląstelėse, funkciniu požiūriu yra neveiklūs, apie tai galima spręsti iš ląstelių išgyvenimo nesant apsauginio metilinimo.
[0092] 2. In vitro atgalinis kryžminimas yra atliekamas su laukinio tipo genu, kur fragmentai iš mutagenizuoto pulo pakeičia atitinkamą geno laukinio tipo segmentą. Tai galima pasiekti: restrikcinio skaidymo būdu padalinant mutagenizuotą geną į du fragmentus; išvalant restrikcijos fragmentus gelyje; liguojant mutagenizuotą N-terminalinę koduojančią seką su laukinio tipo C-terminaline koduojančia seka; ir transformuojant liguotą DNR į E. coli kaip šeimininkę esant apsauginėms metilazėms (gimininga ir negimininga metilazė).
[0093] 3. Nikuojančių endonukleazių aptikimui atliekamas skryningas. Pavyzdžiui, individualių transformantų ląstelių kultūrų ar ląstelių ekstraktų nikuojančių fermentų aktyvumas gali būti nustatytas panaudojant atitinkamus DNR substratus, tokius kaip superspiralinė DNR.
[0094] 4. Nikuojančio fermento aktyvumo optimizacija gali būti pasiekta naudojant jame identifikuotų aminorūgščių sait-nukreiptą mutagenezę, nurodytą (3). Tuo būdu galima gauti variantus, turinčius skirtingas aminorūgščių pakaitas ir pasižyminčius optimizuotu nikuojančio fermento aktyvumu ir minimaliu dvigrandininiu DNR skaidymu. Gali būti identifikuotos giminingų endonukleazių aminorūgščių liekanos, kurios po taikininės mutagenezės predeterminuotoje pozicijoje įtakoja nikuojantį aktyvumą, ir tokiu būdu sukuriamas aukštesnės kokybės nikuojantis fermentas.
[0095] Aminorūgščių pakaitai, paveikiantys nikuojantį aktyvumą, nurodyti (3) ir (4) aukščiau, gali būti įterpti į izošizomerus, neošizomerus ar fermentus, turinčius giminingą atpažinimo seką ir panašią aminorūgščių sekų sudėtį.
[0096] Aukščiau aprašyti būdai buvo panaudoti nikuojančios endonukleazės sukūrimui iš llS tipo restrikcijos endonukleazės BsaI (1 pavyzdys). BsaI variantai buvo išskirti ir nustatyti aminorūgščių pakaitai. Rasta, kad šie variantai pasižymi nikuojančiu aktyvumu, kuris daugiausia pasireiškia sukeldamas trūkius dvigubos DNR viršutinėje ar apatinėje grandinėje (viršutinę ir apatinę grandinę nikuojantys fermentai buvo pavadinti atitinkamai Nt.BsaI ir Nb.BsaI).
[0097] Atitinkami aminorūgščių pakaitai buvo įterpti į llS tipo restrikcijos endonukleazes BsmBI ir BsmAI, turinčias panašias DNR atpažinimo sekas ir taip pat panašias aminorūgščių sekas. 2 pavyzdyje buvo išskirti BsmBI nikuojantys fermentai, kurie daugiausiai sukeldavo trūkius viršutinėje ar apatinėje grandinėje (viršutinę ir apatinę grandinę nikuojantys fermentai buvo pavadinti atitinkamai Nt.BsmBI ir Nb.BsmBI). Nt.BsmBI ir Nb.BsmBI fermentai buvo panašiai sukurti panaudojant sait-nukreiptą mutagenezę, pagrįstą žiniomis apie N.BsaI nikuojančių variantų mutacijas. Be to, 3 pavyzdyje N .BsmAI variantai buvo išskirti panaudojant aukščiau aprašytą sait-nukreiptą mutagenezę ir genetinio skryningo metodą,
[0098] Atsitiktinė mutagenezė
[0099] Atsitiktinė mutagenezė gali būti pasiekta panaudojant bet kurį žinomą metodą (Heitman, J. ir Model, P., EMBO J. 9:3369-3378 (1990)) Pavyzdžiui, restrikcijos endonukleazės genas gali būti mutagenizuotas veikiant cheminiu mutagenu (natrio bisulfitu, NH20H, nitrozoguanidinu ir kt.), ar paveikiant mutatoriniu kamienu (MutD/MutH/MutS', pasižyminčiu klaidingo poravimo DNR reparacijos defektu) arba veikiant ląsteles, turinčias taikininį geną UV arba y-spinduliuote, arba paveikiant kamienu, kurio DNR polimerazė pasižymi taisyklingo skaitymo defektu. Kaip alternatyvą kiekvienas, mokantis atitinkamą metodą, gali panaudoti Ala skenavimą pakeičiant IIA/IIS tipo endonukleazės baltyme svarbias liekanas, tokias kaip Asp, Glu, Lys, Arg liekanas, į Ala, ir po to atliekant mutantinių ląstelių ekstraktų DNR nikuojančio aktyvumo skryningą. Taip pat galima mutagenizuoti taikininį geną atvirkštinės PGR būdu, linkusios klysti PGR būdu ar kitais, PGR pagrįstais mutagenezės metodais, panaudojant juos po vieną ar derinant, liguoti PGR produktą su klonavimo vektoriumi ir tada transformuoti liguotą DNR i šeimininkę tam, kad būtų sukurtas mutantinių plazmidžių DNR rinkinys (biblioteka).
[0100] Mutagenizuotos DNR klonavimas ir ekspresijos analizė
[0101] Po POR mutagenezės mutagenizuota plazmidinė DNR gali būti paveikta DpnI, skaidančiu Dam-metilintą matricinę DNR. Po to DNR yra transformuojama į E. coli kaip į ekspresijos šeimininkę giminingų ar negiminingų metilazių apsaugos nebuvimo sąlygomis. Aktyvūs mutantai, pasižymintys dsDNR skaidymo aktyvumu, yra eliminuojami, kadangi jie dėl didelio DNR pakenkimo užmuša šeimininkę. Mažo aktyvumo mutantai, nuliniai mutantai, nikavimo mutantai, mutantai su skaidymo defektu ir galintys jungtis atsiduria tarp išgyvenusių transformantų. Visi transformantai yra surenkami, amplifikuojami ir paruošiama plazmidinė DNR tam, kad būtų sukurtas plazmidinės DNR rinkinys (biblioteka). Kaip alternatyvą galima panaudoti individualių transformantų nikuojančio aktyvumo skryningą ląstelių kultūrose ar ląstelių ekstraktuose tam tikslui naudojant aukšto ištisinio skryningo sistemą.
[0102] Mutagenizuoto geno skaidymas ir rekombinacija su skaidyto laukinio tipo geno fragmentu
[0103] Mutagenizuotas genas gali būti suskaidytas į du ar daugiau fragmentų ir atgaliniai sukryžmintas. Vienas būdas tai atlikti yra restrikcijos fragmentų mainai ir kitas būdas - panaudoti POR. Plazmidės DNR yra skaidoma panaudojant dvi restrikcijos endonukleazes, vienas fermentas skaido endonukleazės geną į norimus fragmentus ir kitas fermentas skaido vektorių (pageidautina, kad tai būtų plazmidės replikacijos rajone). Tie patys fermentai taip pat skaido laukinio tipo (wt) plazmidę į fragmentus. Skaidymo saitas restrikcijos gene nebūtinai turi būti tiksliai endonukleazės geno viduryje. Tikslus skaidymo taškas priklauso nuo esamų restrikcijos saitų pačiame gene. Po restrikcinio skaidymo restrikcijos fragmentai yra išvalomi gelyje panaudojant žemo lydymosi agarozės gelį. wt N-terminalinė koduojanti seka yra jungiama su mutagenizuota C-terminaline koduojančia seka. Atitinkamai, mutagenizuota N-terminalinė koduojanti seka yra jungiama su mutagenizuota wtC-terminaline koduojančia seka. DNR fragmentai yra liguojami ir pernešami į ekspresijos šeimininkę apsauginio metilinimo sąlygomis, esant giminingai ar negiminingai metilazei. Jeigu nikuojančio fermento aktyvumas nėra letaius šeimininkei arba, jeigu nikuojančio fermento ekspresija yra labai kontroliuojama (represuota), gali ir nereikėti metilazių apsaugos. Elektroporacija - tai pirmenybinis transformacijos atlikimo būdas. Tačiau, transformacijai taip pat galima naudoti ir didelio efektyvumo chemiškai kompetentingas ląsteles.
[0104] Atgalinio kryžminimo su wt koduojančia seka alternatyvus metodas yra lokalizuotos atsitiktinės mutagenezės būdas, kurią atlikus liguojamas, pakeičiant wt restrikcijos fragmentą, mutagenizuotas DNR fragmentas. Be to, galima mutagenizuoti dalį koduojančios sekos linkusią klysti PGR būdu ir po to liguoti mutagenizuotą fragmentą prie likusio wt DNR fragmento.
[0105] Nikuojančio aktyvumo įvertinimas
[0106] Individualūs transformantai gali būti kultivuojami per naktį kaip mažos apimties kultūra (pavyzdžiui, 1-10 m/s). Į ląstelių kultūrą plazmidžių atrankai pridedama atitinkamų antibiotikų. Visa ląstelių kultūra (ląstelės plius terpė) yra naudojama tiesiogiai vertinant individualių mutantų nikuojantį aktyvumą panaudojant superspiralinę DNR kaip substratą, Kai kurios E. coli ląstelės yra lizuojamos ir jų fermentai išlaisvinami į reakcijos mišinį, Kaip alternatyva, ląstelių nuosėdas galima resuspenduoti ultragarsinio ardymo ar lizės buferyje. Ląsteles galima lizuoti ultragarsu, veikiant lizozimu, detergentu ar užšaldymu-atšildymu, Kuomet ląstelių kultūroje aptinkamas nikuojantis aktyvumas, po to nikuojantį aktyvumą galima patvirtinti panaudojant ultragarsu suardytus ir nuskaidrintus ląstelių ekstraktus.
[0107] Mutantinio alelio sekų nustatymas (sekvenavimas)
[0108] Kuomet patvirtinamas nikuojantis fermento aktyvumas, galima sekvenuoti visą mutantinio alelio seką, pavyzdžiui, panaudojant didezoksi-terrninatorinį sekvenavimą, Po to yra identifikuojama genetinė mutacija ir aminorūgščių pakaitos. Jeigu tame pačiame baltyme randamos daugybinės aminorūgščių pakaitos, individualių amino rūgčių pakeitimus galima segreguoti panaudojant sait-nukreiptą mutagenezę ir galima įvertinti kiekvieną atskirą mutantą jo DNR nikuojančio aktyvumo atžvilgiu.
[0109] Variantų, pasižyminčių nikuojančiu aktyvumu. optimizacija
[0110] Kai kuriais atvejais variantai, pasižymintys nikuojančiu aktyvumu, taip pat pasižymi ir silpnu dsDNR skaidymu. Tam, kad būtų optimizuotas nikuojantis aktyvumas, identifikuotą amino rūgšties (aa) liekaną galima paveikti panaudojant sait-nukreiptą prisotinimo mutagenezę, ir tuomet išskirti variantus, kurių kiekvienas turi vieną ar daugiau likusių 18 aa pakaitų. Po to palyginamas visų mutantų DNR nikuojantis aktyvumas. Geriausi nikuojantys variantai, pasižymintys minimaliu dsDNR skaidymo aktyvumu, yra atrenkami. Kai kuriais atvejais dvi ar daugiau aa pakaitų reikia tam, kad būtų pasiektas optimalus nikuojantis aktyvumas ir maksimalus specifinis aktyvumas. Kitais atvejais sutrumpinti mutantai (C-terminalinės iškritos (delecijos) mutantai) taip pat pasižymi DNR nikuojančiu aktyvumu. Panašu, kad dvi aa pakaitos su daliniais efektais gali būti pirmą kartą identifikuotos dviejuose skirtinguose mutantuose. Kuomet dvi aa pakaitos susiderina viename mutante, tuomet kombinuotos mutacijos gali sąlygoti labai aktyvų nikuojantį fermentą.
[0111] Nikuojantis fermentas dalinai išvalomas chromatografinėje kolonėlėje (pavyzdžiui, afiniškumo kolonėlėje, jonų mainų kolonėlėje) ir po to naudojamas atitinkamos superspiralinės DNR kaip substrato nikavimui. Po to suskaidyta DNR yra tiriama "run-off'sekvenavimo būdu tam, kad būtų nustatyta nikuota grandinė. Baltymo valymo palengvinimui baltymo (peptido) tags, tokios, kaip His tags, chitiną-jungiančio domeno tags ar maltozę-jungiančio domeno tags, prijungiamos prie nikuojančių fermentų C-galo. Sulietas baltymas išskiriamas afiniškumo kolonėlėje ir po to tags gali būti pašalintos paveikiant proteaze ar skaidant baltymą.
[0112] Ląstelės-šeimininkės
[0113] Nikuojančių fermentų variantų skryningui bakterinės šeimininkės neapsiriboja vien tik E. coli. Bakterijos-šeimininkės tokios, kaip Bacillus ir Pseudomonas, gali būti irgi panaudotos drauge su atitinkamais klonavimo/ekspresijos vektoriais tam, kad būtų gautas pakankamas DNR transformacijos ar elektroporacijos efektyvumas. Termofiliniams fermentams gali būti naudojama Thermus thermophillus šeimininkės ir Thermus-E. coli pernešimo vektorius (Wayne, J. ir Xu, S.-y., Gene 195: 32328 (1997)). Nikuojančių fermentų išskyrimui naudojamus genetinio skryningo būdus galima panaudoti ir kitiems DNR skaidantiems fermentams tokiems, kaip fago terminazė, transpozazė, rekombinazė, integrazė, intron-koduota endonukleazė ar intein-koduota endonukleazė.
[0114] Aprašytasis pirmenybinis būdas, kaip IIA/IIS tipo restrikcijos endonukleazę, BsaI, perdaryti į grandinei specifinį nikuojantį fermentą, apėmė šias pakopas:
[0115] 1. bsaIR genas (pUC-BsaIR) buvo mutagenizuotas panaudojant linkusią klysti atvirkštinę PGR (25 ciklai). PGR produktas buvo suskaidytas panaudojant XhoI ir DpnI ir suliguotas. Liguota DNR transformacijos būdu pernešta į E.eoli ER2566 kompetentines ląsteles. Mutantų bibliotekoje gauta apie 2,926 išgyvenusių transformantų. Mutantinių plazmidžių DNR išskirta Qiagen kolonėlėje.
[0116] 2. Panaudojus PstI ir BseYI, mutagenizuotos plazmidės ir wt plazmidė buvo suskaidytos. PstI lokalizuotas bsalR geno viduryje ir BseYI yra pUC ColEI replikacijos origin rajone. Du restrikcijos fragmentai išskirti gelyje ir apkeisti su atitinkamais wt fragmentais, liguoti ir elektroporacijos būdu pemešti į E. coli kaip į ekspresijos šeimininkę. Šeimininkė-recipientė turėjo BsmAI metilazę (M.BsmAI), apsaugančią šeimininkės DNR.
[0117] 3. Penki ml per naktį augintos ląstelių kultūros buvo gauti individualius transformantus kultivuojant LB plius Ap ir Cm sąlygomis, 37° C temperatūroje, purtyklėje. Lėtai centrifuguojant gautos ląstelių nuosėdos. Dešimt l ląstelių kultūros panaudota g superspiralinės pUC 19 DNR skaidymui (nikavimui). Kuomet ląstelių kultūroje buvo aptiktas DNR nikuojantis aktyvumas, ląstelių nuosėdos buvo resuspenduotos ultragarsinio ardymo buferyje ir lizuotos ultragarsu. Lizatai buvo nuskaidrinti ir po to panaudoti nikuojančių fermentų aktyvumo ląstelių ekstrakte patvirtinimui. Iš viso skryningo būdu ištirtas 271 mutanto DNR nikuojantis aktyvumas. Penki mutantai pasižymėjo nikuojančiu aktyvumu tiek ląstelių kultūroje, tiek ir ląstelių ekstraktuose. Šiuose penkiuose nikuojančiuose variantuose buvo sekvenuoti bsaIR aleliai. Skryningo metu buvo taip pat nustatyti keli klaidingai pozityvūs variantai. Pradžioje buvo aptiktas nikuojantis aktyvumas ląstelių kultūroje, tačiau nerasta nikuojančio aktyvumo pėdsakų ląstelių ekstraktuose. Šie klaidingai pozityvūs variantai buvo eliminuoti ir toliau netyrinėti.
[0118] 4. Nikuojančio fermento B3 variantas turi aa pakaitas K150R ir R236G. Kitas nikuojančio fermento B36 variantas taip pat turi aa pakaitas S 128L ir R236G. Padaryta išvada, kad R236G yra labiausiai tinkama aa pakaita, turinti įtakos nikuojančiam aktyvumui. Kadangi dvigubi mutantai, Kl50R/R236G (3A pav.), S128L1R236G, ir viengubas mutantas R236G be nikuojančio aktyvumo dar pasižymi tam tikru liekamuoju dsDNR skaidymo aktyvumu (~10%), panaudojus sait-nukreiptą mutagenezę, buvo sukurtas kitas viengubas mutantas R236D. Fig. 3B parodyta, kad BsaI variantas R236D daugiausiai nikuoja superspiralinę DNR. Nikuotos DNR produktai buvo panaudoti kaip matrica "run-off" sekvenavime nikuotai grandinei nustatyti. Fig. 4 parodyta, kad jis skaido viršutinę grandinę ir tai rodo staigus sekvenavimo signalo sumažėjimas už nikuotos (trūkio) vietos. Todėl N.BsaI variantas R236D buvo pavadintas Nt.BsaI.
[0119] 5. Nikuojančio fermento variantas All turi du aa pakaitus N441D ir R442G. N441D/R442G DNR nikuojantis aktyvumas parodytas fig. SA. N441D ir R442G aa pakitimai buvo atskirti sait-nukreiptos mutagenezės būdu tam, kad būtų sukurti viengubi mutantai, turintys arba N441D, arba R442G. Varianto N441D dsDNR skaidymo aktyvumas panašus į wt fermento. R442G be nikuojančio aktyvumo dar pasižymi ir kai kuriuo dsDNR skaidymo aktyvumu. Todėl dvi aa pakatos gali veikti sinergistiniu būduj pasiekdamos didelį nikuojantį aktyvumą. Nikuotos DNR produktas buvo panaudotas kaip matrica "run-off' sekvenavime nikuotai grandinei nustatyti. Fig. 6 parodyta, kad BsaI variantas R442G. N441 DIR442G skaido apatinę grandinę ir todėl jis buvo pavadintas Nb.BsaI R442G. Viršutinė grandinė lieka nepaliesta ir generuoja normalią DNR seką.
[0120] 6. Nikuojančio fermento skryningo metu rasta, kad BsaI iškritos (delecijos) variantai taip pat pasižymėjo DNR nikuojančiu aktyvumu. Du iškritos variantai atsirado dėl prasminio kodono mutacijos į stop kodoną. Izoliate A26 Leu446 kodonas buvo mutavęs į stop kodoną (UUA į UAR). Todėl BsaI aa seka po 446 buvo iškritusi izoliate A26 L'1(446-544). Izoliate A57 Glu440 kodonas buvo mutavęs i stop kodoną (GAR į VAR). Todėl aa seka po 440 yra iškritusi mutante A57 L'1( 440-544). run-off sekvenavimc metu buvo nustatyta, kad delecijos variantas A57 sukelia trūki apatinėje grandinėje.
[0121] 7. Svarbios aa pakaitos, atsakingos už nikuojantį aktyvumą, gali būti sukeltos izošizomere/neošizornere ir kitose restrikcijos endonukleazėse, jeigu jos turi panašią DNR atpažinimo seką arba turi panašias/identiškas baltymų aa sekas. Ištyrus aa sekas, homologiški rajonai rasti tarp BsaI, BsmAI ir BsmBI. Tos pačios aa pakaitos, sukeltos BsmBI, sukūrė Nt.BsmBI ir Nb.BsmBI nikuojančius fermentus. Kuomet tos pačios aa pakaitos buvo sukeltos BsmAI, buvo gauti Nt.BsmAI ir Nb.BsmAI nikuojantys fermentai. Tačiau Nb.BsmAI variantas, gautas atlikus aa liekanų, atitinkančių BsaI nikuojantiems fermentams, sait nukreiptą mutagenezę, taip pat pasižymėjo ir dsDNR skaidymo aktyvumu. Apibendrinant galima pasakyti, kad svarbios aa pakaitos gali būti sukeltos izošizomeruose ar neošizomeruose, kuomet pastarieji pasižymi dideliu aa sekų panašumu (nuo 15% iki 99% aa sekų panašumo).
[0122] Nikuojančių fermentų panaudojimas:
[0123] 1) Grandinės išstūmimo DNR amplifikacija. Panaudojant nikuojantį fermentą galima sukelti specifinį viengrandininį trūki taikininėje DNR. Bst polimerazė ar kitos DNR polimerazės gali pradėti naujos grandinės sintezę viengrandininio trūkio vietoje ir išstumti nikuotą grandinę, tuo būdu pagaminant linijinius DNR amplifikacijos produktus.
[0124] 2) Geno fragmentų surinkimo rekombinantinė DNR technologija. DNR fragmentus galima surinkti, pavyzdžiui, sukeliant išmėtytus trūkius dvigubos DNR viršutinėje ir apatinėje grandinėse tam, kad rastųsi ilgi viengrandininiai (nuo 8 iki 20 nt ilgio). Komplementarūs lipnūs galai gali drauge susijungti. Kadangi fragmentai yra tokie ilgi, todėl dažnai galima praleisti ligavimo pakopą ir susijungusią DNR galima naudoti tiesiogiai transformacijos, elektroporacijos ar transfekcijos veiksmams. Nikuojantys fermentai gali būti taip pat naudojami paruošiant viengrandininės DNR galus DNR fragmentų surinkimui į linijinę ar žiedinę formą.
[0125] 3) Genetinio polimorfizmo nustatymas. Mažus PGR fragmentus galima amplifikuoti iš genominės DNR. Naudojant nikuojantį fermentą, taikinyje sukeliamas viengrandininis trūkis. Po denatūracijos, naudojant aukšto slėgio skystinę chromatografiją, nikuotą produktą galima "perskaityti" masinės spektrometrijos būdu ir nustatyti genetinius pokyčius. Nikuojantys fermentai gali būti panaudoti onkogeno mutacijų nustatymui, bakterinio ar virusinio patogeno detekcijai.
[0126] 4) Dvigubos DNR, turinčios viengrandininį trūkį, pakitusio migracinio mobilumo gelyje įvertinimas. Šis ypatumas gali būti panaudotas tiriant skirtingą/diferencinę bazių sangulą (stacking) ir artimiausio kaimyno energetiką (Kuhn, H. ir kt. Electrophoresis 23: 2384-7 (2002)).
[0127] 5) DNR klaidingo poravimo ekscizinė reparacija gali būti tiriama paruošus nikuotą dvigubą DNR ar "skylėtą" DNR (Wang, H.and Hays, J.B., J Biol Chem 277: 26136-42 (2002)).
[0128] Duotasis išradimas toliau yra iliustruojamas pateikiant sekančius pavyzdžius.
[0129] Pavyzdžiai pateikiami tuo tikslu, kad išradimas būtų suprantamesnis ir jais nesiekiama griežto apribojimo. Suprantama, kad patyrę tyrinėtojai gali daryti nedideles šio išradimo modifikacijas ir variacijas ir gali gauti tą patį rezultatą. Cituoti aukščiau ir žemiau darbai yra įtraukti į nuorodas. Priedo į nuorodas įtraukti Zhu ir kt. J Mol. Biol. 337, 573-583 (2004) ir Samuelson ir kt. Nucl Acids Res 32,3661-3671 (2004)).
[0130] PAVYZDŽIAI
[0131] 1 pavyzdys. Grandinei specifinių nikuojančių fermentų Nt.BsaI ir Nb.BsaI sukūrimas iš BsaI restrikcijos endonukleazės
[0132] I. Mutantinės plazmidžių DNR rinkinio (bibliotekos) sukūrimas
[0133] Pirmiausia bsaIR genas buvo klonuotas panaudojant pUCI9 tam, kad būtų gauta pUC-Bsal, Norint nustatyti wt sekos buvimą, endonukleazės genas buvo sekvenuotas. bsaIR genas mutagenizuotas, panaudojant linkusios klysti atvirkštinės PGR keturias atskiras reakcijas ir jas atliekant šiomis sąlygomis: 94° C - 30 sek., 55° C - 30 sek., 72° C - 4 min. 8 sek., 25 ciklai, naudojant Taq DNR polimerazę, pridėjus 2, 4, 6 ar 10 mM MgCI2, dNTF, pUC-BsaI matricą ir Ix Thermopol buferį. PGR produktai surinkti ir išvalyti Qiagen spin kolonėlėse, suskaidyti panaudojant XhoI ir Dpnl. Dpnl skaidymo dėka pašalinama Dam-metilinta DNR matrica (laukinis tipas). Po to PGR produktai savaime ligavosi ir elektroporacijos būdu buvo pernešti į E. coli kaip ekspresijos šeimininkę, transformantai buvo pasėti Ap lėkštelėse. Recipientinė šeimininkė neturėjo apsauginės meti1transferazės, ir todėl didelio aktyvumo wt fermentas ar mutantinis fermentas užmušė ląsteles-šeimininkes. Tik nuliniai mutantai, mažo aktyvumo mutantai ar mutantai, pasižymintys skaidymo defektu ir geru jungimosi gebėjimu, išgyveno šioje transformacijos pakopoje. Viso gauti 2936 išgyvenę transformantai, kurie buvo surinkti į bendrą pulą, Plazmidinė DNR išskirta iš ląstelių pulo ir tuo būdu sukurtas mutantinės plazmidžių DNR rinkinys (biblioteka).
[0134] 2. wt ir mutantinės plazmidžių DNR restrikcinis skaidymas, restrikcijos fragmentų mainai ir ligavimas
[0135] wt ir mutantinės plazmidės (4.1 kb) buvo suskaidytos restrikcijos fermentais Pstl ir BseYI. Kadangi Pstl lokalizavosi bsaIR geno viduryje, todėl, skaidant PstI, endonukleazės genas skilo į du lygius segmentus. Bse YI lokalizavosi vektoriaus ColEI replikacijos ori rajone. Restrikcijos fragmentai buvo išskirti žemos lydymosi temperatūros gelyje ir po to išvalyti Qiagen spin kolonėlėse. wt N-terminalinė koduojanti seka (wt kairė pusė) buvo sujungta su mutagenizuota (inaktyvuota) C-terminaline koduojančia seka (mutantas dešinė pusė) ir liguota panaudojant T4 DNR ligazę. Liguota DNR, panaudojus standartine transformaciją ar elektroporaciją, buvo pernešta į E. coli kaip ekspresijos šeimininkę ER2683 [pACYC-BsmAI]. Negimininga metilazė M. BsmAI (atpažinimo seka GTCTC) modifikuoja visus BsaI saitus lygiai taip, kaip ir papildomus giminingus saitus ir todėl suteikia šeimininkės DNR apsaugą. Standartinė transformacija, panaudojant chemiškai kompetentingas ląsteles, duoda mažai transformantų, todėl pirmenybė teikiama elektroporacijai, kaip transformacijos būdui. Transformantai buvo išsėti LB agaro lėkštelėse + Ap ir Cm ir inkubuoti per naktį prie 37° C temperatūros.
[0136] 3. Nikuojančių fermentų variantų skryningas ląstelių kultūrose ir ląstelių ekstraktuose
[0137] Pavienės kolonijos, atsiradusios po transformacijos buvo išsėtos į lOmi terpės,
[0138] turinčios LB + Ap ir Cm, ir augintos per naktį 37 °C temperatūroje. Testuojant nikuojantį aktyvumą (skaidymą), išbandytas dešimties μ1 totalinės ląstelių kultūros poveikis 1 μg pUCI9 superspiralinės DNR. Pozityvios kontrolės variante tas pats substratas veiktas skaidant grandinei specifiniu nikuojančiu fermentu N.BstNBI. Nikuota DNR buvo išanalizuota elektroforezės agarozės gelyje būdu. Kuomet izoliato kultūros terpėje buvo nustatyta nikuota žiedinė DNR, tuomet atitinkamas ląstelių nuosėdų kiekis buvo atšildytas , lizuotas veikiant ultragarsu ir nuskaidrintas centrifuguojant. Ląstelių ekstraktas buvo panaudotas nikuojančio fermento aktyvumo patvirtinimui. Kai kuriais atvejais, kuomet buvo nustatomas didelis nikuojančio fermento aktyvumas, ląstelių ekstraktą reikėjo skiesti serijiniais skiedimais. Pavyzdžiui, 2-kartinis serijinis skiedimas nuo 2-kartų iki 512-kartų buvo atliktas nustatant mutantinio izoliato All (Nb.BsaI, N44ID/R442G, fig. 5A) nikuojantį aktyvumą. Pirmo skryningo metu ištyrus 160 klonų, rasta, kad II klonų pasižymėjo pozityviu nikuojančiu aktyvumu ląstelių kultūroje, ir 3 klonai (A 11, A26 ir A57) buvo po to sekvenuoti ir apibūdinti. Antro skryningo metu 6 pozityvūs nikuojantys aktyvumai buvo aptikti ląstelių kultūrose ir du (B3 ir B36) buvo sekvenuoti ir apibūdinti. Tie, kurie pasižymėjo tam tikru nikuojančiu aktyvumu ląstelių kultūroje, bet nepasižymėjo nikuojančiu aktyvumu ląstelių ekstraktuose, buvo laikomi klaidingai pozityviais ir buvo atmesti. Tie variantai, kurie pasižymėjo tam tikru nikuojančiu aktyvumu ir aktyviu dvigrandininiu DNR skaidymu, buvo taip pat atmesti. Tik tie variantai, kurie pasižymėjo vyraujančiu nikuojančiu aktyvumu buvo sekvenuojami ir toliau tiriami. Sekantys pradmenys panaudoti ištisų bsaIR alelių, koduojančių nikuojančius variantus, sekvenavimui:
[0139] S 1224S ir S 1233S (pUC universalūs įpriekiniai ir atbuliniai pradmenys)
[0140] 5'CGATCTGTCTAITTCGTICATCCA 3' (299-313) (SEQ ID NO:4)
[0141] 5'GGCAACAATIAATAGACTGGATGG 3' (299-314) (SEQ ID NO:5)
[0142] 5'TTTGAAATIGATTCACTAGAACAT 3' (299-315) (SEQ ID NO:6)
[0143] 5'AAGGAAACTTGITTAAATGATAAC 3' (299-316) (SEQ ID NO:7)
[0144] 5'AGAGATACAAAATACACTGAAGAG 3' (299-317) (SEQ ID NO:8)
[0145] 1 lentelė sumuoja mutantinių izoliatų skaičių, bazių mutacijas, aa pakaitas ir nikuojamą grandinę.
[0146] 1 lentelė. Nikuojančių fermentų variantai, gauti bsaJR geno atsitiktinės mutagenezės būdu
[0147]
[0148] 4. aa liekanų, susijusių su fermento nikuojančiu aktyvumu, sait-nukreipta mutagenezė
[0149] Kadangi abu izoliatai B3 ir B36 turi R236G pakaitas, padaryta išvada, kad Arg236 pakaita į Gly gali rodyti, kad ši yra liekana yra atsakinga už nikuojantį fenotipą. Mes pagrindėme, kad šios aminorūgšties (R) konversija į rūgštinę (D) galėtų turėti dar didesnę įtaką nikuojančiam aktyvumui negu Gly pakaita. Asp buvo pasirinkta dėl jos šoninės grandinės neigiamo krūvio. Atlikta sait-nukreipta mutagenezė (atvirkštinė PGR) tam, kad būtų sukurti viengubi mutantai R236G ir R236D. Atvirkštinės PGR pradmenys turi šias sekas:
[0150] R236G įpriekinis pradmuo
[0151] 5'TCATATACAACAGATAGAGGAGCATTTGAATACTGGGTT3' (SEQ ID NO:9)
[0152] R236G atbulinis pradmuo
[0153] 5'AACCCAGTATTCAAATGCTCCTCTATCTGTTGTATATGA3' (SEQ ID NO: 10)
[0154] R236D įpriekinis pradmuo
[0155] 5'TCATATACAACAGATAGAGACGCATTTGAATACTGGGTT3' (SEQ ID NO:Il)
[0156] R236D atbulinis pradmuo
[0157] 5'AACCCAGTATTCAAATGCGTCTCTATCTGTTGTATATGA3' (SEQ ID NO:I2)
[0158] Atvirkštinės PGR reakcijos atliktos šiomis sąlygomis: 94 oC - 30 sek., 55 oC - 30 sek., 72 oC - 4 min. 8 sek., 20 ciklų, naudojant Vent DNR polimerazę, pridėjus 2, 4, ir 8mM MgCl2, dNTF, pUC-Bsal matricą ir Ix Thermopol buferį. Amplifikuoti produktai paveikti Dpnl tam, kad būtų suskaidyta matricos DNR. Iš transformantų skryningo būdu atrinkti viengubi mutantai, norimai mutacijai patvirtinti mutantai buvo sekvenuoti. Paruošti variantų R236G ir R236D ląstelių ekstraktai ir patikrintas šių variantų grandinei specifinis nikuojantis aktyvumas. Rasta, kad R236D pasižymi vyraujančiu nikuojančiu aktyvumu ir labai mažu dsDNR skaidančiu aktyvumu (fig. 3B). Variantai K150R/R236G (fig. 3A), R236G taip pat nikuoja DNR, bet nedidelė dalis DNR buvo jų skaidoma ir dvigrandiniškai. Padaryta išvada, kad Arg236 pakaita į Glu ar Gly yra atsakinga už virsmą į nikuojantį fermentą. Šis bandymas parodė, kad po atsitiktinės mutagenezės, skirtos aa liekanų, susijusių su nikuojančiu aktyvumu, identifikavimui, galima daryti išvadą, kad sait-nukreiptą mutagenezę galima naudoti variantų, pasižyminčių optimizuotu grandinei specifiniu, aktyvumu, sukūrimui.
[0159] Nikuojantis variantas N441D/R442G turi dvi aa pakaitas. Bsal varianto N44lD/R442G nikuojantis aktyvumas parodytas fig. SA. Viengubų mutantų N44lD ir R442G sukūrimui panaudota sait-nukreipta mutagenezė. Atvirkštinės PGR pradmenys turi šias sekas:
[0160] N44lD įpriekinis pradmuo
[0161] 5' AGCTATATIGAAAAAGAAGACAGAAATGCCITATIAGTAATA 3' (SEQ ID NO: 13)
[0162] N441 D atbulinis pradmuo
[0163] 5' TA TI ACT AA TAAGGCA TTTCTGTCTICITTTTCAA TA TAGCT 3' (SEQ ID NO:14)
[0164] R442G įpriekinis pradmuo
[0165] 5' AGCTATA TTGAAAAAGAAAACGGAAATGCCTI A IT AGTAATA 3' (SEQ ID NO: I5)
[0166] R442G atbulinis pradmuo
[0167] 5'TA TI ACTAAT AAGGCA TTTCCGTTTTTCITTTTCAA TA T AGCT 3' (SEQ ID NO: 16)
[0168] Atvirkštinės PGR reakcijos atliktos šiomis sąlygomis: 94 oC - 30 sek., 55 oC - 30 sek., 72 oC - 4 min. 8 sek., 20 ciklų, naudojant Vent DNR polimerazę, pridėjus 2 ir 4 mM MgCIz, dNTF, pUC-BsaI matricą ir lx Thennopol buferį. Amplifikuoti produktai paveikti DpnI tam, kad būtų eliminuota matricos DNR. Iš transfonnantų atrinkti mutantai, norima mutacijai patvirtint atlikus DNR sekvenavimą. Variantas N441D pasižymi dsDNR skaidančiu aktyvumu, o variantas R442G - vyraujančiu nikuojančiu aktyvumu. Tačiau viengubo mutanto R442G nikuojantis aktyvumas yra maždaug 8x mažesnis negu dvigubo mutanto N441D/R442G. Palyginus ląstelių ekstraktų nikuojančius aktyvumus, nustatyta, kad R442G aktyvumas yra I x IOS vienetų/gramui drėgnų ląstelių, o dvigubo mutanto N441D/R442G atitinkamai - 8 x 105 vienetų/gramui drėgnų ląstelių. Todėl padaryta išvada, kad dvigubo mutanto N441D/R442G dvi aa pakaitos gali veikti sinergistiškai paverčiant BsaI į nikuojantį fermentą, Fig. 7 išvardinti visi BsaI nikuojančio fermento variantai išskirti gauti naudojant atsitiktinę ir sait-nukreiptą mutagenezę.
[0169] 6. Iškritą (deleciją) turinčių BsaI variantų, pasižyminčių DNR nikuojančiu aktyvumu, išskyrimas
[0170] Kaip parodyta 1 lentelėje, du iškritą turintys variantai A26 ir A57 buvo išskirti iš plazmidinės DNR rinkinio (bibliotekos), gauta atsitiktinės mutagenezės būdu. A26 ir A57 turi iškritą atitinkamai nuo 446 iki 544 ir nuo 440 iki 554. Dviejų delecinių variantų nikuojantys aktyvumai parodyti 5B figūroje (7-16 takeliai). Pirmą kartą parodyta, kad C-terminalinės iškritos mutacija gali paversti IIA/I1S tipo restrikcijos endonukleazę į DNR nikuojantį fermentą. A57 poveikio dėka gauta nikuota DNR panaudota kaip matrica run-off sekvenavime. Nustatyta, kad A57 ( (440-554) nikuoja apatinę grandinę. Todėl pastarasis buvo pavadintas Nb.Bsag(440-544). Nb.BsaIo(440-544) nikuojantis aktyvumas yra mažiausiai visa eile mažesnis negu kitų nikuojančių variantų Nt.BsaI (R236D) ar Nb.BsaI (N44I D/R442D).
[0171] 7. Nikuojančių fermentų dalinis išvalymas
[0172] N .BsaI nikuojantys fermentai buvo dalinai išvalyti chromatografiškai panaudojant heparino Sefarozės ir DEAE Sefarozės kolonėles. Baltymai eliuoti iš heparino Sefarozės kolonėlės panaudojant NaCI gradientą nuo 50 mM iki I M. Baltymai srove praėjo pro DEAE Sefarozės kolonėlę, o DNRlRNR liko prikibusios kolonėlėje.
[0173] 8. Šiame darbe panaudoti molekulinės biologijos metodai
[0174] PGR, atvirkštinės PGR būdu atliekamos sait-nukreiptos mutagenezės eiga: PGR sąlygos - 94 oC- 30 sek., 55 oC- 30 sek., 72 oC - 4 min. 8 sek., 20 - 25 ciklai, naudojant Tag ar Vent DNR polimerazę, pridėjus 2 -10 mM MgCl2, dNTF, pUC-BsaI matricą ir Ix Thermopol buferį. Tag DNR polimerazė naudota atvirkštinės PGR metu vykdant atsitiktinę mutagenezę. Vent DNR polimerazė naudota atvirkštinės PGR metu vykdant oligonukleotido-nukreiptą mutagenezę. Paveikus DpnI, iš amplifikuotos DNR buvo pašalinta matricos DNR.
[0175] Plazmidinės DNR paruošimo eiga: Plazmidinės DNR paruošimui naudota Qiagen sūkinio (spin) kolonėlės. Ląstelių lizė, baltymų ir ląstelinės DNR denatūracija atlikta pridėjus PI, P2 ir N3 buferių. Nuskaidrinti supernatantai, turintys plazmidinę DNR, buvo užliejami ant Qiagen kolonėlių ir plaunami PB ir PE buferiais. Plazmidinė DNR eliuojama su 10 mM Tris-HCI buferiu.
[0176] Transformacijos eiga: Chemiškai kompetentingos ląstelės paruoštos veikiant eksponentinės augimo fazės E. coli ląsteles lede atšaldytu 50 mM CaCl2 30 min. Kompetentingos ląstelės sumaišomos su plazmidine DNR ir inkubuojamos ant ledo 30 min. Po 3-5 min. kaitinimo 37° C temperatūroje pridedamas toks pat kiekis LB terpės. Ląstelės auginamos vieną val prie 37° C temperatūros inkubatoriuje. Transformantai išsėjami į LB agaro lėkšteles pridėjus atitinkamų antibiotikų plazmidžių selekcijai.
[0177] Elektroporacijos eiga: Elektro-kompetentingos ląstelės paruoštos plaunant du kartus eksponentinės augimo fazės E. coli ląsteles lede atšaldytu 10% gliceroliu (500 ml 10% glicerolio/ ląstelių nuosėdoms, gautoms iš 1 I ląstelių kultūros). Sumaišius DNR su 100 μl kompetentingų ląstelių, elektroporacija vykdyta laikantis šių sąlygų: 1900 V, 200 Ω, 25 μF, 0.1 cm kiuvetė. Prie ląstelių pridedama 1 ml LB terpės ir inkubuojama 1 val tam, kad būtų amplifikuoti transformantai. Transformantai buvo išsėti į LB lėkšteles pridėjus atitinkamų antibiotikų (Ap, Ap plius Cm) plazmidžių selekcijai.
[0178] Ląstelių ekstraktų paruošimas: Ląstelės kultivuotos per naktį 37 oC temperatūroje purtyklėje, po to, lėtai centrifuguojant (1800 g), nusodintos. Ląstelės resuspenduotos ultragarsinio ardymo buferyje (50 mM Tri-HCI, pH 7.8, 10 mM β-merkaptoetanolis, 50 mM NaCI). Ląstelės lizuojamos ultragarsu, esant išeigai 4, 50 %, nutraukiant 5 kartus, naudojant mažą ultragarsinio ardymo antgalį. Lizatas nuskaidrintas centrifuguojant prie 14000 g 4oC temperatūroje 10 min. Supematantas (ląstelių ekstraktas) panaudotas nikuojančio fermento vertinimui.
[0179] Nikuojančio fermento vertinimas: ląstelių kultūros arba skiesto ląstelių ekstrakto 1001 panaudota superspiralinės pUC19 DNR 1 μg skaidyti (nikuoti) 1 val Ix BsaI restrikcijos buferyje (1 % SDS, 50 % glicerolis, 0.1 % BPB dažas). Nikuoti produktai pernešti į nuo 0.8 iki 1 % agarozės gelį su TBE buferiu.
[0180] "Run-off'sekvenavimas ir DNR sekvenavimas: Nikuoti produktai ar gelyje išvalyti nikuoti produktai naudoti "run-off'sekvenavimui. Sekvenavimo reakcijose naudotas "Big dye AmpliTaq dideoxy terminator" sekvenavimo rinkinys (Applied Biosystems, Foster City, CA). DNR seka nustatyta automatiniu sekvenatoriumi ABI373A. DNR seka redaguota ir analizuota panaudojant Seqed programą ir GCG programas.
[0181] 2 pavyzdys. BsmBI nikuojančių variantų sukūrimas iš BsmBI endonukleazės, sait-nukreiptos mutagenezės būdu pakeičiant aa liekanas atitinkamai aa pakaitoms, esančioms Nt. BsaI ir Nb.BsaI
[0182] BsaI ir BsmBI restrikcijos endonukleazės atpažįsta panašias DNR atpažinimo sekas (BsaI GGTCTC; BsmBI CGTCTC) ir skaido N1/N5 pasroviui. Dvi endonukleazės pasižymi 45 % panašumu ir 34 % sekų identiškumu amino rūgščių lygyje (fig. 8). Pagrįstai manoma, kad aa pakaitos, identifikuotos BsaI, pakeitusios BsaI endonukleazę į nikuojančius fermentus, sait-nukreiptos mutagenezės būdu galėtų būti sukeltos BsmBI restrikcijos endonukleazėje ir tai sukurtų BsmBI nikuojančius variantus. Būtina sąlyga tokiam ekvivalentiniam mutacijų pernešimui yra tai, kad du baltymai pasižymėtų aa sekų, aktyvių saitų ir sandaros panašumu. GCG "Bestfit" aa sekų išdėstymo programos duomenimis BsmBI Arg233 liekana atitinka BsaI Arg236 (fig. 8.). Kaip parodyta I pavyzdyje, BsaI endonukleazėje pakeitus Arg236 į Gly ar Arg236 į Asp, generuojami BsaI nikuojantys variantai (Nt.BsaI (R236D, Nt.BsaI (R236G)). Atitinkamas BsmBI variantas R233D buvo sukurtas oligonukleotido-nukreiptos mutagenezės (atvirkštinė PGR) būdu. Atvirkštinės PGR pradmenys turi sekančias sekas:
[0183] R233D įpriekinis pradmuo
[0184] 5'CCTATATAATCATGATAGAGATGCTTTTATGTGGTGGTCA3' (SEQ ID NO: 17)
[0185] R233D atbulinis pradmuo
[0186] 5'TGACCACCACATAAAAGCATCTCTATCATGATTATATAG3' (SEQ ID NO: 18)
[0187] Atvirkštinė PGR atlikta šiomis sąlygomis: 94 °C - 30 sek., 55 °C - 30 sek., 72 °C - 4 min., 20 ciklų (DeepVent DNR polimerazė, pridėjus 2 ir 4 mM MgS04). Amplifikuoti produktai paveikti DpnI ir pernešti i E.coli ER2683 [pACYC-BsmAIM] kaip ekspresijos šeimininkę, Individualūs transformantai kultivuoti 10 ml LB + Ap ir Cm per nakti purtant 37 °C temperatūroje. Ląstelių kultūros (10 μl) buvo tiesiogiai tirtos skryningo būdu ieškant BsmBI nikuojančio aktyvumo. Šeši klonai skryningo būdu tirti ieškant N.BsmBI nikuojančio aktyvumo ir trys klonai parodė nikuojantį aktyvumą. Po to, kai buvo nustatytas nikuojantis aktyvumas, ląstelių nuosėdos buvo resuspenduotos ultragarsinio ardymo buferyje ir lizuotos ultragarsu. Ląstelių liekanos buvo pašalintos centrifuguojant ir buvo tirtas ląstelių ekstrakto gebėjimas nikuoti (skaidyti) superspiralinę pBR322 DNR. BsmBI variantas R233D pasižymėjo DNR nikuojantį aktyvumą tiek tiriant ląstelių kultūrą, tiek ir ląstelių kultūrą (9B paveikslas). Nikuotas produktas buvo gelyje išskirtas ir panaudotas kaip matrica "run-off' sekvenavime. Nustatyta, kad BsmBI R233D nikavo viršutinę grandinę ir todėl buvo pavadintas Nt.BsmBI (R233D). Nikavimo saito nustatymo rezultatas parodytas 10 paveiksle. Apatinė grandinė, kaip matrica, pagamino besitęsianti pradmens ekstensijos produktą, kai tuo tarpu viršutinė grandinė, kaip matrica, davė sutrumpintą produktą.
[0188] BsaI nikuojantys variantai Nb.BsaI (N44ID/R442G) ir Nb.BsaI (R442G) turėjo aa pakaitas N441 ir R442 vietose. BsaI endonukleazėje R442G pakaita yra esminė liekana, kuri BsaI endonukleazę paverčia į N.BsaI nikuojantį fermentą. Atitinkama BsmBI aa liekana yra Arg438 (Glu liekana yra prieš Arg438, Glu437Arg438, 8 pav.). Arg438 buvo pakeista i Asp ar Gly oligonukleotido-nukreiptos mutagenezės būdu (atvirkštinė PGR). Atvirkštinės PGR pradmenys turi šias sekas:
[0189] R438G įpriekinis pradmuo
[0190] 5' AlTCTAAGGATATAAATGAGGGAAAGTTAATTAAATITGACACT 3' (SEQ ID NO: 19)
[0191] R438G atbulinis pradmuo
[0192] 5' AGTGTCAAA TIT AA TI AACTITCCCTCA TIT ATA TCCTI AGAA TI 3' (SEQ ID NO: 20)
[0193] R438D įpriekinis pradmuo
[0194] 5' AA TICT AAGGAT AT AAATGAGGAT AAGTI AA TI AAA TTTGACACT 3' (SEQ ID NO: 21)
[0195] R438D atbulinis pradmuo
[0196] 5' AGTGTCAAA TIT AA TI AACTI ATCCTCA TIT A TA TCCTT AGAATI 3' (SEQ ID NO: 22)
[0197] Atvirkštinė PGR atlikta šiomis sąlygomis: 94 °C - 30 sek., 55 °C - 30 sek., 72 °C - 4 / min., 20 ciklų (DeepVent DNR polimerazė, pridėjus 2 ir 4 mM MgS04). Amplifikuoti PGR produktai paveikti DpnI ir pemešti į E.coli ER2683 [pACYC-BsmAIM] kaip ekspresijos šeimininkę. Individualūs transformantai kultivuoti 10 ml LB + Ap ir Cm per naktį purtant 37 °C temperatūroje. Ląstelių kultūros tiesiogiai tirtos skryningo būdu ieškant BsmBI nikuojančio aktyvumo. Po to, kai buvo nustatytas nikuojantis aktyvumas, ląstelių kultūros lėtai centrifuguotos ir ląstelių nuosėdos buvo resuspenduotos ultragarsinio ardymo buferyje ir lizuotos ultragarsu. Ląstelių liekanos pašalintos centrifuguojant ir tirtas ląstelių ekstrakto gebėjimas nikuoti (skaidyti) superspiralinę pBR322 DNR. BsmBI variantai R438D ir R438G pasižymėjo DNR nikuojančiu aktyvumu tiek tiriant ląstelių kultūrą, tiek ir ląstelių kultūrą (fig. 9A). Nikuotas produktas buvo gelyje išskirtas ir panaudotas kaip matrica "run-off'sekvenavime. Nustatyta, kad BsmBI R438D nikavo apatinę grandinę ir todėl buvo pavadintas Nb.BsmBI (R438D). Nikavimo saito nustatymo rezultatas parodytas II figūroje. Viršutinė grandinė liko nenikuota ir "run-off'sekvenavimas parodė ją vientisą. Apatinė grandinė buvo nikuota ir "run-off'sekvenavimas staiga sustojo ties nikuota vieta.
[0198] 3 pavyzdys. Grandinei specifinių nikuojančių fermentų Nt.BsmaI ir Nb.BsmaI sukūrimas iš BsmAI restrikcijos endonukleazės sait-nukreiptos mutagenezės būdu
[0199] BsaI ir BsmAI restrikcijos endonukleazės atpažįsta panašias DNR atpažinimo sekas (BsaI GGTCTC; BsmAI GTCTC) ir skaido NIIN5 pasroviui. Dvi endonukleazės pasižymi 48 % aa sekų panašumu ir 37 % aa sekų identiškumu (fig. 12). Pagrįstai manoma, kad aa pakaitos, identifikuotos BsaI, pavertusios BsaI endonukleazę į nikuojančius fermentus, sait-nukreiptos mutagenezės būdu galėtų būti sukeltos BsmAI restrikcijos endonukleazėje ir tai sukurtų BsmAI nikuojančius variantus. GCG "Bestfit" aa sekų išdėstymo programos duomenimis BsmAI Arg22 I liekana atitinka BsaI Arg236 (fig. 12). Kaip parodyta I pavyzdyje, BsaI endonukleazėje pakeitus Arg236 į Gly ar Arg236 į Asp, sukuriami BsaI nikuojantys variantai (Nb.BsaI (R236D, Nt.BsaI (R236G)) Atitinkamas BsmAI variantas R22 I D buvo sukurtas oligonukleotido-nukreiptos mutagenezės (atvirkštinė PGR) būdu. BsmAIR genas buvo pirmą kartą klonuotas pUC I 9 vektoriuje tam, kad būtų gauta pUC-BsmAIR. Atvirkštinės PGR pradmenys turi šias sekas:
[0200] R22 I D įpriekinis pradmuo
[0201] 5' TCGTATACAAAAGATAGAGATGCATATGAATATTGGAGC 3' (SEQ ID NO: 23)
[0202] R22 ID atbulinis pradmuo
[0203] 5'GCTCCAATATTCATATGCATCTCTATCTTTTGTATACGA3' (SEQ ID NO: 24)
[0204] Atvirkštinė PGR atlikta šiomis sąlygomis: 94 °C - 30 sek., 55 °C - 30 sek., 72 °C - 4 min., 20 ciklų (DeepVent DNR polimerazė, pridėjus 2,4 ir 6 mM MgSO4). Amplifikuoti PGR produktai paveikti DpnI ir pemešti į E.coli ER2683 [pACYC-BsmAIM] kaip ekspresijos šeimininkę, Individualūs transformantai kultivuoti la ml + Ap ir Cm per naktį purtant 37 °c temperatūroje. Ląstelių kultūros tiesiogiai tirtos skryningo būdu ieškant BsmBI nikuojančio aktyvumo. Šešiolika klonų skryningo būdu tirti ieškant N.BsmBI nikuojančio aktyvumo ir 14 klonų parodė nikuojantį aktyvumą. Pozityvių klonų ląstelių nuosėdos buvo resuspenduotos ultragarsinio ardymo buferyje ir lizuotos ultragarsu. Ląstelių liekanos pašalintos centrifuguojant ir tirtas ląstelių ekstrakto gebėjimas nikuoti (skaidyti) superspiralinę pBR322 DNR. BsmAI varianta R221D pasižymėjo DNR nikuojančiu aktyvumu tiek tiriant ląstelių kultūrą, tiek ir ląstelių ekstraktą (fig. 13). Taip pat buvo aptiktas ir nedidelis dsDNR skaidymo aktyvumas (fig. I3A). Nikuotas produktas buvo gelyje išskirtas ir panaudotas kaip matrica "run-off"sekvenavime. Nustatyta, kad BsmAI R221D nikavo viršutinę grandinę ir todėl buvo pavadintas Nt.BsmBI (R22 ID). Nikavimo saito nustatymo rezultatas parodytas 14 figūroje.
[0205] BsaI nikuojantys variantai Nb.BsaI (N44ID/R442G) ir Nb.BsaI (R442G) turėjo aa pakaitas N441 ir R442 vietose. BsaI endonukleazėje R442G pakaita yra esminė liekana, kuri BsaI endonukleazę paverčia į N.BsaI nikuojantį fermentą. Atitinkama BsmAI aa liekana yra N415 ir R416. OIigonukleotido-nukreiptos mutagenezės būdu (atvirkštinė PGR) BsmAI endonukleazėje Asn415 buvo pakeista į Asp (N415D) ir Arg416 į Gly (R416G). Atvirkštinės PGR pradmenys turi šias sekas:
[0206] N415D/R416G įpriekinis pradmuo
[0207] 5 'GA TI A T AA TGAAAAAGAAGA TGGAAA TAT AAAAGCAAACCTC 3' (SEQ ID NO: 25)
[0208] N4150/R416G BsmAI atbulinis pradmuo
[0209] 5'OAOGTTTOCTTTTATATTTCCATCTTCTTTTTCATTATAATC3' (SEQ IDNO: 26)
[0210] Atvirkštinė POR atlikta šiomis sąlygomis: 94 °C - 30 sek., 55 °C - 30 sek., 72 °C - 4 min., 20 ciklų (DeepVent DNR polimerazė, pridėjus 2, 4 ir 6 mM MgS04). Amplifikuoti POR produktai paveikti Dpnl ir pernešti į E.coli ER2683 [pACYC-BsmAIM] kaip ekspresijos šeimininkę. Individualūs transformantai kultivuoti lOmi LB + Ap ir Cm per nakti purtant 37 °C temperatūroje. Ląstelių kultūros tiesiogiai tirtos skryningo būdu ieškant BsmBI nikuojančio aktyvumo. Rasti šeši pozityvūs nikuojantys aktyvumai tarp 8, tirtų skryningo būdu ieškant N.BsmBI nikuojančio aktyvumo. Šešių pozityvių klonų ląstelių nuosėdos resuspenduotos ultragarsinio ardymo buferyje ir lizuotos ultragarsu. Ląstelių liekanos pašalintos centrifuguojant ir tirtas ląstelių ekstrakto gebėjimas nikuoti (skaidyti) superspiralinę pBR322 DNR. BsmAI variantas N415D/R4160 pasižymėjo tiek dsDNR skaidančiu, tiek ir nikuojančiu aktyvumais (fig. 13B). Kadangi BsmAI variantas šalia dsDNR skaidymo pasižymėjo ir nikuojančiu aktyvumu, jo specifiškumą grandinei galima buvo toliau optimizuoti. BsmAI varianto N415D/R4160 nikuojama grandinė buvo nustatyta "run-off'sekvenavimo būdu. Nustatyta, kad jis nikavo apatinę grandinę, tai parodė staigus sekvenavimo piko signalo kritimas nikuotoje vietoje (fig.15). Viršutinė grandinė generavo normalią DNR seką.
[0211] 4 pavyzdys. Grandinei specifinio nikuojančio fermento N.BsmaI sukūrimas iš BsmAI restrikcijos endonuk1eazės atsitiktinės mutagenezės ir genetinio skryningo būdu
[0212] Tam, kad būtų gauta daugiau BsmaI nikuojančių variantų atlikta bsmAIR geno atsitiktinė mutagenezė. bsmAIR genas mutagenizuotas panaudojant linkusią klysti atvirkštinę POR šiomis sąlygomis: 94 °C - 30 sek., 55 °C - 30 sek., 72 °C - 4 min. 8 sek., 25 ciklai, naudojant Taq DNR polimerazę, pridėjus 2, 4, 6, 10 mM MgCb, dNTF, pUC-BsmAI matricą ir lx Thermopol buferį. POR produktai surinkti ir išvalyti Qiagen sūkinio kolonėlėse, suskaidyti panaudojant XhoI ir Dpnl, Dpnl skaidymo dėka pašalinama Dam-metilinta DNR matrica. Po to PGR produktai savaime ligavosi ir elektroporacijos būdu buvo pernešti į E. coli kaip ekspresijos šeimininkę, transformantai buvo pasėti Ap lėkštelėse. Recipientinė šeimininkė neturėjo apsauginės metilazės, ir todėl didelio aktyvumo wt fermentas ar mutantinis fermentas užmušė ląsteles-šeimininkes. Tik nuliniai mutantai, mažo aktyvumo mutantai ar mutantai, pasižymintys skaidymo defektu ir geru jungimosi gebėjimu, išgyveno šioje transformacijos pakopoje. Viso gauta apie 3,600 išgyvenusių transformantų, kurie buvo surinkti į bendrą pulą, Plazmidinė DNR išskirta iš ląstelių pulo ir tuo būdu sukurtas mutantinės plazmidinės DNR rinkinys (biblioteka).
[0213] BsmAI wt ir mutantinės plazmidės (~3.9 kb) buvo suskaidytos restrikcijos fermentais PstI ir BseYI. PstI lokalizavosi bsmAIR geno viduryje ir todėl, skaidant PstI, endonukleazės genas skilo į lygius segmentus (43% ir 57 %). BseYI lokalizavosi vektoriaus CoIEI replikacijos origin rajone. Restrikcijos fragmentai buvo išskirti žemos lydymosi temperatūros gelyje ir po to išvalyti Qiagen sūkinio kolonėlėse. wt N-terminalinė koduojanti seka (wt kairė pusė) buvo sujungta su mutagenizuota (inaktyvuota) C-terminaline koduojančia seka (mutantinė dešinė pusė) ir liguota panaudojant T4 DNR ligazę. Priešingai, mutagenizuota (inaktyvuota) N-tenninalinė koduojanti seka (mutantinė kairė pusė) buvo sujungta su wt C-terminaline koduojančia seka (wt dešinė pusė) ir liguota panaudojant T4 DNR ligazę. Liguota DNR, panaudojus elektroporaciją, buvo pernešta į E. coli kaip ekspresijos šeimininkę ER2683 [pACYC-BsmAI]. Gimininga metilazė M.BsmAI suteikė šeimininkės DNR apsaugą. Transformantai buvo išsėti LB agaro lėkštelėse + Ap ir Cm ir inkubuoti per naktį 37 °C temperatūroje.
[0214] Transfonnantų pavienės kolonijos, buvo išsėtos į lOmI terpės, turinčios LB + Ap ir Cm, ir augintos purtyklėje per naktį 37° C temperatūroje. Testuojant nikuojantį aktyvumą, išbandytas dešimties JĮI totalinės ląstelių kultūros poveikis 1 μg pUC 19 superspiralinės DNR. Nikuota DNR buvo išanalizuota elektroforezė agarozės gelyje būdu. Kuomet tam tikro izoliato kultūros terpėje buvo aptikta nikuota žiedinė DNR, tuomet l0mI ląstelių nuosėdų buvo surinktos greitai centrifuguojant. Ląstelių nuosėdos resuspenduotos ultragarsinio ardymo buferyje ir lizuotos veikiant ultragarsu. Nuskaidrintas supernatantas (ląstelių ekstraktas) buvo panaudotas nikuojančio fermento aktyvumo patvirtinimui. Viso ištirta 24 transformantų skryningo būdu ieškant nikuojančio aktyvumo. Trys klonai (#48, #100, #234) 'pasižymėjo pozityviu nikuojančiu aktyvumu tiek ląstelių kultūroje, tiek ir ląstelių ekstraktuose. Plazmidinė DNR išskirta iš šių trijų izoliatų, ir bsmAIR alelis sekvenuotas naudojant pUC universalius pradmenis ir vietoje pagamintus pradmenis: Pradmenys turėjo šias sekas:
[0215] 5'GAAGTTATITATGAACTTGAATCA 3' (303-023) (SEQ ID NO:27)
[0216] 5'TTAATITCTGGAGTITACCGAGAT 3' (303-024) (SEQ ID NO:28)
[0217] BsmAI nikuojantis variantas #48 turi 59-aa C-terminalinę iškritą (deleciją), atsiradusią dėl stop kodono įtarpos vietoje kodono 394 [#48N.BsmAI ((394-465)] (žiūr. 16 paveikslą, 5-7 takeliai). Kitas BsmAI nikuojantis variantas # I 00 turi dvi aa pakaitas Nt.BsmAI (R22 I H/K287N). Kaip parodyta 3 pavyzdyje, N.BsmAI variantas R221 D yra viršutinę grandinę nikuojantis fermentas (Nt.BsmAI). Atitinkamai rezultatui, pateiktam 3 pavyzdyje, atsitiktinės mutagenezės būdu taip pat nustatyta, kad R221 yra kritinė liekana, susijusi su konversija į nikuojantį fermentą, K287N pakaitos indėlis i nikuojantį aktyvumą dvigubame mutante, matomai, yra minimalus.
[0218] Kadangi pirmojo genetinio skryningo metu identifikuoti trys BsmAI nikuojantys variantai (#48, #100 ir #234) ir šie trys fermentai pasižymėjo taip pat ir tam tikru dsDNR skaidymo aktyvumu, todėl atliktas antrasis genetinis skryningas tam, kad būtų išskirta daugiau nikuojančių variantų. BsmAI wt ir mutantinės plazmidės (-3.9 kb) buvo suskaidytos restrikcijos fermentais BsrGI ir BseYI. BsrGI lokalizavosi bsmAIR geno viduryje ir todėl, skaidant BsrGI, endonukleazės genas skilo į du segmentus (56% ir 44 %). BseYI lokalizavosi vektoriaus ColE! replikacijos origin rajone. Restrikcijos fragmentai buvo išskirti žemos lydymosi temperatūros gelyje ir po to išvalyti Qiagen sūkinio kolonėlėse. wt N-terminalinė koduojanti seka (wt kairė pusė) buvo sujungta su mutagenizuota (inaktyvuota) C-terminaline koduojančia seka (mutantinė dešinė pusė) ir liguota panaudojant T4 DNR ligazę. Priešingai, mutagenizuota (inaktyvuota) N-terminalinė koduojanti seka (mutantinė kairė pusė) buvo sujungta su wt C-terminaline koduojančia seka (wt dešinė pusė) ir liguota panaudojant T4 DNR ligazę. Liguota DNR, panaudojus elektroporaciją, buvo pernešta į E. coli, kaip ekspresijos šeimininkę ER2683 [pACYC-BsmAI]. Gimininga metilazė M.BsmAI suteikė šeimininkės DNR apsaugą. Transformantai buvo išsėti LB agaro lėkštelėse + Ap ir Cm ir inkubuoti per naktį 37° C temperatūroje. Skryningo būdu testuojant DNR nikuojantį aktyvumą, išbandytas 240 transformantų ląstelių kultūrų poveikis pUCI9 superspiralinei DNR. Šešiolika bandinių pasižymėjo DNR nikuojančiu aktyvumu. Vėliau šį DNR nikuojantį aktyvumą patvirtino ląstelių ekstraktų tyrimai, ir keturi aktyviausi variantai (#40, #55, #101 ir #197) buvo atrinkti. DNR sekvenavimui. N.BsmAI variantų DNR nikuojantis aktyvumas, nustatytas antrojo genetinio skryningo metu, parodytas 16 paveiksle (#40, 2-4 takeliai; .. #55, 8-10 takeliai; #101, 11-13 takeliai; #197, 14-16 takeliai). aa pakaitos ar delecija, esančios N.BsmAI nikuojančiuose variantuose, parodyti žemiau 2 lentelėje:
[0219] 2 lentelė. aa pakaitos ar delecija, esančios N.BsmAI nikuojančiuose variantuose
[0220]
[0221]
[0222] Delecinis variantas # 1 O 1((362-465) ir mutantinis variantas # 197 pasižymėjo nikuojančiu aktyvumu, nustatytu atliekant riboto skaidymo testą (11100 skiedimas 16 figūroje). Naudojant didelę fermento koncentraciją, aptiktas dsDNR skaidymo aktyvumas. Todėl nikuojantis aktyvumas gali būti optimizuotas vykdant Arg386 mutagenezę, pavyzdžiui, išskiriant R386D ar R386E. Be to, aa pakaitos, identifikuotos atsitiktinės mutagenezės būdu, gali būti kombinuojamos siekiant gauti dvigubus ar trigubus mutantus, pavyzdžiui, išskiriant N349Y/R386S,G207E/R386S ar G207E/N349Y/R386S. Dvigubus ar trigubus mutantus galima sukurti oligonukleotido-nukreiptos PGR mutagenezės būdu.
[0223] 5 pavyzdys. lIA/IIS tipo restrikcijos endonuk1eazės lokalizuota atsitiktinė mutagenezė, skirta grandinei specifinių nikuojančių fermentų gavimui
[0224] Panaudojant restrikcijos fermentus, IINIIS tipo restrikcijos endonukleazės genas gali būti skaidomas į du fragmentus, vieną fragmentą, koduojantį N-terminalines aa, ir kitą, koduojantį C-terminalines aa. Vidinis restrikcijos saitas gali būti lokalizuotas koduojančios sekos viduje nuo 5% iki 95% reliatyvioje pozicijoje skaitant nuo pirmojo startinio kodono. DNR N-terminalinis koduojantis fragmentas ar C-terminalinis fragmentas gali būti klonuoti į ekspresijos vektorių. N-terminalinė koduojanti DNR gali būti mutagenizuota atsitiktinės mutagenezės būdu. Po restrikcinio skaidymo, gavus atitinkamą fragmentą, mutagenizuotas fragmentas gali būti liguotas su wt C-terminaliniu koduojančiu fragmentu /vektoriumi ir tokia liguota DNR gali būti panaudota premodifikuotos ar nemodifikuotos šeimininkės transformacijai. Ieškant nikuojančių fermentų variantų galima atlikti transformantų ląstelių kultūrų ar ląstelių ekstraktų skryningą. Kaip alternatyva, C-terminalinė koduojanti DNR gali būti mutagenizuota atsitiktinės mutagenezės būdu. Po restrikcinio skaidymo atitinkamų flankuojančių restrikcijos saitų gavimui mutagenizuotas fragmentas gali būti liguotas su wt N-terminaliniu koduojančiu fragmentu/vektoriumi ir tada liguota DNR naudojama premodifikuotos šeimininkės transformacijai. Ieškant nikuojančių fermentų variantų atliekamas transformantų ląstelių kultūrų ar ląstelių ekstraktų skryningas. Po nikuojančių variantų išskyrimo atliekamas nikuojamo saito ir nikuojamos grandinės nustatymas, tam tikslui naudojant atitinkamą DNR substratą.
[0225] 6 pavyzdys. IIA/IIS tipo restrikcijos endonukleazės dalies geno atsitiktinė mutagenezė, skirta grandinei specifinių nikuojančių fermentų gavimui
[0226] Galima klonuoti wt IIA/IIS tipo restrikcijos endonukleazės geną į plazmidę ir replikuoti plazmidę ląstelėje-šeimininkėje, turinčioje apsauginę metilazę. Galima klonuoti dalį restrikcijos endonukleazės geno (restrikcijos fragmentas, atitinkantis nuo 5% iki 95 % viso geno) ir tada, panaudojant linkusią klysti PGR ar kitus atsitiktinės mutagenezės būdus, galima šį sub-fragmentą mutagenizuoti. Po restrikcijos skaidymo tam, kad būtų gauti atitinkami restrikcijos galai, mutagenizuotas fragmentas yra liguojamas su wt DNR/vektoriumi pakeičiant atitinkamą wt rajoną. Liguota DNR naudojama šeimininkės, turinčios ar neturinčios apsauginę metilazę, transformacijai. Transformantų ląstelių kultūrose galima atlikti nikuojančių variantų skryningą.
1. Grandinei specifinės nikuojančios endonukleazės sukūrimo būdas, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad apima:
(a) pirmosios ląstelių-šeimininkių, kurios neturi metilazių apsaugos, populiacijos transformaciją plazmidėmis, turinčiomis atsitiktinai mutagenizuotą restrikcijos endonukleazės geną;
(b) (a) pakopoje gautų transformuotų ląstelių-šeimininkių kultivavimą ir plazmidžių išskyrimą;
(c) (a) pakopoje nurodyto mutagenizuoto restrikcijos endonukleazės geno ir atitinkamo laukinio tipo restrikcijos endonukleazės geno skaidymą į fragmentus;
(d) laukinio tipo ir mutagenizuoto endonukleazės restrikcijos genų (c) pakopoje gautų fragmentų in vitro atgalinį kryžminimą ir liguoto geno gavimą;
(e) (d) pakopoje gauto liguoto geno ekspresuojamo baltymo grandinei specifinio nikuojančio aktyvumo nustatymą; ir
(f) sukurtos grandinei specifinės nikuojančios endonukleazės identifikavimą.
2. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad restrikcijos endonukleazės geno (c) pakopoje nurodytas skaidymas atliekamas panaudojant restrikcijos endonukleazės skaidymą ir kur restrikcijos endonukleazės geno fragmentai išvalomi agarozės gelyje.
3. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad (d) pakopa toliau apima: antrosios ląstelių-šeimininkių populiacijos transformaciją liguotu genu, kur transformantai yra apsaugoti giminingų ir negiminingų metilazių.
4. Būdas pagal 3 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad toliau apimantis individualių transformantų kolonijų auginimą.
5. Būdas pagal 4 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad ieškant nikuojančio aktyvumo kolonijų individualaus skryningo metu kaip substratas naudojama superspiralinė DNR.
6. Būdas pagal 5 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad individualaus skryningo pakopoje naudojamos visos ląstelės ląstelių kultūroje arba ląstelių ekstraktas.
7. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad (f) pakopa toliau apima mutacijų vietos ir tipo nustatymą nikuojančią endonukleazę koduojančioje DNR.
8. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad mutagenizuotas restrikcijos endonukleazės genas turi iškritą (deleciją), įtarpą ar vieno ar daugiau nukleotidų pakaitą.
9. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad mutagenizuotas genas turi daugybines mutacijas.
10. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad mutagenizuotas genas turi vieną mutaciją.
11. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad restrikcijos endonukleazės genas koduoja baltymą, turintį C-terminalinį galą ir N-terminalinį galą, kur viena ar daugiau mutacijų lokalizuotos C-terminaliniame gale.
12. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad mutagenizuotas genas turi nuo 3 iki 600 nukleotidų ilgio iškritą (deleciją).
13. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad (a) pakopoje nurodytas ląstelių-šeimininkių paruošimas yra pasirenkamas iš gram-neigiamų ar gram-teigiamų bakterijų-šeimininkių.
14. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad (a) pakopoje nurodytas ląstelių-šeimininkių paruošimas yra pasirenkamas iš E. coli ar Bacillus kamienų.
15. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad toliau apima: mutacijos, esančios nikuojančioje endonuklezėje, identifikavimą lyginant su laukinio tipo restrikcijos endonukleaze, iš kurios ji kilo, ir mutacijos įterpimą sait-nukreiptos mutagenezės būdu į restrikcijos endonukleazės izošizomerą ar neošizornerą.
16. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad toliau apima papildomos mutacijos įterpimą į nikuojančią endonuklezę (f) pakopoje aprašytu būdu, panaudojant sait-nukreiptą mutagenezę, nikuojančio aktyvumo padidinimui ar dvigrandininio DNR skaidymo aktyvumo sumažinimui, ar abiem tikslais.
17. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad mutagenizuotas restrikcijos endonukleazės genas yra IIA tipo endonukleazės genas.
18. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad nikuojanti endonukleazė yra termofilinė nikuojanti endonukleazė.
19. Būdas pagal 17 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad restrikcijos endonukleazė yra BsaI, BsmAI, BsmBI ar jų neošizomerai, ar izošizomerai,
20. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad (t) pakopa toliau apima nikuojančios endonukleazės specifiškumo dvigubos DNR grandinei nustatymą.
21. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad (d) pakopos nikuojanti endonukleazė yra viršutinę grandinę nikuojanti endonukleazė.
22. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad (d) pakopos nikuojanti endonukleazė yra apatinę grandinę nikuojanti endonukleazė.
23. Nikuojanti endonukleazė, sukurta būdu pagal 1 punktą.
24. Nikuojanti endonukleazė, apimanti modifikuotą rekombinantinę BsaI.
25. Nikuojanti endonukleazė, apimanti modifikuotą rekombinantinę BsmAI.
26. Nikuojanti endonukleazė, apimanti modifikuotą rekombinantinę BsmBI.
27. Vieno ar daugiau sait-specifinių viengrandininių trūkių įterpimo į pasirinktas dvigubos DNR grandines būdas, besiskiriantis tuo, kad apima: dvigubos DNR skaidymą panaudojant nikuojančią endonukleazę, sukurtą būdu pagal 19 punktą ir išlaikant sąlygas, palankias nikuojančio aktyvumo pasireiškimui.
28. Taikininės sekos amplifikacijos būdas, besiskiriantis tuo, kad apima:
(a) viengrandininio nukleino rūgšties fragmento, turinčio taikininę seką ir turinčio 5' galą ir 3' galą, gavimą;
(b) SDA amplifikacijos pradmens prijungimą prie fragmento 3' galo taip, kad pradmuo sudarytų 5' viengrandininę užlaidą, amplifikacijos pradmenį, apimantį nikuojančios endonukleazės, sukurtos pagal 1 apibrėžtį, atpažinimo/skaidymo saitą; ir
(c) ant fragmento esančio amplifikacijos pradmens pailginimą, kai nėra derivatizuoto ar pakaitinio dezoksinukleozido tri fosfato, ir, kai yra: (1) DNR polimerazė, pasižyminti grandinę išstumiančiu aktyvumu ir neturinti 5'-3' egzonukleazės aktyvumo, ir (2) keturi dezoksinukleozido trifosfatai; ir
(d) amplifikuotos dvigrandininės taikininės sekos nikavimą, panaudojant nikuojančią endonukleazę, pailginamą nuo trūkio vietos naudojant DNR polimerazę, tuo būdu išstumiant pirmąją naujai sintezuotą grandinę nuo fragmento ir generuojant antrąjį ekstensijos produktą, apimantį antrąją naujai sintezuotą grandinę; ir nikavimo, pailginimo ir išstūmimo pakopų kartoj imą taip, kad būtų amplifikuota taikininė seka.
29. Fermento, pasižyminčio bent vienu modifikuotu specifiškumu substratui lr aktyvumu, sukūrimo būdas, besiskiriantis tuo, kad apima:
(a) atsitiktinai mutagenizuotos DNR rinkinio (bibliotekos) sukūrimą, kur rinkinys turi vieną ar daugiau genų, koduojančių visą ar mutantinio geno dalį kur mutantinis fermentas yra iš esmės inaktyvus, kur iš esmės inaktyvus fermentas turi N-terminalinį galą ir C-terminalinį galą, kur inaktyvacija yra atsiradusi dėl mutacijos, esančios laukinio tipo fermento N-terminaliniame gale ar C-terminaliniame gale;
(b) vieno ar daugiau genų, ekspresuojančių inaktyvią endonukleazę, skaidymą į bent pirmą ir antrą fragmentus, kur pirmasis fragmentas koduoja fermento C-terminalinį galą ir, kur antrasis fragmentas koduoja fermento N-terminalinį galą;
(c) ligavimą fragmentų, parinktų iš: pirmojo fragmento ir trečiojo fragmento, koduojančio laukinio tipo fermento N-terminalinį galą; antrojo fragmento ir ketvirtojo fragmento, koduojančio laukinio tipo fermento C-terminalinį galą; arba abiejų pirmojo lr antrojo fragmentų su atitinkamai trečiuoju ir ketvirtuoju fragmentais; ir
(d) liguotos DNR ekspresiją ląstelėje-šeimininkėje tam, kad būtų gautas fermentas, pasižymintis modifikuotu specifiškumu substratui ir aktyvumu.
30. Taikininės nukleino rūgšties amplifikavimo būdas, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad apima: (a) dvigrandininės taikininės nukleino rūgšties bent vienos grandinės viengrandininį skaidymą (nikavimą) daugelyje vietų panaudojant nikuojantį fermentą, sukurtą pagal I punktą tam, kad susidarytų mažiausiai du nauji 3' terminaliniai galai;
(b) vieno ar daugiau iš mažiausiai dviejų naujų 3' terminalinių galų pailginimą panaudojant DNR polimerazę;
(c) ekstensijos produkto, gauto (b) pakopoje, nikavimą; ir
(d) nikavimo produkto, gauto (c) pakopoje, pailginimą amplifikuojant bent dalį taikininės nukleino rūgšties grandinės.
31. Nikuojančio fermento variantų greito skryningo būdas, besiskiriantis tuo, kad DNR nikavimo reakcijoje naudojamos ląsteles-šeimininkės plius kultivavimo terpė drauge su superspiraline DNR kaip substratu.